CN101538611A - Rna和dna双外参实时定量荧光pcr检测方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物信息学领域，具体涉及一种RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用，包括如下步骤：选定外参基因；制备外参基因的mRNA与DNA，配制外参基因的mRNA与DNA的预混合液；在抽提样品时加入预混合液，收集样品中的总mRNA和DNA部分；实时定量荧光PCR，计算待测基因和外参基因mRNA和DNA的拷贝数；数据处理和归一化。本发明还公开了上述方法在基因芯片分析基因表达技术中的应用。本发明改进了对基因转录水平检测的实验设计，可以得到某个基因的真实的转录水平而不是一个相对水平，为基因表达数据和基因拷贝数据的整合提供新的概念和框架。

Description

RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物信息学领域，具体涉及一种RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法及其应用。

背景技术

自从1970年克里克提出分子生物学的中心法则以来，人们对于基因的转录表达和及其调控的机制进行了大量的研究。Northern杂交方法是最早被用来测定基因转录量的方法。后来，结合逆转录和聚合酶链式反应产生的RT-PCR(reverse transcription-PCR，即：逆转录-聚合酶链式反应)提供了一种灵敏而又简便的半定量测定方法。近年来，实时定量聚合酶链式反应(简称为：qPCR)方法由于其灵敏、准确和重复性好，因此逐步成为基因表达的定量测定的主要方法。

所有上述方法的检测原理是：将待测基因的转录水平表示为与一个参考(内参或外参)基因的相对表达量。因此为了减少由于RNA不稳定和逆转录的效率问题产生的误差，通常采用内参或者用相同量的总RNA来对数据进行归一化。内参通常选用一些看家基因，如：β-actin、GAPDH以及rRNA等。然而，众所周知，由于对不同组织而言，细胞的总RNA含量和/或内参的量并不相同，即便同一组织在不同条件下它们也不一定相同，而且这种以总RNA中的含量和/或相对于一个内参的比例的表示方法显示不出一个基因的转录水平。由于上述原因，待测基因转录水平的检测数据往往不准确。因此，如何检测出真实可靠的基因转录水平是目前亟待解决的技术问题。此外，还有利用外源的RNA在实时定量PCR中进行跟踪标定(spike-in qPCR)的方法，此方法结合绝对标准曲线可以产生更加可靠的结果。现有技术中虽然已经有人使用了跟踪标定策略，但没有能够将一个基因的转录水平与它的基因的拷贝数联系起来。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法。所述检测方法通过同时测定待测基因的转录产物的拷贝数和待测基因的拷贝数以及参考基因(包括外参mRNA和外参DNA)的拷贝数来检测待测基因转录水平的检测方法。通过检测待测基因在某个时刻，某个细胞状态下的mRNA和DNA的比值，即mRNA/DNA的值来确定待测基因在某细胞状态下的表观表达水平。

本发明的第一个目的是提供一种RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

1)配制外参基因的mRNA与外参基因的DNA的预混合液；

2)将待测样品与步骤1)中制备的预混合液混合，分别抽提并且收集总mRNA部分和总DNA部分；

3)总mRNA部分进行逆转录合成第一条cDNA链后与总DNA部分分别进行实时定量荧光PCR，然后计算扩增后待测基因的mRNA和DNA以及外参基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数。

上述步骤1)中的外参基因为被测样品中不存在的序列，同时该外参基因的mRNA与外参基因的DNA中均不含有待测基因的mRNA和DNA序列。

常用外参基因的选择：现在已经有多种生物的全基因组已经测序完成，在已经测出的序列中，可以选择被测样品中不存在的序列做外参。通常遗传进化上相差远的生物之间(例如植物与动物之间，原核与真核之间)比较容易找到这种序列。可以选择天然存在并且满足上述要求的序列作为外参基因，或者人工合成一个满足上述要求的人为设定的序列作为外参。

优选的，所述外参基因的DNA为携带外参基因DNA序列的重组载体；所述外参基因的mRNA是以上述线性化的携带外参基因DNA序列的重组载体为模板，通过体外转录制得的mRNA。

上述载体为质粒或杆状病毒DNA(bacmid)。

优选的，所述步骤1)中的外参基因的mRNA的序列长度与待测基因的mRNA的序列长度相近，外参基因的DNA的序列长度与待测基因的DNA的序列长度相近。

上述步骤2)中RNA与DNA的预混合液中，mRNA拷贝数与DNA拷贝数的比值的范围应当不受限制，根据实施例中对家蚕基因转录的测定，中等水平表达在50～5000∶1。因此，预混合液中，mRNA拷贝数与DNA拷贝数的比值优选为100∶1。

