CN116327948A - miR-92b或其抑制剂在调控运动能力或抗疲劳中的应用 - Google Patents

miR-92b或其抑制剂在调控运动能力或抗疲劳中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物医药技术领域，公开了miR‑92b作为靶标在筛选或制备调节运动能力或抗疲劳的产品或药物中的应用，miR‑92b抑制剂在制备增强运动能力或抗疲劳的产品或药物中的应用。本发明研究发现miR‑92b‑3p靶向udp‑葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP2)的表达，抑制糖原合成；miR‑92b‑5p通过直接靶向单羧酸转运体4(MCT4)来抑制乳酸挤出。本发明揭示了miR‑92b‑3p/UGP2/糖原合成和miR‑92b‑5p/MCT4/乳酸挤出的调控通路，可以靶向控制运动能力，为研发增强运动能力和抗疲劳的产品提供了新的思路。

Description

miR-92b或其抑制剂在调控运动能力或抗疲劳中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及一种miR-92b或其抑制剂在调控运动能力或抗疲劳中的应用。
背景技术
运动模拟疗法是一种专门模拟或增强运动的治疗效果的疗法。增加体能已被证明在预防和改善一系列疾病方面有积极的作用，包括大脑疾病，如阿尔茨海默氏病、痴呆症、癌症、糖尿病和心血管疾病。运动模拟物可以通过模拟对常规运动的生化和功能反应，来促进骨骼肌蛋白质的合成和延缓骨骼肌衰退。在小鼠中，已经研究表明口服AICAR，一种靶向AMPK-过氧化物酶体增殖物激活受体-del胫骨前肌通路的药物，可以增强训练适应性，甚至提高耐力程度。类似地，许多物质可以导致骨骼肌质量的增加和性能的增强，包括REV-ERB阿尔法激动剂、sirtuin1和过氧化物酶体增殖物激活受体。值得注意的是，运动模拟物的治疗靶点并不局限于蛋白质，还可能包括RNA转录本、表观遗传修饰和代谢物。小非编码RNA具有广泛的调控作用，并越来越多地被认为是治疗的靶点。研究得最充分的一类小非编码RNA之一是microRNA(miRNAs)，它可以作为基因表达的“主要调控因子”。运动已被证明可以调节各种小的非编码RNA的表达，包括miRNAs。有氧运动训练可以重塑骨骼肌中miRNA的表达。许多miRNAs在急性有氧运动的反应中发生了改变，这表明了miRNA依赖的骨骼肌运动适应性调节的潜能。然而，特异性miRNAs在骨骼肌中基因表达和代谢的调控中的直接作用尚不清楚。
骨骼肌糖原对运动能力至关重要，因为它是用于肌肉收缩的主要能量燃料。肌糖原消耗、肌肉表现受损和运动过程中的疲劳发展之间有很强的联系。这种关联也得到了糖原储存病患者的研究结果的支持，糖原储存病的特征是肌肉gys1完全消除，导致肌无力、疼痛、痉挛和运动表现不佳，最大负荷低，儿童时期因心脏事件死亡。值得注意的是，多项研究表明，耐力运动训练会导致大鼠肌糖原超补偿的速率和幅度的增加；然而，运动训练促进骨骼肌中糖原合成增加的分子机制尚不清楚。
在运动开始时，骨骼肌对三磷酸腺苷(ATP)的需求远大于机体其它组织器官。ATP对于肌肉的收缩至关重要，在运动中，肌糖原被迅速分解，导致乳酸的产生增加。在进行高强度的运动后，血乳酸的浓度可升高到20mM以上，明显高于葡萄糖上升的水平。乳酸曾经被认为是一种代谢废物。血乳酸的浓度随着运动负荷的增加而增加。在剧烈运动后，会产生更多的乳酸，因此阻碍了肌肉和血液的供氧气能力。因此，乳酸的交换能力和乳酸从骨骼肌中清除的效率与较更高的运动表现有关。然而，运动影响骨骼肌乳酸阈值的分子机制尚不清楚。
发明内容
运动模拟疗法是一种专门模拟或增强运动的治疗效果的疗法。肌糖原和乳酸挤出对身体性能至关重要。然而，在运动过程中操纵糖原和乳酸代谢的机制尚不清楚。本发明研究揭示了miR-92b-3p/UGP2/糖原合成和miR-92b-5p/MCT4/乳酸挤出的调控通路，可以靶向控制运动能力。基于此，本发明提供了如下技术方案：
miR-92b作为靶标在筛选或制备调节运动能力或抗疲劳的产品或药物中的应用，所述应用中，miR-92b表达提高，运动能力受到抑制；miR-92b表达降低，运动能力增强，抗疲劳。
在上述的应用技术方案中，所述miR-92b包括miR-92b-3p和miR-92b-5p。
其中，miR-92b-3p靶向UGP2的表达，抑制糖原合成；miR-92b-5p靶向MCT4来抑制乳酸挤出。
在上述的应用技术方案中，miR-92b-3p通过直接结合UGP2 3’-UTR，通过抑制UGP2的表达来调节糖原的合成；miR-92b-5p结合MCT4 mRNA的3’-UTR，介导MCT4 mRNA的降解抑制MCT4的表达，抑制乳酸挤出。
本发明还提供了miR-92b抑制剂在制备增强运动能力或抗疲劳的产品或药物中的应用。
在上述述的应用技术方案中，所述miR-92b抑制剂降低miR-92b-3p和/或miR-92b-5p的表达或活性。
所述miR-92b抑制剂包括miR-92b-3p的抑制剂、miR-92b-5p的抑制剂；所述miR-92b抑制剂包括核酸分子、蛋白分子或化合物。
所述miR-92b-3p的抑制剂是与miR-92b-3p互补的单一RNA序列，所述miR-92b-5p的抑制剂是与miR-92b-5p互补的单一RNA序列。
优选地，所述miR-92b-3p的抑制剂为核酸分子，miR-92b-3p的抑制剂的序列为：5′-ggaggccgggacgagugcaaua-3′，优选地，所述miR-92b-5p的抑制剂为核酸分子，miR-92b-5p的抑制剂的序列为：5′-aacacugcaccacgucccgucccu-3′。
本发明研究了miR-92b对运动训练诱导的体能表现上调的影响。与对照组小鼠相比，全身敲除miR-92b后,小鼠体重和胰岛素敏感性正常，但运动衰竭前糖原含量更高，运动衰竭后乳酸水平更低，表现出更好的运动能力。相反，过表达miR-92b的小鼠骨骼肌表现出运动能力下降，运动衰竭前糖原含量降低，运动衰竭后乳酸积累增加。进一步的机制分析显示，miR-92b-3p靶向udp-葡萄糖焦磷酸化酶2(UGP2)的表达，抑制糖原合成。在类似的研究中，我们发现miR-92b-5p通过直接靶向单羧酸转运体4(MCT4)来抑制乳酸挤出。UGP2和MCT4的敲除逆转了体内miR-92b缺失时观察到的作用。本发明揭示了miR-92b-3p/UGP2/糖原合成和miR-92b-5p/MCT4/乳酸挤出的调控通路，可以靶向控制运动能力。为研发增强运动能力和抗疲劳的产品提供了新的思路。
附图说明
