KR102401450B1 - 전사 인자 tsc22d4의 억제제를 통한 인슐린 저항성의 치료 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 TSC22D 활성 또는 발현의 조절제, 특히 억제제, 및 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병의 예방, 치료 및/또는 조절 및/또는 포유동물에서 인슐린 감수성 개선을 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이들 조절제를 동정하기 위한 스크리닝 방법, 이들 질환의 진단시 확인되는 조절제의 용도, 및 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 물질을 포함하는 키트에 관한 것이다.

Description

전사 인자 TSC22D4의 억제제를 통한 인슐린 저항성의 치료{TREATMENT OF INSULIN RESISTANCE THROUGH INHIBITORS OF TRANSCRIPTION FACTOR TSC22D4}
본 발명은 TSC22D4 활성 또는 발현의 조절제, 특히 억제제, 및 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병을 예방, 치료 및/또는 조절 및/또는 포유동물에서 인슐린 감수성을 개선하기 위한 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 이들 조절제를 동정하기 위한 스크리닝 방법, 이들 질환의 진단시 동정되는 조절제의 용도, 및 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 물질을 포함하는 키트에 관한 것이다.
발명의 배경
인간에서 과도한 지질 축적과 감소된 제거의 조합은 과체중 및 인슐린 저항성, 심혈관 합병증 및 이상지질혈증을 포함한 관련 공존이환을 초래하며(Langin D. In and out: adipose tissue lipid turnover in obesity and dyslipidemia. Cell Metab. 2011 Nov 2; 14(5):569-70), 현재 세계적으로 15억 이상의 인구에게 영향을 끼치고 있다(Finucane MM, et al. National, regional, and global trends in body-mass index since 1980: systematic analysis of health examination surveys and epidemiological studies with 960 country-years and 91 million participants. Lancet. 2011 Feb 12; 377(9765):557-67). 실제로, 인슐린 저항성은 소위 대사 증후군의 핵심 요소를 나타내며, 궁극적으로 대사 기능장애, 예를 들어, 글루코스 불내성, 췌장 베타세포 기능상실 및 결국 제2형 당뇨병의 발달을 초래한다.
손상된 인슐린 분비(베타-세포), 간 글루코스 생성 증가(간) 및 말초(근육) 글루코스 이용의 감소는 제2형 당뇨병의 발달과 진행에 책임이 있는 종래의 주요 결함에 해당한다. 궁극적으로 인슐린 분비 감소를 야기하는 베타-세포 기능상실은 제2형 당뇨병의 자연 경과에서 원래 알던 것보다 더 일찍 발생하는 것으로 알려져 있다. 추가로, 제2형 당뇨병의 병태생리학에 대한 보다 나은 이해는 현재 전조적 옥텟(ominous octet)으로 불리는 기존의 트리아드(triad)를 능가하는 다른 병인 메커니즘을 드러냈다. 베타-세포, 간, 및 근육 이외에 다른 발병 메커니즘은 지방세포 인슐린 저항성(지질 분해 증가), 인크레틴 분비/감수성 감소(위장관), 글루카곤 분비 증가(알파-세포), 글루코스 재흡수 향상(신장), 및 신경전달물질 기능장애로 인한 중추 신경계 인슐린 내성(뇌)을 포함한다. 현재, 제2형 당뇨병의 관리는 혈당(공복 및 식후) 및 헤모글로빈 A(1c)를 낮춤으로써 글루코스를 조절하는데 주력하고 있다. 그러나, 치료의 목표는 질환 진행과 궁극적인 치료 실패를 늦추는 것이어야 한다. 치료는 질환에 대해 알려진 병원성 장애를 대상으로 해야한다(즉, 베타-세포 기능 악화 감소 및 인슐린 감수성의 개선). 최근 몇 년간, 치료 전략은 제2형 당뇨병의 원인이 되는 여러 결함에 영향을 끼치고 질환 진행의 둔화를 통한 지속적인 글루코스 조절을 제공하는 신규 치료 옵션의 개발에 주력해왔다. 제2형 당뇨병의 최적의 관리는 상이한 작용 메커니즘을 갖는 다수의 약물을 조합하여 사용하는 조기의 요법 개시를 포함해야 한다(DeFronzo RA. (Current issues in the treatment of type 2 diabetes. Overview of newer agents: where treatment is going. Am J Med. 2010 Mar;123(3 Suppl):S38-48).
특히, 간, 골격근 및 지방조직을 포함하는 인슐린 작용에 대한 주요 대사 기관의 무감응이, 실질적으로 질환이 진행하고 당뇨병 후기 합병증을 예방하기 위한 약리학적 개입이 궁극적으로 필요한 원인이 된다. 따라서, 효과적이고 안전한 인슐린 감작화가 항-당뇨 요법에 매력적인 표적 및 목표이다.
전사 보조-인자 복합체는 간 및 백색지방조직(WAT)을 포함한 다양한 조직에서 대사 프로그램의 조화에 중요한 체크포인트로서 동정되었다(참조: Sommerfeld A, Krones-Herzig A, Herzig S. Transcriptional co-factors and hepatic energy metabolism. Mol Cell Endocrinol. 2011 Jan 30;332(1-2):21-31).
Kester HA 등(참조: Transforming growth factor-beta-stimulated clone-22 is a member of a family of leucine zipper proteins that can homo- and heterodimerize and has transcriptional repressor activity. J Biol Chem. 1999 Sep 24;274(39):27439-47)은 TGF-베타 자극된 클론-22(TSC-22)가 진화 동안 고도로 보존된 류신 지퍼-함유 단백질을 암호화한다고 기재한다.
게다가, Jones 등(참조: Jones, A., et al., Transforming growth factor-beta1 Stimulated Clone-22 D4 is a molecular output of hepatic wasting metabolism. EMBO Mol Med. 2013 Feb; 5(2):294-308)은, 분자 악액질 산출 경로로서, 전사 인자인 변환 성장인자 베타 1-자극된 클론(TSC)22 D4가 간 수준이 암 악액질에서 증가했다고 기재한다. 건강한 간에서 TSC22D4의 높은 악액질 수준 모방은 간 VLDL 방출 및 지방형성 유전자의 억제, 및 정상 및 고지방 식이 조건 하에서 감소된 전신 VLDL 수준을 이끈다. 따라서, 간 TSC22D4 활성은 암 악액질을 포함한 대사 소모병을 가진 대상체에서 주변 에너지 박탈에 대한 분자적 이론 근거를 나타낼 수 있다.
Kulozik, Ph. 등 (Hepatic deficiency in transcriptional co-factor TBLI promotes liver steatosis and hypertriglyceridemia. 2011 Cell Metab. 13: 389-400)은, 전사 보조인자 트랜스듀신 베타-유사(TBL) 1의 손상된 간 발현이 단일- 및 다유전자적 지방 간 마우스 모델의 공통적인 특징을 나타낸다고 기재한다. 건강한 마우스에서 TBL1 유전자 발현의 간-특이적 차단은 정상 및 고지방 식이 조건 하에서 고트리글리세리드혈증 및 간 지방증을 촉진했다. 또한, TBL1 발현 수준은 인간 환자의 간 지방 함량과 역으로 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌기 때문에, 간 TBL1/TBLR1 보조인자 활성 부족은 비만 및 대사 증후군을 가진 대상체에서 간 지방증에 대한 분자적 이론 근거를 제시할 수 있다.
Berriel Diaz, M, 등(Nuclear receptor co-factor RIP140 controls lipid metabolism during wasting in mice. 2008. Hepatology 48: 782-791)은, 간에서의 RIP140 유도가 간 TG 축적의 동원을 방지함으로써 기아, 패혈증 또는 암 악액질에서의 간 지방증에 대한 분자적 이론 근거를 제공한다고 기재한다. 이에 의해, 간 RIP140 전사 활성의 억제가 이들 조건의 치료에서 매력적인 보조 계획을 제공할 수 있다.
Farese 등(참조: The problem of establishing relationships between hepatic steatosis and hepatic insulin resistance. Cell Metab. 2012 May 2;15(5):570-3)은 간에서 지방의 과도한 축적(간 지방증)이 간 인슐린 저항성과 자주 동반된다고 기재한다.