上述步骤3)中的cDNA的制备过程为：将外参基因的mRNA装入T7体外转录质粒，再用T7RNA聚合酶体外转录制得，其他常用于体外转录的酶还有SP6和T3RNA聚合酶。

上述步骤3)中对同一基因的mRNA与DNA使用相同的引物分别进行实时定量荧光PCR扩增。

上述步骤3)中实时定量荧光PCR中的引物按照实时定量荧光PCR的常规要求进行设计并合成，具体要求为：要求引物退火温度尽量相同，扩增产物的长度尽量接近，扩增产物的GC含量尽量接近，且每对引物应当是位于同一个外显子中。同时由于本发明中需要同时对mRNA与DNA进行扩增，同一基因的mRNA与DNA使用相同的引物进行实时定量荧光PCR扩增可以消除由于引物不同和扩增片段不同带来的误差。可以根据上述规则使用引物设计软件(例如clone manager)进行设计。

上述步骤3)中的实时定量荧光PCR扩增产物的长度范围一般为100bp～300bp，同一批测定要求长度尽量接近，这里在由软件设计时扩增产物的长度规定为140bp～160bp。

优选的，所述RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法还包括根据如下公式计算待测基因的表观表达水平：

本发明的检测方法通过引入外参基因的mRNA和外参基因的DNA分别对待测样品中待测基因的mRNA(转录产物)和DNA(基因)进行标定，通过外参基因的mRNA的初始拷贝数与外参基因的DNA的初始拷贝数之间的比值最终测出在该样品中待测基因的mRNA的初始拷贝数与待测基因的DNA的初始拷贝数之间的比值，并且使用该比值来表征这个基因的表达水平。考虑到各基因转录产物的寿命是不一样的，有些基因的转录产物半衰期很短，在检测过程中可能有些转录产物已经水解消亡，因此将使用本发明的方法测得的基因转录水平称为“表观转录水平”。本发明的方法使用了mRNA和DNA双外参来分别对转录产物和基因进行跟踪标定，是一种双跟踪标定技术(daul-spike-in technique)。

本发明的第二个目的是提供所述的RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法在芯片(包括cDNA芯片和寡核苷酸芯片)检测基因表达和基因拷贝数变异中的应用，包括如下步骤：

1)选定外参基因，在基因芯片上设计针对该外参基因的探针；

2)配制外参基因的mRNA与DNA的预混合液；

3)在抽提样品中加入步骤2)中制得的预混合液，分别收集样品中的总mRNA和DNA部分；

4)mRNA和DNA分别进行表达谱芯片检测流程和拷贝数变异芯片(tiling arrayplatform)检测流程，得到各基因的mRNA和DNA以及外参基因的mRNA和DNA的拷贝数变化情况；

5)根据如下原理进行数据处理和归一化，最终计算待测基因的转录水平：

所述步骤1)中的外参基因可以为1个或多个。

目前，正在广泛使用的芯片技术实际上与实时定量PCR采用同样的方法来进行数据的归一化的。从用看家基因归一化和总RNA归一化，再到跟踪标定。因此本发明的方法可以扩展到高通量测定的平台，即：用RNA外参跟踪标定转录产物，用DNA外参跟踪标定基因拷贝数，这样可以将mRNA水平与基因拷贝数联系起来。基因芯片有二类：cDNA芯片和寡核苷酸芯片。最近更有用寡核苷酸探针如屋顶上盖瓦片一样交叉重叠起来组成了一种嵌合芯片(tiling array platform)技术，这种嵌合芯片既能分析基因表达谱又能够分析基因拷贝数的变化，是一种很好的工具。在用上述二类基因芯片技术分析基因表达谱时使用本发明的方法同样可以将mRNA水平与基因拷贝数联系起来。当mRNA水平与基因拷贝数联系起来后，同一基因的表达水平在不同组织之间可以进行比较，在同一组织不同条件下可以进行比较；不同基因之间也可以进行比较；同一批的实验可以进行比较，不同批的实验也可以进行比较。因此，本发明的方法可以为基因表达数据和基因拷贝数据的整合提供新的概念和框架。

