JP2005500050A

JP2005500050A - 標的化された遺伝子発現阻害のための新規なオリゴリボヌクレオチド誘導体

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Publication number: JP2005500050A
Application number: JP2003514911A
Authority: JP
Inventors: オイゲン・ウールマン; ヨッヘン・フーバー; ニキ・グンケル; ザンドラ・ノイマン
Original assignee: アベンティス・ファーマ・ドイチユラント・ゲゼルシャフト・ミット・ベシュレンクテル・ハフツング
Priority date: 2001-07-12
Filing date: 2002-07-05
Publication date: 2005-01-06
Anticipated expiration: 2022-07-05
Also published as: CY1107776T1; EP1414961A2; DK1414961T3; PT1414961E; JP4690649B2; US7635769B2; US20030105052A1; WO2003008595A2; ES2289131T3; IL159759A0; AU2002325305B2; EP1414961B1; DE50210819D1; WO2003008595A3; US20060025374A1; ATE371734T1; MXPA04000178A; DE10133915A1; CA2453295C; IL159759A

Abstract

本発明は、３′末端に、５′リン酸基を有さない２′５′−結合オリゴリボヌクレオチド基を有するオリゴヌクレオチド誘導体、および、標的化された遺伝子発現阻害のためのその使用に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、３′末端に５′−リン酸残基を有さない２′５′−結合オリゴリボヌクレオチド残基を有する新規のオリゴリボヌクレオチド誘導体、および、遺伝子発現の特異的阻害のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
合成核酸を用いて遺伝子発現を阻害することがますます重要になりつつある。これら合成核酸（オリゴヌクレオチド）の典型的な代表例としては、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ＤＮＡ酵素および外部ガイド配列（ＥＧＳ）がある。「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ワトソン−クリック塩基対を介して相補メッセンジャーリボ核酸（ｍＲＮＡ）に結合し、その対応するタンパク質への翻訳を阻害する短い一本鎖核酸誘導体のことである。ほとんどの場合において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞性リボヌクレアーゼＨ（ＲＮアーゼＨ）によりサポートされるメカニズムに従った作用を示し、多数の研究でこれに関する証拠が示されている。全ての細胞に存在するＲＮアーゼＨは、二本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡを認識し、１つのホスホジエステル結合、またはほとんどの場合において１以上のホスホジエステル結合を加水分解することにより、前記オリゴヌクレオチドに相補的なｍＲＮＡを切断する。ＲＮアーゼＨを活性化するためにオリゴヌクレオチドを改変する方法が知られており、例えば、Uhlmann（2000）Curr．Opin．Drug Discov．Dev．3，203-213に説明されている。合成リボザイムは、その配列中にこのヌクレアーゼ活性を有する。最も一般的なタイプのリボザイムは、「ハンマーヘッド型」リボザイムであり、これは、天然に存在するリボザイムから誘導されたコンセンサス配列ＧＡＡＡＣがＲＮアーゼ部分を形成し、フランキング配列がアンチセンスオリゴヌクレオチド部分を形成する。しかしながら、天然に存在するリボザイムモチーフから誘導されていないが、インビトロでの選択で発見されたＤＮＡ酵素が、同様に作用する。ＥＧＳは、細胞性ＲＮアーゼＰを活性化し、適切なフランキング配列を介して標的ｍＲＮＡに結合し、特異的ｍＲＮＡ分解を誘導する合成ＲＮＡ類似体である。
【０００３】
合成オリゴヌクレオチドを用いる遺伝子発現の阻害に関する共通の問題は、有効な配列を同定するために、標的核酸の様々な領域に対する比較的多数のオリゴヌクレオチドを常に分析する必要があることである。その上、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、しばしば、非効率的または不完全にしか遺伝子発現を阻害できない。その上、配列非特異的な副作用が観察されており、これは、約５塩基の長さの比較的短い部分配列でもＲＮアーゼＨを活性化する現象により生じるものと推測される。これは例えば、Woolf et al．(1992）．Proc．Natl．Acad．Sci U.S.a．89．7305-7309で示される。しかしながら、アンチセンスオリゴヌクレオチドとタンパク質との相互作用により生じる副作用も存在する。
【０００４】
近年、遺伝子発現の阻害に二本鎖ＲＮＡを使用することが説明されている。二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）とは、特定の細胞および生物においてＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として知られるプロセスに従ったｍＲＮＡの配列特異的分解を誘導するシグナルである。ＲＮＡｉ現象は、多数の異なる生物、例えば、C．Elegans、ハエ、菌類、植物およびマウス胚で観察されており、ＲＮＡｉは、植物で発見された転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）と非常に類似しているか、または同一であると考えられている。５００塩基対（ｂｐ）を超過する長さのｄｓＲＮＡ（そのセンス鎖配列は阻害しようとする標的ｍＲＮＡと同一である）を単に注射することにより、対応するＤＮＡ配列を有する標的遺伝子の発現を特異的に阻害することができる。これは、非相同遺伝子の遺伝子発現を損なわず、標的遺伝子の塩基配列は改変されない。ＲＮＡｉは、ｄｓＲＮＡがまず比較的小さい断片に分解され
、続いてその断片が標的ｍＲＮＡの配列特異的分解に用いられると推測される転写後プロセスである。
【０００５】
これまでは、主に長さが１００ｂｐを超えるｄｓＲＮＡを用いて遺伝子発現を効率的に阻害していた。この比較的長いｄｓＲＮＡは、対応するＤＮＡからの適切な転写系を介したインビトロまたはインビボ転写によってのみ利用可能である。長いｄｓＲＮＡを用いるＲＮＡｉのその他の制限は、C．Elegans、ゼブラフィッシュ、植物、特定のタイプの菌類、ショウジョウバエ、マウスの卵母細胞および胚のような特定の有機体でのみｄｓＲＮＡによる配列特異的阻害が可能であり、一方で、ほとんどの動物細胞は、ｄｓＲＮＡで処理するとアポトーシスを起こすということである。長いｄｓＲＮＡでも、配列相同性が７０〜９０％である場合は遺伝子発現を阻害する。この理由のために、高い配列相同性を有する遺伝子ファミリーの場合、複数の完全に相同ではない遺伝子の発現を同時に阻害することにより、表現型の誤訳を起こすことが可能である。
【０００６】
ｄｓＲＮＡ、例えばｄｓＲＮＡウイルスを用いた細胞の処理は、一般的に、アポトーシスプロセス、または、２′５′−オリゴアデニレート−シンターゼ活性の誘導によるｍＲＮＡの配列非特異的分解を生じさせる。感染した細胞は、ウイルスのｄｓＲＮＡに反応して、通常とは異なる２′５′−ホスホジエステル−インターヌクレオシド結合により三量体または四量体アデニレート（２′５′−Ａ）を合成する。２′５′−Ａは、その５′末端で細胞性キナーゼによりリン酸化され、続いてＲＮアーゼＬと呼ばれるヌクレアーゼを活性化する。また、２′５′−Ａを化学合成し、細胞に導入することもできる（Torrence et al．(1994）Curr．Med．Chem1，176-191）。しかしながら、合成２′５′−Ａは、それらが５′−リン酸または５′−三リン酸型に変換された場合にのみＲＮアーゼＬを活性化する。続いて、５′−ｐ−２′５′−Ａ（ｐは、リン酸、二リン酸または三リン酸）により活性化されたＲＮアーゼＬは、配列非特異的な方法で細胞の全てのＲＮＡを分解する。加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドと５′−ｐ−２′５′−Ａ残基との結合体により、遺伝子発現を配列特異的に阻害することが可能であることが示された。しかしながら、この目的に関して、２′５′−Ａ残基の５′末端は、オリゴヌクレオチドに結合するのではなく、リン酸、チオリン酸または三リン酸として存在することが必須である（Torrence et al．(1993）Proc．Natl．Acad．Sci．U．S. A．90，1300-4）。その上、標的ＲＮＡが認識するオリゴヌクレオチド部分（アンチセンス部分）は、一本鎖形態でなければならない。上述した理由のために、結果として遊離の５′−リン酸または三リン酸機能を有さない２′５′−Ａ残基をそれらの３′末端に有するオリゴヌクレオチドは、これまで、遺伝子発現の阻害剤として説明されていない。一本鎖の５′−リン酸化５′−ｐ−２′５′−Ａアンチセンスオリゴヌクレオチド結合体による遺伝子発現の阻害は、アンチセンス原理のバリエーションであり、それゆえに、アンチセンス−オリゴヌクレオチドアプローチの制限にもさらされる。この点について、２′５′−Ａ残基の２′または３′末端が結合形態で存在するように、２′５′−Ａ残基はスペーサー（リンカー）を介してオリゴヌクレオチドの５′末端に付着する。ＲＮＡ結合部分は、好ましくは、ＤＮＡを含む（Torence，Curr．Opin．Mol．Ther．(1999）1，307における図４〜６）。