图1为长期运动训练可下调骨骼肌中miR-92b的表达分析；(A)重新分析了从GEO数据库(GSE95735)中获得的关于12周耐力运动前后的人股外侧肌的数据库(n＝3)；(B)跑步机速度模式(每天45分钟，持续4周)；(C)qPCR用于测定未经训练和训练小鼠的腓肠肌和胫骨前肌肌肉中miR-92b-3p水平；(D)qPCR检测对照组(非悬挂)组、非装载(悬挂7天)组和重新装载组(悬挂7天后不悬挂7天)小鼠腓肠肌和胫骨前肌肌肉中miR-92b-3p的表达，n＝6；(E)qPCR用于测定未经训练和训练的小鼠的腓肠肌和胫骨前肌中的miR-92b-5p水平，n＝6；(F)采用qPCR检测对照组对照组(非悬挂)组、非装载(悬挂7天)组和重新装载组(悬挂7天后不悬挂7天)小鼠腓肠肌和胫骨前肌肌肉中miR-92b-5p的表达，n＝6；(G)后肢悬吊小鼠的骨骼肌重量,对照组、非装载(悬挂7天)组和重新装载组(悬挂7天后不悬挂7天)WT小鼠腓肠肌和胫骨前肌的重量(n＝6)；所有结果均以均值±SD表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过未配对的学生t检验或Bonferroni校正检验。
图2为miR-92b缺失不影响系统代谢研究结果；(A)qPCR用于检测WT和miR-92b敲除(M92KO)小鼠腓肠肌肌肉中的miR-92b-3p和miR-92b-5p，＝6；(B、C)心脏重量(HW、mg)和胫骨长度(TL；mm)的比值，见图B(n＝6)，每日的食物摄入量显示在图C(n＝6)；(D)体重(BW)随时间的变化(n＝6)；(E)用MRI技术测量了18周龄小鼠的体重(n＝6)；(F)测量WT或M92KO小鼠的四种肌肉类型的重量，腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌和趾长伸肌(n＝6)；(G)WT或M92KO小鼠的空腹血糖和重新喂食后血糖(n＝6)；(H)ITT(左图)和GTT(右图)期间的血糖(n＝6)；(I)WT或M92KO小鼠的胫骨前肌(上)和腓肠肌(下)肌肉的H&E组织学染色结果，以及结果的定量分析(n＝6)；所有结果均以均值±SD表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，采取未配对的学生t检验。
图3为miR-92b的缺失增加了运动能力研究结果；(A)WT和M92KO小鼠的跑步时间(左)和距离(中)，前肢握力(右)，n＝6；(B)WT和M92KO小鼠在跑步衰竭前后的血糖水平(n＝6)；(C)WT和M92KO小鼠在跑步衰竭前后的乳酸水平(n＝6)；(D)WT和M92KO小鼠在跑步衰竭前后的糖原水平(n＝6)；(E)WT和M92KO小鼠在跑步耗竭前的甘油三酯水平；(F，G)采用qPCR方法检测WT和M92KO小鼠腓肠肌中Actc1、Pgc1α(也称为Ppargc1α)、Tnnc1和Pgc1β(也称为Ppargc1β)的mRNA水平(F)以及MyhcIIa(也称为Myh2)、MyhcIIb(也称为Myh4)、Tnni2和Tnnc2的mRNA水平(G)；所有结果均以均值±SD表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过未配对的学生t检验。
图4为骨骼肌中miR-92b的过表达降低了运动能力研究结果；(A)qPCR用于检测WT和miR-92b过表达(M92OE)小鼠的腓肠肌中的miR-92b-3p和miR-92b-5p；(B)体重(BW)随时间变化(n＝6)；(C)WT或M92OE小鼠的四种肌肉类型的重量，腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌和趾长伸肌(n＝6)；(D)ITT(左图)和GTT(右图)时的血糖(n＝6)；(E)WT或M92OE小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素和重新喂食后血糖(n＝6)；(F)WT和M92OE小鼠在跑步衰竭前后的糖原水平(n＝6)；(G)WT和M92OE小鼠在跑步衰竭前后的乳酸水平(n＝6)；(H)WT和M92OE小鼠到衰竭的跑步时间(左)和距离(右)(n＝6)；所有结果均以均值±SD表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过未配对的学生t检验。
图5为miR-92b的缺失改善了糖尿病小鼠的胰岛素抵抗、增强了运动能力研究结果；(A)WT或M92KO小鼠，用HFD饮食喂养，用STZ处理，建立糖尿病模型；(B)qPCR用于检测WT和M92KO糖尿病小鼠腓肠肌肌肉中的miR-92b-3p和miR-92b-5p；(C)左图显示心脏重量(HW；mg)和胫骨长度(TL；mm)之比率(n＝6)，右图显示了每日的食物摄入量(n＝6)；(D)体重(BW)随时间的变化(n＝6)；(E)通过MRI测量糖尿病小鼠的体重(n＝6)；(F)糖尿病小鼠的四种肌肉类型，腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌和趾长伸肌的重量(n＝6)；(G)ITT(左图)和GTT(右图)时的血糖(n＝6)；(H)糖尿病小鼠的空腹血糖、空腹胰岛素和重新喂食后血糖(n＝6)；(I)WT和M92KO小鼠在跑步衰竭前后的糖原水平(n＝6)。；(J)WT和M92KO小鼠在跑步衰竭前后的乳酸水平(n＝6)；(K)WT和M92KO小鼠的前肢握力(左)、跑步时间(右)和距离(中)(n＝6)；(L，M)对p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、p-S6K、S6K和β-actin的免疫印迹分析，定量结果显示在柱状图M中(n＝6)；(N)采用qPCR方法检测糖尿病小鼠腓肠肌中MuRF1和Atrogin-1的mRNA水平(n＝6)；所有结果均以均值±SD表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过未配对的学生t检验。
图6为UGP2是骨骼肌中miR-92b-3p的直接靶点研究结果；(A)WT和M92KO小鼠腓肠肌中差异表达基因的热图(n＝3)；(B)WT和M92KO小鼠腓肠肌中差异表达基因的火山图谱(p<0.05)；(C)腓肠肌上RNA-seq的Wiki通路分析；(D)UGP2 3’-UTR内保守的miR-92b-3p结合基序的图示,3’-UTR中miR-92b-3p关键区域的互补序列在人类(Homo)和小鼠(Mus)序列之间是保守的；(E)采用qPCR检测WT、M92KO和M92OE小鼠腓肠肌肌肉中的UGP2(n＝6)；(F)WT、M92KO和M92OE小鼠腓肠肌中UGP2和β-actin的免疫印迹分析(左图)，定量结果见右图(n＝3)；(G)用miR-92b-3p mimic或对照(Ctrl)RNA处理C2C12细胞，采用qPCR分析UGP2 mRNA水平；(H)用miR-92b-3p模拟物(M92M)或Ctrl RNA(n＝5)处理C2C12细胞后，包含小鼠UGP2的野生型或突变(MT)3’-UTR的报告基因构建物的荧光素酶活性；(I)用M92M(或miR-92b-3p抑制剂，M92I)或Ctrl RNA处理C2C12细胞，用蛋白印迹法检测UGP2和β-actin蛋白水平，蛋白印迹定量结果(n＝3)，用试剂盒检测细胞内糖原(n＝3)；(J)用M92I和/或Ugp2 siRNA处理C2C12细胞，用免疫印迹法检测Ugp2和β-actin蛋白水平，用试剂盒检测细胞内糖原(n＝3)；(K)M92M和/或AdUgp2处理C2C12细胞，免疫印迹检测UGP2和β-actin蛋白水平(n＝3)，试剂盒检测细胞内糖原(n＝3)；所有结果均以均值±SD表示，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过未配对的学生t检验(E to I)，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过Bonferroni校正检验(J，K)。