本发明极大地改进了对基因转录水平检测的实验设计，使得人们可以得到某个基因的真实的转录水平而不是一个相对水平。此策略对于芯片分析以及芯片数据的整合同样适用。

本发明采用RNA和DNA双外参分别跟踪标定样品中的转录产物和基因的拷贝数，使基因的转录水平能够与每个基因联系起来。本发明的方法是不依赖样品，可以广泛使用，并且能够得到更具有生物学意义的数据的技术。根据实施例中的实验结果，那些看家基因，如GAPDH和A3实际上在各组织中是差异表达的，然而它们以前却经常被用作内参，因此使用看家基因作内参的数据也许是不准确的，可能需要重新进行检测。

附图说明

图1质粒pPigT.7的结构示意图。

图2质粒FFa2A3IFP2的结构示意图。

图3bacmid AcA3IFP2的结构示意图。

图4IFP2DNA标准曲线。

图5Cyp6AB4在家蚕各组织中的表观转录水平图。

具体实施方式

下面结合实施例进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而非限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：试验手册(New York：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1989)中所述的条件或者制造商建议的条件进行或配置。

实施例1

1.实验蚕的处理：

实验蚕54A的卵由中国农业科学研究院蚕业研究所提供，催青、孵化后用人工饲料在25℃饲养。幼虫长到5龄第3天解剖，取中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管和中肠，重蒸水洗3次后-70℃保存。

2.RNA和DNA外参的选择：

piggyBac转座子在鳞翅目细胞系TN-368中发现的，它由2个转座臂和一个转座酶IFP2的编码序列组成。由于IFP2不存在于家蚕中，因此选择IFP2作为本实施例的外参。

3.检测RNA和DNA外参的比值：

质粒pPigT.7是将T7-IFP2表达框插入载体pUC19中制得，质粒pPigT.7(4983bp)的结构图见图1。

使用限制性内切酶Hind III将质粒pPigT.7线性化，然后进行琼脂糖凝胶电泳纯化后，用Thermo NanoDrop1000 Spectrophotometer(Gene Company Ltd)仪器通过紫外吸收定量。

以上述线性化的pPigT7为模板，使用T7RNA聚合酶通过体外转录制备外参RNA，即IFP2mRNA。其具体制备过程如下：

总反应体积为20μl。反应体系中含有2μl 50mM的DTT(Dithiothreitol，二硫苏糖醇)，pPigT7模板1.2μg，4种NTP各2.5mM，10×反应缓冲液2μl，20单位RNA酶抑制剂和50单位T7RNA聚合酶，37℃下保温1小时。产物经DNase I处理后用CsCl(氯化铯)超离心纯化，用Thermo NanoDrop1000 Spectrophotometer(Gene Company Ltd)仪器通过紫外吸收定量。最后用DEPC-H₂O将制备好的IFP2mRNA稀释成浓度为1ng/μl(即7.605×10⁸拷贝/μl)的溶液。

考虑到细胞DNA抽提液中的DNA片段的长度通常比质粒DNA大许多，为避免DNA抽提液中DNA中其他片段的干扰所产生的不必要的误差，因为外参基因的mRNA和DNA分别对待测基因的mRNA和DNA进行跟踪标定，因此要求与被跟踪的mRNA和DNA在各种处理过程(酒精沉淀，RNA的反转录，用于芯片测定时的DNA随机引物延伸等)中的行为一致。

因此本实施例选用含IFP2的bacmidAcA3IFP2(～134kb)(结构参见图2)来作为外参DNA。含IFP2的bacmid AcA3IFP2的制备方法为：将质粒FFa2A3IFP2(是将A3-IFP2表达框插入载体pFFa2中制得，其结构图见图2)转入bacmid AcΔEGT得到bacmidAcA3IFP2(结构如图3所示)。

通过实时定量PCR方法，以Hind III线性化的pPigT7为标准，检测AcA3IFP2的浓度，具体检测方法如下：

实时定量PCR用SYBR Premix Ex Taq kit(TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95℃下变性1min，然后在95℃ 5sec，55℃ 10sec，72℃ 10sec循环50次，然后收集荧光信号。荧光数据收集的温度77℃。

检测结果如图4所示，经过计算可知AcA3IFP2 DNA外参的浓度为9.341×10⁶拷贝/μl。

将等体积的外参IFP2 mRNA和AcA3IFP2混合，2μl混合液中含DNA外参9.341×10⁶拷贝，RNA外参7.605×10⁸拷贝，二者之比为1∶81.4。将它们加到100mg家蚕组织匀浆液中，与细胞基因组DNA的拷贝数(～10⁸)大致是相匹配的。