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
近年、新しい遺伝子の機能研究（機能ゲノミクス）のためのツールとして、オリゴヌクレオチドがますます用いられつつある。未知の機能を有するタンパク質をコードする新しい遺伝子の遺伝子発現を配列特異的に阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドおよびリボザイムの使用は、一般的に、配列が異なる多種多様なオリゴヌクレオチドを分析しなければならないためにより困難になり、これは、特に高スループットプロセスにおいて不利である。
【０００８】
それゆえに、本発明の目的は、通常の方法および薬剤の上述の制限を回避する、顕著に改善された遺伝子発現の阻害が可能な新規の化学修飾されたオリゴヌクレオチドを提供することである。特に、ＲＮＡ干渉様プロセスにおいて遺伝子発現が阻害されるように意図された。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明によれば、この目的は、リン酸、チオリン酸または三リン酸基を含まない、３′末端に２′５′−結合オリゴヌクレオチド残基を有する新規のオリゴヌクレオチド誘導体により達成される。新規のオリゴヌクレオチド誘導体の配列は、翻訳が阻害されるＲＮＡ配列に相補的である。
【００１０】
従って、本発明は、
式Ｉ：
５′−(Ｎ)_x−(Ｚ)_n 式Ｉ
［式中、Ｎは、標的ＲＮＡに対して少なくとも部分的に相補的である天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチド、好ましくはリボヌクレオチドであり、
ｘは、独立して、１０〜１００、好ましくは１５〜４５、特に好ましくは１６〜２５であり、
ｎは、２〜２０、好ましくは３〜１０、特に好ましくは３〜６であり、
Ｚは、２′５′インターヌクレオシド結合を介して結合される天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドである］
で示されるオリゴヌクレオチド誘導体を提供し、ただし、該オリゴヌクレオチド誘導体の相同標的ＲＮＡは以下の配列パターンを有する：
５′−(Ｕ)_v−(Ｎ′)_z−(Ｕ)_w
５′−(Ｕ)_v−(Ｎ′)_z−ＵＸ
５′−ＵＸ−(Ｎ′)_z−ＵＸ、および、
５′−(Ｕ)_v−(Ｎ′)_z
式中、ｖおよびｗは、互いに独立して、２〜２０、好ましくは２〜１０、特に好ましくは２〜６であり、
ｚは１５〜２５、好ましくは１６〜２３、特に好ましくは１９〜２１であり、
Ｕはウリジンであり、Ｎは、アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）またはＵであり、Ｘは、Ａ、ＧまたはＣ、好ましくはＡである。好ましい実施形態において、Ｎはリボヌクレオチドである。
【００１１】
発現が阻害される遺伝子が、例えば、以下のＤＮＡ配列：
５′−ＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧＡＴＣＴＧ（配列番号１）
または、以下のＲＮＡ配列：
５′−ＵＵＵＵＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＵＵＧＵＧＧＡＵＣＵＧ（配列番号２）
を含む場合、標的ＲＮＡは、以下の配列パターン：
５′−(Ｕ)_v−(Ｎ)_z−ＵＸ
（式中、ｖは４であり、ｚは１９であり、ＸはＧである）を有する。
【００１２】
その上、好ましくは、１またはそれ以上のホスホジエステル結合が、例えばホスホロチオエート結合またはＮ３′,Ｐ５′−ホスホロアミデート結合で置換された式Ｉで示され
るオリゴヌクレオチドである。特に好ましくは、１またはそれ以上のホスホジエステル結合がホスホロチオエート残基で置換された式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドである。特に、いくつかのピリミジンヌクレオチドが配列中で互いに連続する場合、ホスホロチオエート残基は、好ましくは、３′末端、５′末端ならびに内部ピリミジンヌクレオチドＣおよびＵに導入される。
【００１３】
本発明の特定の実施形態は、遺伝子発現を阻害するための、２またはそれ以上の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド誘導体の混合物の使用を含む。この場合におけるオリゴヌクレオチド誘導体は、ＲＮＡの異なる領域に対して、または、異なる遺伝子のＲＮＡに対して向けられていてもよい。
【００１４】
式Ｉで示される一本鎖オリゴヌクレオチドはもともと、短いｄｓＲＮＡを用いたＲＮＡｉ実験でコントロールオリゴヌクレオチドとして用いられていた。従って、一本鎖の特徴のために、遺伝子発現の阻害が期待されていなかった。しかしながら、驚くべきことに、特定の一本鎖オリゴヌクレオチドが、特にヌクレアーゼに対して十分に安定である場合に、遺伝子発現も阻害した。他の驚くべきことは、２′５′−結合オリゴアデニレート残基において遊離の５′−リン酸、５′−チオリン酸または５′−三リン酸残基を含まない式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドが、配列特異的な方法で遺伝子発現を阻害したことである。また、この場合において、２′５′−結合オリゴアデニレート残基が５′機能を介して直接３′５′−結合ＲＮＡに結合できることは、全く驚きである。遺伝子発現を阻害するためには、２′５′−結合オリゴアデニレート残基が５′末端に遊離のリン酸、チオリン酸または三リン酸残基を有さなければならないということは、これまで正当な定説であり続けた。その上、２′５′オリゴアデニレート介在阻害は、これまで常に、非特異的、すなわち配列非依存性効果に関連していた（Bass，Nature（2001）411，428）。それゆえに、式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドが、それらの構造において、Torrence（Curr．Opin．Mol．Ther．(1999）1，307）により説明されたオリゴヌクレオチド結合体から逸脱するだけでなく、結果として異なるメカニズムに基づくよりいっそう優れた阻害作用を示すということは明らかである。
【００１５】
驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチドはまた、ヒトの初期細胞において阻害の配列特異的な効果も有していた。我々が知る限り、ヒトの初期細胞中の、２′５′−結合ヌクレオチドを有するオリゴヌクレオチドによる遺伝子発現の阻害は、これまで観察されていない。
【００１６】
本発明に係る式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドは、わずかな量の不完全な２′５′−オリゴアデニレートシンターゼしか発現しない細胞、または２′５′−オリゴアデニレートシンターゼを全く発現しない細胞において遺伝子発現を阻害することに用いることもできる。
その上また、２′５′−オリゴアデニレートシンターゼの欠陥または異常を有する患者を治療するために式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドを用いることも可能である。例えばＣＦＳ（慢性疲労症候群）の患者を治療することもできる。
【００１７】
特定の標的の遺伝子発現を阻害するのに用いられる式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドの配列は、対応する遺伝子配列に基づき選択される。前記遺伝子の配列は、配列解析により、または、遺伝子データベースから得られる。本明細書で説明され得る例は、二本鎖核酸によるルシフェラーゼ（ホタル）の阻害である。この遺伝子の登録番号はＵ４７２９８である。ホタルルシフェラーゼのコーディング領域は、１６５３個のヌクレオチドを有する。以下の４つの領域を、二本鎖核酸による阻害に関する標的配列として特に選択することができる。
【００１８】
【化１】

【００１９】
従って、これら領域に対応するＲＮＡは以下の配列を有する。
【化２】

【００２０】
それから誘導された式Ｉで示される本発明に係る相補オリゴヌクレオチドは、以下の配列を有し、２またはそれ以上のヌクレオチド（本明細書においては小文字で示される）が、２′５′インターヌクレオシド結合を介して結合されることを特徴とする。好ましくは、２′５′−結合アデニレート残基である。
【００２１】
【化３】

