BR112020010436A2

BR112020010436A2 - oligonucleotídeo radiomarcado, processos para a preparação de um oligonucleotídeo radiomarcado, uso do oligonucleotídeo radiomarcado, método para determinar a biodistribuição e farmacocinética e oligonucleotídeo

Info

Publication number: BR112020010436A2
Application number: BR112020010436-1A
Authority: BR
Inventors: Martin Robert Edelmann
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2018-01-26
Filing date: 2019-01-24
Publication date: 2020-11-24
Also published as: AU2019212849B2; JP2021510684A; WO2019145384A1; CA3085407A1; JP7383618B2; KR20200116088A; US20200345871A1; AU2019212849A1; IL276027A; EP3743116A1; MX2020005751A; CN111867638A

Abstract

A invenção compreende um oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula I; em que, n, X1, X2, ligante 1, ligante 2, Q e a unidade de direcionamento ao receptor são conforme definidos na descrição. Os oligonucleotídeos radiomarcados de Fórmula I podem ser utilizados para a determinação da biodistribuição e farmacocinética do oligonucleotídeo no tecido ou no fluido corporal.

Description

“OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, PROCESSOS PARA A PREPARAÇÃO DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, USO DO OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, MÉTODO PARA DETERMINAR A BIODISTRIBUIÇÃO E FARMACOCINÉTICA E OLIGONUCLEOTÍDEO”

[001] A invenção diz respeito a um novo oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula |: x oH [= — ligante 2 Eb ligante 1 7º ao receptor ou lk n | O& = extremidade 3' ou 5' do oligonucleotideo em que, n, X' e X?, os ligantes 1 e 2, Q e a porção de direcionamento ao receptor são discutidos a seguir, um processo para a preparação do mesmo e o uso do mesmo para a determinação da biodistribuição e farmacocinética do oligonucleotídeo no tecido ou fluido corporal.

[002] Para que uma abordagem terapêutica antissenso seja eficaz, os oligonucleotídeos devem ser introduzidos no paciente e devem atingir os tecidos específicos a serem tratados. A biodistribuição e a farmacocinética de um medicamento terapêutico devem ser determinadas como uma etapa preliminar ao tratamento com o medicamento. Consequentemente, é necessário ser capaz de detectar oligonucleotídeos nos fluidos ou tecidos corporais. Agrawal et al. Clin. Pharmacokinetics 28, 7 (1995), revisaram determinados aspectos da farmacocinética de oligonucleotídeos antissenso. Outra abordagem bem estabelecida usada em estudos farmacocinéticos in vivo de compostos farmacológicos, como oligonucleotídeos antissenso, implica na marcação radioativa dos compostos para permitir a detecção. Em modelos animais, os oligonucleotídeos radiomarcados foram administrados ao animal e sua distribuição nos tecidos e fluidos corporais foi avaliada por extração dos oligonucleotídeos seguida de autorradiografia (consulte Agrawal et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 88, 7595- 7599 (1991).

[003] A marcação ?*ºS é uma técnica estabelecida e amplamente difundida. Para estudos biológicos, fosforoticatos de oligonucleotídeos marcados com *S foram preparados utilizando a química de H-fosfonato (Consulte Garegg et al., Chem. Scr. 25, 280-282 (1985).

[004] A marcação radioisotópica de oligonucleotídeos sintéticos com **C e 3H é atualmente conseguida pelo uso da síntese automatizada em fase sólida bem estabelecida. Nessa abordagem, a montagem das fosforamidita de nucleosídeo *ºC e 3H requer um processo de duas etapas, tal como mostrado na Fig. 1 da Patente US 5.847.104. No entanto, várias desvantagens estão associadas a esse método. Uma vez que o radioisótopo é introduzido na primeira etapa, (a) o rendimento radioquímico depois de duas etapas é limitado; (b) esta operação sofre frequentemente um problema de diluição, ou seja, a abundância natural do isótopo é geralmente misturada com um veículo, a fim de manter uma escala sintética gerenciável, resultando em menor atividade específica dos oligos finais; e (c) a fosforamidita 3 (Fig. 1) é uma espécie reativa propensa a degradação que, como precursor radioativo final, leva a requisitos rigorosos de armazenamento e transporte.

[005] Em vista das deficiências dos métodos da técnica anterior, são desejáveis outras abordagens para a obtenção de oligonucleotídeos radiomarcados com alta atividade específica.

[006] O objetivo da invenção é, portanto, prover uma nova abordagem para a marcação radioativa de oligonucleotídeos.

[007] Descobriu-se que o objetivo poderia ser cumprido com oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula | recentemente desenvolvido.

N oH Porção d . O LO, o. | Q direcionamento — | — ligante 2 — PC pro ligante 1 < ao receptor du | n x | OQ = extremidade 3' ou 5' do oligonucleotideo em que, nébloul; X' e X?, independentemente um do outro, são S ou O; o ligante 1 é uma ponte de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula Fed. * OH : m em que m é um número inteiro de 1 a 6; o ligante 2 opcionalmente é uma ponte (ligação) de amino alquileno—C2-12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte de amino etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol|; Q significa um resíduo de Fórmula 2a ou 2b : o

SR :H 2a ou o R : o *s 2b em que R" e R?' são grupos alquila-C1-6 radiomarcados; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo.

[008] As Figuras têm o seguinte significado: - Na Fig. 1 as concentrações hepáticas de um composto A do GalNAc (linha tracejada) e de um composto A do estudo sem GalNAc (linha contínua) foram comparadas por LC-MS/MS; e - Na Fig. 2, as concentrações hepáticas dos compostos marcados com trítio do Exemplo 3.b (linha tracejada) e Exemplo 3.c (linha contínua) foram comparadas por LSC.

[009] As seguintes definições são apresentadas para ilustrar e definir o significado e o escopo dos vários termos usados para descrever a presente invenção.

[010] O termo “alquila C1.6” denota um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado monovalente com 1 a 6 átomos de carbono, e em exemplos de realização mais particulares, de 1 a 4 átomos de carbono. Exemplos de alquila-Ci6 incluem metila, etila, propila, isopropila, n-butila, j- butila, sec-butila ou tbutila, preferencialmente metila ou etila, mais preferencialmente etila.

[011] O termo “alquila C212” também denota um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramificado monovalente com 2 a 12 átomos de carbono, e em exemplos de realização mais específicos, de 4 a 8 átomos de carbono e em exemplos de realização ainda mais específicos, de 6 átomos de carbono. Exemplos específicos são butila, pentila, hexila, heptila ou octila e seus isômeros, mas de preferência n-hexila.

[012] O termo “ponte (ligação) de alquileno C2-12" designa um grupo hidrocarboneto saturado linear ou ramíificado bivalente com 2 a 12 átomos de carbono, e em exemplos de realização mais específicos, de 4 a 8 átomos de carbono e em exemplos de realização ainda mais específicos, 6 átomos de carbono. Exemplos específicos são butileno, pentileno, hexileno, heptileno ou octileno e seus isômeros, mas preferencialmente n- hexileno.

[013] O termo “ponte (ligação) de amino alquileno-C2-12" representa um grupo bivalente compreendendo um grupo amino ligado a um grupo de hidrocarboneto saturado ramíificado de 2 a 12 átomos de carbono, em um exemplo de realização mais específico, de 4 a 8 átomos de carbono e em um exemplo de realização ainda mais específico de 6 átomos de carbono. Exemplos específicos são amino butileno, amino pentileno, amino hexileno, amino heptileno ou amino octileno e os seus isômeros, mas de preferência amino n-hexileno (-NH-(CH2)6s-).

[014] O termo “unidades de etilenoglicol” significa unidades de Fórmula -(CH2)2-O- que como uma unidade de ligação (ponte) pode conter de 1 a 10 unidades de etilenoglicol, de preferência 2 a 6 unidades de etileno glicol.

[015] O termo “ponte à base de glicerol por unidade de glicerol” ou “ligação à base de glicerol por unidade de glicerol” é caracterizado pela Fórmula Ae OH m em que m é um número inteiro de 1 a 6, de preferência 1 a 3, mais preferencialmente 1.