4.待测样品处理：

依产品说明书用TRNzol-A⁺Total RNA试剂(Tiangen Biotech Co.，LTD Beijing，China)分别抽提家蚕各组织的总mRNA和DNA，具体步骤如下：

将待检测组织研磨后将1ml抽提液加到100mg组织样品中，同时加2μl IFP2 mRNA和AcA3IFP2的预混合液，使之充分混合，裂解细胞并且溶解细胞内含物。在12,000rpm的转速下离心15min，分别收集RNA和DNA部分。

总RNA部分用DNase I处理后进行逆转录，合成第一条cDNA链。具体反应为：在20μl总反应体系中含有4μl 5×反应缓冲液，1μg总RNA，4种dNTP各0.5mM，25单位RNasin(核酸酶抑制剂)，1μl 50μM(dN)₆，2μl 10μM oligo(dT₁₅)及200单位M-MuLV逆转录酶(200U/μl；TaKaRa)。

5.实时定量PCR引物检测：

为减少由不同引物和扩增片段带来的实验系统误差，本实施例中对同一基因测定其mRNA和DNA的拷贝数时采用相同的引物对，并设计在同一外显子中。扩增产物的长度在144bp到152bp之间。针对FibH、FibL、Ser-1、Cyp6AB4、A3、GAPDH、28S rRNA和IFP2的引物见表1。

表1实时定量PCR引物

实时定量PCR的条件如下：

实时定量PCR用SYBR Premix Ex Taq kit(TakaRa Biotechnology(Dalian)Co.Ltd.)在95℃下变性1min，然后在95℃ 5sec，55℃ 10sec，72℃ 10sec循环50次，然后收集荧光信号。荧光数据收集的温度依据扩增产物而定(具体温度参见表1)。

6、实时定量PCR效率分析：

对于每一个基因的‘a’值通过实时定量PCR的DNA模板和RNA模板的稀释曲线来测定。取R²值趋向于1的最大值得到直线方程C(T)＝a×lg(copy)+b，这里斜率‘a’给出每一个基因的PCR的效率。结果表明不同基因的PCR扩增效率稍有不同(见表2)。这些‘a’值可以用于RNA与DNA比值的计算。

表2每个基因的qPCR效率

基因	IFP2	A3	GAPDH	28S rRNA	FibH	FibL	Ser-1	Cyp6AB4
									‘a’值	-3.6882	-3.1147	-3.1607	-3.617	-3.0705	-3.3803	-3.4732	-3.1139

7、实时定量PCR检测的数据处理和归一化：

通过检测某个基因在某个细胞状态下的mRNA和DNA的比值，即mRNA/DNA的值来确定在某细胞状态下每个拷贝的基因的表观转录量。

本实施例中通过检测组织或者样品中待测基因的mRNA的拷贝数与待测基因DNA的拷贝数之比来判断待测基因在该组织或者样品中在特定时间范围内的表达水平，即：上述的“表观表达水平”。

本实施例的检测过程如下：

在用实时定量PCR测定了每个基因的mRNA和DNA水平后，计算这个基因的mRNA与DNA之比，并用实时定量PCR测定的外参基因的mRNA与DNA之比进行归一化，再乘以预混合液中外参基因的mRNA与DNA之比(81.4)进行归一化。

其中，第一步归一化的目的是用于去除诸如酒精沉淀、逆转录效率和PCR等技术上的问题；第二步归一化的目的是用于去除RNA和DNA样品处理过程带来的差别。通过上述两步归一化，可以准确地计算出某组织中的待测基因在某个条件下，每个拷贝的表达水平。计算公式如下：

PCR扩增时样品中初始拷贝数越高，则荧光信号强度超过阈值(T)时的扩增圈数C(T)就越小；C(T)值与初始拷贝数的对数成线性关系：C(T)＝a×lg(copy)+b，a和b分别是直线方程的斜率和截距。根据数学运算lg(copy1/copy2)＝(C(T)₁-C(T)₂)÷a.

