NL9300965A - Werkwijze voor het bij een proefobject detecteren van de aanwezigheid van ten minste een hapteen, een macromolecuul, een pathogeen of immuunreactie opwekkend deel daarvan, alsmede een dergelijke werkwijze voor het detecteren van een eventuele immuunreactie. - Google Patents

Description

Werkwijze voor het bij een proefobject detecteren van de aanwezigheid van ten minste een hapteen, een macromolecuul, een pathogeen of immuunreactie opwekkend deel daarvan, alsmede een dergelijke werkwijze voor het detecteren van een eventuele immuunreactie.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bij een proefobject detecteren van de aanwezigheid van ten minste een hapteen, een macromolecuul, een pathogeen of immuunreactie opwekkend deel daarvan, alsmede een werkwijze voor het detecteren van een eventuele immuunreactie tegen het hapteen, het macromolecuul, het pathogeen of ten minste een immuunreactie opwekkend deel daarvan.

De uitvinding heeft ook betrekking op toepassing van genoemde werkwijze voor het screenen van proefobjecten op besmetting met ten minste een pathogeen of antigeen, voor het screenen op eventuele infectie met ten minste een pathogeen en/of voor het screenen op allergie tegen ten minste een hapteen of antigeen.

De uitvinding heeft ook betrekking op toepassing van de werkwijze voor het onderscheiden van besmetting met wild-type pathogeen en gemodificeerde pathogenen, alsmede op het onderscheiden van eventuele immuunreactie na besmetting met wild-type pathogeen en immuunreactie na contact met gemodificeerd vaccin.

De momenteel meest gebruikte manier voor het aantonen van specifieke antilichamen tegen een antigeen is de ELISA (enzyme linked immuno assay). Bij de ELISA vindt detectie van een antilichaam-antigeencomplex plaats door middel van enzymatische kleurreactie.

Andere veelvuldig voor het aantonen van antigeenspecifieke antilichamen toegepaste technieken zijn de RIA (radio immuno assay) en de IRMA (immuno radiometric assay), waarbij detectie van een antilichaam-antigeencomplex plaatsvindt onder toepassing van radioactieve merkmidde-len.

De grootste nadelen van het werken met radioactiviteit zijn de kosten en het besmettingsgevaar van omgeving en de persoon die de werkwijze uitvoert.

De ELISA kent de voor radioactiviteit genoemde nadelen weer niet en heeft als voordelen boven RIA en IRMA de grote gevoeligheid van de test alsmede de veel lagere kosten bij het verwerken van grote aantallen monsters. De ELISA heeft daarnaast echter ook een aantal nadelen. Met de ELISA kan men vele vals-positieve- en vals-negatieve-bepalingen krijgen ten gevolge van de vele forse wasstappen die vereist zijn. Er is slechts een vrij kleine marge waarbinnen de wasstappen niet tot verkeerde resultaten leiden; immers bij te zacht wassen worden er vals-positieve-waar-nemingen gedaan, maar bij te hard wassen worden gevormde immuuncomplexen verwijderd en niet gedetecteerd, hetgeen tot vals-negatieve resultaten leidt. Dit laatste aspect treedt meer op naarmate de immuuncomplexen groter worden, zoals bij bacteriële bepalingen, waarbij het complete microorganisme wordt gecomplexeerd. De ELISA-techniek vereist verder veel stappen en is dus vrij arbeidsintensief. Bij de ELISA wordt tevens indirect door middel van enzymatische reactie de aanwezigheid van een immuun-complex aangetoond. Verder is het niet mogelijk via een ELISA immuunreac-tie tegen pathogeen A bij een proefobject te detecteren, indien men bezig is een ELISA uit te voeren die gericht is op het aantonen van eventuele immuunreactie tegen pathogeen B. Het tegelijkertijd onderscheiden van ziektes is op effectieve wijze met ELISA-technieken niet goed te doen. Het is bijvoorbeeld wel mogelijk de microtiterplaat-putjes die bij een ELISA worden toegepast met een aantal voor verschillende pathogenen specifieke antigenen te bekleden, zodat een aantal voor verschillende patho-geneninfecties kenmerkende antilichamen eventueel uit het monster gebonden kan worden, maar hierbij neemt de gevoeligheid van de assay enorm af. Bovendien is dan slechts aan te tonen dat het proefobject immuunreactie vertoont tegen één van de pathogenen, maar niet tegen welk pathogeen.