항-당뇨 및/또는 인슐린 감작화 약물의 주요 부류는, 심각한 한계와 연관된, 설포닐 우레아, 메트포르민, 티아졸리딘 디온, 알파-글루코시다아제 억제제, 인크레틴 모사제, 및 디펩티딜-펩티다아제 4 억제제를 포함한다(참조: Moller, Metabolic disease drug discovery- "hitting the target" is easier said than done. Cell Metab. 2012 Jan 4;15(1):19-24).
제2형 당뇨병의 발병기전에 있어서 인슐린 저항성의 중요한 역할에도 불구하고, 여전히 효과적이고 안전한 인슐린 민감제는 부족하다. 실제로, 티아졸리딘디온 패밀리의 통용되는 약물은 중간 정도의 효능 프로파일을 나타내며, 체중 증가, 심부전 위험 증가, 방광암 위험 가능성 증가, 및, 예를 들어, 로시글리타존의 최근 시장 철수를 야기한 심근경색 위험 증가를 포함하는 상당한 부작용을 동반한다.
따라서, 본 발명의 목적은 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병을 예방, 치료 및/또는 조절, 및/또는 인슐린 저항성을 개선하기 위한 신규 표적 및 전략을 제공하는 것이다.
본 발명의 제1양태에 따르면, 상기 목적은 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병을 예방, 치료, 및/또는 조절, 및/또는 인슐린 저항성, 예를 들어, 포유동물에서 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성을 개선하기 위한 조절제를 동정하는 방법으로서 해결되며, 하기의 단계를 포함한다: a) TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계; b) 상기 샘플을 상기 TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물에 대한 하나 이상의 추정적 조절제와 접촉시키는 단계; 및 c) 상기 하나 이상의 추정적 조절제와 상기 TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물 간의 결합을 검출하는 단계; 및 d) 상기 TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물의 상기 조절제를 동정하는 단계.
본 발명자는 전사 조절제인 변환 성장 인자 베타 1 자극된 클론 22 D4(TSC22D4)가 간 및 전신 인슐린 감수성을 조절한다는 것을 밝혀내었다. 따라서, TSC22D4는 인슐린 시그널화 캐스캐이드에서 수개의 키 노드를 조절함으로써 간 및 전신 인슐린 감수성을 향상시키고 당뇨병 과혈당을 정상화시키는 규명된 분자 및 기관-특이적 표적물을 나타낸다. 전사 TSC22D4 복합체는 인슐린 감수성을 개선하고 당뇨병 병태에서 정상 글루코스 항상성을 회복하기 위해 조작될 수 있는, 간섭-기반 전략을 위한 신규 분자 표적물로서 역할을 한다. 게다가, 본 발명과 관련하여 수행되는 실험에서, TSC22D4의 간-특이적 손실은 글루코스 내성 및 인슐린 감수성, 및 반작용적 고인슐린혈증을 유의하게 개선시켰다. TSC22D4 복합체는 간 및 전신 인슐린 감작화의 신규 분자 체크포인트로서 동정되었으며, 녹다운 전략(shRNA, siRNa 및 miRNA 기술에 의해 매개됨)이 개발되었다. 간-특이적 표적 접근법을 이용하는 간에서의 TSC22D4의 조작(예를 들어, siRNA-기반 녹다운 전략)은 다른 조직에서의 주요 부작용을 피해야 할 것이다.
더 자세히는, 건강한 동물에서 고속 대량 TSC22D4 표적 전사체 연구와 병행한 TSC22D4(NM_030935) 시스트롬의 ChlP-서열 분석은, 인슐린 시그널화 경로의 주요 노드가 TSC22D4, 가장 특히 리포칼린 13, Grb14, 및 SOCS 2/3에 의해 직접적 또는 간접적으로 표적화된다는 것을 밝혀냈다. 1차 마우스 간세포 및 야생형 마우스에서의 TSC22D4 하향-조절 또는 과발현은, 각각 급성 인슐린 노출에 대해 반응하여, 각각 Ser473에서의 Akt/PKB 키나아제 및 Ser9에서의 GSK3베타의 인산화에 의해 측정되는 바와 같이, 세포내 인슐린 시그널화 경로의 상향- 또는 하향-조절을 야기했다.
당뇨병 db/db 마우스에서의 TSC22D4의 간 불활성화는 이들 동물에서 글루코스 불내성 및 인슐린 저항성을 개선하였고 혈당을 거의 건강한 수준으로 정상화시켰다. 당뇨병 동물에서 대사 상태의 전반적 개선과 일치하게, 간-특이적 TSC22D4 결함을 가진 마우스에서 프로-염증성 시토카인 및 레지스틴의 순환 수준이 상당히 낮았다. 흥미롭게도, 간암 세포에서의 TSC22D4 불활성은 세포 성장을 증가시키지 않고 오히려 증식을 감소시켰으며, 이는 TSC22D4의 인슐린 감작화 작용이 영향을 받은 세포/기관에서 암 감수성을 증가시키지 않는다는 것을 암시한다.
상기 조절제의 존재 또는 부재 하에서 TSC22D4 활성 및/또는 발현을 평가하는 단계를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하며, 여기서 상기 조절제의 부재 하에서 측정된 TSC22D4 활성 또는 발현과 비교하여 상기 조절제의 존재 하에서 측정된 TSC22D4 활성 또는 발현이 감소하는 경우, 상기 조절제가 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병의 예방, 치료 및/또는 조절, 및/또는 인슐린 감수성, 예를 들어, 포유동물에서 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성을 개선하는데 사용된다는 것을 나타낸다. 더욱 바람직하게는, 상기 TSC22D4의 활성 또는 발현은 간 활성 또는 발현이며, 즉, 간 세포 또는 조직에서의 활성 및/또는 발현이다.
상기 TSC22D4의 활성 또는 발현이 간 활성 또는 발현인 본 발명에 따른 방법이 더욱 바람직하다. 따라서, 활성 및/또는 발현은 간 세포 또는 조직에서 시험된다.
일 실시형태에서, 본 발명에 따른 방법의 생물학적 샘플은 시험관 내 또는 생체 내에서 후보 화합물과 접촉된다.
본 발명에 따른 방법의 또 다른 측면에서, 상기 방법은 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병의 예방, 치료 및/또는 조절, 및/또는 인슐린 감수성, 예를 들어, 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성을 개선하기 위한 상기 조절제의 효과를 분석하는 단계를 추가로 포함한다. 상기 표유동물에서 유래된 생물학적 샘플 중의 혈당, 프로-염증성 시토카인의 순환 수준, 및/또는 레지스틴을 분석하는 단계를 추가로 포함하는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. 따라서, 이런 시험은 시험되는 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플 중의 마커, 예를 들어, 바람직하게는 상기 조절제의 존재 또는 부재 하의, 인슐린 농도, c-펩타이드 농도, 인터류킨-6 농도, 렙틴 농도, 레지스틴 농도, TNF 알파 농도, 글루카곤 농도 및/또는 PYY 농도의 분석을 포함할 수 있다. 각각의 검정법은 당업자에게 공지되어 있다.
상기 조절제가 바람직하게는 TSC22D4의 발현을 표적화하고 조절하며, 따라서, 유전자 산물의 상응하는 활성을 또한 변경할 수 있는, 펩티드 라이브러리 분자, 압타머, 조합 라이브러리 분자, 세포 추출물 유래 분자, 소분자 약물, 세균 대사물, 파지 디스플레이 분자, 항체 또는 이의 단편, 단백질, 단백질 단편, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 특히 miRNA, siRNA 또는 shRNA 및 이의 배합물 중에서 선택되는 후보 화합물인 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. 명확하게는, "표적화하다"는 유전자 산물, 또는 상기 산물의 작용 영역에의 직접적 또는 간접적 결합을 포함한다(예를 들어, 항제 결합 및 TSC22D4 중화, 따라서 그 활성의 조절).