[016] O termo “grupo amino-protetor' ou “grupo protetor de amino” indica grupos destinados a proteger um grupo amino e inclui benzoila, benziloxicarbonila, carbobenziloxi (CBZ ou Z), 9-fluorenilmetiloxicarbonila (FMOC), p-metoxibenziloxicarbonila, p-nitrobenziloxicarbonil, t-butoxicarbonila (BOC) e trifluoroacetila. Outros exemplos desses grupos são encontrados em T. W. Greene e P. G. M. Wuts, “Protective Groups in Organic Synthesis”, 2º ed., John Wiley & Sons, Inc., Nova lorque, NY, 1991, cap. 7; E. Haslam, “Protective Groups in Organic Chemistry, J. G. W. McOmie, Ed., Plenum Press, Nova lorque, NY, 1973, Cap. 5, e T.W. Greene, “Protective Groups in Organic Synthesis”, John Wiley & Sons, Nova lorque, NY, 1981.

[017] O termo oligonucleotídeo, conforme utilizado na presente invenção, é definido tal como ele é geralmente entendido pelos especialistas como uma molécula compreendendo dois ou mais nucleotídeos covalentemente ligados. Para uso como um oligonucleotídeo valioso do ponto de vista terapêutico, os oligonucleotídeos são tipicamente sintetizados como 7 a 30 nucleotídeos de comprimento.

[018] Os oligonucleotídeos podem consistir em monômeros de nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos.

[019] Os monômeros de nucleosídeo de LNA são nucleosídeos modificados que compreendem um grupo de ligação (referido como um biradiclo (biradicle) ou uma ponte (ligação)) entre C2' e C4' do anel de açúcar ribose de um nucleotídeo. Estes nucleosídeos são também denominados na literatura de ácido nucleico em ponte ou ácido nucleico bicíclico (BNA).

[020] A expressão “opcionalmente modificado”, conforme utilizada na presente invenção, refere-se a nucleosídeos modificados em comparação com o nucleosídeo equivalente de DNA, RNA ou LNA pela introdução de uma ou mais modificações da porção açúcar ou porção base nitrogenada. Em um exemplo de realização preferido, o nucleosídeo modificado compreende uma porção de açúcar modificada e pode, por exemplo, compreender um ou mais nucleosídeos substituídos em 2' e/ou um ou mais nucleosídeos de LNA. O termo nucleosídeo modificado também pode ser usado na presente invenção de forma alternada com o termo “nucleosídeo análogo” ou “unidades” modificadas ou “monômeros” modificados.

[021] Os nucleosídeos de DNA, RNA ou LNA são, em regra, ligados por um fosfodiéster (P=O) e/ou uma ligação internucleosídica de fosforotioato (P=S) que acopla covalentemente dois nucleosídeos.

[022] Consequentemente, em alguns oligonucleotídeos todas as ligações internucleosídicas podem consistir em um fosfodiéster (P=O), em outros oligonucleotídeos todas as ligações internucleosídicas podem consistir em um fosforotioato (P=S) ou em outros oligonucleotídeos a sequência de ligações — internucleosídicas— pode variar e compreender ambos internucleosídeos, fosfodiéster (P=O) e fosforotioato (P=S).

[023] As porções de nucleobases podem ser indicadas pelo código da letra para cada base nitrogenada (nucleobase) correspondente, por exemplo, A, T, G, C ou U, em que cada letra pode opcionalmente incluir nucleobases modificadas de função equivalente. Por exemplo, nos oligonucleotídeos exemplificados, as porções de nucleobases são descritas com letras maiúsculas A, T, G e VºC (5-metil citosina) para nucleosídeos de LNA e com letras minúsculas a, t, g, c e Yºc para nucleosídeos de DNA. As nucleobases modificadas incluem, entre outras, nucleobases que carregam grupos protetores, como t-butilfenoxiacetila, fenoxiacetila, benzoíla, acetila, i- butirila ou dimetilformamidina (consulte a página da Wikipédia, Phosphoramidit- Synthese, https://de.wikipedia .org/wiki/Phosphoramidit-Synth de 24 de março de 2016).

[024] De preferência, o oligonucleotídeo consiste em monômeros de nucleosídeo de DNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos e tem 10 a 25 nucleotídeos de comprimento.

[025] Os princípios da síntese de oligonucleotídeos são bem conhecidos no estado da técnica e bem descritos na literatura e fontes públicas como Wikipédia (vejay por exemplo, síntese de oligonucleotídeos (Oligonucleotide synthesis), na página da Wikipédia, a enciclopédia livre; https://en.wikipedia.org/wiki/Oligonucleotide synthesis, de 15 de março de 2016).

[026] Atualmente, a síntese de oligonucleotídeos em maior escala é realizada automaticamente, usando sintetizadores controlados por computador.

[027] Como regra geral, a síntese de oligonucleotídeos é uma síntese em fase sólida, em que o oligonucleotídeo sendo montado é covalentemente ligado pelo grupo hidroxi 3'-terminal a um material de suporte sólido e permanece ligado a ele durante todo o curso da montagem de cadeia. Os suportes adequados são os suportes de poliestireno macroporoso disponíveis no mercado, como o suporte Primer 5G da GE Healthcare ou o suporte NittoPhaseºHL da Kinovate.

[028] A síntese de oligonucleotídeos, em princípio, é uma adição gradual de resíduos de nucleotídeos na extremidade 5'-terminal da cadeia em crescimento até que a sequência desejada seja montada.

[029] Como regra, cada adição é chamada de ciclo sintético e, em princípio, consiste nas reações químicas de; ai) desbloquear o grupo hidroxila protegido no suporte sólido, az) acoplaro primeiro nucleosídeo como fosforamidita ativada ao grupo de hidroxila livre no suporte sólido, a;:) oxidar ou sulfurar o respectivo nucleosídeo P-ligado para formar o respectivo fosfotriéster (P=O) ou o respectivo fosforotioato (P=S); a) opcionalmente, cobrir/capear (capping) quaisquer grupos hidroxila que não reagiram no suporte sólido; as) desbloquear o grupo hidroxila 5' do primeiro nucleosídeo ligado ao suporte sólido; as) acoplaro segundo nucleosídeo como fosforamidita ativada para formar o respectivo dímero ligado a P; a7) oxidarou sulfurar o respectivo dinucleosídeo P-ligado para formar o respectivo fosfotriéster (P=O) ou o respectivo fosforotioato (P=S); as) opcionalmente, protegendo ou cobrindo (capping) quaisquer grupos hidroxila 5' que não reagiram; e a9) repetiras etapas anteriores de as a as até que a sequência desejada seja montada.

[030] O termo “radiomarcado” no contexto da presente invenção é utilizado para os substituintes R" e RZ, que são grupos alquila-C1.6 radiomarcados, de preferência grupos alquila-Cis radiomarcados, mais preferencialmente um grupo metila ou etila. Consequentemente, uma radiomarcação adequada para estes grupos significa a substituição dos átomos naturais por seus isótopos radioativos **C ou ?H correspondentes, mas de um modo preferido por 3H.

[031] O termo “porção de direcionamento ao receptor” significa uma porção que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo.

[032] Essas porções podem ser selecionadas a partir de qualquer porção que visa um receptor de proteína que possua potencial para melhorar a funcionalidade do oligonucleotídeo. Elas incluem, mas não estão limitadas a anticorpos ou peptídeos funcionais ou oligonucleotídeos que têm como alvo moléculas específicas, como aptâmeros ou porções alvo de receptores de proteínas não nucleotídicas que têm o potencial de melhorar a entrega do oligonucleotídeo ao tecido ou fluido corporal.

[033] Em um exemplo de realização preferido a porção de direcionamento ao receptor é uma porção que visa o receptor de asialoglicoproteína, mais preferivelmente um grupo GalNAc.