Er bestaat een behoefte om direct te kunnen bepalen tegen welke antigenen, in het bijzonder voor infectie met pathogenen kenmerkende eiwitten, er bij het proefobject antilichamen zijn gevormd. Om dit te kunnen bepalen zullen eiwitten van een monster van een proefobject van elkaar moeten worden gescheiden.

Voor het scheiden van eiwitten in het algemeen is elektroforese een veel gebruikte techniek. Er bestaan diverse soorten elektroforese, zoals SDS-gel-elektroforese, natieve gel-elektroforese en iso-elektrisch focussen (IEF). Bij SDS-gel-elektroforese worden de eiwitten gedenatureerd; bij de laatste twee soorten niet. Bij de eerste twee methoden wordt gescheiden op grootte van het eiwit en bij de laatste op basis van het iso-elektrisch punt.

Aangezien antilichamen vanwege hun grote overeenkomsten qua grootte en lading en masse op hetzelfde punt elektroforeren en gezien het feit dat in situ op de gel direct aantonen van specifieke antilichamen tegen een bepaald antigeen onmogelijk is, omdat niet tegelijkertijd het anti-geen in de gel te krijgen is en de antilichamen op hun plaats te houden zijn, is het gebruik van enkel elektroforese voor het specifiek aantonen van een bepaald antigeen of antilichaam in een monster dat op gel is gebracht, niet mogelijk. Immers, het aan te brengen bestanddeel van het immuuncomplex moet door de gel diffunderen om bij de bestanddelen van het monster te komen en eventueel daarmee te reageren, maar ondertussen diffunderen de bestanddelen van het monster uiteraard ook, waardoor het onmogelijk is een betrouwbaar detectiepatroon te ontwikkelen.

Als oplossing voor dit probleem bij toepassing van elektroforese bij immunochemie zijn de blottingtechnieken ontwikkeld. Bij dergelijke blottingtechnieken wordt eiwitbindend papier in contact gebracht met een gel waarop eiwitten zijn gescheiden. Door toepassing van druk of elektroforese worden vervolgens de eiwitten op het papier overgebracht, waarbij op het papier een gefixeerde afdruk ontstaat van de eiwitbestanddelen zoals deze gescheiden zijn op de gel. Vervolgens kunnen op dezelfde wijze als bij de ELISA en RIA door het aanbrengen van een specifiek antilichaam, dat tegen het te detecteren pathogeen, deel van een pathogeen, hapteen of eiwit is gericht, specifieke detecteerbare immuuncomplexen worden gevormd, of kan een afdruk op papier worden gemaakt van de anti-lichamen en vervolgens het specifieke antigeen daarmee in contact worden gebracht en het eventuele resulterende immuuncomplex detecteerbaar worden gemaakt. Ook aan de blottingtechnieken kleven nadelen. De techniek is langzaam, duur, inefficiënt en ongevoelig. Bij het blotten, het kopiëren van de gel naar papier, gaat maar een deel van de gescheiden monster-bestanddelen over naar het papier, zodat de test inefficiënt is. Verder gelden ook dezelfde nadelen als bij de ELISA en RIA hiervoor zijn aangegeven.

De bestaande technieken volstaan niet om direct te bepalen tegen welke antigenen er bij het proefobject antilichamen zijn gevormd. Er bestaat geen test die efficiënt en eenvoudig laat zien dat een proefobject besmet en eventueel geïnfecteerd is en tegelijkertijd laat zien waarmee besmet en eventueel geïnfecteerd is.

Verrassenderwijs is nu een werkwijze gevonden voor het door middel van elektroforese direct bepalen tegen welke antigenen er door een proefobject, een proefdier of mens antilichamen zijn gevormd.