【００２２】
代謝上の安定性を高めるために、例えばホスホロチオエート（星印）としてオリゴヌクレオチドを改変することも可能である。ホスホロチオエートによる安定化は、好ましくは、末端および内部ピリミジンヌクレオチドで行われる。
３′ａ^*ａ^*ａａ−Ｃ^*Ｕ^*Ｕ^*ＣＧＣ^*Ｕ^*ＵＣ^*ＣＡＡ^*ＣＡＣ^*Ｃ^*ＵＡＧＡ^*Ｃ
【００２３】
ルシフェラーゼ発現の阻害の特異性は、標的ＲＮＡに完全に相補的ではなく、例えば４塩基のミスマッチを有するコントロールオリゴヌクレオチドに基づき調べることができる。
３′ａ^*ａ^*ａａＣ^*Ｕ^*Ｕ^*ＣＵ^*ＣＵ^*Ｕ^*ＣＡＡＣ^*ＣＡ^*Ｃ^*ＣＧＡ^*ＧＡ^*Ｃ配列番号１５
【００２４】
式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドの構造の例は、以下で示される。
【化４】

【００２５】
式中、Ｂは、天然に存在する、または天然に存在しない核酸塩基であり、
Ｕ、ＶおよびＷは、互いに独立して、Ｏ、Ｓ、ＮＨまたはＣＨ₂、好ましくはＯまたは
Ｓであり、
Ｒ¹は、互いに独立して、ＯＨ、ＳＨ、ＣＨ₃もしくはＢＨ₃、好ましくはＯＨもしくは
ＳＨ、または生理学的に許容されるそれらの塩であり、
Ｒ²は、互いに独立して、ＯＨ、Ｈ、Ｏ−Ｃ₁〜Ｃ₁₂−アルキル、好ましくはＯＨ（リボヌクレオチド）であり、ここでＣ₁〜Ｃ₁₂−アルキルは、好ましくはＣＨ₃またはＣＨ₃−
Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂であり、
Ｒ³は、互いに独立して、ＯＨ、Ｈ、Ｏ−Ｃ₁〜Ｃ₁₂−アルキル、好ましくはＯＨまたはＨであり、ここでＣ₁〜Ｃ₁₂−アルキルは、好ましくはＣＨ₃またはＣＨ₃−Ｏ−ＣＨ₂ＣＨ₂であり、
ｘは、独立して、１０〜１００、好ましくは１５〜４５、特に好ましくは１６〜２５であり、
ｎは、２〜２０、好ましくは３〜１０、特に好ましくは３〜６であり、
Ａは、アデニンまたはアデニン誘導体であり、例えば８−ブロモアデニン、８−メチルアデニン、またはヒポキサンチンである。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、動物細胞、特にヒトの初期細胞で遺伝子発現の阻害を試験するために、これらを、例えば、ヒト遺伝子またはそれに対応するＲＮＡに対して向けて、ヒト細胞（ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞）で分析する。これに関して、遺伝子データベースからのＥｄｇ−１のＤＮＡ（登録番号Ｍ３１２１０）を、例えば、対応するメッセンジャーＲＮＡに転写することができ、以下の２つの領域（１７５および７２５）を、適切なオリゴヌクレオチドを合成するのに選択することができる。
【００２７】
Ｅｄｇ−１のＲＮＡ：
【化５】

【００２８】
対応するオリゴヌクレオチドの可能な構造の例を以下に示す：
【化６】

【００２９】
ミスマッチコントロールと、ｅｄｇ−１ＲＮＡとは、５個のヌクレオチドが異なる（
ミスマッチとして下線で示した）。
その上、ｅｄｇ−１に対して向けられた以下のオリゴヌクレオチドが調製され、該オリゴヌクレオチドは、改善されたヌクレアーゼ安定性と、増加した阻害活性を有し、上記のｅｄｇ−１配列から誘導された。
【化７】

