PT1414961E - Novos derivados oligorribonucleotídeos para a inibição orientada da expressão genética - Google Patents

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DESCRIÇÃO "NOVOS DERIVADOS OLIGORRIBONUCLEOTÍDEOS PARA A INIBIÇÃO ORIENTADA DA EXPRESSÃO GENÉTICA" A presente invenção refere-se a novos derivados oligorribonucleotídeos, que apresentam no terminal 3' um residuo oligorribonucleotideo ligado a 2'5' sem residuo 5'-fosfato e sua utilização para a inibição orientada da expressão genética. A inibição da expressão genética com auxilio de ácidos nucleicos sintéticos ganhou um significado crescente. Representantes tipicos destes ácidos nucleicos sintéticos (oligonucleotideos) são oligonucletídeos anti-sentido, ribozimas, enzimas de ADN e sequências de guia externa (EGS). Os "oligonucleotideos anti-sentido" são derivados de ácidos nucleicos de cadeia única curta, que se ligam através de um emparelhamento de bases de Watson-Crick a um ácido ribonucleico mensageiro (ARNm) complementar, cuja tradução deve inibir a proteína correspondente. Na maioria dos casos, os oligonucleotideos anti-sentido desenvolvem a sua actividade de acordo com um mecanismo que é apoiado pela ribonuclease H celular (RNase Η), o que é provado por inúmeros estudos. A Rnase H que ocorre em todas as células, reconhece uma cadeia dupla do ADN e ARN e corta o ARNm complementar ao oligonucleotideos através de hidrólise de uma, ou frequentemente, várias ligações fosfodiéster. É conhecido como os oligonucleotideos têm de ser modificados, de maneira a poder ocorrer uma activação da RNase H. Isto é descrito, por exemplo, em "Uhlmann (2000) Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 3, 203-213". As 1 ribozimas sintéticas trazem esta actividade da nuclease na sua sequência. Os tipo mais conhecido de ribozima são os designados ribozimas "Hammerhead", nos quais a sequência de consenso GAAAC, derivada de ribozimas que ocorrem naturalmente, forma a parte da RNase e as sequências flanqueadoras formam a parte do oligonucleotideo anti-sentido. As enzimas de ADN actuam de forma semelhante, que não derivam efectivamente de motivos de ribozima que ocorrem naturalmente, mas foram encontradas através de selecção in vitro. EGS são análogos de ARN sintéticos, os quais activam a RNase P celular e que se ligam através das sequências flanqueadoras correspondentes ao ARNm alvo e que iniciam uma decomposição especifica de ARNm.

Um problema conjunto da inibição da expressão genética com auxilio de oligonucleotideos sintéticos consiste no facto de um grande número de oligonucleotideos ter de ser testado sempre contra diferentes dominios do ácido nucleico alvo, de maneira a identificar uma sequência eficiente. Além disso, a inibição da expressão genética através de oligonicleotideos anti-sentido ocorre frequentemente apenas de forma ineficiente ou incompleta. Adicionalmente foram observados efeitos secundários inespecificos da sequência, que podem depender do facto de partes de sequência relativamente curtas de um comprimento de aproximadamente cinco bases já activarem a RNase H. Isto é mostrado, por exemplo, por "Woolf et al. (1992). Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 89,7305-7309)". Existem porém também efeitos secundários que são devidos a interaeção dos oligonucleotideos anti-sentido com proteínas.

Recentemente foi descrita a utilização de ARN de cadeia dupla para a inibição da expressão genética. O ARN de cadeia dupla (ARNds) é para determinadas células e organismos um sinal, 2 para iniciar uma decomposição, especifica da sequência, do ARNm de acordo com um processo que é conhecido como interferência de ARN (ARNi) . Este fenómeno do ARNi foi observado numa série de diferentes organismos, como por exemplo, C. elegans, moscas, fungos, plantas e embriões de ratinhos. Pensa-se que o ARNi é muito semelhante ou igual ao gene silenciador pós-transcripcional (PTGS) observado nas plantas. Através da simples injecção de ARNds com um comprimento de mais de 500 pares de bases (pb), cuja sequência de cadeia de sentido é idêntica com o ARNm alvo a ser inibido, podendo a expressão de um gene alvo ser inibida especificamente com a correspondente sequência de ADN. A expressão genética de genes não homólogos não é aqui afectada. A sequência de bases do gene alvo não é aqui modificada. O ARNi é um processo pós-transcripcional, no qual o ARNds é em primeiro lugar clivado em fragmentos mais pequenos, os quais possivelmente, encontram depois utilização para a decomposição, especifica da sequência, do ARNm alvo.

Até agora foi conseguida uma inibição eficiente da expressão genética principalmente com ARNds de mais de 100 pb de comprimento. Este ARNds relativamente comprido é apenas acessível através de transcripção in vitro ou in vivo a partir de ADN correspondente em sistemas de transcripção adequados. Uma outra limitação do ARNi com ARNds comprido consiste em que apenas determinados organismos, como c. elegans, peixe zebra, plantas, determinados tipos de fungos, drosófilas, oócitos e embriões de ratinhos, permitem a inibição específica da sequência com ARNds, enquanto a maioria das células animais desenvolvem apoptose por tratamento com ARNds. Para ARNds comprido é também ainda observada uma inibição da expressão genética, se a homologia da sequência for 70 até 90%. Assim podem, para famílias genéticas com elevada homologia nas 3 sequências, ocorrer erros de interpretação do fenótipo, em que a expressão de vários genes, não completamente homólogos, é simulataneamente inibida. 0 tratamento de células com ARNds, como por exemplo, com ARNds de virus, conduz, em geral, a um processo apoptópico ou à decomposição do ARNm não especifica da sequência em consequência da indução de uma actividade da sintetase de 2'5'-oligoadenilato.

Como resposta ao ARNds virai, a célula infectada sintetiza trimeros ou tetrameros de adenilato (2'5'-A) com a ponte internucleosidica não habitual de 2'5'-fosfodiéster. 0 2'5'-A é fosforilado através de cinases celulares no terminal 5' e activa depois uma nuclease, que é designada de RNase L. Também se pode sintetizar quimicamente o 2'5'-A e conduzi-lo à célula (Torrence et al. (1994) Curr. Med. Chem 1, 176-191). 0 2'5'-A sintético activa a RNase-L mas apenas quando fôr convertido ao 5'-fosfato ou 5'-trifosfato. A RNase L activada através do 5,-p-2'5'-A (p significa fosfato, difosfato ou trifosfato) decompõe depois todo o ARN da célula de uma forma não específica da sequência.

Também foi mostrado que com auxílio de conjugados de oligonucleotídeo anti-sentido com um resíduo de 5'-p-2'5'-A se pode inibir a expressão genética de forma específica da sequência.

Porém, é essencialpara esse efeito que o terminal 5' do resíduo 2'5' não esteja ligado com o oligonucleotídeo, mas que exista na forma de fosfato, tiofosfato ou trifosfato (Torrence et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 90, 1300-4). Além disso, a parte do oligonucleotídeo que reconhece o ARN alvo 4 (parte anti-sentido) tem de existir na forma de cadeia única. Os oligonucleotideos com resíduos 2'5'-A nos terminais 3', que consequentemente não apresentam nenhuma função livre 5'-fosfato ou trifosfato, não foram até agora descritos para a inibição da expressão genética pelas razões acima mencionadas. A inibição da expressão genética com os conjugados de cadeia única de oligonucleotideos com anti-sentido 5'-p-2'5'-A, 5'-fosforilados, é uma variação do princípio de anti-sentido e está assim também sujeita às limitações da mistura anti-sentido-oligonucleotídeo. 0 resíduo 2'5'-A é preso aqui através de um ligante (Linker) ao terminal 5' do oligonucleotideo, de maneira que o terminal 2' ou 3' do resíduo 2'5'-A exista ligado. A parte que se liga do ARN consiste, de um modo preferido, por ADN (figuras 4 até 6 em Torence, Curr. Opin. Mol. Ther. (1999) 1, 307).

Ultimamente são utilizados de forma crescente, oligonucleotideos, como instrumentos para o estudo da função de novos genes (genómica funcional). A utilização de oligonucleotideos anti-sentido e ribozimas para a inibição específica da sequência da expressão genética de novos genes, que codificam proteínas de função desconhecida é dificultada, por em geral, ser necessário testar muitos oligonucleotideos diferentes de sequências variadas, o que em especial é impeditivo em grande magnitude.