图7为MCT4是骨骼肌中miR-92b-5p的直接靶点研究结果；(A)MCT4的3'-UTR内保守的miR-92b-5p结合基序的图形表示，3′-UTR中miR-92b-5p种子区的互补序列在人类(Homo)和小鼠(Mus)序列之间是保守的；(B)采用qPCR检测WT、M92KO和M92OE小鼠(n＝6)腓肠肌肌肉中的MCT4；(C)蛋白免疫杂交分析WT、M92KO和M92OE小鼠腓肠肌中的MCT4和β-actin(左图)，定量结果见右图(n＝6)；(D)用miR-92b-5p mimic或对照(Ctrl)RNA处理C2C12细胞，用qPCR分析MCT4mRNA水平(n＝5)；(E)用miR-92b-5p模拟物(M92M5)或Ctrl RNA(n＝5)处理C2C12细胞后，含有小鼠MCT4野生型或突变(MT)3′-UTR的报告构建物的荧光素酶(luc)活性；(F)在缺氧条件下用M92M5(或miR-92b-5p抑制剂，M92I5)或Ctrl RNA处理C2C12细胞，采用蛋白印迹法检测MCT4和β-actin蛋白水平，蛋白印迹法定量结果显示(n＝3)，用试剂盒进行细胞内乳酸检测(n＝3)；(G)在缺氧条件下，用M92I5和/或Mct4 siRNA处理的C2C12细胞，采用免疫印迹法检测MCT4和β-actin蛋白水平(n＝3)，采用试剂盒检测细胞内乳酸含量(n＝3)；(H)用M92M5和/或AdMct4处理的C2C12细胞，免疫印迹法检测MCT4和β-actin蛋白水平，用试剂盒检测细胞内乳酸(n＝5)；所有结果均以均值±SD表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过未配对的学生t检验(B-F)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过Bonferroni校正检验(G，H)。
图8为UGP2和MCT4介导miR-92b对运动能力、糖原合成和乳酸挤出的影响研究结果；(A至C)转染了AAV-Ctrl或AAV-shUGP2的WT或M92KO小鼠，如A图所示；B：对小鼠腓肠肌中的UGP2、MCT4和β-肌动蛋白进行免疫印迹分析(左图)，定量结果见右图(n＝6)；C：跑步衰竭前小鼠腓肠肌糖原水平(n＝6)，跑步衰竭后小鼠腓肠肌乳酸水平(n＝6)，跑步时间(左)和到衰竭的距离(中间)(n＝6)；(D至F)转染AAV-Ctrl或AAV-ChMCT4的WT或M92KO小鼠，如图D所示；E：小鼠腓肠肌中UGP2、MGT4和β-actin的免疫印迹分析(左图)，定量结果见右图(n＝6)；F：跑步衰竭前小鼠腓肠肌糖原水平(n＝6)，跑步衰竭后小鼠腓肠肌乳酸水平(n＝6)，跑步时间(左)和到衰竭的距离(中间)(n＝6)；(G到I)转染了AAV-Ctrl或AAV-shU&M(shUGP2和shMCT4)的WT或M92KO小鼠，如G图所示；H：小鼠腓肠肌中UGP2、MCT4和β-actin的免疫印迹分析(左图)，定量结果见右图(n＝6)；I：跑步衰竭前小鼠腓肠肌糖原水平(n＝6)，跑步衰竭后小鼠腓肠肌乳酸水平(n＝6)，跑步时间(左)，距离(中间)到疲惫的距离(n＝6)；所有结果均以均值±SD表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过Bonferroni校正检验。
图9为运动调节miR-92b的表达水平；(A)缺氧条件下C2C12细胞中HIF-1α和β-actin的蛋白水平，以及采用qPCR方法检测miR-92b-3p和miR-92b-5p(n＝3)；(B，C)免疫印迹分析未训练和训练小鼠的腓肠肌中PHD2、HIF-1α和β-actin(图B组)，通过qPCR(图C组)检测PHD1、PHD2和PHD3的mRNA水平(n＝6)；(D)在急性运动后不同时间点检测miR-92b-3p和miR-92b-5p的表达(n＝3；无运动小鼠为对照)；所有结果均以均值±SD表示。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，通过未配对的学生t检验。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1材料和方法
1.1动物研究
外显子完全缺失的雄性miR-92bKO小鼠购自南京大学动物中心(南京，江苏，中国)。本研究使用了8周大和10周龄的雄性miR-92bKO小鼠。以年龄匹配的C57BL/6小鼠作为WT对照。小鼠被饲养在一个温度控制在25℃的设施中，进行12小时/12小时的光/暗循环，并在除了采集空腹血液标本，能自由地获得食物和水。所有进行体内研究的动物护理和实验方案都符合美国国立卫生研究院出版的《实验动物护理和使用指南》(NIH；NIHpublication no.:85–23,revised 1996)。所有实验动物操作程序均经暨南大学第二临床医学院深圳人民医院(中国深圳)伦理委员会批准。所有的动物在实验前都被随机分组。
1.1.1糖尿病小鼠
将miR-92bKO和C57BL/6J小鼠(分别为8±0.5和24±1g)随机分为两组，每组各为n＝6只动物。喂食HFD(高脂饲料)(D12492；研究饮食，新不伦瑞克，美国)4周后，小鼠腹腔注射50mg/kg体重的链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)，连续注射5天。STZ给药后，糖尿病小鼠维持HFD饮食10周。实验周期结束后，所有小鼠在禁食16小时后，在二氧化碳室内被麻醉并实施安乐死，然后采集它们的血液和肌肉样本进行进一步分析。
1.1.2将AAV9-hsa-miR-92b全身注射至C57BL/6J小鼠
AAV9-hsa-miR-92b(吉凯基因，上海，中国)或AAV9-hsa-gfp(1×1012vg/mL200μL生理盐水[0.15mol/L氯化钠]；吉凯基因)注入C57BL/6J小鼠尾静脉，诱导miR-92b骨骼肌特异性过表达(每组＝6只)。治疗期间，每周测定小鼠体重，并记录平均食物摄入量。进行小鼠葡萄糖耐量实验(GTT)和胰岛素耐量实验(ITT)。治疗8周后，对小鼠进行了骨骼肌性能和耐力测试，并测量了它们的血糖水平和身体组成。随后，所有小鼠被禁食过夜(16小时)，麻醉，并在二氧化碳室内安乐死，然后获得它们的血液和组织样本进行进一步分析。从小鼠身上分离出胫骨，冲洗掉它们的毛发，用尺子测量骨长度。从小鼠的整个心脏被称重，并归一化到胫骨的长度。1.1.3M92KO小鼠骨骼肌中UGP2或MCT4基因敲减