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bij een proefobject detecteren van de eventuele aanwezigheid van ten minste een hapteen, macromolecuul, pathogeen of een immuunreactie opwekkend deel daarvan en/of voor het detecteren van een eventuele immuunreactie op ten minste het hapteen, macromolecuul, pathogeen of een immuunreactie opwekkend deel daarvan, waarbij men a) een vloeistofmonster van het te onderzoeken proefobject neemt of bereidt, b) het monster incubeert met een stockoplossing, welke stockoplossing ten minste een kenmerkend antigeen van het te onderzoeken patho-geen, van een deel van het te onderzoeken pathogeen, van het te onderzoeken macromolecuul of van het te onderzoeken hapteen omvat of welke stockoplossing ten minste een antistof omvat, welke antistof specifiek is voor het te onderzoeken pathogeen, voor een deel van het te onderzoeken pathogeen, voor het te onderzoeken macromolecuul of voor het te onderzoeken hapteen, c) het geïncubeerde mengsel na incubatie aanbrengt op een voor niet-denaturerende-elektroforese geschikte drager, d) op dezelfde drager dezelfde stockoplossing die men in stap b) toepast als referentie aanbrengt, e) het mengsel van stap c) en de stockoplossing van stap d) onderwerpt aan elektroforese, waarbij scheiding van de componenten van incuba-tiemengsel en stockoplossing optreedt, f) bij een van de bovengenoemde stappen de componenten van incubatie-mengsel en stockoplossing detecteerbaar maakt en g) de na elektroforese resulterende bandenpatronen van incubatiemeng-sel en stockoplossing vergelijkt.

Tijdens de incubatiestap van vloeistofmonster met stockoplossing, welke stockoplossing bijvoorbeeld ten minste een specifiek te detecteren antigeen omvat, kunnen eventueel in het monster aanwezige antilichamen, die specifiek zijn voor het in de stockoplossing aanwezige antigeen, tot immuuncomplex met hun overeenkomstig antigeen reageren. Indien het proefobject een immuunreactie heeft ondergaan in reactie op besmetting of inoculatie met het specifiek te detecteren antigeen, zal het overeenkomstige voor dat antigeen specifieke antilichaam aanwezig zijn in het serummonster van het proefobject. Het antilichaam zal binden met in de stockoplossing aanwezig antigeen. Er zal immuuncomplexvorming plaatsvinden. Door vorming van het immuuncomplex zullen bepaalde moleculaire parameters van het aldus gebonden antigeen ten opzichte van niet gebonden antigeen veranderen. Deze wijziging van parameters, zoals iso-elektrisch punt en molecuulgewicht, kan bij elektroforese worden waargenomen, indien men bij de elektroforese de stockoplossing als referentie meeneemt naast het incubatiemengsel. Omdat men bij deze werkwijze de complexen van eiwitten, in het bijzonder van antilichaam-antigeen wil volgen is het noodzakelijk de elektroforese onder niet-denaturerende omstandigheden uit te voeren. Verrassenderwijs is gebleken dat de gevormde immuuncomplexen niet onder invloed van gelbestanddelen als glycerol of amfolinen denatureren of dissociëren en dat het beoogde doel derhalve bereikbaar is. Een deskundige op het gebied van eiwitten weet wat bij gel-elektroforese voor eiwitscheiding gebruikelijke niet-denaturerende omstandigheden zijn en kan deze zonder meer toepassen bij uitvoering van de werkwijze volgens de uitvinding.

SDS-PAGE levert voor de blottingtechniek weliswaar de beste resultaten, maar is voor het beoogde doel vanwege de plaatsvindende denatura-tie van eiwitten niet geschikt. Natieve PAGE kan in een werkwijze volgens de uitvinding worden toegepast als elektroforese-stap, maar verdient niet de voorkeur, vanwege de vorming van onscherpe banden, een slecht scheidend vermogen, veel aggregatie en problemen ten gevolge van lipiden e.d. in het monster. Natieve PAGE leidt vaak tot een ingewikkeld, moeilijk te interpreteren gelpatroon. Voor bepaalde simpele gevallen, die voor een deskundige op het gebied van elektroforese zonder meer duidelijk zullen zijn, is natieve PAGE echter wel toepasbaar als elektroforesestap in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding.

Het is bekend dat IEF kan plaatsvinden onder niet-denaturerende omstandigheden en derhalve is IEP geschikt om als elektroforesestap in de werkwijze volgens de onderhavige uitvinding te worden toegepast. IEF biedt bovendien het voordeel dat het een techniek is met een hoog scheidend vermogen en zal bij voorkeur als de elektroforesestap worden toegepast in stap e van de onderhavige werkwijze.