Assim o documento US 5886165 publica oligonucleotideos a partir de desoxirribonucleotideos com ligações 3'-5' e ribonucleotideos com ligações 2'— 3'. O documento WO 00/04189 publica oligonucleotideos modificados com pelo menos menos uma ligação 2'— 5' . 5 0 objectivo desta invenção consistiu assim em disponibiliar novos oligonucleotideos modificados quimicamente com uma melhoria significativa da inibição da expressão genética, os quais evitam as limitações acima mencionadas dos métodos e agentes convencionais. A expressão genética devia em especial, ser inibida num processo similar à interferência de ARN. 0 objectivo foi resolvido de acordo com a invenção através de novos derivados oligonucleotideos que apresentam no terminal 3' um residuo de oligonucleotideo ligado a 2'5', em que este não possui nenhum grupo fosfato, tiofosfato ou trifosfato livre. A sequência dos novos derivados de oligonucleotideo é complementar à sequência de ARN, cuja tradução deve ser inibida. A invenção refere-se assim a derivados de oligonucleotideos da fórmula I,

5' — (N) χ—(Z)n fórmula I em que N são ribonucleotideos que ocorrem naturalmente ou não naturalmente, que são pelo menos parcialmente complementares a um ARN alvo, x é independentemente igual a 10 até 100, de um modo preferido 15 até 45, e de um modo especialmente preferido 16 até 25, n é igual a 2 até 20, de um modo preferido 3 até 10, de um modo especialmente preferido 3 até 6, 6 Z são nucleotideos que ocorrem naturalmente ou não naturalmente, que estão ligados com uma ligação 2'5'-internucleosídica, com a condição que os seus homólogos ARN alvo apresentem o seguintes padrões de sequência: 5'-(U)v-(N')z-(U)w 5 ' —(U)v—(Ν')Z-UX 5'-UX-(N')Z-UX e 5 ' - (U) v- (N' ) z em que v e w independentemente um do outro são iguais a 2 até 20, de um modo preferido 2 até 10, de um modo especialmente preferido 3 até 6 e z é igual a 15 até 25, de um modo preferido 16 até 23 e de um modo especialmente preferido 19 até 21 e U é igual a uridina, N é igual a adenosina (A), guanosina (G), citidina (C) ou U, e X é igual a A, G ou C, de um modo preferido A. N pode ser um ribonucleotídeo numa forma de realização preferida.

Se o gene cuja expressão deve ser inibida contiver, por exemplo, a seguinte sequência de ADN 5i-TTTTGAAGCGAAGGTTGTGGATCTG (Seq ID N° 1)

ou a seguinte sequência de ARN 5'-UUUUGAAGCGAAGGUUGUGGAUCUG (Seq ID N° 2) então o ARN alvo tem o seguinte padrão de sequência 5'-(U) v~ (N) Z-UX, em que v é igual a 4, z é igual a 19 e X é igual a G. 7

Além disso, são preferidos oligonulceotídeos da fórmula I, nos quais uma ou várias ligações fosfodiéster são substituídas, por exemplo, através de ligações fosforotioato ou ligações N3',P5'-fosforamidato. São especialmente preferidos oligonucleotídeos da fórmula I, nos quais uma ou várias ligações fosfodiéster estão substituídas por resíduos de fosforotioato. A introdução dos resíduos de fosforotioato decorre, de um modo preferido, nos terminais 3', nos terminais 5', bem como nos nucleotídeos C e U pirimidínicos internos, em especial quando, vários nucleotídeos pirimidínicos se sucederem uns depois dos outros na sequência.

Uma forma de realização especial da invenção consiste em serem utilizados dois ou vários derivados oligonucleotídeos, de acordo com a fórmula I, como mistura para a inibição da expressão genética. Aqui, os derivados oligonucleotídeos podem ser orientados contra diferentes regiões de um ARN ou contra o ARN de diferentes genes.

Os oligonucleotídeos de cadeia única da fórmula I foram utilizados originalmente como oligonucleotídeos de controlo para experiências de ARNi com ARNds curto. Devido ao carácter de cadeia única não era esperada assim uma inibição da expressão genética. De forma surpreendente porém, determinados oligonucleotídeos de cadeia única inibiram também a expressão, especialmente quando estes apresentavam uma estabilidade suficiente relativamente a nucleases. Foi também surpreendente que os oligonucleotídeos da fórmula I, nos quais o resíduo de oligodenilato ligado a 2'5' não apresenta nenhum resíduo 5'-fosfato, 5'-tiofosfato ou 5'trifosfato livre, inibissem de forma específica da sequência a expressão genética. Também foi completamente surpreendente que aqui o resíduo de oligodenilato 8 ligado a 2'5' através da função 5' possa estar directamente ligado ao ARN ligado a 3'5' . Até agora era válido o dogma que o resíduo de oligoadenilato ligado a 2'5' tivesse possuir no terminal 5' um resíduo fosfato, tiofosfato ou trifosfato livre, de maneira a inibir a expressão genética.

Além disso associou-se até agora uma inibição mediada por 2'5'-oligoadenilato sempre com um efeito não específico, ou seja independente da sequência (Bass, Nature (2001) 411, 428) . É assim evidente que os oligonucleotídeos da fórmula I não só variam na sua estrutura dos conjugados de oligonucleotídeos descritos por Torrence (Curr. Opin. Mol. Ther. (1999) 1, 307), mas além disso mostram um efeito inibidor muito melhor que assenta por conseguinte noutro mecanismo de actividade.

De forma surpreendente os oligonucleotídeos de acordo com a invenção foram efectivos na inibição de forma específica da sequência, também em células humanas primárias. Tanto quanto sabemos não foi até agora observada a inibição da expressão genética em células humanas primárias, através de oligonucleotídeos com nucleotídeos ligados em 2'5'.

Os oligonucleotídeos da fórmula I de acordo com a invenção podem também ser utilizados para a inibição da expressão genética em células, que exprimem apenas pouca, nenhuma ou defeituosa sintase de 2'5'-oligoadanilato.

Além disso, os oligonucleotídeos da fórmula I podem também ser utilizados para o tratamento de doentes com uma deficiência ou um defeito da sintase de 2'5'-oligoadenilato. Por exemplo, podem ser também tratados doentes com CFS síndroma da fadiga crónica). 9 A selecção das sequências dos oligonucleotídeos da fórmula I, que são utilizados para a inibição da expressão genética de determinados alvos, decorre com base nas correspondentes sequências genéticas. As sequências destes genes são obtidas através de sequenciação ou a partir de bancos de dados genéticos. Como exemplo, seja aqui elucidada a inibição da luciferase (de pirilampo) com ácidos nucleicos de cadeia dupla. 0 número de acesso para este gene é U47298. 0 domínio de codificação da luciferase de pirilampos compreende 1653 nucleotídeos. Podem ser seleccionados por exemplo, entre outros, os seguintes quatro domínios como sequências alvo para a inibição com ácidos nucleicos de cadeia dupla. gcttttacagatgcacatatcgaggtggacatcacttacg 121 ----------1-----------1-----------1-----------1~ 160 cgaaaatgtctacgtgtatagctccacctgtagtgaatgc (Seq. ID N° 3) ccgcgaacgacatttataatgaacgtgaattgctcaacag 311 ---------+---------+---------+---------+ 350 ggcgcttgctgtaaatattacttgcacttaacgagttgtc (Seq. ID N° 4) gcggtcggtaaagttgttccattttttgaagcgaaggttg 1081---------+---------+---------+---------+ 1120 cgccagccatttcaacaaggtaaaaaacttcgcttccaac (Seq. ID N° 5) attttttgaagcgaaggttgtggatctggataccgggaaa 1101---------+---------+---------+---------+ 1140 taaaaaacttcgcttccaacacctagacctatggcccttt (Seq. ID N° 6) 10 0 ARN correspondente para estes domínios tem então a seguinte sequência. GCUUUUACAGAUGCACAUAUCGAGGUGGACAUCACUUAGC (Seq. ID N° 7) CCGCGAACGACAUUUAUAAUGAACGUGAAUUGCUCAACAG (Seq. ID N° 8) GCGGUCGGUAAAGUUGUUCCAUUUUUUGAAGCGAAGGUUG (Seq. ID N° 9) AUUUUUUGAAGCGAAGGUUGUGGAUCUGGAUACCGGGAAA (Seq ID N° 10)

Os oligonucleotídeos complementares da fórmula I de acordo com a invenção derivados destes têm as seguintes sequências e são caracterizados por dois ou vários nucleotídeos (aqui indicados com letra minúscula) estarem ligados através de uma ligação internucleosídica 2'5'. São preferidos resíduos de adenilato ligado a 2'5'.