한 측면에서, 생물활성제는 "RNA 간섭(RNAi)"을 활용한다. RNAi는 이중가닥 RNA(ds RNA) 또는 siRNA에 의해 개시되는 서열-특이적, 전사-후 유전자 침묵의 과정이다. RNAi는 초파리, 선충, 진균 및 식물과 같은 수 많은 유기체에서 보여지고, 항-바이러스 방어, 트랜스포존 활성 조절, 및 유전자 발현의 조절에 관련되는 것으로 생각된다. RNAi 동안 dsRNA 또는 siRNA는 표적 mRNA의 분해와 그 결과로 유전자 발현의 서열-특이적 억제를 유도한다. 본원에서 사용되는, "작은 간섭 RNA"(siRNA)는 TSC22D4 유전자에 표적화되는 뉴클레오티드의 RNA 듀플렉스(duplex)이다. "RNA 듀플렉스"는 RNA 분자의 두 영역 간의 상보적 짝짓기에 의해 형성되는 구조를 말한다. siRNA는 siRNA의 이중 부분의 뉴클레오티드 서열이 표적화된 유전자의 뉴클레오티드 서열에 상보적이라는 점에서 유전자에 "표적화"된다. 일부 실시형태에서, siRNA 듀플렉스의 길이는 30개 뉴클레오티드 미만이다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스는 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11 또는 10개 뉴클레오티드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 듀플렉스의 길이는 19 내지 25개 뉴클레오티드 길이이다. siRNA의 RNA 듀플렉스 부분은 헤어핀 구조의 일부일 수 있다. 듀플렉스 부분 이외에, 헤어핀 구조는 듀플렉스를 형성하는 2개의 서열 사이에 위치한 루프 부분을 포함할 수 있다. 루프는 다양한 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 루프는 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 또는 13개 뉴클레오티드 길이이다. 헤어핀 구조는 또한 3' 및/또는 5' 돌출 부분을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 돌출물은 0, 1, 2, 3, 4 또는 5개 뉴클레오티드 길이의 3' 및/또는 5' 돌출물이다. siRNA는 핵산 서열에 의해 암호화될 수 있으며, 핵산 서열은 또한 프로모터를 포함할 수 있다. 핵산 서열은 또한 폴리아데닐화 시그널을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 폴리아데닐화 시그널은 합성된 최소의 폴리아데닐화 시그널이다.
상기 기재한 본 방법의 또 다른 실시형태에서, TSC22D4의 활성 평가는 효소 활성 검정, 면역 검정, 또는 웨스턴 블로팅, 바람직하게는 전사 인자의 기능 분석을 위한 하나 이상의 방법, 예를 들어 리포터 검정을 포함한다. 일 실시형태에서, TSC22D4의 발현 평가는 노던 블로팅, 마이크로어레이 분석, RNA 혼성화, 메틸화 분석, 및/또는 RT-PCR을 포함한다. 효소의 활성 평가 또는 유전자의 발현 평가는 당업자에게 공지된 효소(여기서 전사 인자)의 활성을 평가하기 위한 모든 방법을 포함한다.
따라서, 대안으로서, 효소 또는 TSC22D4의 발현 활성은 효소 또는 TSC22D4에 의해 조절되는 효소의 발현 활성을 평가함으로써 간접적으로 평가될 수 있다. 이런 시험은 시험되는 대상체로부터 얻어진 생물학적 샘플 중의 마커, 예를 들어, 바람직하게는 상기 조절제의 존재 또는 부재 하의, 인슐린 농도, c-펩타이드 농도, 인터류킨-6 농도, 렙틴 농도, 레지스틴 농도, TNF 알파 농도, 글루카곤 농도 및/또는 PYY 농도의 분석을 포함할 수 있다. 각각의 검정법은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에 따른 추가의 방법은 마이크로어레이 분석, 및 당업자에게 공지된 유전자 발현의 검출 또는 효소 활성에 적합한 임의의 방법이다.
또한, 본 발명의 또 다른 양태는 TSC22D4에 특이적이고, 및 본원에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 방법에 따라 동정되는 조절제에 관한 것이며, 여기서 상기 조절제는 펩티드 라이브러리 분자, 압타머, 조합 라이브러리 분자, 세포 추출물 유래 분자, 소분자 약물, 세균 대사물, 파지 디스플레이 분자, 항체 또는 이의 단편, 단백질, 단백질 단편, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 특히 miRNA, siRNA 또는 shRNA 및 이의 배합물의 그룹 중에서 선택된다. 바람직하게는, 상기 조절제는 TSC22D4의 발현 및/또는 생물학적 활성의 억제제로부터 선택된다.
일 실시형태에서, TSC22D4의 억제제는 안티센스 DNA- 및/또는 RNA-올리고뉴클레오티드, 안티센스 2'-O-메틸 올리고리보뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은-간섭 RNA, miRNA, 록킹된 핵산 LNA(Locked Nucleic Acid LNA®) 염기를 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 모폴리노 안티센스 올리고, PPAR-감마 효능제, 안타고미르(antagomir), 및 이의 혼합물, 특히 TSC22D의 안타고미르로부터 선택된다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 조절제는 융합단백질의 일부일 수 있고/있거나, 임의로 하나 이상의 항-당뇨제, 예를 들어, 상기 조절제와 접합된 화학요법제, 펩티드, 소분자 약물, 및/또는 방사성뉴클레오티드를 포함하는 캐리어 분자의 일부이고/이거나 임의로 하나 이상의 검출 가능한 모이어티를 포함하는 진단제의 일부이다. 이는 특히 본 발명의 진단적 맥락에서 유리하고/하거나 다른 항-당뇨제와 함께 더 효율적인, 바람직하게는 상승 작용적인, 치료를 위한 것이다.
또한, 이의 목적은 a) 임의로, 상기와 같이 본 발명에 따른 방법을 수행하는 단계; 및 b) 동정된 상기한 하나 이상의 조절제 또는 본 발명에 따른 조절제를 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화하는 단계를 포함하는 약제학적 조성물을 생산하기 위한 방법에 의해 해결된다. 약제학적 조성물의 캐리어 및/또는 부형제는 제형 중의 다른 성분과 화합되고 이의 수령인에게 해롭지 않다는 의미에서 "허용가능"해야한다.
상기 목적은 본 발명에 따라 생산되는 약제학적 조성물에 의해 추가로 해결된다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 투여를 위한 것이고/이거나 경구, 직장, 경점막, 경피, 장, 비경구, 근육내, 격막내, 직접 심실내, 정맥내, 복강내, 안내 또는 피하 투여된다.
상기 목적은 질환의 진단시 용도를 위한 및/또는 질환의 예방, 조절, 및/또는 치료를 위한 본 발명에 따른 조절제 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물에 의해서 추가로 해결된다. 상기 질환은 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병으로부터 선택되며 본 발명에 따른 용도를 위한 조절제 또는 약제학적 조성물이 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 용도를 위한 조절제 또는 약제학적 조성물은 펩티드 라이브러리 분자, 압타머, 조합 라이브러리 분자, 세포 추출물 유래 분자, 소분자 약물, 세균 대사물, 파지 디스플레이 분자, 항체 또는 이의 단편, 단백질, 단백질 단편, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 특히 miRNA, siRNA 또는 shRNA 및 이의 배합물의 그룹 중에서 선택된다. 일 실시형태에서, TSC22D4의 억제제는 안티센스 DNA- 및/또는 RNA-올리고뉴클레오티드, 안티센스 2'-O-메틸 올리고리보뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은-간섭 RNA, miRNA, 록킹된 핵산 LNA 염기를 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 모폴리노 안티센스 올리고, PPAR-감마 효능제, 안타고미르, 및 이의혼합물, 특히 TSC22D의 안타고미르로부터 선택된다.
상기 목적은 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병으로부터 선택되는 질환에 대한 존재 또는 위험 검출 및 임의로 진단, 및/또는 인슐린 감수성, 예를 들어, 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성 개선 방법에 의해 추가로 해결되며, 상기 방법은 상기 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 TSC22D4의 발현 및/또는 생물학적 활성을 측정하는 단계를 포함하고; 여기서 건강한 대상체로부터의 샘플에서 측정된 TSC22D4의 활성 또는 발현과 비교하여 상기 샘플에서 측정된 TSC22D4의 활성 또는 발현이 감소하는 경우, 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 제1형 또는 제2형 당뇨병 중에서 선택되는 질환의 존재 또는 위험, 및/또는 인슐린 감수성, 예를 들어, 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성 개선을 나타낸다. 바람직하게는, 상기 검출은 본 발명에 따른 조절제의 결합을 검출하는 것을 포함한다. 상기 샘플이 바람직하게는 혈액, 혈장, 소변, 세포 및 샘플 조직, 예를 들어, 간, 유방, 전립선, 뼈, 연골, 폐 또는 뇌조직을 포함하는 생검으로부터 선택되는 생물학적 샘플인 본 발명에 따른 방법이 바람직하다. "생물학적 샘플"은 임의의 생물학적 공급원의 시료이다. 생물학적 공급원은 임의의 자연 발생적인 또는 유전적으로 변형된 유기체일 수 있다. 생물학적 샘플은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 조직, 세포 배양액, 조 추출물, 체액으로부터 유래될 수 있고, 또한 유전자 발현 산물, 핵산, 단백질 또는 펩티드의 용액 또는 고체 물질로서의 핵산, 단백질 또는 펩티드로부터 유래될 수 있다.