[034] O grupo GalNAc tem a Fórmula VII: nº ” à o

S NS HaC o ds o. o H o o o N HN. O. O o. o o OA o A R EHs ns o A E º o o NA H o o o teA, É 3 R o. o ” À % N CH; vI R o

NE em que R? é hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxi e n representa um número inteiro de O a 10, preferivelmente de O a 5, mais preferenciamente de 1 a 3, sendo mais preferido 2, os seus sais correspondentes, enantiômeros e/ou um estereoisômero do mesmo.

[035] Os grupos protetores de hidroxila adequados são acila, e particularmente um grupo alquilcarbonila C1-12, mais particularmente, um grupo alquilcarbonila C1-6 que é opcionalmente substituído por alquila C1-6 ou fenila. Sendo mais preferido a acetila, pivaloíla ou benzoíla, de modo que a acetila é o grupo protetor de hidroxila mais preferido.

[036] Em um exemplo de realização preferido, o grupo GalNAc tem a Fórmula VII, em que Rº é hidrogênio e n é 2.

[037] A porção GalNAc é conectada ao ligante 2 por meio de uma ligação peptídica -CO-NH-.

[038] Os compostos de agregados (cluster) de GalNAc podem ser preparados de acordo com a publicação PCT WO2017021385.

[039] Em um exemplo de realização preferido, o oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula 1 Q tem a Fórmula 2b e a conjugação é na extremidade 3' ou 5' do oligonucleotídeo.

[040] Em outro exemplo de realização preferido, oO oligonucleotídeo radiomarcado da reivindicação 1 ou 2, em que Q tem a Fórmula 2a e a conjugação é na extremidade 3' ou 5' do oligonucleotídeo.

[041] São particularmente preferidos oligonucleotídeos radiomarcados de Fórmula 1, em que Q tem a Fórmula 2b e a conjugação está na extremidade 3' ou 5' do oligonucleotídeo.

[042] Em outro exemplo de realização, o oligonucleotídeo radiomarcado tem a Fórmula lb: o FÉ & TP O igante 1 SO º Ho Se O = oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5' b em que: R?' é alquila-C1.6 radiomarcado; XPéSouoO; o ligante 1 é uma ponte de alquileno-C212, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula: Fe OH m em que m é um número inteiro de 1 a 6.

[043] Em um exemplo de realização preferido, o oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lb tem uma conjugação na extremidade 3'.

[044] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lb, R? é metila ou etila, mais preferivelmente etila.

[045] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lb, X? é S.

[046] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula Ib, o ligante 1 é uma ligação (ponte) alquileno-C2-12, de preferência uma ligação alquileno Cs.

[047] É ainda mais preferido o oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lb em que R?' é metila ou etila, de preferência etila; X? é S e o ligante 1 é uma ligação de alquileno Ce.

[048] Em outro exemplo de realização, o oligonucleotídeo radiomarcado tem a Fórmula lc: Í TV o NÃ | «sm | ligante 2 Opa On pr O ligante 1 To ao receptor o " | | Ss * k Q = oligonucleotideo em que,

R?' é alquila-C1-6 radiomarcado; X' e X?, independentemente um do outro, são S ou O; o ligante 1 é uma ponte de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula: Ae OH m em que m é um número inteiro de 1 a 6; o ligante 2 opcionalmente é uma ponte de amino alquileno—C2-12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte amino etilenoglicol! contendo 1 a 10 unidades de etilenoglico!; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo.

[049] A porção de direcionamento ao receptor é conforme definido acima, mas é preferencialmente uma porção que visa o receptor de asialoglicoproteína, mais preferencialmente um grupo GalNAc.

[050] Em um exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lc, R? é metila ou etila, mais preferivelmente etila.

[051] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula le, X' é O0e XP éS.

[052] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lc, o ligante 1 é uma ligação (ponte) de alquileno-C2-12, de preferência uma ligação de alquileno-Cse.

[053] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lc, o ligante 2 é uma ligação (ponte) de amino alquileno-C2-12, de preferência uma ligação de amino alquileno—Cs.

[054] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lc, a porção de direcionamento ao receptor é um grupo GalNAc de Fórmula V.

[055] É ainda mais preferido o oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lc, em que RZ' é metila ou etila, de preferência etila; X* representa O e X? é S; o ligante 1 é uma ligação de alquileno-Cse; o ligante 2 é uma ligação de amino alquileno Cs e a porção de direcionamento ao receptor é um grupo GalNAc de Fórmula V, com Rº sendo hidrogênio e n=2.

[056] Em outro exemplo de realização, o oligonucleotídeo radiomarcado tem a Fórmula Id: o e. nx ligante 1 A * | SN SR oH H O =olgonuclectídeo, extremidade 3' ou 5º d em que: R** é alquila-C1.6 radiomarcado; X?éSouO; o ligante 1 é uma ponte de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula: Ae oH : m em que m é um número inteiro de 1 a 6.

[057] Em um exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula Id, R é metila ou etila, mais preferivelmente etila.

[058] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula Id, X? é S.

[059] Em outro exemplo de realização preferido do oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lc, o ligante 1 é uma ligação (ponte) de alquileno-C2-12, de preferência uma ligação de alquileno-Cse.

[060] É ainda mais preferido o oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula lb em que R" é metila ou etila, de preferência etila; X?º é S e o ligante 1 é uma ligação de alquileno Ce.

[061] O oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula Id pode ser ilustrado com os seguintes compostos: Prop-5'-Am-C6*G*C*a*t*tigrgta*t TCA G*A*G*tttra*tc*ttig*c*cta*A*C*T*-Am-GBB-Prop G*Cra*tttigig*ta*t T*C*A*-Am-GBB-Prop em que Am-C6 significa um ligante amino (hexileno) C6; Am-GBB significa um amino ligante amino com ponte (ligação) à base de glicerol (m = 1), Prop é uma propionila marcada com ?H; * significa ligações de fosforoticato; A, C, G, T são monômeros de nucleosídeos de LNA e a, t, c, g são monômeros de nucleosídeos de DNA.

[062] Os exemplos de realização mais preferidos são de oligonucleotídeos radiomarcados de Fórmula |b e lc.

[063] Os oligonucleotídeos radiomarcados de Fórmulas |b e lc podem ser ilustrados com os seguintes compostos: 5'-GN2-C6-caG*A*G*t*ta*c*tttig"ctcta*A*C*T*-CESH-NEM G*Cratttrg*grta*t T"C*A*--C6SH-NEM G*Cratttrgrgrta*t T"C*A*--C6SH-NMM

G*A*G*titrato*ttigicícta*A*C*T*-CESH-NEM G*A*G*ttato*ttigicícta*A*C*T*-CESH-NMM 5'-NEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*ttrata*tttratta*ct TCC, em que C6SH significa um ligante tiol C6 (hexileno); NEM é uma N-etilmaleimida marcada com 3H; NMM é uma N-metilmaleimida marcada com 3H; * significa ligações de fosforoticato; A, C, G, T são monômeros de nucleosídeos de LNA e a, t, c, g são monômeros de nucleosídeos de DNA.

[064] Os oligonucleotídeos radiomarcados de acordo com a presente invenção têm uma atividade específica de 37 GBqg/mmol (1 Ci/mmol) a 3,7 TBg/mmol (100 Ci/mmol), preferencialmente 111 GBq/mmol (3 Ci/mmol)) a 1,85 TBg/mmol (50 Ci/mmol), mais preferencialmente de 185 GBq/mmol (5 Ci/mmol) a 740 GBq/m mol (20 Ci/mmol).

[065] A invenção também compreende processos adequados para a preparação de um oligonucleotídeo radiomarcado de Fórmula |.

[066] Para aqueles oligonucleotídeos radiomarcados de Fórmula | em que Q representa o resíduo de Fórmula 2a o processo compreende a conjugação de uma amina de Fórmula Ill: x oH E ligante 2 olho ole ligante 1 Pa ao receptor du lt n a O =oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5º em que, X' e X?, independentemente um do outro, são S ou O; e o ligante 1 é uma ponte de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula:

Fe OH m em que m é um número inteiro de 1 a 6; o ligante 2 opcionalmente é uma ponte de amino alquileno—-C2-12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte amino etilenoglico! contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol|; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo; com um composto de succinimidila radiomarcado de Fórmula IV: 7 o

É Oo

N em que R* é conforme descrito acima.