Seq ID N° 11 Seq ID N° 12 Seq ID N° 13 Seq ID N° 14

3' aaaaAUGUCUACGUGUAUAGCUCCAC 3'aaaaAUAUUACUUGCACUUAACGAG 3'aaaaCCAUUUCAACAAGGUAAAAAA 3'aaaaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC

Os oligonucleotídeos podem também ser modificados para melhorar a estabilidade metabólica, por exemplo, como fosforotioato (estrelinhas). A estabilização através de fosforotioato decorre, de um modo preferido, nos terminais e nos nucleotídeos pirimidínidos internos. 11

3'a*a*a a-C*U*U*C G C*U*U C*C A A*C A C*C*U A G A*C A especificidade da inibição da expressão da luciferase pode ser testada com base em oligonucleotídeos de controlo, que não são completamente complementares para o ARN alvo e apresentam, por exemplo, 4 bases erradamente emparelhadas.

3'a*a*a a C*U*U*C U*C U*U*C A A C*C A*C*C G A*G A*C

Seq ID N° 15

Oligonucleotídeos da fórmula I têm, por exemplo a seguinte estrutura:

em que B é uma base nucleotidica que ocorre naturalmente ou não naturalmente, U, V e W independentemente uns dos outros são 0, S, NH ou CH2, de um modo preferido 0 ou S, 12 R1 é independentemente uns dos outros OH, SH, CH3 ou BH3, de um modo preferido OH ou SH, ou seus sais fisiologicamente aceitáveis R2 é independentemente uns dos outros OH, H, O-alquilo-Ci até C12, de um modo preferido OH (ribonucleotideo) , em que alquilo-Ci até C12 é de um modo preferido CH3 ou CH3-0-CH2CH2, R3 é independentemente uns dos outros OH, H, O-alquilo-Ci até C32, de um modo preferido OH ou H, em que alquilo-Ci até C32 é de um modo preferido CH3 ou CH3-0-CH2CH2, x é independentemente igual a 10 até 100, de um modo preferido 15 até 45, e de um modo especialmente preferido 16 até 25, n é igual a 2 até 20, de um modo preferido 3 até 10, de um modo especialmente preferido 3 até 6, A significa adenina ou um derivado de adenina, por exemplo, 8-bromoadenina, 8-metiladenina ou hipoxantina.

Para testar a inibição da expressão genética com auxilio dos oligonucleotideos de acordo com a invenção em células animais, em especial em células humanas primárias, estas são orientadas, por exemplo, contra um gene humano ou ao ARN correspondente e testadas em células humanas (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells) . Para este efeito pode ser transcrito, por exemplo, o ADN Edg-1 (número de acesso M31210) do banco de dados genéticos no correspondente ARN mensageiro e serem seleccionados os dois domínios (175 e 725) seguintes para a síntese dos correspondentes oligonucleotideos. 13 ARN edg-1: "175" GACCUCGGUGGUGUUCAUUCUCAUCUGCUGCUUUAUCAUCCUGGAGAACAUCUUUGUCUU (Seq ID N° 16) "725" AUUUCCAAGGCCAGCCGCAGCUCUGAGAAUGUGGCGCUGCUCAAGACCGUAAUUAUCGUC (Seq ID N° 17)

Os oligonucleotídeos correspondentes teriam, por exemplo, uma formação como se publica de seguida: 3'-aaaaUAGUAGGACCUCUUGUAGAAA Seq ID N° 18; 3'-aaaaGGUUCCGGUCGGCGUCGAGAC Seq ID N° 19;

Controlo de falha de correspondência 3'-aaaaGGUGCCUGUCUGCGGCGACAC Seq ID N° 20; O controlo de falha de correspondência não coincide em 5 nucleotideos (sublinhado como falha de correspondência) com o ARN edg-1.

Além disso, foram preparados os seguintes oligonucleotídeos orientados contra edg-1 com estabilidade da nuclease melhorada e actividade inibidora aumentada, que derivam das sequências de edg-1 anteriores.

3'-a*a*a a U*A G*U A G G A C*C*U C*U*U G*U*A G A A*A 3'-a*a*a a G G U*U*C*C G G*U*C G G*C G*U*C G A G A*C 14

3'-a*a*a a G G U*G C*C*U G*U*C*U G*C G G*C G A*C A*C

Os derivados de ácidos nucleicos da fórmula I de acordo com a invenção são formados a partir de oligonucleotideos. Um oligonucleotideo pode, por exemplo, ser formado completamente a partir dos nucleotideos de fosfato de adenosina, fosfato de guanosina, fosfato de inosina, fosfato de citidina, fosfato de uridina e fosfato de timidina. São preferidos, os nucleotideos que são formados a partir de ribonucleotideos os designados oligorribonucleotideos. Noutras formas de realização da invenção um oligonucleotideo pode conter eventualmente uma ou várias modificações, por exemplo, modificações químicas. Um oligonucleotideo pode apresentar várias modificações iguais e/ou diferentes. 0 resíduo ligado a 2'5' pode conter, por exemplo, adenosina, 3'-desoxiadenosinaa (cordicepina), inosina, 8-bromoadenosina, 8-metiladenosina e outros derivados de adenosina 8-substituída. 0 resíduo de ribose pode também ser derivatizado como 3'-O-metiladenosina. As ligações internucleosídicas na parte ligada a 2'5' são de um modo preferido ligações fosfodiéster e fosforotioato. Derivados convencionais do 2'5' — adenilato, sua síntese e activação da RNase L, são descritos na literatura (Player et al. (1998) Pharmacol. Ther. 78, 55).

Exemplos para modificações químicas são conhecidas do especialista e estão descritos, por exemplo, em E. Uhlmann and A. Peyman, Chemical Reviews 90 (1990) 543 e "Protocols for Oligonucleotides and Analogs" Synthesis and Properties & Synthesis and Analytical Techniques, S. Agrawal, Ed, Humana Press, Totowa, USA 1993, J. Hunziker e C. Leumann 'Nucleic Acid Analogs: Sythesis and Properties' in Modern Synthetic Methods 15 (Ed. Beat Ernst e C. Leumann) Editora Helvetica Chimica Acata, Basileia, pág. 331-417, RP Iyer et al. Curr Opin Mol Therap (1999) 1: 344-358; S. Verma e F. Eckstein, Annu Rev Biochem (1998) 67: 99-134; JW Engels e E. Uhlmann: Chemistry of oligonucleotides. Em: Pharmaceutical aspects of oligonucleotides. Couvreur P, Malvy C (Eds), Taylor & Francis, London, (2000): 35-78. A modificação quimica de um oligonucleotideo pode compreender por exemplo a) a substituição completa ou parcial das pontes de diéster de ácido fosfórico, por exemplo, através de pontes e fosforotioato, fosforoditioato, NR1R1'-fosforamidato, boranofosfato, fosfato-O-éster-alquilo-(C1-C21), fosfato-[aril- (C6-Ci2) -O-éster-alquilo- (C1-C21) ] , alquil (Ci-