상기 목적은 추가로 이를 필요로 하는 대상체에서 인슐린 저항성, 대사 증후군 및/또는 당뇨병으로부터 선택되는 질환을 치료 및/또는 예방하기 위한 방법에 의해 해결되며, 상기 방법은 이를 필요로 하는 상기 환자에게 본 발명에 따른 조절제 또는 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 유효량을 투여하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조절제는 펩티드 라이브러리 분자, 압타머, 조합 라이브러리 분자, 세포 추출물 유래 분자, 소분자 약물, 세균 대사물, 파지 디스플레이 분자, 항체 또는 이의 단편, 단백질, 단백질 단편, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 특히 miRNA, siRNA 또는 shRNA 및 이의 배합물의 그룹 중에서 선택된다. 일 실시형태에서, TSC22D4의 억제제는 안티센스 DNA- 및/또는 RNA- 올리고뉴클레오티드, 안티센스 2'-O-메틸 올리고리보뉴클레오티드, 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 작은-간섭 RNA, miRNA, 록킹된 핵산 LNA 염기를 함유하는 안티센스 올리고뉴클레오티드, 모폴리노 안티센스 올리고, PPAR-감마 효능제, 안타고미르, 및 이의 혼합물, 및 특히 TSC22D의 안타고미르로부터 선택된다.
상기 목적은 추가로 진단 또는 치료 키트에 의해 해결되며, 상기 키트는 본 발명에 따른 방법을 수행하기 위한 물질, 예를 들어, 임의로 상기 키트의 사용 지침과 함께, 진단을 위한 적합한 효소 및 완충제를 포함한다. TSC22D4 폴리펩티드를 검출하는 키트는 바람직하게는 TSC22D4 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체 및/또는 miRNA를 포함한다. TSC22D4 mRNA를 검출하는 키트는 바람직하게는 TSC22D4 mRNA와 특이적으로 혼성화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 또는 탐침, DNA 탐침, RNA 탐침, 또는 RNA 탐침을 생성하기 위한 템플레이트)을 포함한다. 본질적으로, 바람직하게는 TSC22D4 폴리펩티드 및/또는 mRNA에 대한 약제학적으로 허용되는 조절제를 포함하는 치료 키트에 대해서도 동일하게 유효하다.
TSC22D4 기능 및/또는 발현의 "조절제"는 TSC22D4의 기능 및/또는 발현을 조절 또는 변경하는 물질이다. 상기 조절제는 TSC22D4 기능 및/또는 발현에 직접적으로 또는 간접적으로 영향을 줄 수 있다. TSC22D4 기능 및/또는 발현은, 예를 들어, 이에 제한되는 것은 아니지만, TSC22D4 단백질 도메인에 결합, 또는 TSC22D4의 유전자 발현을 향상 또는 억제함으로써 변경 또는 조절될 수 있다. 본 발명에 따른 조절제는 또한 TSC22D4를 조절하거나, TSC22D4에 의해 조절되는 유전자의 기능 및/또는 발현을 조절 또는 변경함으로써 TSC22D4의 기능 및/또는 발현을 간접적으로 조절 또는 변경할 수 있다.
본 발명에 따른 "유전자 발현 산물"은, 이에 제한되는 것은 아니지만, DNA, cDNA, RNA, 또는 mRNA와 같은 정제된, 재조합의, 자연적, 인공적 또는 합성 뉴클레오티드 서열; 또는 단백질, 또는 펩티드를 포함한다. 본 발명에 따른 "유전자 발현 산물"은, 이에 제한되는 것은 아니지만, 정제된, 재조합의, 자연적, 인공적 또는 합성 유전자 발현 산물 또는 이의 변형물을 포함한다. 본 발명에 따른 핵산 서열은 종래 기술에 공지된 임의의 TSC22D4 암호화 핵산 서열, 또는 상보성 서열, 또는 엄격한 조건 하에서 그에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열, 및 이의 변형물이다.
"억제제"는 촉매 반응(비-생물학적 촉매 또는 효소)에서 촉매의 효율성을 감소시킬 수 있는 물질이다. 본원에 언급된 억제제는 효소 활성의 효율성을 감소시킬 수 있고; 또한, 본원에 언급된 억제제는 효소 발현의 효율성을 감소시킬 수 있다. 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, DNA, cDNA, RNA, miRNA 또는 mRNA와 같은 재조합의, 자연적, 인공적 또는 합성 뉴클레오티드 서열; 또는 단백질(예를 들어, 항체), 또는 펩티드 또는 이의 변형물일 것이다. 억제제는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 임의의 핵산 서열, 또는 상보성 서열, 또는 엄격한 조건 하에서 종래 기술에 공지된 TSC22D4 암호화 뉴클레오티드 서열에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열, 및 이의 변형물일 것이다.
본 발명에 따른 "세포"는 원핵성 또는 진핵성 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 "세포"는 바람직하게는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 간 세포 중에서 선택된다. 포유동물 세포는 바람직하게는 인간, 토끼, 마우스 또는 래트 중에서 선택될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 인간 세포이다. "세포"라는 용어는 또한 동물 모델의 세포를 포함한다. 또한, 세포는 조직 배양물의 일부일 수 있다.
본 발명과 연관된 "예방"이라는 용어는 질환이 있는 환자의 병태를 악화, 또는 건강한 및/또는 아픈 대상체의 부상 또는 죽음을 야기할 가능성이 가장 유력한 부정적인 사건의 발생을 피하는 것을 목적으로 하는 의학적 개입으로 이해되어야 할 것이다.
"이를 필요로 하는 대상체"는, 이에 제한되는 것은 아니지만, 통증, 특히 신경병 통증을 겪는 임의의 동물 또는 인간일 수 있다. 바람직하게는, 이를 필요로하는 대상체는 인간이다.
TSC22D4의 간세포-특이적 불활성은 간 및 골격근에서 인슐린 시그널화를 향상시켰고, 반면 간 TSC22D4 과발현은 인슐린 조직 반응을 둔화시켰다. 결과적으로, 간 TSC22D4 억제는 다양한 당뇨병 마우스 모델 각각에서 고혈당, 글루코스 불내성 및 인슐린 저항성을 모두 예방하고 및 역전시켰다. TSC22D4는 생체 내에서의 염색질 점증(recruitment) 및 유전적 구조(rescue) 실험에 의해 입증되는 바와 같이, 부분적으로 소 분비 단백질 리포칼린(LCN) 13의 전사 조절을 통해 전신 글루코스 항상성에 대해 영향을 끼치는 것으로 밝혀졌다. 감소된 인슐린 감수성 및 고혈당과 관련하여, 간 TSC22D4 수준이 인간 당뇨병 환자에서 증가되는 것으로 밝혀졌기 때문에, 본 발명은 제1형 또는 제2형 당뇨병의 요법, 및 인슐린 저항성, 대사 증후군의 요법에서 및/또는 인슐린 감수성, 예를 들어 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성의 개선을 위한 매력적인 인슐린 감작화 옵션으로써 TSC22D4의 억제를 입증한다.
하기 도면, 서열, 및 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 및 실시예에 기재된 본 발명의 특성 실시형태로 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안 된다. 본 발명의 목적상, 본문에 인용된 모든 참고 문헌은 본원에 그 전체가 포함된다.
도 1은 1차 마우스 간세포에서 TSC22D4의 녹다운이 인슐린 시그널화를 향상시킨다는 것을 도시한다. 1차 (1°) 마우스 간세포의 웨스턴 블롯은 총-Akt 및 인-Akt(Ser473) 항체(세포 시그널화)를 사용하여 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스로 처리되었다. 1차 마우스 간세포를 PBS 또는 인슐린에 10분 동안 항온처리하였다. TSC22D4 shRNA-매개된 녹다운은 Akt-인산화를 증가시켰다.
도 2는 간 TSC22D4의 녹다운이 야생-형 마우스의 인슐린 시그널화를 향상시킨다는 것을 도시한다. 총-Akt 및 인-Akt(Ser473) 항체(세포 시그널화)를 사용하여 주사한지 7일 후 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스 주사된 암컷 C57B1/6 마우스로부터의 간 추출물의 웨스턴 블롯. 장기 수거 20분 전에, 마우스에 복강 내로 PBS 또는 인슐린을 주사하였다. 마우스를 주사하기 전 4시간 동안 절식시켰다. TSC22D4 shRNA-매개된 녹다운은 인슐린 자극 후 Akt-인산화를 증가시켰다.