为了诱导WT小鼠或M92KO小鼠(即miR-92b敲除小鼠)的骨骼肌特异性敲减UGP2或MCT4，将AAV9-hsa-shUgp2(即Ugp2敲减的腺相关病毒9)或AAV9-hsa-sa-shMct4(即Mct4敲减的腺相关病毒9)(基因化学公司)(1×1012vg/mL50μL生理盐水[0.15mol/L氯化钠])注射到WT或M92KO小鼠尾静脉(每组＝6)。AAV9-hsa-null转染的WT或M92KO小鼠作为对照组。治疗10周后，让所有小鼠在二氧化碳室内禁食过夜、麻醉和安乐死，然后从它们那里获取血液样本和组织进行进一步分析。
在实验前2天，先让8周龄雄性C57BL/6J WT小鼠适应性跑步，小鼠在10m min-1下跑步10min。第三天开始，小鼠在没有倾斜的跑步机上跑步，10mmin-1持续10min，然后再20mmin-1跑30min，持续4周。
1.3运动能力测量
8周大的小鼠在运动能力测量前先在跑步机上进行为期两天的适应性运动。在适应性运动中，跑步机设置无倾斜，先在10m min-1速度下运动10min，然后在20m min-1的速度下运动50min。进行运动能力测量时，跑步机没有倾斜，运动开始的速度为10min-1，运动10分钟，紧随其后的是增加到20m min-1,直到老鼠筋疲力尽(其特点是老鼠被点击超过5秒没有恢复运动)。记录跑步时间和距离。
1.4悬挂实验
将小鼠随机分为对照组(非悬挂)组、非装载(悬挂7天)组和重新装载组(悬挂7天后不悬挂7天)，构建所描述的HLS模型。简单地说，对10周龄雄性小鼠进行HLS造模7天。重新装载的小鼠先悬挂7天，然后再重新加载7天。处死小鼠后，测量骨骼肌的重量。
1.5miR-92b水平分析
使用miR-92b-3p和miR-92b-5p引物(Thingke，北京，中国)检测小鼠组织(胫骨前肌、腓肠肌、比目鱼肌、脂肪和心脏)和血清样本中的miR-92b-3p和miR-92b-5p的水平。血清miR-92b-3p和miR-92b-5p水平归一化为cel-miR-39(英特朗，卡尔斯巴德，加利福尼亚)，而组织miR-92b-3p和miR-92b-5p水平归一化为β-actin mRNA。定量RT-PCR使用的引物如下：1)miR-92b-3p引物：正向5′-gtccgctattgcactcgtcccggcctcc-3′(SEQ ID NO.1)；反向5′-gtgcgtgtcgtggagtc-3′(SEQ ID NO.2)；2)miR-92b-5p引物：正向5′-agggacgggacgcggtgcagtg-3′(SEQ ID NO.3)和反向5′-gcgagcacagaattaatacgac-3′(SEQID NO.4)。
1.6组织学分析
H&E染色，收集雄性小鼠骨骼肌，用4％多聚甲醛(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密苏里州，美国)固定，并用石蜡包埋。石蜡切片被切为5μm厚，按照标准方案用H&E试剂盒(索莱宝，北京，中国)进行染色。为了进行ATP酶染色，收集雄性小鼠的骨骼肌并用OCT冷冻，使用冷冻切片机(徕卡生物系统公司，Wetzlar，德国)切割8μm厚的连续切片进行染色。采用ATP酶染色试剂盒(钙-钴法)(索莱宝)说明书标准步骤进行染色。简单地说，切片在pH 4.5条件下预孵育15min，然后在pH 9.4条件下孵育45min，进行标准ATP酶反应。
1.7身体成分测量
根据产品的说明书，使用全自动EchoMRITM系统(Echo医疗系统，德克萨斯州，美国)分析总脂肪和瘦肉质量。
1.8血糖、胰岛素水平的测定
收集miR-92b KO小鼠(即miR-92b敲除小鼠)或AAV-hsa-M92 OE(即miR-92b过表达小鼠)对比WT小鼠的血清样本，分别使用
Figure SMS_1
血糖仪和测试条(LifeScan,Milpi胫骨前肌,加州，美国)或胰岛素ELISA试剂盒(ab277390；美国马萨诸塞州剑桥市Abcam))测量血糖和胰岛素水平。对于禁食后重新进食测量葡萄糖的样本，则是对miR-92b KO或AAV-hsa-M92 OE对比WT小鼠禁食过夜，然后给它们添加食物2小时，然后测定血清葡萄糖水平。同样，使用从Abcam获得的小鼠胰岛素ELISA试剂盒(ab277390)测定血清胰岛素水平。
1.9GTT和ITT
分别在14周龄和15周龄的小鼠中进行GTT和ITT检测。简单地说，让小鼠禁食6小时，然后腹腔注射葡萄糖(2g葡萄糖/公斤体重；Y0001745，西格玛-奥德里奇)进行GTT试验，或胰岛素(1U胰岛素/公斤体重；丹麦诺和诺德公司)进行ITT试验。分别在注射后0、15、30、60、90和120min测定葡萄糖水平。在治疗期间，使用
Figure SMS_2
血糖仪和试验条从小鼠尾静脉提取血样，测定空腹血糖。
1.10糖原和乳酸含量分析
根据产品的说明，分别使用糖原检测试剂盒(ab65620，Abcam)和乳酸检测试剂盒(ab169558，Abcam)评估小鼠骨骼肌中的糖原和乳酸含量。
1.11实时荧光定量PCR分析
所有试剂均是从Sigma-Aldrich购得。用RNAiso Plus从细胞或组织中提取总RNA。由Generay(上海，中国)合成的寡核苷酸引物序列见表1。使用Quantity
Figure SMS_3
软件(Bio-RadLaboratories,加州，美国)将相对mRNA表达水平归一化到对照基因上(actin)。
实时荧光定量PCR的扩增程序如下：
两步法PCR扩增标准程序：第一步95℃预变性30秒；第二步95℃5秒，60℃31秒或34秒，40个循环。
表1用于实时荧光定量PCR分析的引物序列
Figure SMS_4
1.12蛋白提取及蛋白印迹分析
使用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液，从C2C12细胞或从小鼠肌肉(腓肠肌)组织中提取蛋白质。根据产品的说明书，使用快速BCA蛋白检测试剂盒(Thermo Fisher)进行定量。对于蛋白印迹分析，将50μg蛋白裂解液加入十二酰基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶上，印迹电转到聚偏二氟乙烯膜(微孔)上，并与以下一抗一起孵育：β-actin(ab213262)、mTOR(ab25880)、磷酸化-mTOR(Ser2448；ab109268),Akt(ab8805),p-Akt(Ser473；ab81283),GLUT1/UGP2(ab252403)、PHD2(ab133630)、和HIF-1α(ab221610)(均从Abcam购得),SLC16A3/MCT4(NBP3-13033)(购自Novus,安大略省,加拿大),and p-p70 S6kinase(Thr389)(9205S),p70 S6 kinase(9202S)(均购自Cell Signaling Technology,马萨诸塞州,美国)。使用Quantity