Ce)fosfonato e/ou aril- (C6-C12)-fosfonato, em que R1 e R1' independentemente um do outro significam hidrogénio, alquilo-(Ci-Cie), arilo-(C6-C20), aril-(C6-C14)-alquilo-(Ci-Cs), de um modo preferido, hidrogénio, alquilo-(Ci-C8), e/ou metoxietilo, de um modo especialmente preferido hidrogénio, alquilo-(C1-C4), e/ou metoxietilo ou R1 e R1 em conjunto com 0 átomo de azoto que os suporta formam um anel heterocíclico de 5-6 membros, que pode conter adicionalmente um outro heteroátomo da série O, S N; 16 b) a substituição completa ou parcial das pontes diéster do ácido 3'- e/ou 5'-fosfórico através de pontes "defosfo" (descrita, por exemplo, em Uhlmann, E. e Peyman, A. em "Methods in Molecular Biology", Vol. 20, "Protocols for Oligonucleotides and Analogs", S. Agrawal, Ed., Humana Press, Totowa 1993, Chapter 16, 355 e seguintes), por exemplo através de grupos formacetal, 3'-tioformacetal, metil-hidroxilamina, oxima, metilenodimetil-hidrazo, dimetilenossulfona e/ou sililo; c) a substituição parcial da estrutura de fosfato de açúcar, por exemplo, através de oligómeros de "morfolino" (descritos, por exemplo, em E. P. Stirchak et al., Nucleic Acids Res. 17 (1989) 6129 e em J. Summerton and D. Weller, Anti-sentido and Nucleic Acid Drug Dev. 7 (1997) 187-195) e/ou através de ácido nucleicos poliamidicos ("PNAs") (descrit, por exemplo, em P. E. Nielsen et al, Bioconj. Chem. 5 (1994) 3) e/ou de ésteres de ácido monofosfórico de ácidos nucleicos ("PHONAs") (descrito, por exemplo, em Peyman et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 35 (1996) 2632-2638) ; d) a substituição parcial da unidades de β-D-ribose, por exemplo, através de β-ϋ-2'-desoxirribose, a-D-2'-desoxirribose, L-2'-desoxirribose, 2'-F-2'-desoxirribose, 2'-F-2'-desoxiarabinofuranose, 2'-O-alquilo-(Ci-C6)-ribose, 2'-O-alcenilo-(C2-Cê)-ribose, 2'-[O-alquil-(Ci-C6)-O-alquilo-(Ci-C6) ]-ribose, 2 ' -NH2-2'-desoxirribose, β-D-xilofuranose, β-D-arabinofuranose, a-arabinofuranose, 2,4-dideoxi-B-D-eritro-hexo-piranose, análogos de açúcar restringidos na conformação como LNA (Locked nucleic acids; Singh et al., Chem. Commun. 4 (1998) 455; Singh et al. Chem. Commun. 12 17 (1998) 1247) e carbocíclicos (descritos, por exemplo, em Froehler, J.Am.Chem.Soc. 114 (1992) 8320) e/ou análogos de açúcares de cadeia aberta (descritos, por exemplo, em Vandendriessche et ai., Tetrahedron 49 (1993) 7223) e/ou análogos de açúcar biciclicos (descritos, por exemplo, em M. Tarkov et ai., Helv. Chim. Acta 76 (1993) 481). Os análogos de oligonucleotideos modificados em 2' são descritos em detalhe em Manoharan, Biochim. Biophys. Acta (1999) 117 e análogos de oligonucleotideos restringidos na conformação são descritos em detalhe em Herdewijn, Biochim. Biopyhs. Acta (1999) 167. e) a modificação ou a substituição completa ou parcial das bases de nucleosideos naturais, por exemplo, através de 5-(hidroximetil)uracilo, 5-aminouracilo, pseudouracilo, pseudoisocitosina, di-hidrouracilo, 5-alquil-(Ci-Cê) - 5-alcinil- (C2-C6) -5-alcenil- (C2-Ce) -5-fluorouracilo, 5-clorcitosina, ou purinas de bases uracilo, 5-alcenil-(C2-Cê)-uracilo, uracilo, 5-alquil-(Ci-Cê)-citosina, citosina, 5-alcinil-(C2-Ce)-citosina, 5-fluorocitosina, 5-clorouracilo, 5-bromouracilo, 5-bromcitosina 7-deaza-7-substituídas. Modificações heterocíclicas são, por exemplo, descritas em Herdewijn, Anti-sentido & Nucl. Acid Drug Dev. (2000) 297. A modificação química do oligonucleotídeo compreende, além disso, a conjungação de um oligonucleotídedo com uma ou várias moléculas, as quais influenciam vantajosamente as propriedades do oligonucleotídeo (por exemplo, estabilidade da nuclease, afinidade para a sequência alvo, farmacocinética) e/ou na hibridização do oligonucleotídeo modificado na sequência alvo prendendo esta através de ligação e/ou reticulação cruzada 18 (conjugados de oligonucleotídeos). Exemplos para isto são conjugados com poli-lisina, com intercaladores como pireno, acridina, fenazina, fenantridina, com compostos fluorescentes, como fluoresceína, com reticuladores, como psoralenos, azidoproflavina, com moléculas lipofílicas como alquilo-(Ci2-C20), com lípidos como 1,2-di-hexadecil-rac-glicerina, com esteróides como colesterol ou testosterona, com vitaminas como vitamina E, com poli- ou oligo-etilenogilcol, com diésteres de alquil-(Ci2-Cis)-fosfato e/ou com -0-CH2-CH (OH)-O-alquilo-(Ci2-Ci8) . Tais moléculas podem estar conjugadas no terminal 5' e/ou no terminal 3' e/ou dentro da sequência, por exemplo, numa nucleobase. Os conjugados de oligonucleotídeos conhecidos do especialista são, por exemplo, descritos em Manoharan (2001) Conjugated Oligonucleotides in Anti-sentido technology. Em: Crooke (editor) Anti-sentido Technology. Mareei Dekker, Nova Iorque.

Uma forma especial de realização da modificação química refere-se à conjugação do oligonucleotídeo a) com moléculas lipofílicas, por exemplo, alquilo-(C12-C20) , b) com esteróides como colesterol e/ou testosterona, c) com poli- e/ou oligoetilenoglicol, d) com vitamina E, e) com intercaladores como pireno, f) com diésteres de alquilo- (Cu-Cie)-fosfato e/ou g) com -O-CH2-CH (OH)-O-alquilo-(Ci2-Ci6) .

Uma outra forma de realização especial da modificação química refere-se à derivatização do oligonucleotídeo com descrito em HMR 99/L045 como conjugado de éster arílico, por exemplo como conjugado de FDA, através da qual é favorecida a absorção celular dos oligonucleotídeos.

Processos para a preparação dos derivados oligonucleotídeos são conhecidos do especialista e estão descritos, por exemplo, 19 em Uhlmann, E. & Peyman, A., Chem. Rev. 90 (1990) 543 e/ou M. Manoharan em "Anti-sentido Research and Applications", Crooke and Lebleu, Eds., CRC Press, Boca Raton, 1993, capítulo 17, pág. 303 e seguintes e/ou no documento EP-A 0552766.

Em outras formas de realização especial da invenção o oligonucleotídeo pode apresentar no terminal 5' uma inversão 5'-5'. Este tipo de modificação química é conhecido do especialista e está descrito, por exemplo, em M. Koga et al.r J. Org. Chem. 56 (1991) 3757. O terminal 5' é adicionalmente uma posição preferida para a conjugação do oligonucleotídeo com uma ou várias moléculas, as quais influenciam favoravelmente as propriedades do oligonucleotídeo (por exemplo, estabilidade da nuclease, absorção celular, afinidade para a sequência alvo, farmacocinética) . A invenção refere-se além disso, a processos para a preparação dos oligonucleotídeos. Os oligonucleotídeos descritos podem ser preparados com auxílio de diferentes processos químicos conhecidos, por exemplo, conforme descrito em Eckstein, F. (1991) "Oligonucleotides and Analogues, A Practical Approach", IRL Press, Oxford. Os oligonucleotídeos podem também ser preparados através de processos, que contêm eventualmente um ou vários passos enzimáticos. A invenção refere-se além disso à utilização dos oligonucleotídeos para a modulação bem como para a inibição total ou parcial da expressão de determinados genes alvo, por exemplo, para a inibição total ou parcial da tradução. A invenção refere-se além disso à utilização dos oligonucleotídeos para a modulação bem como para a inibição total ou parcial da 20 expressão em células, que apresentam apenas pouca, nenhuma ou defeituosa sintase do 2'5'-oligoadenilato. A invenção refere-se além disso à utilização dos oligonucleotideos como medicamentos ou à utilização dos oligonucleotideos para a preparação de medicamentos. Os oligonucleotideos podem, em especial, ser utilizados em medicamentos que são utilizados para a prevenção e/ou tratamento de doenças, que estão associadas com a expressão ou uma sobre-expressão de determinados genes. A invenção refere-se além disso à utilização dos oligonucleotideos ou de medicamentos que contenham estes oligonucleotideos, para o tratamento de doenças, nas quais genes definidos são a causa ou participam através de sobre-expressão.

Os medicamentos da presente invenção podem ser utilizados, por exemplo, para o tratamento de doenças que são provocadas por virus, por exemplo, através de CMV, HIV, HSV-1, HSV-2, hepatite B, hepatite C, ou virus do papiloma. Os medicamentos desta invenção adequam-se especialmente para o tratamento de virus de ARN como, por exemplo, poliovirus, VSV ou gripe, em especial também de virus de ARN de cadeia dupla como, por exemplo, reovirus.