도 3은 간 TSC22D4의 손실이 야생-형 마우스에서 인슐린 시그널화 경로의 상이한 성분들을 조절한다는 것을 도시한다. 도 4에서와 같이 공복 및 재공급된 상태의 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스 주사된 야생형 암컷 C57B1/6 마우스의 간에서 A) 전사 인자인 변환 성장 인자 베타 1-자극된 클론 22D4(TSC22D4), B) 리포칼린 13(Lcn13), C) 성장 인자 수용체-결합 단백질 14(Grb14), D) 시토카인 시그널화 3 억제제(SOCS3), E) 아데닐 시클라아제 1 (ADCY1)의 정량적 PCR분석(평균 ± SEM, n = 7). 통계적 시험 A-E: 스투덴트 t-시험.
도 4는 TSC22D4의 간세포-특이적 불활성화가 야생형 동물에서 글루코스 내성, 인슐린 감수성을 개선하고 인슐린 수준을 낮춘다는 것을 도시한다. 저지방 식이-공급 C57B16 마우스에 TSC22D4의 장기간 간세포-특이적 녹-다운을 위해 대조군 또는 TSC22D4 miRNA 아데노-관련 바이러스를 주사하였다. A) 바이러스를 주사한지 8주 후, 복강 내로 체중 kg 당 글루코스 1g 주사에 의해 글루코스 내성 시험을 수행하기 전 4시간 동안 마우스를 절식시켰다. B) 바이러스를 주사한지 9주 후, 복강 내로 체중 kg 당 인슐린 1U 주사에 의해 인슐린 내성 시험을 수행하기 전 4시간 동안 마우스를 절식시켰다. TSC22D4의 녹다운으로 대조군 동물과 비교하여 복강 내 인슐린 주사 후 혈당 수준이 현저히 떨어졌으며(p < .001 TWO-WAY ANOVA RM; Holm-Sidak post hoc) 이는 개선된 인슐린 감수성을 나타낸다. 통계적 시험 A-B, D: TWO-WAY ANOVA RM; Holm-Sidak post hoc. 통계적 시험 C: 스투덴트 t-시험.
도 5는 인슐린 감수성이 저지방 및 고지방 식이 조건 하의 장기간 TSC22D4 녹다운에서 개선된다는 것을 도시한다. 도 6에서와 동일한 동물 및 상응하는 고지방 식이-공급 집단에서 인슐린 저항 지수(HOMA). (평균 ± SEM, n = 7).
도 6은 간의 TSC22D4의 녹다운이 인슐린 감수성을 개선하고 유전적으로 당뇨병에 걸린 마우스를 정상화한다는 것을 보여준다. 11주령의 db/db 마우스(비만에 대한 유전적 마우스 모델)에 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스를 주사하였다. A) 바이러스를 주사한지 7일 후, 복강 내로 체중 kg 당 인슐린 2U 주사에 의해 인슐린 내성 시험을 수행하기 전 4시간 동안 마우스를 절식시켰다. TSC22D4의 녹다운으로 대조군 동물과 비교하여 복강 내 인슐린 주사에 따라 혈당 수준이 현저히 떨어졌으며(p < .001 TWO-WAY ANOVA RM; Holm-Sidak post hoc) 이는 개선된 인슐린 감수성을 나타낸다. B) 바이러스를 주사한지 13일 후, 복강 내로 체중 kg 당 글루코스 1g 주사에 의해 글루코스 내성 시험을 수행하기 전 4시간 동안 마우스를절식시켰다. TSC22D4의 녹다운으로 대조군 동물과 비교하여 복강 내 글루코스 주사에 대해 대사 반응이 개선되었으며(p < 0.001; TWO-WAY ANOVA RM; Holm-Sidak post hoc) 이는 개선된 인슐린 감수성을 나타낸다. C) 마우스를 공복상태(18시간 동안), 재공급(18시간 공복상태 후 6시간 재공급), 또는 임의의 공급 상태에서 희생시켰다. 공복상태, 재공급 또는 임의의 공급 조건 하의 혈당 수준(mg/dl) (평균 ± SEM, n=4). D) db/db 마우스의 1일 물 섭취량(g) (평균 ± SEM, n=12). 통계적 시험 A-B: TWO-WAY ANOVA RM; Holm-Sidak post hoc. 통계적 시험 C-D: 스투덴트 t-시험.
도 7은 TSC22D4 녹다운 시 db/db 마우스에서의 신체 조성물 마커를 도시한다. 11주령의 db/db 마우스(도 8에서와 동일한 동물)에 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스를 주사하였다. 마우스를 공복(18시간 동안), 재공급(18시간 공복상태 후 6시간 재공급), 또는 임의의 공급 상태에서 희생시켰다. A) 체중(g) (평균 ± SEM, n=4). B) 간 중량(g) (평균 ± SEM, n =4). C) 혈청 알라닌-아미노트랜스퍼라제 수준 (ALT; 평균 ± SEM, n =4). D) 간 글리코겐 수준 (간 조직 g당 글리코겐 mg; 평균 ± SEM, n =4). E) 간 트리글리세리드 수준 (간 조직 g당 트리글리세리드 mg; 평균 ± SEM, n =4). E) 간 글리코겐 수준 (간 조직 g당 글리코겐 mg; 평균 ± SEM, n =4). E) 혈청 트리글리세리드 수준 (혈청 ml당 트리글리세리드 mg; 평균 ± SEM, n =4). 통계적 시험 A-E: 스투덴트 t-시험.
도 8은 간 TSC22D4 결핍이 당뇨병 db/db 마우스에서 염증성 마커의 발현을 개선한다는 것을 도시한다. 11주령의 db/db 마우스(도 8에서와 동일한 동물)에 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스를 주사하였다. 마우스를 공복(18시간 동안), 재공급(18시간 공복상태 후 6시간 재공급), 또는 임의의 공급상태에서 희생시켰다. A) 혈청 인슐린 수준(pg/ml) (평균 ± SEM, n =4). B) 혈청 C 펩티드 수준 (pg/ml) (평균 ± SEM, n =4). C) 혈청 인터류킨-6 수준(pg/ml) (평균 ± SEM, n =4). D) 혈청 렙틴 수준(pg/ml) (평균 ± SEM, n =4). E) 혈청 레지스틴 수준(pg/ml) (평균 ± SEM, n =4). F) 혈청 TNF 알파 수준(pg/ml) (평균 ± SEM, n =4). 통계적 시험 A-H: 스투덴트 t-시험.
도 9는 당뇨병 동물에서 TSC22D4의 간 녹다운이 인슐린-감작화 유전자를 상향 조절시킨다는 것을 도시한다. 임의의, 공복(18시간) 및 재공급(18시간 공복상태 후 6시간 재공급) 상태의 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스 주사된 db/db 마우스(도 8에서와 동일한 동물)의 간에서 A) 전사 인자인 변환 성장 인자 베타 1-자극된 클론 22D4 (TSC22D4), B) 리포칼린 13(Lcn13), C) 성장 인자 수용체-결합된 단백질 14 (Grb14), D) 시토카인 시그널화 3 억제제 (SOCS3), E) 아데닐레이트 시클라아제 1 (ADCY1)의 정량적 PCR 분석(평균 ± SEM, n = 7). 통계적 시험 A-D: 스투덴트 t-시험.
도 10은 TSC22D4의 손실이 당뇨병 간에서 인슐린 시그널화를 향상시킨다는 것을 도시한다. 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스로 주사된 11주령의 db/db 마우스(도 8에서와 동일한 동물)로부터의 간 추출물의 웨스턴 블롯. 주사한지 7주 후 간 용해물을 총-Akt 및 인-Akt(Ser473) 항체(세포 시그널)에 대해 블로팅하였다. 마우스를 공복상태(18시간 동안) 또는 재공급(18시간 공복상태 후 6시간 재공급) 상태에서 희생시켰다. TSC22D4의 shRNA-매개된 녹다운은 공복상태 및 재공급 조건 하 모두에서 Akt-인산화를 증가시켰다.