Figure SMS_5
软件进行密度分析，并相对于对照β-actin进行定量。
1.13细胞培养
C2C12成肌细胞(SCSP-505)购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库(上海，中国)。使用ISO17025认证的qPCR检测，以标准化的方式对细胞进行支原体检查，以确保工作是在支原体阴性细胞中进行的。C2C12成肌细胞在生长培养基中培养(DMEM培养基，高糖；Gibco，格兰德岛，纽约，美国)，该培养基含有10％(vol./vol)的胎牛血清(Gibco)，10U/mL青霉素和10μg/mL链霉素(Welgene，中国台北)，放置于37℃、含5％二氧化碳的培养箱中。
1.14miR-92b的预测靶点
利用Starbase预测miR-92b-3p和miR-92b-5p的靶点。我们在搜索栏中查询了“miR-92b-3p或miR-92b-5p”，这为我们提供了miR-92b-3p和miR-92b-5p的预测靶点的结果。
1.15C2C12瞬时转染
miR-92b-3p模拟物是一个双链RNA,具有正义序列5′-uauugcacucgucccggccucc-3′(SEQ ID NO.33)和反义序列5′-aggccgggacgagugcaauauu-3′(SEQ ID NO.34)。miR-92b-5p模拟物是一个双链RNA，具有正义序列5′-agggacgggacguggugcaguguu-3′(SEQ IDNO.35)和反义序列5′-aauauugcacuacgucccggcccu-3′(SEQ ID NO.36)。非靶向阴性对照序列(正义5′-uucuccgaacgugucacgutt-3′(SEQ ID NO.37)和反义5′-acgugacacguucggagaatt-3′(SEQ ID NO.38)作为对照。miR-92b-3p的抑制剂(5′-ggaggccgggacgagugcaaua-3′，SEQ ID NO.39)是与miR-92b-3p互补的单一RNA序列。miR-92b-5p的抑制剂(5′-aacacugcaccacgucccgucccu-3′，SEQ ID NO.40)是与miR-92b-5p互补的单一RNA序列。以非靶向阴性对照序列(5′-caguacuuuuguguaguacaa-3′，SEQ ID NO.41)作为对照。抗Ugp2(sc-154894)、Mct4(sc-40120)的siRNA和干扰siRNA均购自San ta Cruz生物技术公司(加利福尼亚，美国)。根据产品的说明书，使用脂质体TM3000(Invitrogen)进行瞬时转染。
1.16
Figure SMS_6
报告基因检测
C2C12细胞转染3‘-UTR荧光素酶报告基因构建载体(Ugp2 3’-UTR或Ugp2 3‘-UTR-突变体)、miRNA(对照RNA[sc-36869；Santa Cruz生物技术]或miR-92b-3p)、3’-UTR荧光素酶报告基因构建(Mct4 3‘-UTR或Mct4 3’-UTR-突变体)或miRNA(对照RNA或miR-92b-5p)和肾荧光素酶，使用脂质体TM3000。转染48小时后，使用
Figure SMS_7
报告检测试剂盒(E1910；Promega，麦迪逊，WI，美国)和酶标仪(H1；Biotek，维诺斯基，VT，美国)测定荧光素酶活性。用肾素酶对这些数值进行归一化处理。
1.17数据分析
所有的数据都来自于至少三个独立的实验。没有数据、样本细胞或小鼠被排除在统计分析之外。数据以各组的平均±SD表示。基于我们之前的研究和/或初步实验，我们计算了体内和体外研究所需的分组规模。使用ImageJ软件(1.51版本；NIH)对图像密度进行量化。将每个目标条带的密度归一化为相应样本中的β-actin，以减少方差。qPCR数据和蛋白免疫印迹定量以对照组平均值的倍数表示，定义为1加上自己的标准差。两组间的比较采用双尾非配对的学生t检验。两个以上的实验组之间的比较采用单因素方差分析，然后采用Bonferroni的事后检验。所有分析均使用GraphPad Prism 7.04(www.graphpad.com/)进行。P<0.05，视为差异有统计学意义。
2结果
2.1miR-92b的表达受骨骼肌运动的调节
我们首先发现，在12周的耐力运动后，股外侧肌中miR-92b的表达下降(图1A；GSE95735)。此外，当我们比较耐力运动(图1B)和未运动的小鼠骨骼肌中miR-92b-3p的表达时，其在腓肠肌和胫骨前肌中的表达明显低于无运动小鼠(图1C)。与此一致的是，与无运动小鼠相比，耐力运动小鼠在腓肠肌和胫骨前肌中显示miR-92b-5p的表达下降(图1D)。
啮齿动物的后肢悬吊(HLS)是一种成熟的方法，可以创建一个微重力和肌肉骨骼废弃的地面模型，该模型模拟了许多与太空飞行、长期卧床休息以及极端不运动相关的生理变化。C57BL/6J小鼠随机分为三组对照组(非悬挂)组、非装载(悬挂7天)组和重新装载组(悬挂7天后不悬挂7天)。与对照组小鼠相比，非装载组小鼠的腓肠肌和胫骨前肌肌肉重量显著降低，在重新装载组有所升高(图1G)。在HLS小鼠的腓肠肌和胫骨前肌肌肉中，miR-92b-3p和miR-92b-5p mRNA水平较高，但在重新加载7d后较低，尽管没有恢复至正常(图1E-F)。此外，miR-92b-3p和miR-92b-5p水平在脂肪组织和心脏没有明显变化(数据未展示)，表明运动后miR-92b的表达增加不是一个系统性效应。这些数据表明，骨骼肌中的miR-92b-3p和miR-92b-5p与体力活动相关。
2.2miR-92b敲除(M92KO)小鼠表现出增强的运动能力
我们使用M92KO小鼠进一步评估了miR-92b在骨骼肌中的作用。与对照组、野生型小鼠(WT)相比，对腓肠肌中miR-92b-3p和miR-92b-5p水平的分析证实了miR-92b在小鼠骨骼肌中的敲除(图2)，没有影响心脏重量/胫骨长度比(图2B)或每日食物摄入量(图2C)。在常规饮食条件下，我们也发现WT和M92KO小鼠在体重和身体组成上没有明显的差异(图2D-E)。与此一致的是，与WT小鼠相比，M92KO小鼠显示出相似的肌肉重量(腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌、趾长伸肌)(图2F)。骨骼肌是葡萄糖代谢的主要组成部分。与WT型小鼠相比，M92KO对空腹血糖(FBG)和补充血糖没有显著影响(图2G)。小鼠的胰岛素耐受试验(ITT)和糖耐受试验(GTT)的结果与在正常饮食中的对照组老鼠的结果显示一样的正常(图2H)。我们还使用显微镜检查了骨骼肌，看看miR-92b的缺失是否有任何大体的形态学后果。与WT小鼠相比，使用苏木精和伊红(H&E)染色检查M92KO小鼠的骨骼肌切片，没有发现任何异常(图2I)。