Os medicamentos da presente invenção adequam-se também, por exemplo, para o tratamento de cancro. Ppor exemplo, podem aqui ser utilizadas sequências de oligonucleotideos que são orientadas contra alvos, que são responsáveis por provocarem o cancro ou crescimento do cancro. Tais alvos são por exemplo: 21 1) oncoproteínas nucleares como por exemplo c-myc, N-myc, c-myb, c-fos, c-fos/jun, PCNA, pl20 2) oncoproteínas associadas a citoplasma/membrana como por exemplo EJ-ras, c- Ha-ras, N-ras, rrg, bcl-2, cdc-2, c-raf- 1, c-mos, c-src, c-abl, c-ets 3) receptores celulares como por exemplo receptor EGF, Her- 2, c-erbA, receptor VEGF (KDR-1), receptores de retinóide, subunidade reguladora de cinase de proteína, c-fms, Tie-2, cinase de c-raf-1, PKC-alfa, cinase A de proteína (RI alfa) 4) citoquinas, factores de crescimento, matriz extracelular, como por exemplo, CSF-1, IL-6, IL-la, IL-lb, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, bFGF, VEGF, mieloblastina, fibronectina. 5) inibidores de genes supressores de tumores como por exemplo MDM-2.

Os medicamentos da presente invenção adequam-se, por exemplo, além disso para o tratamento de doenças que são influencidas através de integrinas ou receptores de adesão célula-célula, por exemplo, através de VLA-4, VLA-2, ICAM, VCAM ou ELAM.

Os medicamentos da presente invenção adequam-se também, por exemplo, para prevenir a restenose. Aqui podem, por exemplo, ser utilizadas sequências de oligonucleotídeos que são orientadas contra alvos que são responsáveis pela proliferação ou migração. Tais alvos são, por exemplo: 22 1) proteínas transactivadoras nucleares e ciclinas como por exemplo c-myc, c-myb, c- fos, c-fos/jun, ciclinas e cinase de cdc2 2) mitogénios ou factores de crescimentos como por exemplo PDGF, bFGF, VEGF, EGF, HB-EGF e TGF-β. 3) receptores celulares como por exemplo, receptor de bFGF, receptor de EGF e receptor de PDGF. A invenção refere-se além disso a oligonucleotídeos para o tratamento de asma, em que a expressão do receptor de adenosina-Al, receptor de adenosina-A3, receptor de bradiquinina ou de IL-13 é inibida com o auxilio de oligonucleotídeos adequados. A invenção refere-se também, por exemplo, a oligonucleotídeos para o tratamento de doenças cardiovasculares, em que é inibida, por exemplo, a expressão do receptor do βΐ-adrenérgico ou de uma proteína da famila das EDG, como por exemplo Edg-1. A invenção refere-se também, por exemplo, a oligonucleotídeos para o tratamento da diabetes, em que é inibida, por exemplo, a expressão de PTP-1B.

Os medicamentos podem ser utilizados, por exemplo, na forma de preparados farmacêuticos, que podem ser administrados de forma oral, por exemplo, na forma de comprimidos, drageias, cápsulas de gelatina dura ou mole, soluções, emulsões ou suspensões. Eles podem também ser administrados de forma rectal, por exemplo, na forma de supositórios ou parentericamente, por exemplo, na forma de soluções injectáveis. Para a preparação de 23 preparados farmacêuticos, estes compostos podem ser processados em suportes orgânicos e inorgânicos terapeuticamente inertes. Exemplos para tais suportes para comprimidos, drageias e cápsulas de gelatina dura são lactose, amido de milho ou derivados deste, talco e ácido esteárico ou sais deste. Suportes adequados para a preparação de soluções são água, polióis, sacarose, açúcar invertido e glucose. Suportes adequados para soluções injectáveis são água, álcoois, polióis, glicerol e óleos vegetais. Suportes adequados para supositórios são óleos vegetais e endurecidos, ceras, gorduras e polióis semi-liquidos. Os preparados farmacêuticos podem conter também, conservantes, solventes, estabilizadores, agentes de reticulação, emulsionantes, edulcorantes, corantes, agentes de sabor, sais para modificar a pressão osmótica, tampões, agentes de revestimento, antioxidantes, bem como, eventualmente outras substâncias activas terapêuticas.

Formas de administração preferidas são aplicações tópicas, aplicações locais, como por exemplo, com o auxilio de um catéter ou através de inalação, injecções ou infusões e a administração oral. Para injecção, formulam-se os derivados oligonucleotideos numa solução liquida, de um modo preferido num tampão fisiologicamente aceitável, como por exemplo, solução de Hank ou solução de Ringer. Os oligonucleotideos podem ser formulados porém também na forma sólida e antes da utilização serem dissolvidos ou suspendidos. As doses preferidas para a administração sistemática são de aproximadamente 0,01 mg/kg até aproximadamente 50 mg/kg por peso corporal e dia. A invenção refere-se além disso a preparações farmacêuticas que contêm os oligonucleotideos e/ou seus sais fisiologicamente 24 aceitáveis a par de substâncias de suporte e/ou auxiliares farmaceuticamente aceitáveis.

Os oligonucleotideos e/ou seus sais fisiologicamente aceitáveis podem ser administrados em animais, de um modo preferido, mamíferos, e em especial ao ser humano, como medicamento individualmente, em mistura uns com os outros ou na forma de preparações farmacêuticas, que permitem uma aplicação tópica, percutânea, parentérica ou enteral e que contêm como componente activa uma dose aficaz de pelo menos um oligonucleotideo, a par de substâncias de suporte e auxiliares farmaceuticamente aceitáveis habituais. As preparações contêm normalmente aproximadamente 0,1 até 90% em peso do composto terapeuticamento activo. Para o tratamento de doenças da pele, como por exemplo, psoríase ou vitiligo, é preferida uma aplicação tópica, por exemplo, na forma de unguentos, loções ou tinturas, emulsões, suspensões. A preparação dos preparados farmacêuticos decorre de forma em si conhecida (por exemplo, Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publ. Co., Easton, PA.), em que são utilizados agentes de suporte inorgânicos e/ou orgânicos farmaceuticamente inertes. Para a preparação de pílulas, comprimidos, drageias e cápsulas de gelatina dura, pode-se utilizar, por exemplo, lactose, amido de milho e/ou derivados deste, talco, ácido esteárico e/ou sais deste, etc. Agentes de suporte para cápsulas de gelatina mole e/ou supositórios são, por exemplo, gorduras, ceras, polióis semi-sólidos e líquidos, óleos naturais e/ou endurecidos, etc.. Como agentes de suporte para a preparação de soluções e/ou xaropes, adequam-se, por exemplo, água, sacarose, açúcar invertido, glucose, polióis, etc. Como agentes de suporte para a preparação de soluções injectáveis, adequam-se, água, álcoois, glicerina, polióis, óleos vegetais, etc. Como agentes de suporte para 25 microcápsulas, implantes e/ou tubos de implante, adequam-se polimerisatos mistos de ácido glicólico e ácido láctico. Além disso, são adequadas formulações de lipossomas, que são conhecidas do especialista (N. Weiner, Drug Develop Ind Pharm 15 (1989) 1523; "Liposome Dermatics, Springer Verlag 1992), por exemplo lipossomas HVJ (Hayashi, Gene Therapy 3 (1996) 878) . A aplicação dermal pode também decorrer, por exemplo, com o auxilio de métodos ionoforéticos e/ou com auxilio de electroporação. Além disso, podem ser utilizadas lipofectinas e outros sistemas de transporte, por exemplos tais, que encontram utilização na terapia genética. São adequados, em especial, sistemas com os o auxilio dos quais os oligonucleotideos podem ser colocados em células eucarióticas com grande eficiência.

Uma preparação farmacêutica pode conter ainda, a par das substâncias activas e de suporte, substâncias aditivas, como por exemplo, agentes de enchimento, diluentes, propulsores, aglutinantes, lubrificantes, reticuladores, estabilizadores, emulsionantes, conservantes, edulcorantes, corantes, agentes de sabor ou aromatizantes, espessantes, agentes promotores de diluição, substâncias tampão, além de solventes e/ou promotores de dissolução e/ou agentes para conseguir um efeito de depósito, bem como sais para modificar a pressão osmótica, agentes de revestimento e/ou antioxidantes. Eles podem também conter dois ou vários oligonucleotideos diferentes e/ou seus sais fisiologicamente aceitáveis, bem como além disso, a par de pelo menos um oligonucleotideo, uma ou várias substâncias terapeuticamente activas. A dose pode variar dentro de uma limite largo, e é em cada caso individual, individualmente ajustável à situação. 26

Exemplos

1.Síntese dos oligonucleotídeos da fórmula I a) 3'aaaaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC (as bases indicadas com as letras minúsculas indicam uma ligação 2'5'-internucleosídeo).