도 11은 TSC22D4의 간세포-특이적 불활성화가 당뇨병-경향 마우스에서 고혈당을 예방한다는 것을 도시한다. 명백한 고혈당 발병 이전 5주령(그래프에서는 0주를 나타냄)의 db/db마우스에 TSC22D4 miRNA를 발현하는 AAV를 주사하였다. 글루코스(mg/dl)를 바이러스 주사 시 및 바이러스 주사 2 및 4주 후에 측정하였다. 글루코스 측정 전 마우스를 4시간 동안 절식시켰다. (평균 ± SEM, n = 7).
도 12는 TSC22D4가 LCN13 내분비계를 통해 작용하고 인간에서 인슐린 감수성을 서로 관련된다는 것을 도시한다. (A) 야생-형 마우스의 간에서 TSC22D4에 대한 항체에 의한 LCN13 프로모터 영역(1-3)의 염색질 면역침전. qPCR에 의해 측정된 음성 대조군 IgG과 비교한 농축 배율(fold). 영역 4는 음성 PCR 대조군을 나타낸다(n=2-3). 상이한 TSC22D4 항체를 사용하여 유사한 결과를 수득하였다. (B) 대조군 또는 TSC22D4 shRNA 아데노바이러스-주사된 야생형 C57B1/6(좌측), db/db(중간) 및 NZO 마우스(우측)의 간에서 LNC13의 정량적 PCR 분석(평균 ± SEM, 각 실험 당 n > 6 ). (C) 주사한지 7일 후 대조군(NC shRNA) 또는 TSC22D4(D4 shRNA) shRNA 아데노바이러스-주사된 C57B1/6 마우스로부터의 혈청을 LCN13 항체로 면역침전시키고 및 LCN13 항체로 면역블로팅하였다. 알부민 항체를 로딩 대조군으로 사용하였다. (D) 총-Akt, 인-Akt(Ser473), 및 VCP 항체를 사용한 대조군 (PBS) 또는 LCN13 (200nM)-처리된 C2C12 근육세포 추출물로부터의 대표적인 웨스턴 블롯. 각각 LCN13 (3시간) 및 15분 동안의 인슐린 처리(30nM)를 나타냄. 농도계 분석이 표시되었다. **는 인슐린의 효과를 나타내고; ##은 LCN13의 효과를 나타낸다. (E) 주사한지 1주 후 대조군(대조군 shRNA), LCN13(LCN13 shRNA), TSC22D4(TSC22D4 shRNA), TSC22D4 + LCN13(TSC22D4 + LCN13 shRNA) shRNA 아데노바이러스-주사 db/db마우스에서의 글루코스 내성 시험. 글루코스를 체중 kg당 1g 글루코스 농도로 복강 내 주사하였다. *는 NC와 TSC22D4 그룹 간의 유의성을 나타내고; #은 TSC22D4와 TSC22D4 + LCN13 그룹 간의 유의성을 나타내며; $는 NC와 TSC22D4 + LCN13 그룹 간의 유의성을 나타낸다. (F) (E)에서와 동일한 마우스에서 HOMA IR 지수. (G) (E)에서와 동일한 마우스에서 혈청 글루코스 수준. (H) 제2형 당뇨병 (T2D, n=26) 또는 정상 글루코스 내성 (NGT, n=40)을 가진 환자의 간에서 TSC22D4 mRNA 발현의 정량적 PCR분석. (I) (H)에서와 동일한 환자의 TSC22D4 mRNA의 간 발현과 공복상태의 혈장 글루코스의 상관관계. (J) (H)에서와 동일한 환자에서 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 연구 동안의 TSC22D4 mRNA의 인간 간 발현과 글루코스 주입 속도(GIR)의 상관관계. A에 대한 통계적 분석, C-F: 스투덴트 t-시험, G-I: 피어슨(Pearson) 상관 계수, *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001.
도 13은 (A) 제2형 당뇨병(n=26) 또는 정상 글루코스 내성(n=40)을 가진 환자에서 LCN13 (Obp2a)의 인간 간 발현과 TSC22D4 mRNA 수준과의 상관관계. (B) 제2형 당뇨병(T2D, n=26) 또는 정상 글루코스 내성(NGT, n=40)을 가진 환자의 간에서 LCN13(Obp2a) mRNA 발현의 정량적 PCR 분석. (C) (A)에서와 동일한 환자에서 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 연구 동안의 LCN13(Obp2a) mRNA의 인간 간 발현과 글루코스 주입 속도(GIR)의 상관관계. (D) (A)에서와 동일한 환자에서 LCN13(Obp2a) mRNA의 간 발현과 공복상태의 혈장 글루코스의 상관관계. A, C, D에 대한 통계적 분석: 피어슨 상관계수, b: 스투덴트-t 시험, *: p < 0.05; **: p < 0.01; ***: p < 0.001.
서열번호 1 내지 4는 본 발명의 실험에서 사용된 올리고뉴클레오티드를 나타낸다.
실시예
재조합 바이러스
U6 프로모터의 조절 하의 TSC22D4 또는 비-특이적 shRNA, 또는 CMV 프로모터의 조절 하의 TSC22D4 cDNA를 발현하는 아데노바이러스를 BLOCK-iT Adenoviral RNAi 발현 시스템(Invitrogen, Karlsruhe, Germany)을 사용하여 클로닝하였다. 바이러스를, 이전에 기재된 바와 같이, 염화세슘 방법으로 정제하였고 동물에 주사 전에 10% 글리세롤을 함유하는 포스페이트-완충된-식염수 완충액에 대하여 투석하였다(Herzig S, Hedrick S, Morantte I, Koo SH, Galimi F, Montminy M. CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPAR-gamma. Nature. 2003; 426: 190-193. Herzig S, Long F, Jhala US, Hedrick S, Quinn R, Bauer A, Rudolph D, Yoon C, Puigserver P, Spiegelman B, et al. CREB regulates hepatic gluconeogenesis through the coactivator PGC-1. Nature. 2001; 413: 179-183). 간세포-특이적 프로모터의 조절 하의 대조군 또는 TSC22D4-특이적 miRNA(s)를 암호화하는 AAV(s)는 이전에 기재된 바와 같이 설정되었다(Rose AJ, Frosig C, Kiens B, Wojtaszewski JF, Richter EA. Effect of endurance exercise training on Ca2+ calmodulin-dependent protein kinase II expression and signaling in skeletal muscle of humans. J Physiol. 2007; 583: 785-795).
동물 실험
수컷인 8 내지 12주령의 C57B1/6 및 10주령의 db/db 마우스가 챨스 리버 실험실 (Charles River Laboratories; Brussels, Belgium)로부터 수득되었고 정기적인 비제한 식이와 12시간 명-암 주기로 관리되었다. 인슐린 및 글루코스 내성 시험 전에, 동물을 4시간 동안 절식시켰다. 그외에는, 동물은 무제한으로 먹이를 공급받았으며 자유롭게 물에 접근 가능했었다. 아데노바이러스 주사를 위하여, 재조합 바이러스 당 1 내지 2 × 109개 플라크-형성 단위(pfu)를 꼬리 정맥 주사를 통해 투여하였다. AAV 실험을 위하여, 5 × 1011개 바이러스를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 각 실험에서, 6 내지 12마리 동물이 동일한 치료를 받았으며, 나타낸 바와 같이 절식상태(18시간 절식상태), 임의의 공급 또는 공급(18시간 절식 후 6시간 재-공급)조건 하에서 분석하였다. 간, 부고환 및 복부 지방 패드, 및 장딴지 근을 포함하는 기관을 특정 시간 후 수집하고, 중량을 재고, 스냅-동결 후, 추가 분석에 사용하였다. 총 신체 지방 함량을 Echo MRI 신체 조성물 분석기(Echo Medical Systems, Houston, USA)로 측정하였다. 동물 취급 및 실험은 NIH 지침에 따라 수행하였으며 지방 정부 당국에 의해 허가되었다.
인슐린 내성 시험을 위해 1U 인슐린/mL의 원액(stock solution)을 0.9% 염화나트륨을 사용하여 제조하였다. 마우스를 실험 전 4시간 동안 절식시켰다. 모든 동물의 체중을 측정하고 면도날로 꼬리를 자름으로써 혈당 수준을 측정하였다. 혈액 방울을 혈당 측정기 스트립 상에 떨어뜨리고 측정하였다. 1U 인슐린/체중kg을 C57B1/6 복강 내로 주사하였고 1.5U 인슐린/체중kg을 db/db 마우스 복강 내로 주사하였다. 혈당 수준을 20, 40, 60, 80 및 120분 후 모니터링하였다.
