CN104195148B - 用于EPA合成的一种绿色巴夫藻delta-5去饱和酶基因及制备方法 - Google Patents

用于EPA合成的一种绿色巴夫藻delta-5去饱和酶基因及制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及用于EPA合成的一种绿色巴夫藻delta‑5去饱和酶基因，其DNA序列为SEQ ID No.1。制备方法是：首先，从绿色巴夫藻中分离获得绿色巴夫藻的基因组DNA；接着，以绿色巴夫藻的基因组DNA为模板，根据去饱和酶基因保守组氨酸框的序列设计简并引物，从而扩增得到保守区基因；接下来，分别对其5’末端和3’末端进行染色体歩移获得全基因序列，通过普通PCR的方法获得基因全长。该基因的获得为进一步认识和利用极有现实意义的DHA合成过程提供了依据。

Description

用于EPA合成的一种绿色巴夫藻delta-5去饱和酶基因及制备 方法
技术领域
本发明属于基因克隆分离技术领域，尤其涉及于一种来源于真核微藻的有关多不饱和脂肪酸合成的去饱和酶基因及其分离方法。
背景技术
多不饱和脂肪酸是人体必需的重要的营养物质，真核微藻因富含多不饱和脂肪酸而成为重要的生物资源。绿色巴夫藻(Pavlova viridis)含有丰富的EPA(二十碳五烯酸)与DHA(二十二碳六烯酸)，该微藻是进行多不饱和脂肪酸相关合成基因识别与克隆的良好实验材料。
SEFA-PCR全称self-formed adaptor PCR，是一种通过引物“回头”形成适配子的方式来完成染色体行走的一种PCR技术。与其他如反向PCR等技术相比，SEFA-PCR具有扩增片段长、可靠性高、无需酶切连接步骤等优点。SEFA-PCR在扩增长未知DNA片段时尤其有效。SEFA-PCR全程需要三个引物的参与，分别是SP1,SP2和SP3。其中SP1和SP2是退火温度较高的特异性引物，而SP3则是一个从5’到3’末端分别含有15个特异性碱基、9个随机碱基与6个特异性碱基的部分兼并引物。
SOE全称Splicing by overlap extension，是一种不受酶切位点限制通过聚合酶链式反应获得基因拼合的方法。其原理是进行两端扩增的引物本身有一部分是反向互补的，通过大片段互为引物扩增的方式来获得经过拼合后的基因全长。SOE方法的优点是简单快捷，缺点是容易引入错配碱基，需要重复实验确认拼接结果。
在真核微藻的DHA的体内合成途径中，起到最关键作用的是多不饱和脂肪酸去饱和酶和多不饱和脂肪酸延伸酶两大酶类。但由于其为与内质网结合的膜蛋白，上述酶类在分子水平上的研究受到很大限制。其中，delta-5去饱和酶是合成二十碳五烯酸EPA的最后一个关键酶，其在合成途径中的地位是极为重要的。目前在真核微藻中已经有数个来自于不同物种的delta-5去饱和酶获得了分离和识别，但不同物种的同源酶显然都存在序列上和结构上的差异，进而导致其酶活性和功能的不同。因此，从绿色巴夫藻中分离得到其delta-5去饱和酶的同源酶是对该部分研究资源的很好补充，本发明就试图从这个角度展开相关的工作。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于EPA合成的一种绿色巴夫藻delta-5去饱和酶基因及制备方法。
用于EPA合成的一种绿色巴夫藻delta-5去饱和酶基因的DNA序列为SEQ IDNo.1。
制备所述的绿色巴夫藻delta-5去饱和酶基因的具体操作步骤如下：
首先，从绿色巴夫藻中分离获得绿色巴夫藻的基因组DNA；接着，以绿色巴夫藻的基因组DNA为模板，根据去饱和酶基因保守组氨酸框的序列设计简并引物P3F和P3R，从而扩增得到保守区基因；接下来，分别对其5’末端和3’末端进行染色体歩移获得全基因序列，通过普通PCR的方法获得基因全长。
本发明首次从绿色巴夫藻的基因组中分离获得了推定的多不饱和脂肪酸delta-5去饱和酶基因，丰富了该类酶的重要的基因资源，为进一步研究该酶的体内和体外的作用机制奠定了基础。