As sínteses foram efectuadas no ABI 394 ADN ou Expedite Synthesizer (firma Applied Biosystems, Weiterstadt). Foram utilizados os ciclos de síntese aconselhados pelo fabricante, em que porém para a ribonucleosídeo-2'-O-fosforamidite a condensação foi duplicada (com 400 segundos de tempo de acoplamento de cada vez) e a oxidação com iodo foi prolongada a 30 segundos. Como fase sólida foi utilizado um suporte 1000 R Controlled Pore Glass (CPG) , que manteve ligada a 5'-0-dimetoxitritil-N-6- benzoiladenosina (NSS-6101-10A, Chemgenes, Waltham, MA) através da posição 2' ou 3' do açúcar. Depois da cisão do grupo 5'-O-dimetoxitritilo com ácido trifluoroacético formou-se a parte de oligonucleotídeo ligada a 2'5' com cinco vezes a condensação com 5'-0-dimetoxitritil-N-6-benzoil-3'-0-terc-butildimetilsilil-adenosino-2'-O-fosforamidite (ANP-5681, Chemgenes). Depois formou-se a parte de oligonucleotídeo ligada a 3'5' através de condensação repetida com as correspondentes 5'-O-dimetoxitritil-2'-O-terc-butildimetilsilil-nucleosídeo-3'-O-fosforamidites (ANP-5671 até ANP-5680, Chemgenes). Para efectuar a cisão do oligómero do suporte e desprotecção dos grupos de protecção fosfato e amina, agitou-se o suporte de CPG com 750 pL de amoníaco concentrado/etanol (3:1 v:v) durante 24 horas a 30 °C. 0 sobrenadante foi separado do suporte e este foi de novo lavado duas vezes com 150 pL de amoníaco concentrado/etanol (3:1 v:v). Os sobrenadantes reunidos foram 27 concentrados em vácuo e o resíduo foi agitado em 1200 pL de trietilamina><3HF (muito tóxico) para cisão dos grupos de protecção sililo durante 24 horas a 30 °C. Depois adiciona-se 700 pL de n-butanol, arrefece-se a mistura durante 30 minutos sobre gelo seco e centrifuga-se. O pellet foi ainda lavado duas vezes com butanol. De seguida efectuou-se ainda uma precipitação de cloreto de sódio. Obteve-se 112 OD (260) do produto bruto desejado, que por electroforese em gel apenas apresenta uma banda principal. O produto foi caracterizado posteriormente por meio de HPLC e espectrometria de massa de electrospray (modo negativo) (calculado 8527,2, encontrado 8527,5).

b) 3'a*a*a a-C*U*U*C G C*U*U C*C A A*C A C*C*U A G A*C A síntese foi efectuada de forma análoga ao exemplo 1 a, em que a parte de oligonucleotídeo ligada a 2'5' foi formada através de três vezes a condensação com 5'-O-dimetoxitritil-N-6-benzoil-3'-O-terc-butildimetilsilil-adenosina-2'-O-fosforamidite (ANP-5681, Chemgenes). Para introduzir o resíduo de fosforotioato foi utilizado em cada um dos passos da oxidação o reagente de Beaucage (RN- 1535, Chemgenes, Waltham, MA) em lugar da solução de iodo. Obteve-se 128 OD (260) do produto bruto desejado, que que por electroforese em gel mostra apenas uma banda principal. O produto foi posteriormente caracterizado por meio de HPLC e espectrometria de massa de electrospray (modo negativo) (calculado 8061,6, encontrado 8062,8). 2. Inibição da expressão da luciferase em células SL-3 28

Para testar a actividade biológica foram preparados os seguintes oligonucleotideos como se descreve no exemplo 1, e testados relativamente à inibição da actividade da luciferase.

a) 3' aaaaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC

b) 3'a*a*a a-C*U*U*C G C*U*U C*C A A*C A C*C*U A G A*C

Transfecção: No dia anterior à experiência foram colocadas 2χ106 células/mL em placas de 6 poços. Os oligonucleotideos foram retomados em 100 pL de SF 900II SFM (SF-900 meio de insectos II sem soro; Gibco BRL 10902-096) . Para a transfecção foram misturados 10 pL de lipofectina (1 mg/mL; Gibco BRL) com 100 pL de SF 900II SFM e incubou-se 15 minutos à temperatura ambiente. Depois pipetou-se em conjunto a mistura de lipofectina e o ácido nucleico e incubou-se 15-45 minutos à temperatura ambiente. No entretanto, as células foram lavadas com 3 mL de meio sem soro, e misturadas consecutivamente com 800 pL de SF 900II SFM e a mistura de ácido nucleico/lipofectina e incubou-se durante a noite a 25 graus. No dia seguinte adicionou-se 1 mL de meio e soro (Gibco BRL 10122-166; concentração final 2 %) .

Marcador duplo de luciferase (DLR; Promega E1960) sistema de ensaio: (http://www.promega.com/catalog) O ensaio DLR da Promega permite a determinação sequencial a partir de uma única amostra da actividade da luciferase de pirilampo e da luciferase da renilla, que se diferenciam na sua sequência de ácidos nucleicos. Os oligonucleotideos de acordo com a fórmula I a serem medidos foram orientados contra a luciferase de pirilampo. Assim, apenas a actividade da 29 luciferase de pirilampo devia ser inibida mas não a luciferase da renilla. A par do efeito de inibição pode portanto também ser testada a especificidade.

Para a lise passiva das células nas placas com poços, em primeiro lugar foi removido o meio e as células foram lavadas com PBS (solução de cloreto de sódio tamponado com fosfato (Gibco BRL 14200-067) . O meio foi completamente filtrado por sucção e de seguida foi adicionado o PLB (adicionar num poço de uma placa de 6 poços tampão de lise passiva, diluido com 1:5 com água; 500 μL de PLB (1 χ)). Depois incubou-se 15 minutos sob agitação à temperatura ambiente.

Para a preparação do reagente de ensaio II da luciferase (LARII) o substrato de ensaio da luciferase (LAS) foi ressuspendido em 10 mL do tampão de ensaio II da luciferase (LAB II) . Para a preparação do reagente de Stop & Glo foram colocados 200 pL do substrato Stop & Glo (solução) no recipiente, que continha substrato seco de Stop & Glo, e misturou-se 10 segundos com um vórtex. De maneira a obter 1* uma solução de Stop & Glo, adiciona-se 20 pL do substrato 50χ Stop & Glo e 1 mL de tampão Stop & Glo. Isto é suficiente para 10 ensaios.

Ensaio de DLR: 100 pL de LARII foram adicionados num poço em conjunto com 20 pL de lisato de célula e misturados por 2-3 segundos através de pipetação. Depois de medição luminométrica da actividade da luciferase de pirilampo, foram adicionados 100 pL de reagente Stop & Glo, misturou-se e depois foi medida a actividade da luciferase da renilla. 30

Para a determinação da luminescência foi utilizado o luminómetro Fluoroskan Ascent FL (firma Thermo Labsystems, Frankfurt). ligonucleotídeo % de inibição a)3'aaaaaaCUUCGCUUCCAACACCUAGAC (ARN na orientação anti-sentido, com 2'5'-A) 43 b) 3' a*a*a a-C*U*U*C G C*U*U C*C A A*C A C*C*U A G A*C (ARN na orientação anti-sentido, com 2'5'-A) 43 c) 3'aaaaTTTTTTACCTTGTTGAAATGG (não complementar ao ARN alvo; orientação de sentido) 12 d) 3'a*a*a a-C*U*U*C G C*U*U C*C A A*C A C*C*U A G A*C (orientação anti-sentido, com 2'-0-metil sublinhado) 7 5' -G A A G*C G A A G G*U*U G*U G G A U*C*U*G-teg (Seq. ID N° 20; orientação de sentido, sem 2'5'-A, teg: fosfato de trietilenoglicol) 0 3'-teg-G*C*T*T C*C*A A*C A*C*C*T A G A*C*C*T*A (Seq. ID N° 21; orientação anti-sentido, ADN, com 2'-0-metil sublinhado) 0 1100 pb ARNds 94 Sem ARNds 0 * % da inibição da actividade da luciferase de pirilampo () 31 0 oligonucleotídeo a) complementar à luciferase de pirilampo inibiu a actividade da luciferase do pirilampo de forma essencialmente mais intensa que o oligonucleotídeo não complementar c) . A estabilização do oligonucleotídeio com resíduos de fosforotioato (oligonucleotídeo b) em determinadas posições do oligómero conduziu a uma melhoria significativa da actividade. Quando toda a sequência complementar ligada a 3'5' foi derivatizada como derivado 2'-O-metilo, não foi praticamente verificável nenhuma actividade (oligonucleotídeo d) . 3. Inibição da expressão da edg-1 em células primárias humanas do cordão umbilical (HUVEC).