글루코스 내성 시험을 위해 20% 글루코스의 원액을 0.9% 염화나트륨을 사용하여 제조하였다. 마우스를 실험 전 4시간 동안 절식시켰다. 모든 동물의 체중을 측정하고 면도날로 꼬리를 자름으로써 혈당 수준을 측정하였다. 혈액 방울을 혈당 측정기 스트립 상에 떨어뜨리고 측정하였다. 20% 글루코스 용액 그램 당 5㎕를 C57B1/6 및 db/db 마우스 복강 내로 주사하였다. 혈당 수준을 20, 40, 60, 80 및 120분 후 모니터링하였다.
인간 대상체
본 발명자는 뤽 상 Y 우회술(Roux en Y bypass), 위소매 절제술, 선택 담낭절제술 또는 탐구적 개복술로 인한 개복술을 겪은 광범위하게 특징지어진 백인(caucasian) 비만 및 마른 남자 및 여자 66명으로부터 수득된 간 조직 샘플에서 TSC22D4 mRNA 발현을 조사하였다. 경구 글루코스 내성 시험으로, 본 발명자는 제2형 당뇨병(n=26) 또는 정상 글루코스 내성(n=40)을 가진 개인을 동정하였다. 인슐린 감수성을 기재된 바와 같이 정상혈당-고인슐린 클램프 방법을 사용하여 평가하였다. 모든 기준치 혈액 샘플을 밤새 절식 후 오전 8시 내지 10시 사이에 수집하였다. 모든 연구 프로토콜은 라이프치히 대학의 윤리위원회에 의해 승인되었다(363-10-13122010 및 017-12-230112). 모든 참가자는 연구에 참여하기 전에 동의서를 제출했다.
혈액 대사물
글루코스 및 트리글리세리드(TG)의 혈청 수준을 자동 글루코스 모니터(One Touch, Lifescan, Neckargemund, Germany) 또는 시판 키트(Sigma, Munich, Germany; RANDOX, Crumlin, Northern Ireland; WAKO, Neuss, Germany, respectively)를 사용하여 측정하였다. 인슐린 수준을 마우스 인슐린 효소-결합된 면역흡착 검정법을 사용하여 측정하였다(Mercodia, Uppsala, Sweden).
조직 지질 추출
간 지질을 이미 기재된 바와 같이 추출하였다(Herzig S, Hedrick S, Morantte I, Koo SH, Galimi F, Montminy M. CREB controls hepatic lipid metabolism through nuclear hormone receptor PPAR-gamma. Nature. 2003; 426: 190-193).
조직 화학
간 조직을 조직 테크(Tek) 최적 절단 온도 화합물에 매몰시켰다.(Sakura, Torrance, USA). 5-마이크로미터 동결절편을 기재된 바와 같이 해마톡실린 및 에오신 오일 레드 오(Oil Red O)로 염색하였다(Peet DJ, Turley SD, Ma W, Janowski BA, Lobaccaro JM, Hammer RE, Mangelsdorf DJ (1998) Cholesterol and bile acid metabolism are impaired in mice lacking the nuclear oxysterol receptor LXR alpha. Cell 93: 693- 704).
정량적 타크맨 ( Taqman ) RT- PCR
총 RNA를 퀴아졸 시약(Qiagen, Hilden, Germany)을 사용하여 균질화된 마우스 간 또는 세포 용해물로부터 추출하였다. cDNA를 M-MuLV 효소 및 올리고 dT 프라이머(Fermentas, St. Leon-Rot, Germany)를 사용하여 역전사에 의해 제조하였다. cDNA를 주문형 검정 키트(assay-on-demand kit) 및 ABIPRISM 7700 서열 검출기(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany)를 사용하여 증폭시켰다. RNA 발현 데이터를 TATA-박스 결합 단백질(TBP) RNA의 수준으로 정규화하였다.
인간 TSC22D4 mRNA 발현을 타크맨 검정을 사용하여 형광 온도 사이클러에서 정량적 실시간 RT-PCR로 측정하고, 형광을 ABI PRISM 7000 서열 검출기(Applied Biosystems, Darmstadt, Germany) 상에서 검출하였다. 총 RNA는 트라이졸(Life technologies, Grand Island, NY)을 사용하여 단리하고, 1 ㎍ RNA를 표준 시약(Life Technologies, Grand Island, NY)으로 역전사시켰다. 각 RT-PCR에 대해, 2 ㎕를 ktratagene으로부터의 Brilliant SYBR green QPCR Core 시약 키트(La Jolla, CA)을 사용하여 제조사의 지침에 따라 26 ㎕의 PCR 반응으로 증폭시켰다. 샘플을 초기 변성을 위해 95°C에서 10분 동안 ABI PRISM 7000 서열 검출기에서 항온처리하고, 각각 95°C에서 15초, 60°C에서 1분 및 72°C에서 1분의 사이클로 이루어진 40번의 사이클을 수행하였다. 인간 TSC22D4 및 Obp2a(LCN13) (각각 Hs00229526_m1 및 Hs01062934_g1에 의해 측정됨) (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany) mRNA 발현을 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라아제 1 (HPRT1)의 mRNA 발현과 비교하여 추정하고, HPRT1의 수요에 관한 프리믹스 검정에 의해 측정하였다 (Hs01003267_m1) (Applied Biosystems, Darmstadt, Germany). 특정 전사물의 증폭을 각 PCR 말에 용융 곡선 프로필(형광 측정과 함께 샘플을 68°C로 냉각시키고 95°C로 천천히 가열함)에 의해 확인하였다. PCR 특이성을 증폭 산물을 아가로오스 겔 전기영동함으로써 추가로 입증하였다.
단백질 분석
단백질을 동결된 기관 샘플 또는 세포 용해 완충액 중의 배양된 간세포로부터 추출하고(Rose AJ, Frosig C, Kiens B, Wojtaszewski JF, Richter EA. Effect of endurance exercise training on Ca2+ calmodulin-dependent protein kinase II expression and signaling in skeletal muscle of humans. J Physiol. 2007; 583: 785-795), 단백질 20㎍을 4-12% SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩한 후 니트로셀룰로오스 막에 블로팅하였다. 웨스턴 블롯 검정법을 TSC22D4(Abcam, Cambridge, UK or Sigma, Munich, Germany), AKT, p-AKT, GSK, p-GSK(Cell signaling, Danvers, USA) 또는 VCP(Abcam)에 특이적인 항체를 사용하여 기재된 바와 같이(Herzig et al, 2001) 수행하였다.
플라스미드 및 RNA 간섭
shRNA 실험을 위해, 마우스 TSC22D4를 표적하는 올리고뉴클레오티드 (GCCTGGTTGGCATTGACAACACGAATG; 서열번호 1)를 어닐링하고 pENTR/U6 shRNA 벡터(Invitrogen) 내로 클로닝하였다. 어떠한 포유동물 유전자 서열과도 유의한 상동성이 없는 비-특이적 올리고뉴클레오티드(5'-GATCTGATCGACACTGTAATG-3′서열번호 2)를 모든 실험에서 비-침묵 대조군으로 사용하였다. miRNA 실험을 위해서, 마우스 TSC22D4를 표적하는 올리고뉴클레오티드(5'-GACAGCGATGACGATAGTGGT-3′서열번호 3) 및 비-특이적 올리고뉴클레오티드(5'-AAATGTACTGCGCGTGGAGAC-3′서열번호 4)를 pdsAAV-LP1 벡터 내로 클로닝하였다.