C(T)＝a×lg(copy)+b，

C(T)₁＝a×lg(copy₁)+b………………………………………………………………(1)

C(T)₂＝a×lg(copy₂)+b………………………………………………………………(2)

(1)式-(2)式可得：

C(T)₁-C(T)₂＝a×(lgcopy₁-lgcopy₂)

所以可得：lg(copy₁/copy₂)＝[C(T)₁-C(T)₂]÷a

即：

第一步归一：

第二步归一：

由于IFP2基因的mRNA与IFP2基因的DNA的初始含量之比为81.4，因此经过两步归一步骤后可知，

同时因为：

可得：

A3基因在后部丝腺测定结果计算步骤如下：

三次mRNA测定的C(T)值的平均为24.092，

三次DNA测定的C(T)值的平均为32.947，

A3基因PCR扩增反应的a值是-3.1147，

lg(A3mRNA/A3DNA)＝(24.092-32.947)÷(-3.1147)＝2.84297

(A3mRNA/A3DNA)＝10^2.84297＝696.58

外参IFP2在后部丝腺测定结果：

四次RNA测定的C(T)值的平均为23.337，

六次DNA测定的C(T)值的平均为29.742，

外参IFP2PCR扩增反应的a值是-3.6882，

lg(IFP2 RNA/IFP2 DNA)＝(23.337-29.742)÷(-3.6882)＝1.73662

(IFP2 RNA/IFP2 DNA)＝10^1.73662＝54.528

A3基因在后部丝腺的表观表达水平＝696.58÷54.528×81.4＝1039.9

实施例2 检测A3，GAPDH，28S rRNA在家蚕各组织中的表达：

使用实施例1中的检测方法对A3，GAPDH，28S rDNA基因的转录产物和基因以及外参IFP2mRNA和DNA在家蚕中部丝腺、后部丝腺、脂肪体、马氏管和中肠抽提物中的拷贝数进行了测定。A3，GAPDH and 28SrDNA基因在这些组织中的每拷贝基因的表达量按上述方法计算出来。它们的表观转录水平在不同组织间差别很大(如表3所示)。

表3 家蚕各组织中A3，GAPDH and 28S rRNA基因的表观转录水平

组织	A3	GAPDH	28S rRNA
				中部丝腺(MSG)	122.25±4.83	10.794±1.728	5935.5±353.3
后部丝腺(PSG)	1097.6±276.4	154.39±6.72	9016.1±458.8
				脂肪体(FB)	538.69±102.55	10475±2237	97321±12804
马氏管(Malpighiantubule)	408.88±34.85	124.11±21.01	2915.1±318.8
				中肠抽提物(middle gut)	9.9191±0.4845	6.5678±0.1937	2177.8±389.8

上述实验结果表明actin-3基因(即：A3基因)的表观转录水平与家蚕组织的生长速度相一致，最高的是后部丝腺，接下来依次是脂肪体、马氏管、中部丝腺和中肠。GAPDH的表观转录水平反映了各组织的能量代谢的能力，而28S rDNA的表观转录水平表示出各组织的蛋白质合成能力。GAPDH的表达最高的是脂肪体，接着是后部丝腺、马氏管、中肠和中部丝腺。28S rDNA的表达最高的也是脂肪体，接着是后部丝腺、中部丝腺、马氏管和中肠。家蚕脂肪体的功能与高等动物的肝脏类似，在能量代谢和蛋白质合成上起着至关重要的作用，这能解释GAPDH和28S rDNA基因在脂肪体中的表达特别高的结果。28S rDNA基因在后部丝腺和中部丝腺也相当高，这与丝腺的这两部分中高蛋白合成的相符。

这个结果提示这些常被用作内参的基因在测定组织专一性表达时用来归一化其他基因的表达是不合适的。

由于本实施例中计算的是每个基因的转录水平，对于多拷贝基因，它的真实的转录产物就要多得多。例如，在脂肪体中RNA与DNA之比对A3是538.69，对GAPDH是10475，对28S rRNA是97321。由于基因组中rDNA和核糖体蛋白基因有200-300拷贝，所以28SrRNA的量比A3和GAPDH的mRNA还要多得多。

实施例3家蚕中丝素基因和丝胶1基因的表达的检测：

检测方法同实施例1。测定了家蚕各组织中丝素重链基因(FibH)、轻链基因和丝胶1基因的表观转录水平。结果显示FibH和FibL专一地在后部丝腺表达，Ser-1专一地在中部丝腺表达。FibL在后部丝腺的表观转录水平(192029±30739)与Ser-1在中部丝腺的表观转录水平(196539±12455)相近，而FibH在后部丝腺的表观转录水平(106453±13667)约是FibL的一半。

如果将FibH和FibL在后部丝腺的表达以及Ser-1在中部丝腺的表达如以前常做的用A3，GAPDH或28S rRNA进行归一化，Ser-1在中部丝腺的表达比FibL在后部丝腺的表达要高得多。这是由于A3，GAPDH和28S rDNA基因在丝腺两部分的表达不同之故。结果参见表4，表4中的结果证明一个基因的表观转录水平比对看家基因的相对表达要可靠。