【００３０】
式Ｉで示される本発明に係る核酸誘導体をオリゴヌクレオチドから合成する。例えば、オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドアデノシンホスフェート、グアノシンホスフェート、イノシンホスフェート、シチジンホスフェート、ウリジンホスフェート、および、チミジンホスフェートから完全に合成することができる。好ましくは、リボヌクレオチドから合成されたオリゴヌクレオチド、「オリゴリボヌクレオチド」である。本発明の他の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、必要に応じて、１またはそれ以上の修飾、例えば化学修飾を含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、複数の同一および／または異なる修飾を有してもよい。
【００３１】
２′５′−結合残基は、例えば、アデノシン、３′−デオキシアデノシン（コルディセピン）、イノシン、８−ブロモアデノシン、８−メチルアデノシン、およびその他の８−置換アデノシン誘導体を含み得る。リボース残基はまた、３′−Ｏ−メチルアデノシンとして誘導体化することができる。２′５′−結合部分におけるインターヌクレオシド結合は、好ましくはホスホジエステルおよびホスホロチオエート結合である。２′５′−アデニレートの一般的な誘導体、それらの合成およびＲＮアーゼＬ活性化は、文献（Ｐｌａｙｅｒｅｔａｌ．（１９９８）Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｈｅｒ．７８，５５）に説明される。
【００３２】
化学修飾の例は当業者既知であり、例えば、以下で説明されている：Ｅ．ＵｈｌｍａｎｎａｎｄＡ．Ｐｅｙｍａｎ，ＣｈｅｍｉｃａｌＲｅｖｉｅｗｓ９０（１９９０）５４３ａｎｄ“ＰｒｏｔｏｃｏｌｓｆｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｓ”ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ＆ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＡｎａｌｙｔｉｃａｌＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄ，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＵＳＡ１９９３，Ｊ．ＨｕｎｚｉｋｅｒａｎｄＣ．Ｌｅｕｍａｎｎ’ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＡｎａｌｏｇｓ：ＳｙｎｔｈｅｓｉｓａｎｄＰｒｏｐｅｒｔｉｅｓ’ｉｎＭｏｄｅｒｎＳｙｎｔｈｅｔｉｃＭｅｔｈｏｄｓ（Ｅｄ．ＢｅａｔＥｒｎｓｔａｎｄＣ．Ｌｅｕｍａｎｎ）ＶｅｒｌａｇＨｅｌｖｅｔｉｃａＣｈｉｍｉｃａＡｃａｔａ，Ｂａｓｌｅ，ｐ．３３１−４１７，ＲＰｌｙｅｒｅｔａｌ．ＣｕｒｒＯｐｉｎＭｏｌＴｈｅｒａｐ（１９９９）１：３４４−３５８；Ｓ．ＶｅｒｍａａｎｄＦ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，ＡｎｎｕＲｅｖＢｉｏｃｈｅｍ（１９９８）６７：９９−１３４；ＪＷＥｎｇｅｌｓａｎｄＥ．Ｕｈｌｍａｎｎ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌａｓｐｅｃｔｓｏｆｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ．ＣｏｕｖｒｅｕｒＰ，ＭａｌｖｙＣ（Ｅｄｓ），Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，（２０００）：３５−７８。
【００３３】
オリゴヌクレオチドの化学修飾としては、例えば、以下が挙げられる：
ａ）例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ＮＲ¹Ｒ¹′ホスホロアミデート、ボランホスフェート、（Ｃ₁〜Ｃ₂₁）−Ｏ−アルキルホスフェート、［（Ｃ₆〜Ｃ₁₂）アリール−（Ｃ₁−Ｃ₂₁）−Ｏ−アルキル］ホスフェート、（Ｃ₁〜Ｃ₈）アルキルホスホネートおよび／または（Ｃ₆〜Ｃ₁₂）アリールホスホネート架橋で、リン酸ジエステル架橋を、完全または部分的に置換すること、ここで、
Ｒ¹およびＲ¹′は、互いに独立して、水素、（Ｃ₁〜Ｃ₁₈）アルキル、（Ｃ₆〜Ｃ₂₀）アリール、（Ｃ₆〜Ｃ₁₄）アリール−（Ｃ₁〜Ｃ₈）アルキル、好ましくは水素、（Ｃ₁〜Ｃ₈）アルキルおよび／またはメトキシエチル、特に好ましくは水素、（Ｃ₁〜Ｃ₄）アルキルおよび／またはメトキシエチルであり、または、
Ｒ¹およびＲ¹′は、それらが結合する窒素原子と一緒になって、５〜６員環複素環（Ｏ、Ｓ、Ｎからなる群より選択された他のヘテロ原子をさらに含んでもよい）を形成する；
【００３４】
ｂ）完全または部分的に３′−および／または５′−リン酸ジエステル架橋を「デホスホ」架橋で置換すること（例えば、Ｕｈｌｍａｍ，Ｅ．ａｎｄＰｅｙｍａｎ，Ａ．Ｉｎ“ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ”，Ｖｏｌ．２０，“ＰｒｏｏｏｃｏｌｓｆｏｒＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｓ”，Ｓ．Ａｇｒａｗａｌ，Ｅｄ.，ＨｕｍａｎａＰｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ１９９３，Ｃｈａｐｔｅｒ１６，３５５ｆｆで説明された）、例えば、ホルムアセタール、３′−チオホルムアセタール、メチルヒドロキシルアミン、オキシム，メチレンジメチルヒドラゾ，ジメチレンスルホンおよび／またはシリル基で置換すること；
【００３５】
ｃ）部分的に糖リン酸主鎖を、例えば「モルホリノ」オリゴマーで置換すること（例えば、Ｅ．Ｐ．Ｓｔｉｒｃｈａｋｅｔａｌ．，ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ．１７（１９８９）６１２９、および、Ｊ．ＳｕｍｍｅｒｔｏｎａｎｄＤ．Ｗｅｌｌｅｒ，ＡｎｔｉｓｅｎｓｅａｎｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ．７（１９９７）１８７−１９５で説明された）、および／または、ポリアミド核酸（「ＰＮＡｓ」）で置換すること（例えば、Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎｅｔａｌ．，Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．５（１９９４）３で説明された）、および／または、ホスホモノエステル核酸（「ＰＨＯＮＡｓ」）で置換すること（例えば、Ｐｅｙｍａｎｅｔａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．３５（１９９６）２６３２−２６３８で説明された）；
【００３６】
ｄ）例えば、β−Ｄ−２′−デオキシリボース、α−Ｄ−２′−デオキシリボース、Ｌ−２′−デオキシリボース、２′−Ｆ−２′−デオキシリボース、２′−Ｆ−２′−デオキシアラビノフラノース、２′−Ｏ−（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルリボース、２′−Ｏ−（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケニルリボース、２′−［Ｏ−（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル−Ｏ−（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキル］リボース、２′−ＮＨ₂−２′−デオキシリボース、β−Ｄ−キシロフラノース、β−Ｄ−アラビノフラノース、α−アラビノフラノース、２，４−ジデオキシ−β−Ｄ−エリスロヘキソピラノース、立体構造的に制限された糖類似体（例えばＬＮＡ）（ＬｏｃｋｅｄＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ；Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．４（１９９８）４５５；Ｓｉｎｇｈｅｔａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１２（１９９８）１２４７）、および、炭素環（例えば、Ｆｒｏｅｈｌｅｒ，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１４（１９９２）８３２０で説明された）、および／または、開環した糖類似体（例えば、Ｖａｎｄｅｎｄｒｉｅｓｓｃｈｅｅｔａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ４９（１９９３）７２２３で説明された）、および／または、ビシクロ糖類似体（例えば、Ｍ．Ｔａｒｋｏｖｅｔａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ７６（１９９３）４８１で説明された）で、部分的にβ−Ｄ−リボース単位を置換すること。２′−修飾オリゴヌクレオチド類似体は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ（１９９９）１１７で詳細に説明され、立体構造的に制限されたオリゴヌクレオチド類似体は、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｙｈｓ．Ａｃｔａ（１９９９）１６７で詳細に説明される；
【００３７】
ｅ）天然ヌクレオシド塩基を修飾し、それぞれ完全または部分的に、例えば、５−（ヒドロキシメチル）ウラシル、５−アミノウラシル、プソイドウラシル、プソイドイソシトシン、ジヒドロウラシル、５−（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルウラシル、５−（Ｃ₂〜Ｃ₆）−アルケニルウラシル、５−（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキニルウラシル、５−（Ｃ₁〜Ｃ₆）アルキルシトシン、５−（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルケニル−シトシン、５−（Ｃ₂〜Ｃ₆）アルキニルシトシン、５−フルオロウラシル、５−フルオロシトシン、５−クロロウラシル、５−クロロシトシン、５−ブロモウラシル、５−ブロモシトシン、または、７−デアザ−７−置換プリンで置換すること。
複素環式の塩基修飾は、例えば、Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ＆Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄＤｒｕｇＤｅｖ．（２０００）２９７に説明される。
【００３８】