[067] Os derivados de succinimidila radiomarcados estão disponíveis comercialmente. O composto de succinimidil marcado com ?H de Fórmula IV com R"' etila (propionato de N-succinimidila; NSP) pode ser obtido, por exemplo, a partir da Pharmaron, Cardiff, Reino Unido.

[068] A reação de conjugação pode ser realizada na presença de uma base orgânica e de um solvente orgânico ou em um sistema tampão aquoso a uma temperatura de reação de 0ºC a 50ºC.

[069] As bases orgânicas adequadas são aminas terciárias tais como N,N-di-isopropiletilamina (base de Húnig).

[070] Os tampões aquosos adequados, como salina tamponada com fosfato, estão na faixa de pH de 6 a 9.

[071] Os solventes adequados são solventes apróticos polares,

como N,N-dimetilformamida ou dimetilsulfóxido.

[072] A mistura de reação contendo o oligonucleotídeo radiomarcado resultante pode ser liberada do solvente e o produto bruto pode ser dissolvido em uma solução tampão aquosa adequada para a purificação adicional.

[073] A purificação compreende essencialmente as etapas de cromatografia, concentração e isolamento, aplicando técnicas bem conhecidas dos especialistas no assunto.

[074] A cromatografia é uma HPLC preparatória tipicamente com uma coluna C-18 de fase reversa usando solventes aquosos e orgânicos como fases móveis.

[075] A concentração das frações obtidas da cromatografia pode ocorrer através de uma filtração de fluxo tangencial, particularmente uma diafiltração sobre uma membrana adequada.

[076] Por fim, o isolamento do oligonucleotídeo radiomarcado a partir do eluente pode ocorrer tipicamente por liofilização.

[077] Para aqueles oligonucleotídeos radiomarcados de Fórmula | em que Q representa o resíduo de Fórmula 2b, o processo compreende a conjugação de um tiol de Fórmula V: x oH E Iene 2 Io ol.o ligante 1 2! ao receptor de | | n x v O =oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5º em que, X' e X?, independentemente um do outro, são S ou O; o ligante 1 é uma ponte de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula: Fe OH m em que m é um número inteiro de 1 a 6; o ligante 2 é opcionalmente uma ponte de amino alquileno—C2-12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte amino etilenoglico! contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo; com um composto maleimida radiomarcado de Fórmula VI: Ps o

VI em que R?' é conforme descrito acima.

[078] Os derivados de maleimida radiomarcados estão disponíveis comercialmente. A maleimida marcada com ?H com R? metila (Fornecedor 1) ou etila (Fornecedor 2) pode ser obtida, por exemplo, a partir da RC Tritec, Teufen, Suíça (Fornecedor 1), Pharmaron, Cardiff, Reino Unido (Fornecedor 2).

[079] A reação de conjugação pode ser realizada na presença de um solvente orgânico a uma temperatura de reação de 0ºC a 50ºC.

[080] Os solventes adequados são solventes apróticos polares, como N, N-dimetilformamida, dimetilsulfóxido ou sistemas tampão aquosos.

[081] A mistura de reação contendo o oligonucleotídeo radiomarcado resultante pode ser liberada do solvente e o produto bruto pode ser dissolvido em uma solução tampão aquosa adequada para a purificação adicional.

[082] A purificação compreende essencialmente as etapas de concentração e isolamento, aplicando técnicas bem conhecidas dos especialistas no assunto.

[083] A concentração pode ocorrer através de uma filtração de fluxo tangencial, particularmente uma diafiltração da solução aquosa sobre uma membrana adequada.

[084] A invenção compreende ainda o uso do oligonucleotídeo radiomarcado para a determinação da biodistribuição e farmacocinética do oligonucleotídeo no tecido ou fluido corporal. Além disso, os oligonucleotídeos marcados com trítio podem ser aplicados em biociência, incluindo autorradiografia quantitativa de corpo inteiro (QWBA), estudos de ligação ao alvo e estudos de efluxo e captação.

[085] A invenção também compreende um método para determinar a biodistribuição e farmacocinética de um oligonucleotídeo no tecido ou fluido corporal, compreendendo: a) administrar uma quantidade eficaz de oligonucleotídeo radiomarcado de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 no tecido ou fluido corporal a ser examinado; e b) mensurar a biodistribuição e a farmacocinética do oligonucleotídeo — radiomarcado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, no tecido ou fluido corporal e, opcionalmente; c) realizar a imagiologia do oligonucleotídeo radiomarcado de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 no tecido ou fluido corporal a ser examinado por autorradiografia.

[086] A invenção compreende ainda o oligonucleotídeo de Fórmula X: í oH POiGAG A o lo | Mira sinamento: |— ligante 27 PS Ox pr O ligante 11-72 ao receptor du | n x x O& =oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5' em que, néboul X' e X?, independentemente um do outro, são S ou O; o ligante 1 é uma ponte de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula: Ae OH : m em que m é um número inteiro de 1 a 6; o ligante 2 opcionalmente é uma ponte de amino alquileno—C2-12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte amino etilenoglicol! contendo 1 a 10 unidades de etilenoglico!; Q significa um resíduo de Fórmula 2a' ou 2b': Oo

SR :H 22' ou

O R 2 We N ! o >s 2b' em que R' e R? são grupos alquila-C1+; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo.

[087] Os exemplos de realização preferidos descritos para os oligonucleotídeos radiomarcados de Fórmula | também se aplicam aos oligonucleotídeos de Fórmula X.

[088] Consequentemente, R' e R? representam um grupo alquila C14, preferencialmente um grupo metila ou etila com maior preferência para um grupo etila.

[089] Os exemplos de realização preferidos descritos para os oligonucleotídeos radiomarcados de Fórmula lb, lc e ld também se aplicam aos oligonucleotídeos de Fórmula Xb: 2 o RP

N o PO > ligante sz 9

IX no” Sê O =oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5' xb em que R?, X? e ligante 1 são conforme acima; para o oligonucleotídeo de Fórmula Xc:

x oH o R Porção de ; oo 5,30. (o) bi Y o direcionamento — |— ligante 27 MP“ Seg sp ligante 1 ao receptor | || Ss oH x Xc O& = oligonucleotideo em que R?, X' e X?, ligante 1 e ligante 2 são conforme acima; para o oligonucleotídeo de Fórmula Xd: o || o 9 QT TP ia. ligante 1 A 1 | SNÓDR oH H OQ = oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5 xd em que R', X? e ligante 1 são conforme acima; e o a porção de direcionamento ao receptor que é uma porção não nucleotídica, preferencialmente uma porção que visa o receptor de asialoglicoproteína, mais preferencialmente um grupo GalNAc de Fórmula VII:

A q no. e o Aa A e R > o s = to É o o. o ão em que R? é hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxi e n representa um número inteiro de O a 10, preferivelmente de O a 5, mais preferenciamente de 1 a 3, sendo mais preferido 2, os seus sais correspondentes, enantiômeros e/ou um estereoisômero do mesmo.

[090] Os compostos divulgados na presente invenção possuem as seguintes sequências de nucleobases: SEQ ID NO 1 : gcattagtattica (Oligo 1,3,5); SEQ ID NO 2 : gagttacttgccaact (Oligo 2,6); SEQ ID NO 3 : cagagttacttaccaact (Oligo 4); e SEQ ID NO 4 : ttacacttaattatacttcc (Oligo 7).