세포 배양 및 일시적 형질전환 검정
1차 마우스 간세포를 기재된 바와 같이 단리하고 배양하였다(Klingmuller U, Bauer A, Bohl S, Nickel PJ, Breitkopf K, Dooley S, Zellmer S, Kern C, Merfort I, Sparna T, et al. Primary mouse hepatocytes for systems biology approaches: a standardized in vitro system for modelling of signal transduction pathways. IEE Proc Syst Biol. 2006; 153: 433-447). 간략하게는, 8 내지 12주령의 수컷 C57B1/6 마우스를 100mg/체중kg의 케타민 염산염 및 5mg/체중kg의 자일라진 염산염의 복강 내 주입에 의하여 마취시켰다. 개복 후, 간을 37°C에서 간문맥을 통해 5분 동안 HANKS I (8 g NaCl, 0.4 g KCl, 3.57 g Hepes, 0.06 g Na2HPO4 × 2 H2O, 0.06 g KH2PO4 , 1 L 증류된 H2O 중, 2.5 mM EGTA, 0.1% 글루코스, pH 7.4로 조절됨)에 이어서 간 구조의 분해가 관찰될 때까지 5 내지 7분 동안 HANKS II(8 g NaCl, 0.4 g KCl, 3.57 g Hepes, 0.06 g Na2HPO4 × 2 H2O, 0.06 g KH2PO4 , 1 L 증류된 H2O 중, 0.1% 글루코스, 3 mg/ml 콜라게나제 CLSII, 5 mM CaCl2, pH 7.4로 조정)로 관류시켰다. 간 피막을 제거하고 세포 현탁물을 100㎛ 메쉬를 통해 여과시켰다. 세포를 세척한 후, 세포 생존력을 트립판 블루 염색에 의해 측정하였다. 웰당 1,000,00개의 살아있는 세포를 콜라겐 I-코팅된 6-웰 플레이트 상에 접종하였다. 24시간 후, 세포를 100의 감염 다중도로 재조합 아데노바이러스로 감염시켰다. 자극 실험을 위해, 1차 간세포를 10분 동안 100nM/6-웰의 농도로 PBS(대조군 배지) 또는 인슐린으로 처리하였다. 세포를 감염 48시간 후에 수거하였다.
간 TSC22D4의 시스트롬 분석
Chip-서열분석의 KEGG-경로 분석 결과를 중요성에 따라 분류하였다. 인슐린 시그널화 경로가 유의하게 조절되는 것으로 밝혀졌다(p = 0.00005). Chip-서열분석은 주사한지 7일 후 Flag-TSC22D4 아데노바이러스-주사된 수컷 C57B1/6 마우스의 간 추출에서 수행되었다.
인간 환경에서 연구 결과의 관련성을 시험하기 위해, 본 발명자는 정상 글루코스 내성(NGT) 또는 제2형 당뇨병(T2D)을 가진 66명의 환자 집단을 분석하였다. TSC22D4 mRNA가 상대 NGT에 비해 T2D 환자의 간에서 유의하게 증가되었다(도 12h). 마우스에서 TSC22D4의 인슐린-감작화 및 글루코-조절 기능과 일치하게, 간 TSC22D4 mRNA 수준은 이러한 인간 집단에서 간 공복상태 글루코스 수준(도 12i) 및 인슐린 감수성과 유의하게 연관되었으며, 후자는 고인슐린혈증-정상혈당 클램프 동안 글루코스 주입 속도(GIR)에 의해 측정되었다(도 12j). TSC22D4 mRNA 수준은 순환 TG 및 프로-염증성 시토카인 수준과 분명히 연관되었으며, 따라서 동물 모델로부터의 결과를 더욱 지지한다. 중요하게는, 환자 집단에서 LCN13 발현 연구는 TSC22D4 및 LCN13 mRNA 수준 간에 매우 유의한 상관관계를 나타내었으며, 비-당뇨병 대상체에 비해 당뇨병 환자에서 전반적으로 낮은 LCN13 발현을 나타내었다. 추가로, 간 LCN13 mRNA 수준은 인간에서 GIR 및 공복상태 글루코스 수준과 연관되었으며, 전반적으로 동물 모델에서의 TSC22D4-LCN13-인슐린 감작화 연계를 재현한다.
종합하면, 상기 데이터는 TSC22D4가 전신 글루코스 대사 및 인슐린 감수성에서 임계 노드임을 확증한다. LCN13 내분비계에 대한 TSC22D4의 업스트림 조절 기능 및 인슐린 감수성 및 글루코스 축적에 대한 후속적인 다중-기관 증진을 고려할 때, TSC22D4 억제가 예방적 및 치유적 제2형 당뇨병 치료 및 인슐린 감작화에 매력적인 대안 형태를 나타낸다는 것이 명백하다.
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Claims (15)

  1. 인슐린 저항성, 대사 증후군, 및 제1형 또는 제2형 당뇨병 중에서 선택되는 적어도 하나의 질환의 예방, 치료, 조절, 또는 이의 조합을 위한, 또는 인슐린 감수성 또는 포유동물에서 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성의 개선을 위한 조절제를 동정하는 방법으로서,
    a) TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물을 포함하는 생물학적 샘플을 제공하는 단계;
    b) 상기 샘플을, 상기 TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물에 대한 적어도 하나의 추정적 조절제와 접촉시키는 단계;
    c) 상기 적어도 하나의 추정적 조절제와 상기 TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물 간의 결합을 검출하는 단계;
    d) 상기 TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물에 결합하는 것으로 동정된 추정적 조절제의 존재 또는 부재 하에 TSC22D4의 활성 또는 발현 중 적어도 하나를 평가하는 단계; 및
    e) 상기 TSC22D4 암호화 핵산 서열 또는 TSC22D4의 유전자 발현 산물에 대한 조절제를 동정하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 조절제의 부재 하에 측정된 TSC22D4의 활성 또는 발현과 비교하여 상기 조절제의 존재 하에 측정된 TSC22D4의 활성 또는 발현의 감소가, 상기 조절제가 인슐린 저항성, 대사 증후군 및 제1형 또는 제2형 당뇨병 중에서 선택되는 적어도 하나의 질환의 예방, 치료, 조절, 또는 이의 조합을 위한, 또는 인슐린 감수성 또는 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성을 개선하기 위한 조절제임을 나타내는 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 TSC22D4의 활성 또는 발현이 간에서의 TSC22D4의 활성 또는 발현인, 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 조절제의 존재 또는 부재 하에 인슐린 농도, c-펩타이드 농도, 인터류킨-6 농도, 렙틴 농도, 레지스틴 농도, TNF 알파 농도, 글루카곤 농도 및 PYY 농도 중 적어도 하나를 분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 조절제가 펩티드 라이브러리 분자, 압타머, 조합 라이브러리 분자, 세포 추출물 유래 분자, 소분자 약물, 세균 대사물, 파지 디스플레이 분자, 항체 또는 이의 단편, 단백질, 단백질 단편, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, miRNA, siRNA, shRNA 및 이의 배합물 중에서 선택되는, 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    TSC22D4의 활성을 평가하는 단계가 효소 활성 검정, 면역 검정, 리포터 검정 및 웨스턴 블로팅 중 적어도 하나를 포함하거나; 또는 TSC22D4의 발현을 평가하는 단계가 노던 블로팅, 마이크로어레이 분석 및 RT-PCR 중 적어도 하나를 포함하는, 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 포유동물에서 유래된 생물학적 샘플 중의 혈당, 프로-염증성 시토카인의 순환 수준 및 레지스틴 중 적어도 하나를 분석하는 단계를 추가로 포함하는, 방법.
  8. 삭제
  9. a) 제1항 내지 제7항 중의 어느 한 항에 따른 방법을 수행하는 단계; 및
    b) 동정된 적어도 하나의 조절제를 적어도 하나의 약제학적으로 허용되는 부형제와 함께 제형화하는 단계를 포함하는, 약제학적 조성물을 제조하는 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 인슐린 저항성, 대사 증후군 및 당뇨병 중에서 선택되는 질환의 진단을 위한 정보를 제공하는 방법으로서,
    인슐린 저항성, 대사 증후군 및 당뇨병 중에서 선택되는 질환을 갖는 것으로 의심되는 대상체로부터 수득된 생물학적 샘플에서 TSC22D4의 발현, 생물학적 활성, 또는 이들 둘 다를 측정하는 단계를 포함하고,
    여기서 건강한 대상체로부터의 샘플에서 측정된 TSC22D4의 활성 또는 발현과 비교하여 상기 샘플에서 측정된 TSC22D4의 활성 또는 발현의 감소가, 인슐린 저항성, 대사 증후군 및 제1형 또는 제2형 당뇨병 중에서 선택되는 질환의 존재 또는 위험, 또는 인슐린 감수성 또는 종양 질환과 연관된 인슐린 감수성의 개선에 대해 나타내는, 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 방법이 서열번호 1 또는 3의 올리고뉴클레오티드인 TSC22D4에 특이적인 조절제의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 임의로 적합한 완충제 및 부형제와 함께, 제1항 내지 제7항 및 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법을 수행하기 위한 물질; 및 사용 지침서를 포함하는, 진단용 또는 조절제 스크리닝용 키트.
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