Para testar os oligonucleotídeos de acordo com a invenção em células primárias humanas quanto à inibição da expressão genética, estas foram orientadas também contra um gene humano ou contra o ARN associado e testadas em células humanas (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells) .

Foram sintetizados os oligonucleotídeos correspondentes. As primeiras duas sequências são complementares para ARN de edg-1, enquanto o terceiro oligonucleotídeo apresenta emparelhamentos errados das bases. #2: 5' A U*C A U*C*C*U G G A G A A*C A*U C*U*U*U-teg

#3: 3'-a*a*a a U*A G*U A G G A C*C*U C*U*U G*U*A G A A*A #5: 5' C*C*A A G G*C*C A G*C*C G*C A G C*U*C*U*G-teg

#6: 3'-a*a*a a G G U*U*C*C G G*U*C G G*C G*U*C G A G A*C 32 #7: 5' C*C*A C*G G A C*A G A C*G C*C*G C*U*G*U*G-teg

#8: 3'-a*a*a a G G U*G C*C*U G*U*C*U G*C G G*C G A*C A*C

Como oligonucleotídeos de controlo foram utilizadas as sequências complementares (orientação de sentido) sem resíduo de 2'5 ' -oligoadenilato. e que * é fosforotioato; a*a*a a é um adenilato ligado a 2'5' (parcialmente modificado com *), e teg é um fosfato de trietilenoglicol.

Os análogos oligorribonucleotídeos modificados com fosforotioato em determinadas posições foram utilizados como se segue em células primárias humanas para a inibição da expressão genética de Edg-1 em células humanas (HUVEC, human umbilical vein endothelial cells) . Células (HUVECs) e detecção da absorção celular.

Transfecção: 24 horas antes da transfecção propriamente dita, foram colocadas em placas de 6 poços revestidas, HUVECs primárias (2a passagem, isoladas de acordo com Jaffe et al., 1973, J. Clin. Invest 52, página 2745) numa densidade de 2,5 χ 105 células/poço em colagéneo-I de ratos (Biocoat, #354400, Becton Dickinson). Para a transfecção foram misturados 6 pL de lipofectina (1 mg/mL; Gibco BRL, # 18292-011) com 200 pL de meio Opti-MEM 1 sem soro (Gibco BRL, 31985-047) e incubou-se 15 minutos à temperatura ambiente. 33

Paralelamente a isto foram diluídos 10 μΜ (-> concentração final 0,1 μΜ) ou uma solução de oligonucleotídeo 100 μΜ (-> concentração final 1 μΜ) (em PBS, pH 7,4) numa relação de 1:10 com meio Opti-MEM 1 sem soro e nos mesmos volumes misturou-se com a solução de lipofectina pré-incubada. Depois de 15 minutos de incubação à temperatura ambiente esta mistura foi aferida a 2 mL com meio Opti-MEM 1 sem soro e o residuo de células lavado uma vez com PBS foi incubado com esta mistura 4 horas a 37 °C, 5% de C02 e 95% de humidade. De seguida, o resíduo de células lavado de novo com PBS foi sobrenadado com meio EGM contendo soro (CellSystems, # CC-3024 + aditivo de EGM # CC-3124) e incubou-se mais 24 ou 48 horas. No caso dos estudos de absorção com oligonucleotídeos marcados para fluorescência, as células, após 4 horas de incubação com 5% de para-formaldeido (em PBS, pH 7,4) foram fixadas e directamente registadas com um microscópio de fluorescência com base invertida (Zeiss Axiovert 135M) através de excitação com um filtro FITC (excitação: 490 nm, emissão: 510 nm) numa ampliação de 200 vezes com uma câmara arrefecida CCD (ORCA-1, Bfi optilas) e processou-se através do software AQM2000 (Kinetic Imaging).

Análise de Western Blot: Para a lise das células o residuo de células foi lavado uma vez com PBS e de seguida sobrenadado com 200 pL/poço de 2 χ tampão Laemmli (Bio-Rad #161-0737) . Depois de cinco minutos de incubação à temperatura ambiente, o lisato de células foi recolectado com um raspador de células (Becton Dickinson, #3085) e antes da electroforese descontinua em gel de 12% de SDS-poliacrilamida (SDS-PAGE, Laemmli et al., 1970, Bio-Rad-Criterion-System #345-0014), aqueceu-se durante 5 minutos a 95 °C e daqui colocados 45 pL por poço. A corrida em gel decorreu em 1 χ tampão tris/glicina/SDS (Bio-Rad # 161-0732). Para o imunoblot, o gel foi transferido com auxílio 34 do aparelho Bio-Rad Criterion Westernblot (#170-4070) para uma membrana de nitrocelulose (NC) (Amersham # RPN 2020D) em tampão 1 x tris/glicina (Bio-Rad #161-0732, + 10% de metanol). De seguida, a membrana de NC foi saturada durante uma hora à temperatura ambiente com tampão 1 χ TBS (Bio-Rad # 170-6435), que continha 5% de leite em pó ("Blotto", Bio-Rad #170-6404) e 0,1% de Tween 20 (Bio-Rad # 170-6531). Depois de lavar três vezes a membrana em tampão sem Blotto TBS-Tween (TBST) a membrana foi incubada com o anticorpo primário anti-hEDG-1 (soro de coelho policlonal, que foi obtido através da imunização com a sequência peptidica especifica para EDG-1 CKAHRSSVSDYVNYD, acoplada a KLH, e purificada contra a sequência peptidica acima mencionada por afinidade) durante a noite a 4 °C numa diluição 1:50 em TBST-Blotto. Depois de três lavagens com TBST o anticorpo secundário (anti-coelho, acoplada a fosfatase alcalina, Dianova # 111-055-045) numa diluição de 1:2000 em TBST-Blotto foi incubado uma hora à temperatura ambiente. Depois de nova lavagem (ver acima) decorreu a reacção de detecção ECF-quimioluminescência ampliada) (Amersham #RPN5785), em que a membrana de NC revestida com película de plástico foi incubada com 1 mL de substrato ECF (Amersham Pharmacia #RPN5785) durante 5 minutos à temperatura ambiente e foi detectado com um Fluor-Imager 595 Scanner (Amersham Pharmacia). A quantificação decorreu com o software ImageQuant (Amersham Pharmacia), em que se normalizou contra o sinal da β-tubulina, que foi obtido, de acordo com o método acima descrito, depois da descoloração uma vez (Alpha Diagnostic Kit # 90100) da membrana de NC e através de incubação com o anticorpo primário específico da β-tubulina (anticorpo de coelho purificado por afinidade, Santa Cruz # sc-9104) . 35

Proteína EDG-1 (% do controlo) Concentração (pM) Oligo #2 (região "175") Oligo #3 (região "175") Oligo #5 (região "725") Oligo #6 (região "725") Oligo #7 Falha de corresponên-cia Oligo #8 Falha de corresponên-cia 0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 0,01 87,7 51,4 98,6 47,2 89,4 128,3 0, 05 100,8 44,2 129,3 35,5 109,7 107,5 0,1 103,0 35,5 109,4 25,1 121,8 103, 6 0,5 119,2 40,3 107,2 27,1 95, 7 85,6 1,0 104,4 34,0 96,2 22,6 100,1 83,5 0 tratamento das células primárias HUVEC com os oligorribonucleotídeos de cadeia única quimicamente modificados de acordo com a invenção conduziu a uma inibição dependente da dosagem da expressão de edg-1. Apenas os oligorribonucleotídeos #3 e #6 com a orientação anti-sentido inibiram a expressão genética, enquanto os oligorribonucleotídeos #2 e #5 não inibiram a expressão com a orientação de sentido. A inibição demostrou-se como sendo específica para genes alvo, uma vez que apenas o nível da proteína Edg-1 desceu, mas não o nível da tubulina, depois do tratamento com os oligorribonucleotídeos #3 e #6 específicos da edg-1. A inibição demostrou-se também como sendo específica da sequência no que diz respeito aos oligorribonucleotídeos utilizados, uma vez que apenas os oligorribonucleotídeos homólogos a edg-1, #3 e #6 inibiram a expressão de edg-1, enquanto o oligorribonucleotíde #8 com a orientação anti-sentido, que se diferencia em 5 nucleotídeos da sequência de edg-1, não inibiu a expressão de edg-1. 36

LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Aventis Pharma Deutschland GmbH <120> Novos derivados oligorribonucleotídeos para a inibição orientada da expressão genética <130> AVE D-2001/A034 <140> < 141 > <160> 22 <170> Patentln Ver. 2.1

<210> 1 <211> 25 <212> ADN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 1 ttttgaagcg aaggttgtgg atctg 25