绿色巴夫藻delta-5去饱和酶基因可直接应用于多不饱和脂肪酸EPA的合成，为通过分子生物学手段体外合成EPA这种重要的营养物质提供了最关键的基因元件，其在毕赤酵母中的异源表达和转化实验如下：
为验证上述delta-5去饱和酶基因的功能，以所提mRNA为模板利用oligo dT Primer：5’-oligod(T)15GTAAAACGACGGCCAGT-3’逆转录合成cDNA第一链，并以之作为克隆delta-5表达基因的模板。随后根据获得的delta-5全长基因的序列，分别设计上游引物TAGGATTCATGGCTCCGCGCGACGCTTACACG和下游引物AAGCGGCCGCTTAGTGCTTGTGCTCGTGCACG，并以94oC 3min；94oC 30s,60oC 30s,72oC 1.5min，30个循环；72oC 10min的PCR条件扩增获得表达基因片段。随后通过本领域常用的亚克隆手段将该片段连接到载体pPIC3.5k,得到毕赤酵母表达质粒pPIC3.5k-delta-5,随后将该质粒与空载体分别电转化入毕赤酵母中得到GS115-5和GS115-pPIC3.5K。挑取阳性转化子接种到装有5mlBMGY液体培养基的试管中，29oC,180rpm摇床培养过夜。然后吸取500μl过夜培养的菌液接种至50mlBMGY液体培养基的三角瓶中，正常条件培养至OD600达到4-6。离心收集菌体，稀释4-6倍将菌体转移至BMMY液体培养基中，使初始的菌密度值达到1.0。向培养基中加入终浓度为0.5％的甲醇和100μM的底物ETA(二十碳四烯酸)开始诱导。要每隔半天添加甲醇维持0.5％的诱导浓度。培养96h后离心收集菌体，超声法提取脂肪酸并进行甲酯化，气相色谱分析脂肪酸组成变化。脂肪酸变化的结果如表1所示。通过表1的结果可以看出，重组菌具备了将ETA合成EPA(二十碳五烯酸)的能力，表明所克隆得到的基因为一种新的脂肪酸delta-5去饱和酶的编码基因。
表1重组毕赤酵母的长链脂肪酸组成
脂肪酸组成 GS115-5 GS115-pPIC3.5K
C14：0 8.96 8.45
C16：0 5.51 6.37
C17：0 2.38 2.34
C18：0 3.87 3.88
C18：1n9 4.54 9.21
C18：1n7 5.68 3.87
C18：3n3 29.45 30.05
C20：0 27.10 29.35
C20：4n3(ETA) 0.51 ND
C20：5n3(EPA) 3.05 ND
ND表示测量不到；
以上所述BMGY培养基的组成为1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油，外加十分之一体积的13.4％YNB，4*10-5％生物素以及1/10体积的pH6.0的磷酸盐缓冲液。
以上所述BMMY培养基的组成为1％酵母粉，2％蛋白胨，外加十分之一体积的13.4％YNB，4*10-5％生物素以及1/10体积的pH6.0的磷酸盐缓冲液。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。
实施例1
绿色巴夫藻(Pavlova.viridis)为常用真核微藻，购自中国科学院海洋研究所。
制备绿色巴夫藻delta-5去饱和酶基因的具体操作步骤如下：
(1)利用本领域常规的DNA、RNA提取分离手段从绿色巴夫藻(Pavlova.viridis)中获得绿色巴夫藻的基因组DNA和总mRNA；
(2)delta-5去饱和酶基因的保守区扩增过程如下：
(2.1)使用5μl RNA作为模板，利用多聚胸腺嘧啶寡核苷酸引物(oligo dT Primer)：5’-oligod(T)15GTAAAACGACGGCCAGT-3’逆转录合成cDNA第一链；