EXEMPLOS ABREVIAÇÕES: - ACOH Ácido acético; -Bq Becquerel; -Ci Curie; -Da Dalton; -DI Deionizada; - DIPEA N,N-Di-isopropiletilamina (base de Húnig); -DMAP 4-(Dimetilamino)-piridina; - DMF N, N-Dimetilformamida; - DMSO Dimetilssulfoxido; - EtoH Etanol; -GBB Ponte à base de glicerol; -h Horas; - HPLC Cromatografia líquida de alto eficiência; -j iso-; -LC-MS/MS — Cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa em tandem;

-LNA Ácido nucleico bloqueado; -LSC Contagem de cintilação líquida; - MeoH Metanol; -min Minutos; - MM, nM Milimolar, Nanomolar; -mL Mililitro; -ul Microlitro; -MS Espectrometria De Massa; - MW Massa Molecular; - MWCO Valor de corte da massa molecular; -n Normal; - NEM N-Etil maleimida; -ng Nanograma; -nm Nanometro; - NMM N-Metil maleimida; -NSP N-Succinimidil-propionato; -p para, -PBS Salina tamponada com fosfato; - PCR Reação Em Cadeia Da Polimerase; -PD Farmacodinâmica; - Prop Propionato; -QC Controlede Qualidade (amostra); - QWBA Autorradiografia Quantitativa De Corpo Inteiro; -rpm Rotações por minutos; -t Temperatura ambiente; - SRM Monitoramento de reações selecionadas; -t Terciário; - TEA Trietilamina;

- UPLC Cromatografia Líquida de Ultra-Alto Desempenho; e -v Volume.

MÉTODOS GERAIS

[091] Todos os oligonucleotídeos que foram utilizados como materiais de partida foram sintetizados pela Roche Pharma research e desenvolvimento anterior. A N-[?H]-etil maleimida marcada com trítio (atividade específica: 2 TBg/mmol = 55 Ci/mmol) foi obtida a partir da Pharmaron (Cardiff, Gales, Reino Unido) como solução em pentano. O propionato de N- [H]succibimidila marcado com trítio (atividade específica: 3,8 TBg/mmol = 103 Ci/mmol) foi obtido da RC Tritec (Teufen, Suíça) como solução em tolueno. À contagem de cintilação líquida para compostos de trítio foi realizada usando um HIDEX 300 SL e coquetel ULTIMATE GOLD (PerkinElmer Inc., Waltham, MA, EUA). O monitoramento da reação e a pureza para Oligos 1-3 foram determinados em instrumento HPLC Agilent 1210 no comprimento de onda de 260 nM, coluna Waters XBridge RP18, 4,6 x 150 mm, de 3,5 um a 60ºC ([A] = água/metanol/hexafluoro — i-propanol/TEA: —950/25/21/23 mL; |[B] = água/metanol/hexafluoro i-propanol/TEA: 175/800/21/2,3 mL) na velocidade de fluxo de 1,0 mL/min com o seguinte gradiente: 10% [B] a 60% [B] em 12 min. Os Oligos 4- 6 foram determinados em um UPLC Agilent 1290 no comprimento de onda de 260 nm, coluna ACQUITY UPLC Oligonucleotide BEH, 2,1 x 50 mm, de 1,7 uM a 80ºC com mesmos eluentes e o seguinte gradiente: 10% [B] para 40% em 6 min. Oligo 7 foi analisado com a mesma condição como Oligos 4-6 aceitar o seguinte gradiente: 10% [B] para 30% em 6 min. A espectrometria de massa foi realizada utilizando um espectrômetro Waters Acquity UPLC H- class System equipado com uma Quádrupolo único (SQ) e Detector de massa ESI; a pureza foi medida usando um B-radioactivity HPLC detector RAMONA Quattro com cintilador sólido interno (Raytest, Straubenhardt, Alemanha). À HPLC preparativa para Oligos 1-3 foi realizada em um Gilson PLC 2050 com coluna XBridge C18, 5 um, 10 mm * 250 mm e utilizando água (950 mL)/metanol (25 mLYTEA (2,3 mL)/hexafluoro i-propanol (21 mL) como fase móvel [A] e água (175 mL)/metanol (800 mMLYTEA (2,3 mL)/hexafluoro i- propanol (21 mL) como fase móvel [B] e gradiente com 10% [B] a 60% [B] em minutos. A concentração foi determinada utilizando um espectrofotômetro Eppendorf BioSprectrometerº basic, no comprimento de onda de 260 nm e o coeficiente de extinção molar correspondente foi calculado. EXEMPLO 1

CONJUGAÇÃO NÃO RADIOATIVA NO LIGANTE AMINO A) OLIGONUCLEOTÍDEOS UTILIZADOS NOS EXEMPLOS

[092] 5-Am-C6*G*CrattttigigtattT"C*A; MW: 4520,7 gimol; (Oligo 1).

[093] G*A*G*ttra*c*titig*c*cta*A*C*T*-Am-GBB; MW: 5506,5 g/mol; (Oligo 2).

[094] G*C*a*tttigig*ta*t T"C*A--Am-GBB; MW: 4553,6 gimol; (Oligo 3).

B) MODO GERAL DE REAÇÃO: O o o SN Hay + Cod —.> A Oo OD= oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5º C) PROCEDIMENTO GERAL

[095] Em 1 equivalente de oligonucleotídeo, contendo um ligante amino na extremidade 5' ou 3' em DMF (fator de volume: 125 mL/g) e 40 equivalentes de base de Húnig foi adicionado 1,2 equivalente de propionato de N-succinimidila (NSP), resultando em uma suspensão incolor. A mistura foi agitada durante a noite em temperatura ambiente para se tornar uma solução límpida e incolor. O solvente foi removido sob alto vácuo e o resíduo dissolvido em PBS. A mistura bruta foi purificada por HPLC preparativa. As frações desejadas foram transferidas para um sistema de purificação Amicon€& Pro (MWCO: 3.000 Da) e centrifugadas a 4000 rpm. Foi adicionada água Dl e o processo foi repetido 4 vezes mais para concluir uma troca de eluente de HPLC para água. A solução aquosa resultante foi liofiizada para isolar o oligonucleotídeo como um pó incolor com um rendimento na faixa de 47% - 74% e 96% - 99% de pureza.

[096] De acordo com o procedimento geral (1.c.)) os oligonucleotídeos Oligo 1-3 foram conjugados. EXEMPLO 1.D. (CONJUGADO 1)

[097] Prop-5-Am-C6*G*C*a*titigigttat TCA; Rend: 47%, pureza: 99%, MS (m/z): 4577,0 [M-(H)]. EXEMPLO 1.E. (CONJUGADO 2)

[098] G*A*G*tttra*c*tt'g*c*c*a*A*C*T*-Am-GBB-Prop; Rend.: 74%, pureza: 95%, MS (m/z): 5561,6 [M-(H)]. EXEMPLO 1.F. (CONJUGADO 3)

[099] G*C*a*t'tºgigta*t T*C*A*--Am-GBB-Prop; Rend.: 60%, pureza: 96%, MS (m/z): 4662,3 [M-(H)] EXEMPLO 2

CONJUGAÇÃO NÃO RADIOATIVA NO LIGANTE TIOL A) OLIGONUCLEOTÍDEOS UTILIZADOS NOS EXEMPLOS

[0100] 5-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*titig*c"cra*A*C*T*-C6SH; MW: 7709,5 gímol; (Oligo 4).

[0101] G*Cra*tttgrg*ta*t T"C*A*-C6SH; MW: 4537,6 gimol; (Oligo 5).

[0102] G*A*G*ttra*c*ttigrctctaA*C*T*-C6SH; — MW: 5491,5 g/mol; (Oligo 6).

[0103] 5-SH-C6*T*T*A*c*Atottitiata*tt tata TCC; MW: 6742,3 g/mol; (Oligo 7). B) MODO GERAL DE REAÇÃO: o 9 a

XD SOSH + Cs — .a,7?s

O o- oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5' R = metila ou etila C) PROCEDIMENTO GERAL

[0104] Dissolveu-se 1 equivalente de oligonucleotídeo com ligante sulfidrila na extremidade 5' ou 3' em PBS (fator de volume: 250 mL/g). 1,5 equivalentes de maleimida N-alquilada (metil ou etil), dissolvida em DMSO (fator de volume: 1500 mL/g) foram adicionados à solução aquosa e a solução foi agitada à temperatura ambiente por 1 h. A análise por UPLC mostrou uma adição completa de maleimida ao oligonucleotídeo. Para trocar o tampão por água, a mistura de reação foi transferida para um sistema de purificação Amicon& Pro (MWCO: 3.000 Da) e centrifugada a 4000 rpm. Foi adicionada água DI e o processo foi repetido por mais 4 vezes para concluir a troca. À solução aquosa resultante foi liofilizada para isolar o oligonucleotídeo como um pó incolor com um rendimento na faixa de 69% - 81% e 96% - 99% de pureza.