表4 表观转录水平和相对测定的比较

表达的基因和组织	后部丝腺中FibH的表达	后部丝腺中FibL的表达	中部丝腺中Ser-1的表达
				表观转录水平	106453	192029	196539
相对于A3的表达	96.987	174.95	1607.7
				相对于GAPDH的表达	689.51	1243.8	18208
相对于28S rRNA的表达*	0.039357	0.070995	0.11037

^*依每个基因组中有300拷贝28S rDNA计算。

同样，如上所述，FibH和FibL在后部丝腺的表观转录水平(106453和192029)，Ser-1在中部丝腺的表观转录水平(196539)都超过28S rDNA在丝腺的这二个部分中的表观转录水平(后部丝腺9016.1，中部丝腺5935.5)。这与丝腺在5龄第3天大量合成丝素和丝胶相一致。考虑到基因组中rDNA有200-300拷贝，虽然FibH，FibL和Ser-1以每个基因的转录水平高于28S rDNA，rRNA的总量还是比比这些基因的mRNA高许多，因而保证了蛋白合成系统的功能。

实施例4细胞色素P450(Cyp6AB4)表达的组织专一性

Cyp6AB4是近年克隆的一种家蚕细胞色素P450，然而其表达的组织专一性还不清楚。

检测方法同实施例1。检测结果如图5中所示，Cyp6AB4在各组织的表观转录水平显示Cyp6AB4主要在马氏管和脂肪体中表达，在中肠和丝腺中不表达。

本实施例用家蚕做模式系统来测定不同基因在各组织中的表观转录水平。家蚕的基因表达明显地在空间与时间上受到调控，例如丝素蛋白专一地在5龄家蚕的后部丝腺表达，而丝胶蛋白则在中部丝腺表达。这对于研究基因的组织专一性表达，并发展测定方法十分有利。

同时，本实施例测定了家蚕幼虫丝腺的不同部位、脂肪体、马氏管、中肠中细胞质肌动蛋白(cytoplasmic actin，A3)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)、28S核糖体RNA(28S rRNA)的表观转录水平。发现A3，GAPDH、28SrRNA这些常被用作内参的基因在不同组织中的表达差别非常大，说明采用本实施例的检测方法是非常必要的。在此基础上，本实施例中测定了丝素重链蛋白基因(fibroin heavychain，FibH)和轻链蛋白基因(fibroin light chain，FibL)、丝胶蛋白1基因(sericin-1，Ser-1)和细胞色素P450Cyp6AB4基因(cytochrome P450，Cyp6AB4)转录的组织专一性。

实施例5RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法应用于嵌合芯片(tiling arrayplatform)技术平台

本实施例中，将该RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法应用于嵌合芯片(tilingarray platform)技术平台，对表达谱和基因拷贝数进行联合检测和整合分析。步骤如下：

1)选定外参基因，并且在tiling array芯片上设计针对该外参基因的探针；

2)制备外参基因的RNA与DNA，配制外参基因的RNA与DNA的预混合液；

3)将预混合液混入组织样本，分别收集总mRNA和DNA；

4)mRNA样本用于表达谱检测，得到样本的基因表达情况以及外参基因的mRNA拷贝数；DNA样本用于拷贝数变异(copy number variation，缩写为CNV)检测，得到样本的DNA拷贝数以及外参基因的拷贝数情况；

5)按照如下原理进行数据处理和归一化，实现基因表达数据与基因拷贝数据的整合，最终计算待测基因的转录水平：

序列表

<110>上海生物信息研究中心

<120>RNA和DNA双外参检测方法

<130>090365

<160>17

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>4983

<212>DNA

<213>重组质粒

<400>1

tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca    60

cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg    120

ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc    180

accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc    240

attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat    300

tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt    360

tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt ctaatacgac tcactatagg    420