(2.2)以上述cDNA第一链作为模板，并根据delta-5去饱和酶同源基因的保守性设计上游引物P3F、下游引物P3R来进行保守区基因的扩增；所述上游引物P3F的DNA序列为：5’-TTGCAGCACATGGGCGGCCACTAC-3’；所述下游引物P3R的DNA序列为：5’-AGCCATGTGGTGCTCGATCTCTGGTA-3’；PCR反应条件为：94℃预变性时间3min；94℃变性时间30s，60℃退火时间30s，72℃延伸时间1min,30个循环；72℃后延伸时间10min；其具体的10μl反应体系如下：上游引物P3F、下游引物P3R各自0.4μl；10×PCRbuffer 1μl；dNTP 2.5mM each 0.8μl；Easytaq酶0.2μl；去离子水6.2μl；
本步骤(2)扩增得到delta-5去饱和酶基因的保守区片段；
(3)delta-5去饱和酶基因两端基因的克隆通过SEFA-PCR的方法来完成，具体步骤如下：
(3.1)获得delta-5去饱和酶基因的保守区3’末端片段；
(3.1.1)在10μl无引物的所述常规PCR体系中，加入1μl SP3-3’引物，94℃变性时间30s，35-45℃退火时间30s，然后以0.2度/s的速度升至70度，接下来以70℃延伸5min；
(3.1.2)加入3μl SP1-3’引物，94℃变性时间30s，以70℃退火和延伸5min，进行两个循环；
(3.1.3)94℃变性时间30s，以70℃退火和延伸5min，再以94℃变性时间30s，55-60℃退火时间30s，70℃延伸时间5min，进行25个循环；
第二轮反应是只使用SP2-3’引物的普通的PCR反应，反应条件设为94℃预变性时间3min；94℃变性时间30s,70℃退火时间30s，72℃延伸时间1min，进行30个循环；最后72℃延伸时间10min；
本步骤扩增得到delta-5去饱和酶基因的保守区3’末端片段；
以上所述的3’末端的引物序列为：
SP1-3’：5’-GCTTCCCGTCCCCAGGGTCGAGTATG-3’；
SP2-3’：5’-TCGTGGTGGTGCGACTGGTGGATGT-3’；
SP3-3’：5’-CCTACCTCAACTACCAGANNNNNNNNNACATGG-3’；
(3.2)获得delta-5去饱和酶基因的保守区5’末端片段；
(3.2.1)在10μl无引物的所述常规PCR体系中，加入1μl SP3-5’引物，94℃变性时间30s，35-45℃退火时间30s，然后以0.2度/s的速度升至70度，接下来以70℃延伸5min；
(3.2.2)加入3μl SP1-5’引物，94℃变性时间30s，以70℃退火和延伸5min，进行两个循环；
(3.2.3)94℃变性时间30s，以70℃退火和延伸5min，再以94℃变性时间30s，55-60℃退火时间30s，70℃延伸时间5min，进行25个循环；
第二轮反应是只使用SP2-5’引物的普通的PCR反应，反应条件设为94℃预变性时间3min；94℃变性时间30s,70℃退火时间30s，72℃延伸时间1min，进行30个循环；最后72℃延伸时间10min；
本步骤扩增得到delta-5去饱和酶基因的保守区5’末端片段；
以上所述的5’末端的引物序列为：
SP1-5’：5’-TGCGGCGTCGCGTGGTGCTTGTTGTG-3’；
SP2-5’：5’-ACCCGACATGCCGCAACCGAG-3’；
SP3-5’：5’-CCATACACCGCGACCTGANNNNNNNNNGATTCG-3’；
将所有获得的基因片段连入pMD18T载体转化入大肠杆菌宿主菌后挑取转化子，进行测序，分别获得所述基因的保守区片段的DNA序列以及5’末端的DNA序列、3’末端的DNA序列，利用常规的DNA序列拼接方法将上述三个序列拼接到一起，得到的多不饱和脂肪酸delta-5去饱和酶的全长多核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2