[0105] De acordo com o procedimento geral (2.c) os oligonucleotídeos Oligo 4-7 foram conjugados. EXEMPLO 2.D. (CONJUGADO 4)

[0106] 5-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*titig*c*cra*A*C*T*+-CEsH- NEM; Rend.: 73%, pureza: 99%, MS (m/z): 7833,4 [M-(H)]. EXEMPLO 2.E. (CONJUGADO 5)

[0107] G*C*a*ttttgig*ta*t T"C*A+-C6SH-NEM; — Rend: 73%, pureza: 99%, MS (m/z): 4662,3 [M-(H)]. EXEMPLO 2.F. (CONJUGADO 6) G*Cra*tttrg*g*ta*t T"C*A*-CESH-NMM; Rend.: 81%, pureza: 99%, MS (m/z): 4648,2 [M-(H)]. EXEMPLO 2.G. (CONJUGADO 7)

[0108] G*A*G*ttra*c*titigrc*cta*A*C*T*-CESH-NEM; Rend.: 73%, pureza: 96%, MS (m/z): 5616,2 [M-(H)]. RMN *H (600 MHz, D2O0) 5 ppm 4,11 (br s, 2 H), 4,05 - 4,17 (m, 1 H), 3,75 (br s, 2 H), 3,43 - 3,52 (m, 1 H), 2,80 - 2,91 (m, 1 H), 2,74 - 2,91 (m, 2 H), 1,71 - 1,83 (m, 2 H), 1,61 - 1,77 (m, 2H), 1,44 - 1,59 (m, 2 H), 1,43 - 1,56 (m, 2 H), 1,34 (br s, 3H)

[0109] Dados de RMN limitados ao ligante e ao marcador conjugado com NEM. EXEMPLO 2.H. (CONJUGADO 8)

[0110] G*A*G*tttra*c*ttigrctocta*A*C*T*-CESH-NMM; Rendimento: 69%, pureza: 97%, MS (m/z): 5602,2 [M-(H)] EXEMPLO 2.1. (CONJUGADO 9)

[0111] 5-NEM-SH-— Co*T*T'A*c*Atotttatatttiatta*ct TCC; Rend.: 97%, pureza: 99%, MS (m/z): 6868,7 [M-(H)]. EXEMPLO 3

OLIGONUCLEOTÍDEOS CONJUGADOS RADIOATIVOS EXEMPLO 3.A. (COMPOSTO 1 - [?ºH] BASEADO NO CONJUGADO 2)

[0112] G*A*G*t*tra*c*tttig*c*cta*A*C*T*-Am-GBB-[?H]-Prop.

[100] 370 MBq (10 mCi) de propionato de N-[ºH]succinimidila (17,3 g, 0,079 mol) com uma atividade específica de 3,811 GBq/mmol (103 Ci/mmol) e dissolvido em 2 mL de tolueno foi diluída com 22,8 ug de o propionato de N-succinimidila não radioativo correspondente para atingir uma quantidade total de 40,1 ug (0,234 umol) com uma atividade específica de

1,554 TBq/mmol (42 Ci/mmol). O solvente foi removido por evaporação e o resíduo sólido foi dissolvido em 100 ul de DMF. 0,98 mg (0,167 umol) de Oligo 2, dissolvido em 250 ul de DMF e 1,3 ul (0,97 umol) de DIPEA, foi adicionado em gotas à solução de [?H]NSP e a solução foi agitada durante a noite em temperatura ambiente. UPLC mostrou uma conversão de 40% no produto desejado. A solução da reação foi colocada em um sistema de purificação Amicon& Pro (MWCO: 3.000 Da) e centrifugada a 4000 rpm para alterar o solvente para água/metanol/hexafluoro i-propanol/TEA: 950/25/21/2.3 para a preparação da amostra por HPLC preparativa. Após a prep-HPLC, a fração correspondente foi diluída com PBS e transferida para um sistema de purificação Amicon& Pro (MWCO: 3.000 Da) e centrifugada a 4000 rpm. Foi adicionado PBS e o processo foi repetido 4 vezes mais para atingir uma pureza química de 99%. Volume: 0,55 mL, concentração: 0,32 mg/mL, quantidade: 0,19 mg (rendimento: 19,5 %), atividade: 51,8 MBq (1,4 mCi), atividade específica: 262,7 MBq/mg (7,1 mCi/mg) que é igual a 1,554 TBq/mmol (42 Ci/mmol). EXEMPLO 3.B. (COMPOSTO 2-[?H] BASEADO NO CONJUGADO 4)

[0113] 5-GN2-C6-caG*A*G*t*ta*c*ttg"o*cta*A*C*T*-CESH-[?H]- NEM.

[100] 370 MBq (10 mCi) de N-[ºH]etil maleimida (20,5 g, 0,159 pmol) em 4 mL de pentano foi concentrada sobre uma coluna pré-embalada de sílica-gel e eluído com 2 x 0,5 mL de DMSO. Uma solução de Oligo 4 (1,02 mg, 0,132 umol) em 1 mL de PBS foi adicionada e agitada por 1 h à temperatura ambiente. A análise por UPLC mostrou 20% do produto desejado. NEM não radioativo (166 ug, 1,32 umol) foi adicionado e agitado à temperatura ambiente por 1 h. A HPLC mostrou uma adição completa ao produto desejado. A solução da reação foi transferida para um tubo Float-A-Lyzerº de 5 mL (MWCO: 500- 1000 Da) e foi dialisada contra PBS, pH 7,1 à temperatura ambiente. O tampão foi trocado por 4 vezes após 45 minutos e armazenado durante a noite em geladeira. UPLC mostrou uma pureza radioquímica de 93%. Volume: 2,9 mL, concentração: 0,33 mg/mL, quantidade: 0,95 mg (rendimento: 92%), atividade: 33,7 MBq (0,91 mCi), atividade específica: 35,5 MBq/mg (953 uCi/mg) que é igual a 0,3 TBg/mmo!l (7,9 Ci/mmol). EXEMPLO 3.C. (ComPosTO 3-[?H] BASEADO NO CONJUGADO 7)

[0114] G*A*G*t*tra*c*tttºg"c*cta*A*C*T*-CESH-[?H]-NEM.

[100] 1,1 GBq (30 mCi) de N-[?H]etil maleimida (61,5 g, 0,477 pmol) em 12 mL de pentano foi concentrada sobre uma coluna pré-embalada de sílica-gel e eluído com 2 x 0,5 mL de DMSO. Uma solução de Oligo 6 (2,20 mg, 0,401 umol) em 1 mL de PBS foi adicionada e agitada por 1 h à temperatura ambiente. A análise por UPLC mostrou 40% do produto desejado. NEM não radioativo (502 ug, 4,01 umol) foi adicionado e agitado à temperatura ambiente por 1 h. A HPLC mostrou uma adição completa ao produto desejado. A solução da reação foi transferida para um tubo Float-A-Lyzerº de 5 mL (MWCO: 500-1000 Da) e foi dialisada contra PBS, pH 7,1 à temperatura ambiente. O tampão foi trocado por 4 vezes após 45 minutos e armazenado durante a noite em geladeira. A UPLC mostrou uma alta proporção de impureza polar. A solução foi colocada em um sistema de purificação AmiconO&O Pro (MWCO: 3.000 Da) e centrifugada a 4000 rpm. Foi adicionado PBS e o processo foi repetido 4 vezes mais para atingir uma pureza química de 99%. Volume: 1,0 mL, concentração: 1,58 mg/mL, quantidade: 1,58 mg (rendimento: 70%), atividade: 163 MBq (4,4 mCi), atividade específica: 104 MBq/mg (2,8 mCi/mg) que é igual a 614 MBq/mmol (16,6 Ci/mmol).