我们通过将M92KO和WT小鼠进行高强度的跑步机运动方案，来确定敲除miR-92b是否会影响运动能力。有趣的是，我们发现，与WT小鼠相比，敲除miR-92b增强了小鼠的跑步力竭时间和最大跑步距离，但没有增强前肢的握力(图3A)。接下来，我们测量了跑步前后的血糖水平，以确认所有的小鼠都达到了疲劳的极限，并测试血糖水平的差异是否会影响运动能力。两组小鼠的血糖水平均随运动的变化而下降，但两组间运动前和运动后的血糖水平无显著差异(图3B)。乳酸盐的形成会导致酸中毒和肌肉疲劳。WT和M92KO小鼠运动后在腓肠肌中的乳酸水平明显升高，而M92KO小鼠在腓肠肌中的乳酸水平低于WT小鼠(图3C)，说明M92KO小鼠运动能力的增加可能是由于运动后骨骼肌中乳酸含量的降低所致。由于糖原消耗会导致运动疲劳(“糖原分流”假说)，我们评估了两组小鼠肌肉中的基线糖原水平，并发现miR-92b-/-小鼠在运动前骨骼肌中的糖原含量高于WT小鼠，但在运动后没有(图3D)，说明M92KO小鼠运动能力增加的另一个原因可能是运动前糖原含量的增加。此外，WT和miR-92b-/-小鼠之间的骨骼肌甘油三酯含量没有差异(图3E)。因为骨骼肌纤维在缓慢氧化类型和快速氧化类型之间的转换可能会影响运动能力，我们测定了WT和M92KO小鼠的腓肠肌中氧化和糖酵解肌纤维标记物的mRNA水平，但发现在肌纤维型基因中没有差异(图3F-G)。
2.3MiR-92b过表达(M92OE)小鼠的骨骼肌显示出运动能力下降
体内全身注射AAV9可有效靶向骨骼肌和外周器官。肌肉特异性Acta1(编码hsa)启动子被用来驱动目标基因在肌肉中的表达。C57BL/6J小鼠经尾静脉注射AAV9-Ctrl(对照组)或AAV9-hsa-miR92b(M92OE)，注射10周后采集肌肉。与对照组小鼠相比，M92OE小鼠的腓肠肌s中miR-92b-3p和miR-92b-5p的表达显著增加(图4A)，而在其他器官，如肝脏、心脏、前脑、小脑、脂肪、血清和肾脏中没有增加(数据未显示)。对照组和M92OE小鼠的体重和肌肉重量(腓肠肌、比目鱼肌、胫骨前肌和趾长伸肌)差异不显著(图4B-C)。此外，M92OE小鼠的GTT和ITT结果与对照组小鼠相似(图4D)。此外，对照组和M92OE小鼠的FBG、空腹血胰岛素和补充血糖水平相似(图4E)。但M92OE组与对照组之间的参考血糖水平无明显差异(图4E)。不出意料地，M92OE小鼠在运动前的腓肠肌中的糖原含量明显低于对照组小鼠，但在运动后的糖原含量相似(图4F)。对腓肠肌中乳酸含量的进一步分析显示，与对照组小鼠相比，在运动后，miR-92b过表达显著提高了M92OE小鼠的乳酸水平，但在运动前没有(图4G)。最后，与对照组小鼠相比，M92OE小鼠运动能力下降，跑步力竭时间和最大跑步距离减少(图4H)。
2.4敲除miR-92b可改善糖尿病小鼠的胰岛素抵抗和肌肉损失
肌糖原的合成是葡萄糖储存的主要途径。肌肉葡萄糖摄取和糖原合成的损害是胰岛素抵抗和2型糖尿病的主要因素。因此，给M92KO小鼠喂食高脂饮食(HFD)，并用链脲佐菌素(STZ)处理，建立糖尿病模型(图5A)。M92KO不影响HFD饮食中心脏重量和胫骨长度或每日食物摄入量的比例(图5B-C)。WT和M92KO小鼠的体重无明显差异(图5D)。然而，与WT小鼠相比，M92KO小鼠的瘦质量与体重的比例更高，而脂肪质量与体重的比例更低(图5E)。与此一致的是，M92KO小鼠的腓肠肌和胫骨前肌肌肉重量明显高于WT小鼠(图5F)。接下来，我们发现itt和gtt中的葡萄糖水平降低，导致葡萄糖曲线下面积减少(图5G)。此外，与对照组小鼠相比，我们发现M92KO降低了糖尿病小鼠的胰岛素抵抗，表现为空腹和空腹血糖水平下降，以及血清中空腹胰岛素水平下降(图5H)。与我们在图3a中的研究结果一致，M92KO小鼠在运动前显示腓肠肌中的糖原含量明显高于WT小鼠，但在运动后没有(图5I)。运动训练增加了WT和M92KO小鼠的腓肠肌中的乳酸含量，而M92KO小鼠在运动后的乳酸水平明显低于WT小鼠(图5J)。此外，我们的研究结果表明，与WT小鼠相比，M92KO增强了小鼠前肢的握力，增加了极限跑步时间和最大跑步距离(图5K)。肌肉质量受蛋白质合成和降解之间的平衡所控制。激活的Akt能够激活哺乳动物雷帕霉素(mTOR)/S6K信号通路介导的蛋白质合成靶点并抑制FOXO1介导的蛋白质降解，以增加肌肉蛋白质含量。与WT小鼠相比，M92KO增强了腓肠肌中Akt、mTOR和S6K的磷酸化，同时降低了Atrogin-1和MuRF1(肌肉特异性泛素连接酶，图1)的表达(图5L-N)，这两个都是FOXO1的下游靶点。综上所述，这些数据表明M92KO抑制了糖尿病小鼠肌肉的肌肉丢失和肌无力，并增强了AKT/mTOR/S6K的激活。
2.5MiR-92b-3p可能通过UGP2调节骨骼肌中的糖原合成
为了进一步研究miR-92b敲除或过表达骨骼肌引起的分子变化，我们对WT和M92KO小鼠的腓肠肌肌肉样本进行了RNA测序(RNA-seq)，结果显示有2165个差异表达基因(DEGs)，p值为<0.05(图6A)。其中，与WT小鼠相比，M92KO小鼠中有1119个基因表达上调，而1046个基因表达下调(图6B)。Wiki通路分析数据显示，最显著的DEGs与有氧糖酵解等参与糖酵解和糖异生的通路的计算模型有关(图6C)。在这些基因中，UGP2(将G1P转化为UdP-葡萄糖的催化酶；在肝脏和肌肉组织中，udp-葡萄糖是糖原的直接前体)是唯一与糖原合成相关的基因(图6B-C)。利用StarBase(http://starbase.sysu.edu.cn/)，我们确定UGP2是miR-92b-3p的潜在靶点(图6D)。M92KO小鼠在腓肠肌中的Ugp2 mRNA和蛋白水平明显高于WT小鼠(图6E-F)。相反，M92OE显著降低了腓肠肌肌肉中Ugp2的mRNA和蛋白水平(图6E-F)。与对照RNA处理组相比，miR-92b-3p mimic处理(M92M)以时间依赖的方式降低了C2C12细胞中Ugp2的mRNA水平(图6G)。接下来，我们使用
Figure SMS_8
报告基因分析表明，与单独使用对照组RNA进行治疗时相比，在M92M处理后，荧光素酶报告基因的活性显著降低，并以剂量依赖的方式，然而用Ugp2 3‘-UTR突变的荧光素酶报告基因结构处理后，报告基因的活性没有受到影响(图6H)，这表明Ugp2是miR-92b-3p的直接靶基因。通过蛋白免疫印迹检测C2C12细胞中的蛋白水平也支持了我们的研究结果，即与对照RNA处理相比，miR-92b-3p抑制剂(M92I)处理上调了UGP2的表达(图6I)。相反，与对照组RNA处理相比，M92M抑制了C2C12细胞中的UGP2蛋白水平(图6I)。此外，与对照组RNA处理相比，M92I处理增加了C2C12细胞内糖原含量，而M92M处理则同样降低了糖原含量(图6I)。值得注意的是，与对照组RNA处理相比，Ugp2小干扰RNA(siRNA)处理降低了C2C12细胞内糖原含量，而再M92I处理后没有变化(图6J)。相反，腺病毒介导的Ugp2过表达增加了细胞内糖原含量，而再加M92M处理后没有变化(图6K)。综上所述，我们证实了miR-92b-3p通过直接结合UGP2 3’-UTR，通过抑制UGP2的表达来调节糖原的合成。