为验证上述delta-5去饱和酶基因的功能，以所提mRNA为模板利用oligo dT Primer：5’-oligod(T)15GTAAAACGACGGCCAGT-3’逆转录合成cDNA第一链，并以之作为克隆delta-5表达基因的模板。随后根据获得的delta-5全长基因的序列，分别设计上游引物TAGGATTCATGGCTCCGCGCGACGCTTACACG和下游引物AAGCGGCCGCTTAGTGCTTGTGCTCGTGCACG，并以94oC 3min；94oC 30s,60oC 30s,72oC 1.5min,30个循环；72oC 10min的PCR条件扩增获得表达基因片段。随后通过本领域常用的亚克隆手段将该片段连接到载体pPIC3.5k,得到毕赤酵母表达质粒pPIC3.5k-delta-5,随后将该质粒与空载体分别电转化入毕赤酵母中得到GS115-5和GS115-pPIC3.5K。挑取阳性转化子接种到装有5mlBMGY液体培养基的试管中，29oC,180rpm摇床培养过夜。然后吸取500μl过夜培养的菌液接种至50mlBMGY液体培养基的三角瓶中，正常条件培养至OD600达到4-6。离心收集菌体，稀释4-6倍将菌体转移至BMMY液体培养基中，使初始的菌密度值达到1.0。向培养基中加入终浓度为0.5％的甲醇和100μM的底物ETA(二十碳四烯酸)开始诱导。要每隔半天添加甲醇维持0.5％的诱导浓度。培养96h后离心收集菌体，超声法提取脂肪酸并进行甲酯化，气相色谱分析脂肪酸组成变化。脂肪酸变化的结果如表1所示。通过表1的结果可以看出，重组菌具备了将ETA合成EPA(二十碳五烯酸)的能力，表明所克隆得到的基因为一种新的脂肪酸delta-5去饱和酶的编码基因。
表1重组毕赤酵母的长链脂肪酸组成
脂肪酸组成 GS115-5 GS115-pPIC3.5K
C14：0 8.96 8.45
C16：0 5.51 6.37
C17：0 2.38 2.34
C18：0 3.87 3.88
C18：1n9 4.54 9.21
C18：1n7 5.68 3.87
C18：3n3 29.45 30.05
C20：0 27.10 29.35
C20：4n3(ETA) 0.51 ND
C20：5n3(EPA) 3.05 ND
ND表示测量不到；
以上所述BMGY培养基的组成为1％酵母粉，2％蛋白胨，1％甘油，外加十分之一体积的13.4％YNB，4*10-5％生物素以及1/10体积的pH6.0的磷酸盐缓冲液。
以上所述BMMY培养基的组成为1％酵母粉，2％蛋白胨，外加十分之一体积的13.4％YNB，4*10-5％生物素以及1/10体积的pH6.0的磷酸盐缓冲液。
ID NO.1:
P.viridis的多不饱和脂肪酸delta-5去饱和酶的全基因序列
ATGGCTCCGCGCGACGCTTACACGTACGTCAGCGGGCCGTCGGCGGCGATCTACGAGGGTGATGCGCCGCCGCAGGACGACAAGAAGGAGCTTGTGATCAACGATCGCGCCTACGACGTGACCGCGTTCATCAAACGCCACCCCGGTGGCAAGGTGATCGCCTACCAGGTGGGCACCGATGCGACCGATGCTTACAGGCAGTTCCATGTCCGCTCGAAGAAGGCGGACAAGGTGCTCAAGTCGCTGCCCTCGCGCCCGCTTCACAAGGGCTACGAGCCACGCCGCGCCGCGCTGCTCGCCGACTTTGCCGACTTCACGGCGCAGCTGAAGGCGGAGGGCAAGTTTGAGCCGAGCCCGCGCCAAGTGGTGTACCGCCTGGTGGAGGTGGTGGCGATGCACCTGGCGGGCGCCACGCTGATCTGGCACGGGTACACGCTTGCCGGCATCGCCATGCTCGGCGTCGTGCAGGGCCGCTGCGGCTGGCTCATGCACGAGGGCGGCCACTACTCGCTGACGGGCAACATCGGGATTGACCGCGCCATCCAGGTGGGCCCTCGCCCCACGCCTCTGCCGTCCAACCGGCGCGTGCCGCTGAGTGCGCGAGTCGAGCGGCGCTTGCTTCTCCTCGCCAGCCCGCCTCTGACCCCGCCCCTCTGACCCCGCACCGCGGCCATGGCGCGAATCGCGGCACGCTCAGGTCGCGGTGTATGGCCTCGGTTGCGGCATGTCGGGTGCCTGGTGGCGCAACCAGCACAACAAGCACCACGCGACGCCGCAGAAGATGAAGCACGACGTCGACCTCGACACGCTGCCCCTCGTCGCCTTCCACGAGCGGTGAGCCGCCAGCCTCGGCGCGCGCACGGGCGGTGTGCCATTCGCCTGCTGCACGCCACGCCCGCCGCGCCGCTGGCGAGAGGAGGGCAGGGCGGAGTGCCGAGGCCTCGCCCTCGCCATCCGGCGCCGCGCGCGACCGCGCGCCTCACCCGCCCTGTCCATCTCCCCATACCGCATCGTGCCCGCAGCGTGGCCTCGCGCGTGAAGAGCCCTCTGCTCAAGCAGTGGCTCAAGCTGCAGGCGACGCTCTTCGCGCCCGTCACGACTCTTCTCGTTGCGCTCGGCTGGCAGcTCTACCTGCACCCGCGCCACATGCTCCGCACCAAGCACTACGACGAGCTCTCGTAAGCCCTAGCCTGCTCCCGCCCTCCCCGCGCGGTCGACAAGGAGTTAGGCAAAGAGGGGTTGGCGGGGAAGTTGAGAGGGCGCATGCACCCTTCGCACGGGCGCCTGCGCACGGGCGCTGACGCGCGCGCCCGCCCCCTCTCCGCGCCCCCCGCTGCAGGATGCTCGGCATCCGTTACGGCTTCGTCGGCTACCTCGCGGCCAACTACGGCGCCGGCTACACGCTCGCCTGCTACCTGCTCTACGTCTCGCTCGGCAGCATGTACATCTTTTGCAACTTTGCCGTCTCGCACACGCACCTCGCCATTGTCGAGCCCGACCAACATGCCACATGGTAAGCGCCGCGCCCAGGCCCCGCCCGCACGCGCGCTTGGCGCGTGCGAGCTGCGGGCGTGTGCTCGCTCCGCCCGCACGTCGAGGCGTTGCCGCTCCCAAGCGGCGCAGCGCCCTGGACAGCGCAACGCACGCCGCTTGATGCCCGCGTCCCGGTGCGCTCATCTCTTCCCCGCGTTTCCCGCTTCCCGTCCCCAGGGTCGAGTATGCGGCCAACCACACGACCAACTGCGCGCCGTCGTGGTGGTGCGACTGGTGGATGTCCTACCTCAACTACCAGATCGAGCACCACCTGTTCCCGTCCATGCCCCAGTTCCGCCACCCGACCATTGCGCCGCGCGTGAAGGCGCTCTTCGAGAAGCACGGGCTCCATTACGACGTGCGCGGTTACTTCGAGGCGATGGCCGACACCTTCGTGAACCTCGACAAGGTGGGCAACGGCGTGCACGAGCACAAGCACTAA。

Claims (2)

1.一种来自于绿色巴夫藻的去饱和酶基因，其特征在于，其序列如SEQ.ID.No.1所示。
2.一种如权利要求1所述基因的用途，其特征在于，来自于绿色巴夫藻的去饱和酶基因在毕赤酵母中催化外源添加的二十碳四烯酸转化生成二十碳五烯酸中的应用。
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