EXEMPLO 3.D. (ComPOSTO 4-[?H] BASEADO NO CONJUGADO 9)

[0115] 5-PH-NEM-SH-C6*T*T*A*c*A*c*titrata*tita*ta"ot TCC.

[100] 370 MBq (10 mCi) de N-[?H]etil maleimida (20,5 ug, 0,159 upmol) em 4 mL de pentano foi concentrada sobre uma coluna pré-embalada em sílica-gel e eluída com 2 x 0,5 mL de DMSO, e adicionada em gotas em uma solução de Oligo 7 (1,13 mg, 0,168 umol) em 0,5 mL de PBS e a mistura foi agitada por 1,5 h à temperatura ambiente. A UPLC mostrou 45% do produto desejado e 55% do material de partida. NEM não radioativo (210 ug, 1,68 upmol) foi adicionado e agitado à temperatura ambiente por 1 h. A HPLC mostrou uma adição completa ao produto desejado. A solução de reação foi transferida para um sistema de purificação Amicon& Pro (MWCO: 3.000 Da) e centrifugada a 4000 rpm. Foi adicionado PBS e o processo foi repetido 4 vezes mais para atingir uma pureza química de 99%. Volume: 1,0 mL, concentração: 1,80 mg/mL, quantidade: 1,07 mg (rendimento: 93%), atividade: 71 MBq (1,91 mCi), atividade específica: 67 MBq/mg (1,8 mCi/mg) que é igual a 481 MBq/mmol (13,0 Ci/mmol). EsTuDO DE EXPOSIÇÃO TECIDUAL DE LNA NÃO MARCADO E MARCADO COM TRÍTIO - UM EsTUDO DE VIABILIDADE

[101] Os estudos foram realizados com os seguintes compostos: -5'-GN2-C6-ca G*A*G*tttiatc*ttigic*cta*A“C*T*-3' (composto A do estudo GalNAc LNA); 5- GrA*G*Ftra*c*tt gica A*C*T*-3' (composto A do estudo LNA); 5"-GN2-C6-caG*A*G*t*t*a*c*t*t*g"c*c*a*A*C*T*-CESH-[?PH]-NEM (=Exemplo 3.b) ; 5-G*A*G*ttra*tc*tttig"c*cta*A*C*T*-CESH-[PH-NEM — (=Exemplo

3.c).

[102] Foi realizado um experimento de PK de dose única com o composto do Exemplo 3.b (composto 2-[º?H] baseado no conjugado 4) e Exemplo 3.c (composto 3-[?H] baseado no conjugado 7) a 1 mg/kg. Os LNAs foram analisados no fígado 24, 72 e 336 horas após a administração. O estudo confirmará a viabilidade de oligonucleotídeos com conjugação radioativa. PARTE EXPERIMENTAL PARA ESTUDO /N VIVO: PREPARAÇÃO DA SOLUÇÃO DE ESTOQUE, PADRÕES DE CALIBRAÇÃO E VERIFICAÇÕES DE QUALIDADE.

[103] Foram feitas diluições seriadas a partir da solução-estoque (aprox. 1 mg/mL em água grau PCR, a concentração exata da solução-estoque será quantificada com o dispositivo espectrofotométrico Nanodrop (Thermo Scientific) com base no coeficiente de extinção a 260 nm) para gerar soluções de trabalho em água a partir de aprox. 100 ng/mL até aprox. 250.000 ng/mL.

[104] Essas soluções de trabalho foram usadas para preparar o plasma seguindo este procedimento: Solução de trabalho de 1 uL foi adicionado a 49 ul de plasma de modo a criar amostras de calibração e amostras de controle de qualidade em 4 níveis de concentração no plasma.

MÉTODO DE EXTRAÇÃO

[105] Os padrões de calibração e as amostras de controle de qualidade (preparadas no momento do uso em plasma, 50 uL) foram tratados por desnaturação da proteína com 150 uL de tiocianato de guanidina 4M após a adição do padrão interno. Após mistura vigorosa (20 min a 1600 rpm), 200 ul de uma solução de água/hexafluoroisopropanol/di-isopropiletilamina (100:4:0,2, víviv) foram adicionados, seguidos de mistura (15 min a 1500 rpm). Em seguida, uma etapa de limpeza foi realizada por meio de cartuchos de extração em fase sólida (Waters, OASIS HLB 5 mg, 30 um), e após eluição e evaporação até a secura (30-45 min a +40ºC) as amostras foram reconstituídas em 200 4u7l de fase móvel (água/metanol/hexafluoroisopropanol/di- isopropiletilamina (95/5/1/0,2, víiv/ív/v)). Após a mistura utilizando um agitador vortex (10 min a 1500 rpm), uma alíquota (20 uL) foi injetada em um sistema LC-MS/MS (com loop de 50 uL).

Descrição Do MÉTODO DE LC-MS/MS

[106] Foi utiizada uma bomba Shimadzu 30ADXR, equipada com uma coluna Waters Acquity C18 (50 x 2,1 mm) a 60ºC. Os analitos e o padrão interno foram separados das interferências da matriz utilizando gradiente de eluição com água/metanol/hexafluoroisopropanol/di- isopropiletilamina (95/5/1/0,2, vivivlv) em água/metanol/hexafluoroisopropanol/di-isopropiletilamina (10/90/1/0,2, viviviv) dentro de 4,0 min a uma velocidade de fluxo de 0,4 mL/min.

[107] A detecção espectrométrica de massa foi realizada em um espectrômetro de massa AB-Sciex Triple Quad 6500* usando SRM no modo de íon negativo.

CONTAGEM DE CINTILAÇÃO LÍQUIDA (LSC)

[108] Foi utilizado um dispositivo Packard Tri-carb 3100TR para análise de LSC.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[109] Na Fig. 1 as concentrações hepáticas de um composto A do estudo GalNAc LNA (linha tracejada) e de um composto A do estudo sem GalNAc (linha contínua) foram analisadas por LC-MS/MS. O LNA marcado com GalNAc mostra como esperado uma alta captação inicial no fígado e uma diminuição normal ao longo do tempo. Da mesma forma, o LNA nu, ou seja, LNA sem GalNAc, mostrou um nível mais baixo de captação.

[110] Na Fig. 2 as concentrações hepáticas dos compostos marcados com trítio do Exemplo 3.b (linha tracejada) e Exemplo 3.c (linha contínua) foram analisadas por LSC. Esta figura mostra, que o composto GalNAc radiomarcado, apesar da conjugação de maleimida, possui uma captação hepática equivalente a de um LNA GalNAc terapêutico (Fig.1).

[111] Os efeitos de PD são comparáveis entre os oligonucleotídeos não marcados e radiomarcados. As medições da concentração de LNA no fígado da radioatividade por LSC são semelhantes aos LNAs terapêuticos, determinadas por LC-MS/MS.

[112] A Figura 2 ilustra de maneira impressionante a alta especificidade dos compostos oligonucleotídicos radiomarcados da presente invenção.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO de Fórmula |: N oH OLLO. Oo. | Q drsdonsnenta — ligante 2 4 “P pro ligante 1 < ao receptor ó H | | n x | OQ = extremidade 3' ou 5' do oligonucleotideo caracterizado por: nserOou1l;e X' e X?, independentemente um do outro, é S ou O; o ligante 1 é uma ponte (ligação) de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula: At OH : m em que m é um número inteiro de 1 a 6; o ligante 2 opcionalmente é uma ponte de amino alquileno—C>2- 12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte amino etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol!; Q representa um resíduo de Fórmula 2a ou 2b: Oo Lele :H 2a ou o R : O >s 2b em que R" e R2' são grupos alquila-C1-6 radiomarcados; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo.

2. OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por Q ter a Fórmula 2b e a conjugação estar na extremidade 3' ou 5' do oligonucleotídeo.

3. OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por Q ter a Fórmula 2a e a conjugação estar na extremidade 3' ou 5' do oligonucleotídeo.

4, OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado por R' e RX serem um grupo alquila-Ci4, preferencialmente um grupo metila radiomarcado ou grupo etila radiomarcado.

5. OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pela marcação radioativa ser uma marcação de ?H ou uma marcação de *“*C, de preferência uma marcação de *H.

6. OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo oligonucleotídeo compreender uma sequência nucleotídica contígua de 7 a nucleotídeos que consiste em monômeros de nucleosídeo de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos.

7. OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, de Fórmula lb: 2* o R

RN o o SF PO > ligante 1 s

JR Ho XR O& = oligonucleotideo, extremidade 3' ou 5º b caracterizado por R2', X? e ligante 1 serem conforme acima.

8. OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, de Fórmula lc: ” 1 R x OH o | | N Porção de | OVON5 3 0! o o direcionamento — f— ligante2 É “P Do NpA = ligante 1 x ao receptor d , | S k Q = oligonucleotídeo caracterizado por R?, X* e X?, ligante 1 e ligante 2 serem conforme definidos acima.

9. OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pela porção de direcionamento ao receptor ser uma porção não nucleotídica, preferencialmente uma porção que visa o receptor de asialoglicoproteína, mais preferencialmente um grupo GalNAc de Fórmula VII:

Rº o A o. > NS HsG o d- o É H A AH, 3 N HN. o o o o 327º MA o

R CH N o N YE A“ CASSA H o Jo

A ; AE R O. o ” À N CH; vI R O. Dê em que R? é hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxi e n representa um número inteiro de O a 10, preferivelmente de 0 a 5, mais preferencialmente de 1 a 3, sendo mais preferido 2, os seus sais correspondentes, enantiômeros e/ou um estereoisômero do mesmo.

10. —OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, de Fórmula ld: x o | Oo o CT 1 ligante 1 she oH H OD = oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5º d caracterizado por R*, X? e ligante 1 serem conforme definidos acima.

11. — OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado por ter uma atividade específica de 37 GBq/mmol (1 Ci/mmol) a 3,7 TBq/mmol (100 Ci/mmol), preferencialmente de 111 GBa/mmol (3 Ci/mmol) a 1,85 TBqg/mmol (50 Ci/mmol), mais preferencialmente de 185 GBq/mmol (5 Ci/mmol) a 740 GBq/mmol (20 Ci/mmol).

12. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO de Fórmula |, caracterizado por Q representar o resíduo de Fórmula 2a compreendendo a conjugação de uma amina de Fórmula Ill: x OH ligante 2 oo odo. ligante 1 petite ao receptor du lt n " O =oligonucleotídeo, extremidade 3º ou 5º em que, néboul.

X' e X?, independentemente um do outro, são S ou O; o ligante 1 é uma ponte (ligação) de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula: Ae “OH m em que m é um número inteiro de 1 a 6;

o ligante 2 opcionalmente é uma ponte de amino alquileno—C2-12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte amino etilenoglico! contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção não nucleotídica que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo, particularmente uma porção que visa o receptor de asialoglicoproteína, de preferência, um grupo GalNAc; com um composto succinimida radiomarcado de Fórmula IV: / Oo Cro o

N em que R" é conforme definido acima.

13. PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE UM OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO de Fórmula |, caracterizado por Q representar o resíduo de Fórmula 2b compreendendo a conjugação de um tiol de Fórmula V: x oH E Iene 2 Io ol.o ligante 1 2! ao receptor de le n v O =oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5º em que, néboul X' e X?, independentemente um do outro, são S$ ou O; o ligante 1 é uma ponte (ligação) de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglico! contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de

71H glicerol de Fórmula: Fe “OH m em que m é um número inteiro de 1 a 6; o ligante 2 opcionalmente é uma ponte de amino alquileno—C2-12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte amino etilenoglico! contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção não nucleotídica que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo, particularmente uma porção que visa o receptor de asialoglicoproteína, de preferência, um grupo GalNAc; com um composto maleimida radiomarcado de Fórmula VI: 2º Cor

O

VI em que R?' é conforme definido acima.

14. USO DO OLIGONUCLEOTÍDEO RADIOMARCADO de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 caracterizado por ser para a determinação da biodistribuição e farmacocinética do oligonucleotídeo no tecido ou fluido corporal.

15. MÉTODO PARA DETERMINAR A BIODISTRIBUIÇÃO E FARMACOCINÉTICA de um oligonucleotídeo no tecido ou fluido corporal, caracterizado por compreender: a) a administação de uma quantidade eficaz de oligonucleotídeo radiomarcado de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 no tecido ou fluido corporal a ser examinado; e b) a medição da biodistribuição e farmacocinética do oligonucleotídeo — radiomarcado, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 11, no tecido ou fluido corporal e, opcionalmente, c) a realzaçção da imagiologia do oligonucleotídeo radiomarcado de qualquer uma das reivindicações de 1 a 11 no tecido ou fluido corporal por autorradiografia.

16. — OLIGONUCLEOTÍDEO de Fórmula X: í oH à O O. | caso |— ligante 27 PS Ox pro ligante 1 O ao receptor du | n x x O& =oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5' caracterizado por: nserOout;e X' e X?, independentemente um do outro, é S ou O; o ligante 1 é uma ponte (ligação) de alquileno-C2-12, uma ponte de etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol ou uma ponte à base de glicerol de Fórmula:

FO OH : m em que m é um número inteiro de 1 a 6; o ligante 2 opcionalmente é uma ponte de amino alquileno—C2-12 protegida por um grupo amino pelo grupo amino, uma ponte amino etilenoglicol contendo 1 a 10 unidades de etilenoglicol; Q designa um resíduo de Fórmula 2a' ou 2b':

No)

SR :H 2a' ou o R ; O >s 2b' em que R' e R? são grupos alquila-C1-6; e a porção de direcionamento ao receptor é uma porção que adiciona funcionalidade adicional ao oligonucleotídeo.

17. “OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por Q ter a Fórmula 2b' e a conjugação estar na extremidade 3' ou 5' do oligonucleotídeo.

18. —“OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com a reivindicação 16 ou 17, caracterizado por Q ter a Fórmula 2a' e a conjugação estar na extremidade 3' ou 5' do oligonucleotídeo.

19. . OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 18, caracterizado por R' e R? serem um grupo alquila-C1-4, preferencialmente um grupo metila ou etila.

20. —“OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 19, caracterizado pelo oligonucleotídeo compreender uma sequência nucleotídica contígua de 7 a 30 nucleotídeos que consiste em monômeros de nucleosídeos de DNA, RNA ou LNA opcionalmente modificados ou combinações dos mesmos.

21. “OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 20, de Fórmula Xb:

o

N SS o FP gates,

NX Ho O =oligonuclentídeo, extremidade 3 ou 5 Xb caracterizado por R?, X? e ligante 1 serem conforme acima.

22. — OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 21, de Fórmula Xc: 2 1 R X OH oO | | À Porção de ; 00.5 3-0 O O direcionamento | ligante 2 Pp Di “pros ligante 1 ao receptor | | Ss OH x Xe | , O = oligonucleotídeo caracterizado por R?, Xº e X?, ligante 1 e ligante 2 serem conforme acima.

23. —“OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 22, caracterizado pela porção de direcionamento ao receptor ser uma porção não nucleotídica, preferencialmente uma porção que visa o receptor de asialoglicoproteína, mais preferencialmente um grupo GalNAc de Fórmula VII:

nº / RR o À No O. R H3G P ds o. o H o o n - 3 N HN. O: o o. o ão OA e À CH; H E º XY É) H o o

AC

IA ; A R o o o o À, % N a vI R o.

NE em que R? é hidrogênio ou um grupo protetor de hidroxi e n representa um número inteiro de O a 10, preferivelmente de O a 5, mais preferencialmente de 1 a 3, sendo mais preferido 2, os seus sais correspondentes, enantiômeros e/ou um estereoisômero do mesmo.

24. —“OLIGONUCLEOTÍDEO, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 16 a 23, de Fórmula Xd:

É o o o

SL CC ' = ligante 1 sh oH H OD = oligonucleotídeo, extremidade 3' ou 5º xd caracterizado por R', X? e ligante 1 serem conforme definidos acima.