gcgccgcttg gagctcgcgt gaggcgtgct tgtcaatgcg gtaagtgtca ctgattttga    480

actatatcga ccgcgtgagt caaaatgacg catgattatc ttttacgtga cttttaagat    540

ttaactcata cgataattat attgttattt catgttctac ttacgtgata acttattata    600

tatatatttt cttgttatag atatcgtgac taatatataa taaaatggga tgttctttag    660

acgatgagca tatcctctct gctcttctgc aaggcgatga cgagcttgtt ggtgaggatt    720

ctgacagtga aatatcagat cacgtaagtg aagacgtcca gagcgataca gaagaagcgt    780

ttatagatga ggtacatgaa gtgtcagcca acgtcaagcg tagtgaaata ttagacgaac    840

aaaatgttat tgaacaacca ggttcttcat tggcttctaa cagaatcttg accttgccac    900

agaggactat tagaggtaag aataaacatt gttggtcaac ttcaaagtcc acgagcggta    960

gccgagtctc tgcactgaac attgtcagat ctcaaagagg tccgacgcgt atgtgccgca    1020

atatatatga cccactttta tgcttcaaac tattttttac tgatgagata atttcgcaaa    1080

ttgtaaaatg gacaaatgct gagatatcat tgaaacgtcg ggaatctatg acaggtgcta    1140

catttcgtga cacgaatgaa gatgaaatct atgctttctt tggtattctg gtaatgacag    1200

cagtgagaaa agataaccac atgtccacag atgacctctt tggatcgatc tttgtcaatg    1260

tgtacgtctc tgtaatgagt ctgtggatcg ttttggattt tttgatacga tgtcttagaa    1320

tggatgacaa aagtatacgg cccacacttc gagaaaacga tgtatttact cctgttagaa    1380

aaatatggga tctctttatc catcagtgca tacaaaatta cactccaggg gctcatttga    1440

ccatagatga acagttactt ggttttagag gacggtgtcc gtttaggatg tatatcccaa    1500

acaagccaag taagtatgga ataaaaatcc tcatgatgtg tgacagtggt acgaagtata    1560

tgataaatgg aatgccttat ttgggaagag gaacacagac caacggagta ccactcggtg    1620

aatactacgt gaaggagtta tcaaagcctg tgcacggtag ttgtcgtaat attacgtgtg    1680

acaattggtt cacctcaatc cctttggcaa aaaacttact acaagaaccg tataagttaa    1740

ccattgtggg aaccgtgcga tcaaacaaac gcgagatacc ggaagtactg aaaaacagtc    1800

gctccaggcc agtgggaaca tcgatgtttt gttttgacgg accccttact ctcgtctcat    1860

ataaaccgaa gccagctaag atggtatact tattatcatc ttgtgatgag gatgcttcta    1920

tcaacgaaag taccggtaaa ccgcaaatgg ttatgtatta taatcaaact aaaggcggag    1980

tggacacgct agaccaaatg tgttctgtga tgacctgcag taggaagacg aataggtggc    2040

ctatggcatt attgtacgga atgataaaca ttgcctgcat aaattctttt attatataca    2100

gccataatgt cagtagcaag ggagaaaagg ttcaaagtcg caaaaaattt atgagaaacc    2160

tttacatgag cctgacgtca tcgtttatgc gtaaccgttt agaagctcct actttgaaga    2220

gatatttgcg cgataatatc tctaatattt tgccaaatga agtgcctggt acatcagatg    2280

acagtactga agagccagta atgaaaaaac gtacttactg tacttactgc ccctctaaaa    2340

taaggcgaaa ggcaaatgca tcgtgcaaaa aatgcaaaaa agttatttgt cgagagcata    2400

atattgatat gtgccaaagt tgtttctgac tgactaataa gtataatttg tttctattat    2460

gtataagtta agctaattac ttattttata atacaacatg actgttttta aagtacaaaa    2520

taagtttatt tttgtaaaag agagaatgtt taaaagtttt gttactttag aagaaatttt    2580

gagtttttgt ttttttttaa taaataaata aacataaata aattgtttgt tgaatttatt    2640

attagtatgt aagtgtaaat ataataaaac ttaatatcta ttcaaattaa taaataaacc    2700

tcgatataca gaccgaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaagcttg gcgtaatcat    2760

ggtcatagct gtttcctgtg tgaaattgtt atccgctcac aattccacac aacatacgag    2820

ccggaagcat aaagtgtaaa gcctggggtg cctaatgagt gagctaactc acattaattg    2880

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cattaatgaa    2940

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg ctcttccgct tcctcgctca    3000