<210> 2 <211> 25 <212> ARN 37 <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Dominio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 2 uuuugaagcg aagguugugg aucug 25

<210> 3 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência sintética <2 2 0 > <223> Descrição da sequência sintética: Dominio a partir de Photinus pyralis Luziferase <4 00> 3 gcttttacag atgcacatat cgaggtggac atcacttacg cgaaaatgtc tacgtgtata 60 gctccacctg tagtgaatgc 80

<210> 4 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Dominio a partir de Photinus pyralis Luziferase 38 < 4 Ο Ο > 4 ggcgcttgct 60 80 ccgcgaacga catttataat gaacgtgaat tgctcaacag gtaaatatta cttgcactta acgagttgtc

<210> 5 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 5 attttttgaa gcgaaggttg cgccagccat 60 80 gcggtcggta aagttgttcc ttcaacaagg taaaaaactt cgcttccaac <210> 6 <211> 80 <212> ADN <213> Sequência sintética <2 2 0> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 6 39 attttttgaa gcgaaggttg tggatctgga taccgggaaa taaaaaactt cgcttccaac 60 acctagacct atggcccttt 80

<210> 7 <211> 40 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Dominio a partir de Photinus pyralis Luziferase <4 00> 7 gcuuuuacag augcacauau cgagguggac aucacuuacg 40

<210> 8 <211> 40 <212> ARN <213> Sequência sintética <2 2 0 > <223> Descricção da sequência sintética: Dominio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 8 ccgcgaacga cauuuauaau gaacgugaau ugcucaacag 40

<210> 9 <211> 40 <212> ARN 40 <213> Sequência sintética <2 2 Ο > <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <4 00> 9 gcggucggua aaguuguucc auuuuuugaa gcgaagguug 40

<210> 10 <211> 40 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 10 auuuuuugaa gcgaagguug uggaucugga uaccgggaaa 40

<210> 11 <211> 26 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 11 caccucgaua ugugcaucug uaaaaa 26 41 <210 > 12

<211> 25 <212> ARN <213> Sequência sintética <2 2 Ο > <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photínus pyralis Luziferase <4 00> 12 gagcaauuca cguucauuau aaaaa 25

<210> 13 <211> 25 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photínus pyralis Luziferase <4 00> 13 cagauccaca accuucgcuu caaaa 25

<210> 14 <211> 25 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> 42 <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 14 cagauccaca accuucgcuu caaaa 25

<210> 15 <211> 25 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir da EDG1 humana <400> 15 cagagccacc aacuucucuu caaaa 25

<210> 16 <211> 60 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir da EDG1 humana <4 0 0> 16 gaccucggug guguucauuc ucaucugcug cuuuaucauc cuggagaaca ucuuugucuu 60 43

<210> 17 <211> 60 <212> ARN <213> Sequência sintética <2 2 0 > <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir da EDG1 humana <4 0 0> 17 auuuccaagg ccagccgcag cucugagaau guggcgcugc ucaagaccgu aauuaucguc 60

<210> 18 <211> 25 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir da EDG1 humana <400> 18 aaagauguuc uccaggauga uaaaa 25

<210> 19 <211> 25 <212> ARN <213> Sequência sintética <2 2 0> 44 <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir da EDG1 humana <400> 19 cagagcugcg gcuggccuug gaaaa 25

<210> 20 <211> 25 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir da EDG1 humana <400> 20 cacagcggcg ucuguccgug gaaaa 25

<210> 21 <211> 21 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 21 gaagcgaagg uuguggaucu g 21 <210> 22 <211> 16 45 <212> ARN <213> Sequência sintética <220> <223> Descrição da sequência sintética: Domínio a partir de Photinus pyralis Luziferase <400> 22 accagaccac aacccg 16

Lisboa, 12 de Setembro de 2007 4 6

Claims (27)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Oligonucleotídeo da fórmula I 5'-(N)x-(Z)n fórmula I em que N são ribonucleotídeos que ocorrem naturalmente ou não naturalmente, que são pelo menos parcialmente complementares a um ARN alvo, x independentemente igual a 10 até 100, n igual a 2 até 20, Z são nucleotideos que ocorrem naturalmente ou não naturalmente, que estão ligados com uma ligação 2'5' — internucleosídica, com a condição que os seus homólogos ARN alvo apresentem um dos seguintes padrões de sequência 5' - (U) v- (N)Z-(U)W 5'-(U)v- (N)z-UX 5'-UX- (N) Z-UX e 5 ' - (U) v- (N)z em que v é independentemente igual a 2 até 20, em que w é independentemente igual a 2 até 20, 1 z é independentemente igual a 15 até 25, U é igual a uridina, N é igual a adenosina (A), guanosina (G) , citidina (C) ou U e X é igualguais a A, G ou C, de um modo preferido A, ou os seus sais fisiologicamente aceitáveis.
2. 2. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com a reivindicação 1, em que x é igual a 15 até 45.
3. 3. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com a reivindicação 2, em que x é igual a 16 até 25.
4. 4. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 3, em que n é igual a 2 até 10.
5. 5. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com a reivindicação 4, em que n é igual a 3 até 6.
6. 6. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 5, em que v é igual a 2 até 10.
7. 7. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com a reivindicação 6, em que v é igual a 3 até 6.
8. 8. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com uma das reivindicações 6 ou 7, em que w é igual a 2 até 10.
9. 9. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com a reivindicação 8, em que w é igual a 3 até 6. 2
10. 10. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 9, em que z é igual a 16 até 23.
11. 11. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com a reivindicação 10, em que z é igual a 19 até 21.
12. 12. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 11, em que Z significa adenosina ou 3'-desoxiadenosina.
13. 13. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 12, nas quais uma ou várias pontes fosfodiéster naturais estão substituídas através de pontes internucleosídeo não naturais, as quais estabilizam contra a decomposição da nuclease.
14. 14. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 13, nas quais uma ou várias ligações fosfodiéster naturais estão substituídas através de ligações fosforotioato.
15. 15. Oligonucleotídeo da fórmula I de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 14, nas quais várias ligações de fosfodiéster naturais estão substituídas através de ligações fosforotioato, em que estas modificações se encontram nos terminais e nucleotídeos pirimidínicos internos.
16. 16. Processo para a inibição da expressão genética de um gene alvo numa célula in vitro com o auxílio de um ou vários oligonucleotídeos de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 15, em que em primeiro lugar se 3 prepara um oligonucleotídeo complementar a um gene alvo correspondente, este oligonucleotídeo é introduzido numa célula, a célula é incubada e de seguida é determinada a inibição da expressão genética do gene alvo através de medições de comparação da quantidade de ARNm correspondente ou do produto genético correspondente numa célula de controlo.
17. 17. Processo in vitro de acordo com a reivindicação 16, para a inibição da expressão genética de um gene alvo numa célula, na qual a sintase do 2'5'-oligoadenilato está subexpressa ou defeituosa em comparação a uma célula de controlo.
18. 18. Medicamento contendo um oligonucleotídeo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 15, bem como substâncias aditivas e/ou de suporte e eventualmente substâncias auxiliares para a preparação ou formulação de um medicamento
19. • 19. Medicamento de acordo com a reivindicação 18, para a utilização na terapia de tumores.
20. 20. Medicamento de acordo com a reivindicação 18, para a utilização na terapia ou prevenção de doenças infecciosas
21. 21. Medicamento de acordo com a reivindicação 18, para a utilização na terapia ou prevenção de doenças virais
22. • 22. Medicamento de acordo com a reivindicação 18, para a utilização na terapia de doenças inflamatórias ou asma. 4
23. 23. Medicamento de acordo com a reivindicação 18, para a utilização na terapia de doenças cardiovasculares ou metabólicas.
24. 24. Utilização de um oligonucleotideo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 15, para a identificação ou validação de novos genes alvo terapêuticos.
25. 25. Utilização de um oligonucleotideo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 15, para a identificação ou validação de novos genes alvo na investigação da protecção vegetal.
26. 26. Processo para a preparação de um oligonucleotideo de acordo com uma ou várias das reivindicações 1 até 15, em que o oligonucleotideos são preparados em primeiro lugar em solução ou em fase sólida através de acoplamento sucessivo ou em bloco e depois da preparação são isolados e purificados.
27. 27. Processo para a preparação de um medicamento, em que é preparado um derivado oligonucleotideo de acordo com a reivindicação 26, e é misturado eventualmente com outras substâncias aditivas e/ou de suporte e eventualmente substâncias auxiliares. Lisboa, 12 de Setembro de 2007 5