2.6MiR-92b-5p通过MCT4调节骨骼肌中乳酸的挤出
在与葡萄糖代谢相关的DEGs中，我们发现在M92KO小鼠的腓肠肌肌肉中，Slc16a3(MCT4)显著上调。MCT4在糖酵解快速收缩肌肉中高表达，其特征是在肌细胞挤出乳酸中发挥作用。利用StarBase，我们确定MCT4是miR-92b-5p的潜在靶点(图7A)。M92KO小鼠在腓肠肌中的MCT4 mRNA和蛋白水平明显高于WT小鼠(图7B-C)。相反，M92OE显著降低了腓肠肌肌肉中Mct4的mRNA和蛋白水平(图7B-C)。在C2C12细胞中，miR-92b-5p mimic(M92M5)以时间依赖的方式降低了MCT4的mRNA水平(图7D)。为了进一步研究miR-92b-5p与MCT4之间的相互作用，我们构建了两个质粒，MCT4 3’-UTR和MCT4-3’-UTR-mt，它们分别包含MCT4的WT和突变体3’-UTR。每个质粒分别与M92M5共转染HEK293T细胞。我们的研究结果显示，M92M5对荧光素酶活性的抑制作用呈剂量依赖性(图7E)。然而，在转染了表达MCT4-3’-UTR-MT的质粒的C2C12细胞中，M92M5并没有影响荧光素酶的活性(图7E)。在体外，与对照RNA处理相比，M92I5处理增加了C2C12细胞中的MCT4蛋白水平，而M92M5处理则降低了相同的水平(图7F)。与此相一致的是，M92I5处理后细胞内乳酸含量下降，而M92M5处理后细胞内乳酸含量增加(图7F)。接下来，我们确定了miR-92b-5p是否通过调节C2C12细胞中MCT4的表达来调节细胞内乳酸含量。我们的结果显示，MCT4 siRNA处理增加了细胞内乳酸含量，而M92I5处理后细胞乳酸含量没有变化(图7G)。相反，过表达MCT4的细胞降低了细胞内乳酸含量，而M92M5处理后乳酸含量没有变化(图7H)。综上所述，我们证明了miR-92b-5p通过直接结合MCT4 3’-UTR，通过抑制MCT4的表达来调节乳酸挤出。
2.7M92KO小鼠的UGP2和MCT4是糖原诱导和骨骼肌乳酸挤出中所必需的
为了进一步检测UGP2和MCT4是否介导了肌肉miR-92b敲除对糖原和乳酸的影响，我们将AAV9-hsa-shUgp2转染到WT或M92KO小鼠中，如图8a所示。以AAV9-hsa-空白腺相关病毒转染的WT小鼠作为对照组，采用小鼠腓肠肌肌肉样本的免疫印迹法检测UGP2和MCT4的蛋白水平，以验证AAV转染的效率(图8B)。AAV9-hsa-shUgp2-和AAV9-hsa-空白腺相关病毒转染小鼠的体重没有显著差异(数据未展示)。与AAV-Ctrl转染的WT小鼠相比，AAV-shUgp 2转染的WT小鼠在运动力竭前的糖原含量和运动能力(以用尽跑步时间和最大跑步距离评估)显著降低(图8C)。此外，与AAV-shUgp 2转染的WT小鼠相比，AAV-shUgp 2转染的M92KO小鼠运动力竭后腓肠肌中的乳酸含量更低，运动能力更高，但运动力竭前腓肠肌中的糖原含量没有变化(图8C)。
为了进一步验证MCT 4是否介导肌肉miR-92b丢失对乳酸挤压的影响，我们在体内采用了MCT 4功能缺失法。我们使用AAV9-hsa-shMct4直接敲除小鼠骨骼肌中的MCT4(图8D)，但AAV9-hsa-shMct4和AAV-Ctrl转染小鼠的体重没有显著差异(数据未展示)。与注射AAV-ctrl的小鼠相比，转染AAV-shMct4抑制了腓肠肌中MCT4的蛋白水平，但没有抑制UGP2的蛋白水平(图8E)。在WT小鼠中，与转染AAV-Ctrl相比，转染shMct4可上调运动后腓肠肌的乳酸含量，降低小鼠的运动能力，但对运动前腓肠肌的糖原含量没有明显影响(图8F)。然而，与转染AAV-shMct4的WT小鼠相比，转染AAV-shMct4的M92KO小鼠在运动前腓肠肌的糖原含量仍显著增加(图8F)。综上所述，敲除UGP2或MCT4并不能完全阻断miR-92b敲除在小鼠骨骼肌中的作用。
最后，与注射AAV-shU&M的小鼠(AAV-shUgp2和AAV-shMct4)的小鼠相比，Gas中的UGP2和MCT4蛋白水平明显低于注射AAV-Ctrl的小鼠(图8G，H)。在注射了AAV-shU&M-和未注射了AAV-的小鼠之间的体重没有差异(数据未展示)。与AAV-Ctrl处理的小鼠相比，AAV-G&M处理的小鼠运动前腓肠肌中的糖原含量降低(图8I)。在运动前，用AAV-shU&M处理的WT和M92KO小鼠的腓肠肌中糖原含量无显著差异(图8I)。与AAV-Ctrl转染相比，AAV-shU&M转染增加了运动后Gas的乳酸含量，而经AAV-G&M处理的WT和M92KO小鼠之间没有明显变化(图8I)。在WT小鼠中，与AAV-Ctrl转染相比，转染AAV-shU&M降低了运动能力(图8I)。更重要的是，当UGP2和MCT4缺失时，M92KO小鼠表现出与WT小鼠相似的运动能力，这表明敲除miR-92b主要通过调节UGP2和MCT4的表达来影响骨骼肌功能。
2.8耐力训练通过负调控缺氧来抑制miR-92b的表达
先前的研究表明，miR-92b很可能是由缺氧转录诱导的.与此相一致的是，我们发现与常氧条件下相比，miR-92b-3p和miR-92b-5p在缺氧条件下均表达上调(图9A)。转录因子缺氧诱导因子(HIF)被认为是调节骨骼肌训练适应的候选因子。经过四周的单侧伸膝训练后，HIF-1mRNA水平仅在未训练的腿中短暂升高，当暴露于急性运动时。另一项研究表明，耐力训练增强了HIF负调控因子的表达，如脯氨酸羟化酶结构域(PHD)酶(PHD1、2和3)，它们催化HIF脯氨酸羟基化，导致氧传感器HIF-1α和HIF-2α的降解。与此一致的是，我们发现，与未训练小鼠相比，训练小鼠(训练4周)显示出更高的PHD2(正常条件下的初级HIF-1PHD)蛋白水平，而HIF-1α水平下调(图9B)。此外，训练后PHD1和PHD2 mRNA水平升高，而PHD3mRNA水平没有升高(图9C)。对miR-92b表达的进一步分析显示，训练后的小鼠在腓肠肌中显示的miR-92b水平低于未训练后的小鼠(图9D)。与无运动小鼠相比，急性运动小鼠的气体中miR-92b-3p的表达急剧增加，但在120min后恢复到基线水平；耐力训练削弱了这些急性运动诱导的影响(图9D)。综上所述，耐力训练通过增加缺氧负调控因子的表达来抑制miR-92b的表达。
3.讨论
在本研究中，我们确定了miR-92b在骨骼肌中影响机体运动的新作用。人类和小鼠骨骼肌中miR-92b水平在慢性耐力运动后下降，但在急性运动后升高。骨骼肌中miR-92b的过表达导致了运动能力的降低。