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg    3060

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc    3120

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc    3180

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac    3240

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc    3300

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata    3360

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc    3420

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca    3480

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag    3540

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta    3600

gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg    3660

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc    3720

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt    3780

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa    3840

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat    3900

atgagtaaac ttggtctgac agttaccaat gcttaatcag tgaggcacct atctcagcga    3960

tctgtctatt tcgttcatcc atagttgcct gactccccgt cgtgtagata actacgatac    4020

gggagggctt accatctggc cccagtgctg caatgatacc gcgagaccca cgctcaccgg    4080

ctccagattt atcagcaata aaccagccag ccggaagggc cgagcgcaga agtggtcctg    4140

caactttatc cgcctccatc cagtctatta attgttgccg ggaagctaga gtaagtagtt    4200

cgccagttaa tagtttgcgc aacgttgttg ccattgctac aggcatcgtg gtgtcacgct    4260

cgtcgtttgg tatggcttca ttcagctccg gttcccaacg atcaaggcga gttacatgat    4320

cccccatgtt gtgcaaaaaa gcggttagct ccttcggtcc tccgatcgtt gtcagaagta    4380

agttggccgc agtgttatca ctcatggtta tggcagcact gcataattct cttactgtca    4440

tgccatccgt aagatgcttt tctgtgactg gtgagtactc aaccaagtca ttctgagaat    4500

agtgtatgcg gcgaccgagt tgctcttgcc cggcgtcaat acgggataat accgcgccac    4560

atagcagaac tttaaaagtg ctcatcattg gaaaacgttc ttcggggcga aaactctcaa    4620

ggatcttacc gctgttgaga tccagttcga tgtaacccac tcgtgcaccc aactgatctt    4680

cagcatcttt tactttcacc agcgtttctg ggtgagcaaa aacaggaagg caaaatgccg    4740

caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc ctttttcaat    4800

attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt    4860

agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct    4920

aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc    4980

gtc                                                                  4983

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>2

cggctactcg ttcactacc                                    19

<210>3

<211>19

<212>DNA

<213>引物

<400>3

ccgtcgggaa gttcgtaag                                    19

<210>4

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>4

cggtaacgag tccattgtag                                   20

<210>5

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>5

ccttgatgag tgctgtatcc                          20

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>6

cggaggtgga agaatctatg                          20

<210>7

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>7

atgtaggcag cgatgttg                            18

<210>8

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>8

gctcaagcaa tcgtgatg                            18

<210>9

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>9

accgtcggtg gatgttac                            18

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>引物

<400>10

cccagtgctc tgaatgtcaa c                        21

<210>11

<211>22

<212>DNA

<213>引物

<400>11

agatagggac agtgggaatc tc                       22

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>12

ctgtgcacgg tagttgtc                            18

<210>13

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>13

tcagtacttc cggtatctcg                            20

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>14

tgttgagggc ttgatgac                              18

<210>15

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>15

accttaccca cagctttg                              18

<210>16

<211>20

<212>DNA

<213>引物

<400>16

cgcgtatttc tatccaaggg                            20

<210>17

<211>18

<212>DNA

<213>引物

<400>17

acatggcacg caatttcc                                    18

Claims (7)

1.一种RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法，包括如下步骤：

1)配制外参基因的mRNA与外参基因的DNA的预混合液；

2)将待测样品与步骤1)中制备的预混合液混合，分别抽提并且收集总mRNA和总DNA；

3)总mRNA进行逆转录合成第一条cDNA链后与总DNA分别进行实时定量荧光PCR，然后计算扩增后待测基因的mRNA和DNA的拷贝数以及外参基因的mRNA和DNA的扩增产物的拷贝数。

2.如权利要求1所述的RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，所述步骤1)中的外参基因为被测样品中不存在的序列，同时该外参基因的mRNA与外参基因的DNA中均不含有待测基因的mRNA和DNA序列。

3.如权利要求1所述的RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，所述外参基因的DNA为包含外参基因的重组载体；所述外参基因的mRNA是以上述线性化的包含外参基因的重组载体为模板，通过体外转录制得的mRNA。

4.如权利要求3所述的RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，所述载体为质粒或杆状病毒。

5.如权利要求1所述的RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，对同一基因的mRNA与DNA使用相同的引物分别进行实时定量荧光PCR扩增。

6.权利要求1-7任一权利要求中所述的RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法，其特征在于，还包括根据如下公式计算待测基因的表观表达水平：

7.权利要求6所述的RNA和DNA双外参实时定量荧光PCR检测方法在芯片分析基因表达和基因拷贝数变化中的应用，其特征在于，步骤1)中的外参基因相应的探针同时出现在用于表达谱检测和基因拷贝数检测的芯片中，可以为1个或多个。

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