その上、オリゴヌクレオチドの化学修飾は、オリゴヌクレオチドと、前記オリゴヌクレオチドの特性（例えばヌクレアーゼ安定性、標的配列に対する親和性、薬物動態学）に有利な影響を与える、および／または、改変オリゴヌクレオチドの標的配列へのハイブリダイゼーションの際に結合および／または架橋により前記標的配列に作用する１またはそれ以上の分子と結合することを含む（オリゴヌクレオチド結合体）。それらの例としては、ポリリジン、インターカレーター（例えばピレン、アクリジン、フェナジン、フェナントリジン）、蛍光性化合物（例えばフルオレセイン）、クロスリンカー（例えばソラレン、アジドプロフラビン）、親油性分子（例えば（Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀）アルキル）、脂質（例えば１,２−ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール）、ステロイド（例えばコレステロールまたはテストステロン）、ビタミン（例えばビタミンＥ）、ポリ−またはオリゴエチレングリコール、（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈）アルキルリン酸ジエステル、および／または、−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ(ＯＨ)−Ｏ−（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈）アルキルとの結合体である。このような分子は、５′および／または３′末端で、および／または、配列内で、例えば核酸塩基で結合させることができる。当業者既知のオリゴヌクレオチド結合体の例は、Ｍａｎｏｈａｒａｎ（２００１）ＣｏｎｊｕｇａｔｅｄＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｉｎＡｎｔｉｓｅｎｓｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｉｎ：Ｃｒｏｏｋｅ（Ｅｄｉｔｏｒ）Ａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＭａｒｃｅｌＤｅｋｋｅｒ．ＮｅｗＹｏｒｋで説明される。
【００３９】
化学修飾の特定の実施形態は、オリゴヌクレオチドと、ａ）親油性分子、例えば（Ｃ₁₂〜Ｃ₂₀）アルキル、ｂ）ステロイド、例えばコレステロールおよび／またはテストステロン、ｃ）ポリ−および／またはオリゴエチレングリコール、ｄ）ビタミンＥ、ｅ）インターカレーター、例えばピレン、ｆ）（Ｃ₁₄〜Ｃ₁₈）アルキルリン酸ジエステル、および／または、ｇ）−Ｏ−ＣＨ₂−ＣＨ(ＯＨ)−Ｏ−（Ｃ₁₂〜Ｃ₁₆）アルキルとの結合に関する。
【００４０】
化学修飾の他の特定の実施形態は、アリールエステル結合体として、例えばＦＤＡ結合体としてＨＭＲ９９／Ｌ０４５で説明されたオリゴヌクレオチドの誘導体化に関し、該誘導体化は、前記オリゴヌクレオチドの細胞の摂取に有用である。
【００４１】
前記オリゴヌクレオチド誘導体を調整する方法は当業者既知であり、例えば、Ｕｈｌｍａｎｎ，Ｅ．＆Ｐｅｙｍａｎ，Ａ．，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．９０（１９９０）５４３、および／または、Ｍ．Ｍａｎｏｈａｒａｎｉｎ“ＡｎｔｉｓｅｎｓｅＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，ＣｒｏｏｋｅａｎｄＬｅｂｌｅｕ，Ｅｄｓ．，ＣＲＣＰｒｅｓｓ，ＢｏｃａＲａｔｏｎ，１９９３，ｃｈａｐｔｅｒ１７，ｐ．３０３ｆｆ、および／またはＥＰ−Ａ０５５２７６６に説明される。
【００４２】
本発明のさらに特定の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、その５′末端に、５′−５′転位を有していてもよい。このタイプの化学修飾は当業者既知であり、例えば、Ｍ．Ｋｏｇａｅｔａｌ.，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．５６（１９９１）３７５７に説明される。その上、５′末端は、オリゴヌクレオチドと、オリゴヌクレオチドの特性（例えばヌクレアーゼに対する安定性、細胞摂取、標的配列に対する親和性、薬物動態学）に有利な効果を与える１またはそれ以上の分子とを結合させるのに好ましい位置である。
【００４３】
本発明は、オリゴヌクレオチドを調製する方法をさらに提供する。説明されたオリゴヌクレオチドを様々な既知の化学法を用いて調製することができ、例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｆ．（１９９１）“ＯｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓａｎｄＡｎａｌｏｇｕｅｓ，ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ”，ＩＲＬＰｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄに説明されたように調製することができる。必要に応じて１またはそれ以上の酵素的な工程を含む方法でオリゴヌクレオチドを調製することもできる。
【００４４】
その上、本発明は、特定の標的遺伝子の発現を調節するため、および、完全または部分的に阻害するため、例えば、完全または部分的に翻訳を阻害するための、オリゴヌクレオチドの使用を提供する。その上、本発明は、わずかな異常な２′５′−オリゴアデニレートシンターゼしか有さない細胞、または、２′５′−オリゴアデニレートシンターゼを全く有さない細胞において、発現を調節するため、および、完全または部分的に阻害するための、前記オリゴヌクレオチドの使用に関する。
【００４５】
その上、本発明は、医薬としての前記オリゴヌクレオチドの使用、または、医薬製造のための前記オリゴヌクレオチドの使用を提供する。特に、特定の遺伝子の発現または過剰発現を伴う病気の予防および／または治療のための医薬において前記オリゴヌクレオチドを使用することが可能である。
【００４６】
本発明は、特定の遺伝子の過剰発現が原因であるか、またはこれが関与する病気の治療のための、前記オリゴヌクレオチドまたは前記オリゴヌクレオチドを含む医薬の使用をさらに提供する。
【００４７】
本発明の医薬は、例えば、ＣＭＶ、ＨＩＶ、ＨＳＶ−１、ＨＳＶ−２、肝炎Ｂ、肝炎Ｃウイルス、またはパピローマウイルスのようなウイルスにより引き起こされる疾患の治療のために用いることができる。本発明の医薬は、例えばポリオウイルス、ＶＳＶまたはインフルエンザウイルスのようなＲＮＡウイルスの治療、また特に、例えばレオウイルスのような二本鎖ＲＮＡウイルスの治療に特に適している。
【００４８】
本発明の医薬はまた、例えばガン治療に適している。この場合において、例えば、ガンの発達または成長の原因となる標的に対して向けられたオリゴヌクレオチド配列を用いることが可能である。このような標的の例としては、以下が挙げられる：
１）核の腫瘍性タンパク質、例えば、ｃ−ｍｙｃ、Ｎ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、ＰＣＮＡ、ｐ１２０、
２）細胞質／膜結合型腫瘍性タンパク質、例えば、ＥＪ−ｒａｓ、ｃ−Ｈａ−ｒａｓ、Ｎ−ｒａｓ、ｒｒｇ、ｂｃｌ−２、ｃｄｃ−２、ｃ−ｒａｆ−１、ｃ−ｍｏｓ、ｃ−ｓｒｃ、ｃ−ａｂｌ、ｃ−ｅｔｓ、
３）細胞性受容体、例えば、ＥＧＦ受容体、Ｈｅｒ−２、ｃ−ｅｒｂＡ、ＶＥＧＦ受容体（ＫＤＲ−１）、レチノイド受容体、タンパク質キナーゼ調節サブユニット、ｃ−ｆｍｓ、Ｔｉｅ−２、ｃ−ｒａｆ−１キナーゼ、ＰＫＣ−α、タンパク質キナーゼＡ（Ｒ１α）、
４）サイトカイン、成長因子、細胞外基質、例えば、ＣＳＦ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ミエロブラスチン、フィブロネクチン、
５）腫瘍抑制遺伝子の阻害剤、例えばＭＤＭ−２。
【００４９】
本発明の医薬は、例えば、インテグリンまたは細胞−細胞付着受容体により、例えばＶＬＡ−４、ＶＬＡ−２、ＩＣＡＭ、ＶＣＡＭまたはＥＬＡＭにより影響を受ける疾患の治療にさらに適している。
【００５０】
本発明の医薬はまた、例えば再狭窄の予防に適している。この点について、例えば、拡散または移動を引き起こす標的に対して向けられたオリゴヌクレオチド配列を用いることが可能である。このような標的の例としては、以下が挙げられる：
１）核のトランスアクチベータータンパク質およびサイクリン、例えば、ｃ−ｍｙｃ、ｃ−ｍｙｂ、ｃ−ｆｏｓ、ｃ−ｆｏｓ／ｊｕｎ、サイクリンおよびｃｄｃ２キナーゼ、
２）マイトジェンまたは成長因子、例えば、ＰＤＧＦ、ｂＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＥＧＦ、
ＨＢ−ＥＧＦおよびＴＧＦ−β、
３）細胞性受容体、例えば、ｂＦＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、および、ＰＤＧＦ受容体。
【００５１】
本発明は、さらに、アデノシンＡ１受容体、アデノシンＡ３受容体、ブラジキニン受容体またはＩＬ−１３の発現を適切なオリゴヌクレオチドを用いて阻害することによる喘息の治療のためのオリゴヌクレオチドに関する。
本発明はまた、例えば、β１−アドレナリン受容体またはＥＤＧファミリーからのタンパク質（例えばＥｄｇ−１）の発現を阻害することにより、例えば心臓血管疾患を治療するためのオリゴヌクレオチドに関する。
本発明はまた、例えばＰＴＰ−１Ｂの発現を阻害することにより、例えば糖尿病を治療するためのオリゴヌクレオチドに関する。
【００５２】
該医薬は、例えば、経口的に投与可能な医薬製剤の形態で、例えば、錠剤、コーティング錠剤、ハードもしくはソフトゼラチンカプセル、溶液、乳濁液または懸濁液の形態で用いることができる。これらはまた、例えば坐剤の形態で直腸に投与することができ、または、例えば注射液の形態で非経口的に投与することができる。医薬製剤は、治療上不活性な有機および無機キャリアー中に前記化合物を加工することにより製造することができる。錠剤、コーティング錠剤およびハードゼラチンカプセルのためのこのようなキャリアーの例としては、ラクトース、コーンスターチまたはそれらの誘導体、タルクおよびステアリン酸またはそれらの塩がある。液剤に適したキャリアーは、水、ポリオール、スクロース、転化糖およびグルコースである。注射液に適したキャリアーは、水、アルコール、ポリオール、グリセロールおよび植物油である。坐剤に適したキャリアーは、植物油および硬化油、ワックス、油脂および半固体ポリオールである。該医薬製剤はまた、保存剤、溶媒，安定剤、湿潤剤、乳化剤、甘味料、着色剤、矯味矯臭剤、浸透圧を改変するための塩、緩衝剤、コーティング剤、抗酸化剤、および、必要に応じて、その他の治療上活性な物質を含んでもよい。
【００５３】
好ましい投与形態は、局所投与であり、例えば、カテーテルを用いた、または、吸入、注射もしくは注入による局所投与、および経口投与である。注射については、オリゴヌクレオチド誘導体は、溶液中に、好ましくは生理学的に許容できる緩衝液（例えば、ハンクス液またはリンガー液）中に処方される。しかしながら、オリゴヌクレオチドを固形状に処方して、使用前に溶解または懸濁してもよい。全身投与に好ましい投与量は、約０.０１mg／kg〜約５０mg／kg体重・１日である。
その上本発明は、オリゴヌクレオチドおよび／または生理学的に許容されるそれらの塩、加えて製薬上適切なキャリアーおよび／または添加物を含む医薬製剤に関する。
【００５４】