人们一直在探寻提升运动能力的方法。骨骼肌糖原被认为是提高运动能力的必要条件。既往的研究表明，由Akt信号通路构成的调节轴在胰岛素信号转导过程中控制糖原合成和葡萄糖稳态。许多研究发现，miR-92b在体内和体外都参与了Akt信号通路的调控。PTEN是Akt信号通路的负调控因子，与miR-92b直接相关。另一项研究表明，miR-92b-3p过表达抑制了Gabra3的表达，从而导致Akt/mTOR和JNK通路等致癌信号通路的失活。然而，在我们的研究中，基于RNA-seq数据，我们没有观察到miR-92b缺失的肌肉中PTEN和Gabra3表达的明显变化。此外，骨骼肌中的Akt信号可以调节骨骼肌的生长和萎缩。然而，与对照组相比，我们没有在M92KO小鼠中观察到Akt信号相关基因的表达改变(根据Wiki通路分析)或肌肉肥大。我们发现M92KO小鼠在运动前骨骼肌中的糖原含量高于WT小鼠(图3D)。然而，当它们跑力竭后，糖原水平在两个模型中是相似的(图3D)。此外，M92KO小鼠中Gas中的UGP2蛋白水平高于WT小鼠，而M92OE小鼠中的UGP2蛋白水平低于WT小鼠(图6F)。重要的是，在UGP2缺失的情况下，miR-92b-3p介导的糖原含量抑制在体外被显著抑制(图6J-K)。与此一致的是，当UGP2缺失时，WT和M92KO小鼠在运动前骨骼肌糖原含量没有明显变化。这些结果表明，ugp2介导的糖原合成对于miR-92b抑制运动能力至关重要。
乳酸，曾经被认为与运动中的疲劳有关，现在被视为一种重要的能量物质。乳酸通过在细胞核组织间的穿梭联系着糖酵解和氧化代谢。乳酸的释放和摄取是由单羧酸转运体(MCTs)介导的，它广泛表达肝脏、肾脏、大脑和心脏。骨骼肌中最重要的MCT亚型是MCT1和MCT4；MCT1对乳酸具有高亲和力，主要在氧化纤维中表达，而MCT4对乳酸的亲和力较低，存在于糖酵解纤维中。既往的研究表明，运动训练可以增加啮齿类动物骨骼肌中MCT1和MCT4的蛋白水平，这导致了乳酸穿梭的增加。相反，另一项研究表明，训练强度的降低导致MCT4的下调。MCT4选择性抑制剂治疗减少了小鼠的运动时间。MCT4敲除小鼠表现出运动不耐受。在本研究中，经过最大耐受运动后，miR-92敲除小鼠骨骼肌中乳酸水平显著低于野生型，而miR-92b过表达则带来相反的效果。体外实验表明，在没有MCT4的情况下，mir-92b-5p介导的乳酸积累在细胞中明显受到抑制。与此相一致的是，当MCT4缺失时，野生型和miR-92b敲除小鼠骨骼肌中乳酸含量没有发生显著变化。这些结果表明，MCT4介导的乳酸堆积是miR-92b抑制运动能力的关键。
HIF-1在运动的6小时内被激活，同时还伴有靶基因表达的增加。与此相一致的是，我们发现miR-92b在急性运动后显著增加，但在20分钟后开始逐渐下降，并在运动后2小时恢复到基线水平。有研究表明，4周的单侧膝关节伸肌训练后，HIF-1α只在未训练的腿部表达；而在相同的运动负荷下，HIF-1α在双腿急性运动有短暂的增加。HIF-1及其靶基因在急性运动反应中的激活能力可能在一段时间的运动训练后减弱。与此相一致的是，与未经训练的小鼠相比，经过训练的小鼠显示出更低的HIF-1α和PHD2水平更高。更重要的是，运动训练减弱了急性运动引起的miR-92b的上调。然而，长期的运动训练显著降低了miR-92b的基线水平。综上所述，我们的研究结果为运动介导的骨骼肌葡萄糖代谢调节提供了一种新的解释。
4.结论
本研究证明了miR-92b介导的运动和运动性疲劳之间的反馈信号通路。当跑步时，miR-92b被诱导，从而抑制UPG2相关的糖原合成，以及MCT4介导的乳酸挤出，最终导致糖原消耗和疲惫。
长期运动训练增强HIF-1负调控因子的表达，如PHD2，然后下调HIF-1介导的miR-92b的转录，从而促进UGP2表达和UGP2介导的糖原合成，以及MCT4表达和MCT4介导的骨骼肌乳酸挤出，最终增强运动能力。
我们的研究确认miR-92b是运动训练的关键调节因子；这是由长期训练后骨骼肌中miR-92b水平降低，但持续运动后增加的结果所支持的。此外，在未训练前，敲除miR-92b促进了糖原合成、乳酸挤出和骨骼肌的耐力运动能力。此外，miR-92b在骨骼肌中的过表达具有相反的效果。因此，我们提出miR-92b可能在操纵运动疲劳中发挥重要作用。

Claims (10)

1.miR-92b作为靶标在筛选或制备调节运动能力或抗疲劳的产品或药物中的应用，其特征在于：所述应用中，miR-92b表达提高，运动能力受到抑制；miR-92b表达降低，运动能力增强，抗疲劳。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述miR-92b包括miR-92b-3p和miR-92b-5p。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：其中，miR-92b-3p靶向UGP2的表达，抑制糖原合成；miR-92b-5p靶向MCT4来抑制乳酸挤出。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：miR-92b-3p通过直接结合UGP2 3’-UTR，通过抑制UGP2的表达来调节糖原的合成；miR-92b-5p结合MCT4 mRNA的3’-UTR，介导MCT4mRNA的降解抑制MCT4的表达，抑制乳酸挤出。
5.miR-92b抑制剂在制备增强运动能力或抗疲劳的产品或药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述miR-92b抑制剂降低miR-92b-3p和/或miR-92b-5p的表达或活性。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述miR-92b抑制剂包括miR-92b-3p的抑制剂、miR-92b-5p的抑制剂；所述miR-92b抑制剂包括核酸分子、蛋白分子或化合物。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：所述miR-92b-3p的抑制剂是与miR-92b-3p互补的单一RNA序列，所述miR-92b-5p的抑制剂是与miR-92b-5p互补的单一RNA序列。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述miR-92b-3p的抑制剂为核酸分子，miR-92b-3p的抑制剂的序列为：5'-ggaggccgggacgagugcaaua-3'。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述miR-92b-5p的抑制剂为核酸分子，miR-92b-5p的抑制剂的序列为：5'-aacacugcaccacgucccgucccu-3'。
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