オリゴヌクレオチドおよび／または生理学的に許容されるそれらの塩は、そのものを医薬として、互いを含む混合物として、または、局所的、経皮、非経口または経腸の適用が可能であり、活性成分として活性な用量の少なくとも１つのオリゴヌクレオチド、それに加えて一般的な製薬上適切なキャリアーおよび添加物を含む医薬製剤の形態で、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトに投与することができる。製剤は、通常、約０.１〜９０重量％の治療上活性な化合物を含む。例えば、乾癬または白斑のような皮膚疾患の治療に関しては、例えば軟膏、ローションもしくはチンキ、乳濁液、または懸濁液の形態での局所適用が好ましい。該医薬製剤は、製薬上不活性な無機および／または有機キャリアーを用いて、それ自体既知の方法で製造される（例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，ＭａｃｋＰｕｂｌ．Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ．）。丸剤、錠剤、コーティング錠剤およびハードゼラチンカプセルの製造に関しては、例えばラクトース、コーンスターチおよび／またはそれらの誘導体、タルク、ステアリン酸および／またはそれらの塩などが用いることができる。ソフトゼラチンカプセルおよび／または坐剤のためのキャリアーの例は、油脂、ワックス、半固体および液体ポリオール、天然油および／または硬化油などである。液剤および／またはシロップの製造に適したキャリアーの例は、水、スクロース、転化糖、グルコース、ポリオールなどである。注射液の製造に適したキャリアーは、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、植物油などである。マイクロカプセル、インプラントおよび／またはロッドに適したキャリアーは、グリコール酸と乳酸との混合ポリマーである。当業者既知のリポソーム製剤（Ｎ．Ｗｅｉｎｅｒ，ＤｒｕｇＤｅｖｅｌｏｐＩｎｄＰｈａｒｍ１５（１９８９）１５２３；”ＬｉｐｏｓｏｍｅＤｅｒｍａｔｉｃｓ，ＳｐｒｉｎｇｅｒＶｅｒｌａｇ１９９２）、例えばＨＶＪリポソーム（Ｈａｙａｓｈｉ，ＧｅｎｅＴｈｅｒａｐｙ３（１９９６）８７８）もまた適切である。皮膚への投与もまた、例えばイオノフォア法および／またはエレクトロポレーションを用いて可能である。加えて、リポフェクチン、およびその他のキャリアーシステム、例えば遺伝子治療で用いられるキャリアーシステムを用いることができる。特に適切なシステムは、優れた効率でオリゴヌクレオチドを真核細胞に導入するのに用いることができるシステムである。
【００５５】
活性物質およびキャリアーに加えて、医薬製剤はまた、添加物、例えば、充填剤、増量剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、湿潤剤、安定剤、乳化剤、保存剤、甘味料、着色剤、矯味矯臭剤、または芳香剤、増粘剤、希釈剤、緩衝物質、さらに、溶媒および／または可溶化剤および／または持続性を達成するための物質、さらに、浸透圧を改変するための塩、コーティング剤および／または抗酸化剤を含ませることができる。これらはまた、２またはそれ以上の異なるオリゴヌクレオチドおよび／またはそれらの生理学的に許容される塩も含ませることができ、さらにその上、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドに加えて、１またはそれ以上のその他の治療上活性な物質を含ませることができる。
用量は広い範囲で変えることができ、個々のケースにおいて、個々の状況に応じて調節するべきである。
【実施例】
【００５６】
１．式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドの合成
ａ）３′ａａａａａａＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＡＡＣＡＣＣＵＡＧＡＣ（小文字で示された塩基は２′５′インターヌクレオシド結合を有する）
ＡＢＩ３９４ＤＮＡまたはＥｘｐｅｄｉｔｅシンセサイザー（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｗｅｉｔｅｒｓｔａｄｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で合成を行った。製造元が推奨する合成サイクルを用いたが、ただしリボヌクレオシド−２′−Ｏ−ホスホロアミダイトに関しては、濃縮工程を２回行い（カップリング時間はそれぞれ４００秒であった）、ヨウ素酸化工程の長さを３０秒に増やした。用いられた固相は、糖の２′または３′位で５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイルアデノシン（ＮＳＳ−６１０１−１０Ａ，Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を結合させた１０００Åに調整された多孔質ガラス（ＣＰＧ）支持体である。トリクロロ酢酸で開裂させて５′−Ｏ−ジメトキシトリチル基を除去した後、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−２′−Ｏ−ホスホロアミダイト（ＡＮＰ−５６８１，Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）で５回の濃縮により２′５′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。これに続いて、対応する５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−２′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルヌクレオシド−３′−Ｏ−ホスホロアミダイト（ＡＮＰ−５６７１〜ＡＮＰ−５６８０，Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）で繰り返し濃縮することによって、３′５′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。支持体からオリゴマーを分離し、リン酸基およびアミノ保護基脱保護するために、ＣＰＧ支持体を、７５０μｌの濃アンモニア／エタノール（３：１、ｖ：ｖ）で３０℃で２４時間振盪しながらインキュベートした。上清を支持体から分離し、次に、支持体を１５０μｌの濃アンモニア／エタノール（３：１、ｖ：ｖ）で更に２回洗浄した。合わせた上清を減圧下で濃縮し、シリル保護基を除去するために、残留物を１２００μｌのトリエチルアミン×３ＨＦ（非常に毒性）中で振盪しながら３０℃で２４時間インキュベートした。これに続いて、７００μｌのｎ−ブタノールを加え、ドライアイス上で３０分間混合物を冷却し、遠心分離した。ペレットをブタノールで更に２回洗浄した。加えて、塩化ナトリウム沈殿を次に行った。ゲル電気泳動において唯一の主要なバンドを示す１１２ＯＤ（２６０）の粗生成物が得られた。生成物をさらにＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）で特徴付けた（計算値８５２７.２，実測値８５２７.５）。
【００５７】
ｂ）３′ａ^*ａ^*ａａ−Ｃ^*Ｕ^*Ｕ^*ＣＧＣ^*Ｕ^*ＵＣ^*ＣＡＡ^*ＣＡＣ^*Ｃ^*ＵＡＧＡ^*Ｃ
実施例１のａ）と同様にして合成を行い、５′−Ｏ−ジメトキシトリチル−Ｎ−６−ベンゾイル−３′−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルアデノシン−２′−Ｏ−ホスホロアミダイト（ＡＮＰ−５６８１，Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）で３回の濃縮により２′５′−結合オリゴヌクレオチド部分を合成した。特定の酸化工程においてヨード液ではなくＢｅａｕｃａｇｅ試薬（ＲＮ−１５３５，Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を用いることによって、ホスホロチオエート残基を導入した。ゲル電気泳動において唯一の主要なバンドを示す１２８ＯＤ（２６０）の粗生成物が得られた。生成物をさらにＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーマススペクトロメトリー（ネガティブモード）で特徴付けた（計算値８０６１.６，実測値８０６２.８）。
【００５８】
２．ＳＬ−３細胞におけるルシフェラーゼ発現の阻害
生物活性に関して試験するために、実施例１で説明したような以下のオリゴヌクレオチドを調製し、ルシフェラーゼ活性の阻害に関して試験した。
ａ）３′ａａａａａａＣＵＵＣＧＣＵＵＣＣＡＡＣＡＣＣＵＡＧＡＣ
【００５９】
ｂ）３′ａ^*ａ^*ａａ−Ｃ^*Ｕ^*Ｕ^*ＣＧＣ^*Ｕ^*ＵＣ^*ＣＡＡ^*ＣＡＣ^*Ｃ^*ＵＡＧＡ^*Ｃ
トランスフェクション：実験の前の日に、２×１０⁶細胞／mlを６ウェルプレートにプレーティングした。オリゴヌクレオチドを、１００μｌのＳＦ９００II ＳＦＭ（ＳＦ−９００無血清昆虫細胞用培地II；ＧｉｂｃｏＢＲＬ１０９０２−０９６）中に溶解した。トランスフェクションのために、１０μｌのリポフェクチン（１mg／ml；ＧｉｂｃｏＢＲＬ）を１００μｌのＳＦ９００II ＳＦＭと混合し、室温で１５分間インキュベートした。これに続いて、リポフェクチンミックスと核酸とを共にピペッティングし、室温で１５〜４５分間インキュベートした。その間に、細胞を３mlの無血清培地で洗浄し、８００μｌのＳＦ９００II ＳＦＭと核酸／リポフェクチン混合物とを連続的に細胞に加え、続いて、２５℃で一晩インキュベートした。次の日、１mlの培地および血清（ＧｉｂｃｏＢＲＬ１０１２２−１６６：最終濃度２％）を加える。
デュアル−ルシフェラーゼレポーター（ＤＬＲ；プロメガＥ１９６０）アッセイシステム：（ http://www.promega.com/catalog）。
【００６０】
プロメガ社のＤＬＲアッセイは、１つのサンプルから、異なる核酸配列を有するホタルルシフェラーゼおよびウミシイタケルシフェラーゼ活性を逐次的に決定することができる。測定しようとする式Ｉで示されるオリゴヌクレオチドは、ホタルルシフェラーゼに対して向けられた。従って、ウミシイタケルシフェラーゼ活性ではなくホタルルシフェラーゼ活性だけが阻害されるはずである。従って、阻害作用に加えて、特異性も試験され得る。
【００６１】
ウェルプレート中での細胞の受動的な溶解は、初めに培地を除去し、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水（ＧｉｂｃｏＢＲＬ１４２００−０６７）で細胞を洗浄することにより行われた。培地を吸引により完全に除去し、続いて、ＰＬＢ（受動的な溶解緩衝液、水で１：５に希釈；５００μｌのＰＬＢ（１×）が６ウェルプレートの１つのウェルに導入された）をそれに加えた。これに続いて、室温で振盪しながら１５分間インキュベートした。
【００６２】
１０mlのルシフェラーゼ分析緩衝液II（ＬＡＢ II）にルシフェラーゼ分析基質（ＬＡＳ）再懸濁することにより、ルシフェラーゼ分析試薬II（ＬＡＲ II）を調製した。Ｓｔｏｐ＆ＧＩｏ試薬の調製は、２００μｌのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ基質（溶液）を乾燥Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ基質を含むボトルに加え、ボルテクサーを用いて１０秒間溶液を混合することによりなされた。１×Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ溶液を作製するために、２０μｌの５０×Ｓｔｏｐ＆Ｇｌｏ基質と、１mlのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ緩衝液を合わせる。これは、１０回の分析に十分である。
【００６３】
ＤＬＲ−アッセイ：１００μｌのＬＡＲ IIを２０μｌの細胞溶解物と共にウェルに導入し、２〜３秒間上下にピペッティングすることにより混合した。ホタルルシフェラーゼ活性の照度測定の後、１００μｌのＳｔｏｐ＆Ｇｌｏ試薬を加え、溶液を混合し、続いて、ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定した。ＦｌｕｏｒｏｓｋａｎＡｓｃｅｎｔＦＬルミノメーター（ＴｈｅｒｍｏＬａｂｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて発光を測定した。
【００６４】
【表１】

【００６５】
ホタルルシフェラーゼ相補的オリゴヌクレオチドａ）は、非相補的オリゴヌクレオチドｃ）よりも実質的に相当な程度ホタルルシフェラーゼ活性を阻害した。オリゴマーの特定の位置におけるホスホロチオエート残基によるオリゴヌクレオチドの安定化（オリゴヌクレオチドｂ）により、顕著に改善された作用が得られた。３′５′−結合相補配列全体が２′−Ｏ−メチル誘導体として誘導体化された場合、実質的に活性は検出されなかった（オリゴヌクレオチドｄ）。
【００６６】
３．ヒト初期臍帯細胞（ＨＵＶＥＣ）におけるｅｄｇ−１発現の阻害
ヒトの初期細胞における遺伝子発現の阻害に関して本発明のオリゴヌクレオチドを試験するために、前記オリゴヌクレオチドはまた、ヒト遺伝子または対応するＲＮＡに対して向けられ、ヒト細胞（ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞）で試験された。
適切なオリゴヌクレオチドを合成した。最初の２つの配列はｅｄｇ−１ＲＮＡに相補的であり、一方で、第三のオリゴヌクレオチドはミスマッチ塩基を有する。
【００６７】
【化８】

【００６８】
用いられたコントロールオリゴヌクレオチドは、２′５′−オリゴアデニレートを有さない相補配列（センス方向）であった（＊はホスホロチオエートであり、ａ^*ａ^*ａａは２′５′−結合アデニレート（部分的に＊で改変された）であり、ｔｅｇはトリエチレングリコールホスフェートである）。
【００６９】
ヒト細胞（ＨＵＶＥＣ、ヒト臍帯静脈内皮細胞）においてＥｄｇ−１遺伝子発現を阻害するために、特定の位置がホスホチオエートで改変されたオリゴリボヌクレオチド類似体を、以下のようにヒト初期細胞に用いた。
【００７０】
細胞（ＨＵＶＥＣ）および細胞摂取の検出
トランスフェクション：実際のトランスフェクションの２４時間前に、初期ＨＵＶＥＣ（Ｊａｆｅｅｅｔａｌ.，１９７３，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ５２，ｐｐ．２７４５に従って単離された第二世代）を密度２.５×１０⁵細胞／ウェルでラットのコラーゲン−Ｉ（Ｂｉｏｃｏａｔ，＃３５４４００，ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）で被覆した６ウェルプレートにプレーティングした。トランスフェクションのために、６μｌのリポフェクチン（１mg／ml；ＧｉｂｃｏＢＲＬ，＃１８２９２−０１１）を２００μｌの無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地（ＧｉｂｃｏＢＲＬ，３１９８５−０４７）と混合し、室温で１５分間インキュベートした。パラレル反応において、１０μＭ（→最終濃度０.１（Ｊ．ｍ）または１００μＭ（→最終濃度１μＭ）のオリゴヌクレオチド溶液（ＰＢＳ中、ｐＨ７.４）を無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地で１：１０の割合に希釈し、同量のプレインキュベートしたリポフェクチン溶液と混合した。室温で１５分間インキュベートした後、前記混合物の量を無血清Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ１培地で２mlに増やし、回収された細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて、前記混合物と共に、３７℃で、５％ＣＯ₂および湿度９５％で４時間インキュベートした。その後、回収された細胞を再びＰＢＳで洗浄し、続いて、血清含有ＥＧＭ培地（ＣｅｌｌＳｙｓｔｅｍｓ，＃ＣＣ−３０２４＋ＥＧＭサプリメント＃ＣＣ−３１２４）で被覆し、さらに２４または４８時間インキュベートした。蛍光標識したオリゴヌクレオチドを用いた摂取の研究の場合において、細胞を４時間インキュベートし、続いて５％パラホルムアルデヒド（ＰＢＳ中、ｐＨ７.４）で固定し、倍率２００倍の倒立蛍光顕微鏡（ＺｅｉｓｓＡｘｉｏｖｅｒｔ１３５Ｍ）で、冷却したＣＣＤカメラ（ＯＲＣＡ−１，Ｂｆｉｏｐｔｉｌａｓ）を用いて、ＦＩＴＣフィルターを通して励起させて（励起：４９０nm，放出：５１０nm）直接撮影し、ＡＱＭ２０００ソフトウェア（ＫｉｎｅｔｉｃＩｍａｇｉｎｇ）で加工した。
【００７１】
ウェスタンブロット分析：回収された細胞をＰＢＳで１回洗浄し、続いて、２００μｌ／ウェルの２×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１６１−０７３７）でそれをオーバーレイすることにより細胞を溶解した。室温で５分間インキュベートした後、セルスクレーパー（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ，＃３０８５）を用いて細胞溶解産物を回収し、不連続の１２％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ，Ｌａｅｍｍｌｉｅｔａｌ．，１９７０，Ｂｉｏ−Ｒａｄ−Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ−Ｓｙｓｔｅｍ＃３４５−００１４）の前に、９５℃で５分間熱して、この溶液（４５μｌ）を各スロットに適用した。ゲルを１×トリス／グリシン／ＳＤＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１６１−０７３２）で泳動した。免疫ブロットのために、Ｂｉｏ−Ｒａｄクライテリオンウェスタンブロット装置（＃１７０−４０７０）で、ニトロセルロース（ＮＣ）メンブレン（Ａｍｅｒｓｈａｍ＃ＲＰＮ２０２０Ｄ）に、１×トリス／グリシン緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１６１−０７３２，＋１０％メタノール）中で、ゲルをトランスファーした。次に、５％粉乳（“Ｂｌｏｔｔｏ”，Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１７０−６４０４）および０.１％Ｔｗｅｅｎ２０（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１７０−６５３１）を含む１×ＴＢＳ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ＃１７０−６４３５）を用いて、ＮＣメンブレンを室温で１時間飽和させた。Ｂｌｏｔｔｏ非含有ＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ（ＴＢＳＴ）緩衝液でメンブレンを３回洗浄した後、ＴＢＳＴ−Ｂｌｏｔｔｏでの１：５０希釈液中の、抗ｈＥＤＧ−１一次抗体（ＥＤＧ−１特異的ペプチド配列ＣＫＡＨＲＳＳＶＳＤＹＶＮＹＤで免疫化し、ＫＬＨとカップリングし、上述のペプチド配列に対する親和性で精製することによって得られたポリクローナルウサギ血清）で、メンブレンを４℃で一晩インキュベートした。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、二次抗体（アルカリホスファターゼをカップリングした抗ウサギ、Ｄｉａｎｏｖａ＃１１１−０５５−０４５）を、ＴＢＳＴ−Ｂｌｏｔｔｏでの１：２０００希釈液で室温で１時間インキュベートした。さらなる洗浄工程（上記参照）の後、ＥＣＦ（「増強された化学蛍光」）検出反応（Ａｍｅｒｓｈａｍ＃ＲＰＮ５７８５）を行い、ラップフィルムで被覆したＮＣメンブレンを、１mlのＥＣＦ基質（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｍａｃｉａ＃ＲＰＮ５７８５）で、室温で５分間インキュベートし、続いて、Ｆｌｕｏｒ−Ｉｍａｇｅｒ５９５スキャナー（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いて検出した。ＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＡｍｅｒｓｈａｍＰｈａｒｍａｃｉａ）を用いてシグナルを定量し、ＮＣメンブレンを１回脱色し（ＡｌｐｈａＤｉａｇｎｏｓｔｉｃＫｉｔ＃９０１００）、上述の方法に従ってβ−チューブリン特異的一次抗体（親和性で精製されたウサギ抗体、ＳａｎｔａＣｒｕｚ＃ｓｃ−９１０４）をインキュベートした後得られたβ−チューブリンシグナルに標準化した。
【００７２】
【表２】

【００７３】
本発明の化学修飾された一本鎖オリゴリボヌクレオチドで初期ＨＵＶＥＣ細胞を処理することにより、ｅｄｇ−１発現の用量依存性の阻害が生じた。アンチセンス方向のオリゴリボヌクレオチド＃３および＃６のみが遺伝子発現を阻害したが、その一方で、センス方向のオリゴリボヌクレオチド＃２および＃５は、発現を阻害しなかった。ｅｄｇ−１特異的オリゴリボヌクレオチド＃３および＃６で処理した後、チューブリンレベルではなくＥＤＧ−１タンパク質レベルのみが減少したことから、阻害は、標的遺伝子特異的であることが証明された。ｅｄｇ−１相同オリゴリボヌクレオチド＃３および＃６のみがｅｄｇ−１発現を阻害したが、一方で、５個のヌクレオチドがｅｄｇ−１配列とは異なるアンチセンス方向のオリゴリボヌクレオチド＃８は、ｅｄｇ−１発現を阻害しなかったことから、阻害は、用いられたオリゴリボヌクレオチドに関して配列特異的でもあることが証明された。

Claims

式Ｉ：
５′−(Ｎ)_x−(Ｚ)_n 式Ｉ
［式中、Ｎは、少なくとも部分的に標的ＲＮＡに対して相補的な天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、
ｘは、独立して、１０〜１００であり、
ｎは、２〜２０であり、
Ｚは、２′５′インターヌクレオシド結合を介して結合した天然に存在する、または天然に存在しないヌクレオチドであり、
ただし、その相同標的ＲＮＡは以下の配列パターン：
５′−(Ｕ)_v−(Ｎ)_z−(Ｕ)_w
５′−(Ｕ)_v−(Ｎ)_z−ＵＸ
５′−ＵＸ−(Ｎ)_z−ＵＸ、および、
５′−(Ｕ)_v−(Ｎ)_z、
（式中、ｖは、独立して、２〜２０であり、
ｗは、独立して、２〜２０であり、
ｚは、独立して、１５〜２５であり、
Ｕはウリジンであり、Ｎはアデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）またはＵであり、Ｘは、Ａ、ＧまたはＣ、好ましくはＡである）
の１種を有する］
で示されるオリゴヌクレオチド、および、その生理学的に許容される塩。
ｘが１５〜４５である、請求項１に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｘが１６〜２５である、請求項２に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｎが２〜１０である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｎが３〜６である、請求項４に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
Ｎがリボヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｖが２〜１０である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｖが３〜６である、請求項７に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｗが２〜１０である、請求項６〜８のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｗが３〜６である、請求項９に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｚが１６〜２３である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
ｚが１９〜２１である、請求項１１に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
Ｚがアデノシンまたは３′−デオキシアデノシンである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴオリゴヌクレオチド。
１またはそれ以上の天然ホスホジエステル結合が、ヌクレアーゼ分解に対して安定な非天然のインターヌクレオチド結合で置換された、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
１またはそれ以上の天然ホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合で置換された、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
複数の天然ホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート結合で置換され、この改変は末端および内部ピリミジンヌクレオチドに位置する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の式Ｉで示されるオリゴヌクレオチド。
初めに、適切な標的遺伝子に相補的なオリゴヌクレオチドを調製し、このオリゴヌクレオチドを細胞に導入し、この細胞をインキュベートし、次に、コントロール細胞中の対応するｍＲＮＡまたは対応する遺伝子産物の量を比較測定することにより、標的遺伝子の遺伝子発現阻害を測定する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の、１またはそれ以上のオリゴヌクレオチドを用いて細胞での標的遺伝子の遺伝子発現を阻害する方法。
２′５′−オリゴアデニレートシンターゼが、コントロール細胞に比べて低く発現されるか、または、不完全である細胞中で標的遺伝子の遺伝子発現を阻害する、請求項１７に記載の方法。
請求項１〜１８のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、ならびに、添加物および／またはキャリアー、ならびに、必要に応じて、医薬を製造または処方するための賦形剤を含む医薬。
腫瘍治療における、請求項１９に記載の医薬の使用。
感染症の治療または予防における、請求項１９に記載の医薬の使用。
ウイルス性疾患の治療または予防における、請求項１９に記載の医薬の使用。
炎症または喘息の治療における、請求項１９に記載の医薬の使用。
心臓血管性疾患または代謝性疾患の治療における、請求項１９に記載の医薬の使用。
新規の治療用標的遺伝子を同定または確認するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
作物保護研究において、新規の標的遺伝子を同定または確認するための、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
初めに、オリゴヌクレオチドを溶液中または固相で、連続カップリングまたは一括したカップリングにより調製し、調製後に単離および精製する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドの調製方法。
請求項２７に記載のオリゴヌクレオチド誘導体を調製し、必要に応じてさらなる添加物および／またはキャリアー、ならびに、必要に応じて賦形剤と混合する、医薬を調製する
方法。