De onderhavige werkwijze biedt als voordeel, dat de gebruikelijke veelvuldige wasstappen en handelingen met het monster die bij ELISA's en dergelijke zijn vereist, niet nodig zijn. Er worden geen valspositieve en valsnegatieve waarnemingen gedaan en ook kan de onderhavige werkwijze dankzij de eenvoudige handelwijze voor grote aantallen monsters worden uitgevoerd.

Het is met de onderhavige werkwijze mogelijk om naar specifieke macromoleculen of haptenen te kijken en niet alleen naar een "all-over” pathogeen. Onder macromolecuul kan onder andere worden verstaan een eiwit of een polypeptide. Het is ook in afhankelijkheid van de samenstelling van de stockoplossing mogelijk om in één keer op meer dan één ziekte te screenen.

Tevens is het met de werkwijze volgens de uitvinding mogelijk, precies de pH-range te nemen die van interesse is voor een bepaalde ziekte. Wanneer men de IEF als elektroforesestap toepast, kan men bijvoorbeeld in een pH-gebied tussen 3"10 elektroforeren, maar kan men, indien men screent voor een specifieke besmetting, waarvan het kenmerkende antigeen bij een pH van 6-7 elektroforeert, enkel binnen dit pH-traject elektro-foreren, waardoor snel een veel duidelijker en specifiek resultaat kan worden verkregen.

Men kan alle immuuncomplexen en eiwitcomponenten van de gel detecteerbaar maken door gebruikelijke kleuringsreacties voor eiwitten toe te passen. Men kan de werkwijze volgens de uitvinding ook zodanig uitvoeren, dat elk kenmerkend antigeen of specifieke antistof van de stockoplossing van stap b) is voorzien van een merkmiddel. Men kan op deze wijze ook verschillende antigenen of antistoffen van de stockoplossing afzonderlijk of in groepen verschillend merken, al naar gelang hetgeen men wil detecteren.

De onderhavige uitvinding heeft ook betrekking op toepassing van de werkwijze volgens de uitvinding, welke werkwijze voor de overzichtelijkheid elektroforetische profilering wordt genoemd, voor het screenen van een proefobject op aanwezigheid van ten minste een pathogeen of deel daarvan of voor het screenen van een proefobject op een immuunreactie bij infectie of inoculatie met ten minste een pathogeen of deel daarvan.

Bij een dergelijke toepassing duidt detectie van een verschuiving en/of verdwijning van ten minste een band van het bandenpatroon van het incubatiemengsel in vergelijking met die van de referentie na elektro-forese op besmetting en eventueel ook op infectie met het toegepaste pathogeen, immuunreactie opwekkend deel van het pathogeen, macromolecuul of hapteen. Om besmetting met een bepaald pathogeen vast te kunnen stellen, is gebruik van het pathogeen zelf in de stockoplossing of gebruik van ten minste een voor infectie met het pathogeen kenmerkend antigeen in de stockoplossing nodig. Indien men op besmetting met een aantal verschillende pathogenen wil screenen, dient de stockoplossing de dienovereenkomstige pathogenen of antigenen daarvan te omvatten, welke antigenen leiden tot een voor infectie kenmerkende immuunreactie.

Indien men enkel voor besmetting screent en niet op immuunreactie, is het mogelijk een specifiek antilichaam voor het te detecteren pathogeen toe te passen in de stockoplossing en vervolgens te volgen of com-plexvorming in het incubatiemengsel heeft plaatsgevonden volgens de onderhavige elektroforetische profileringstechniek. Dergelijke complex-vorming kan alleen plaatsvinden als het te detecteren antigeen zich in het monster bevindt.

Toepassing van de elektroforetische profileringstechniek volgens de uitvinding voor het screenen op allergie tegen ten minste een hapteen of antigeen, waarbij detectie van een verschuiving van ten minste een band van het bandenpatroon van het incubatiemengsel in vergelijking met die van de referentie na elektroforese, allergie tegen het toegepaste hapteen of allergeen aangeeft, behoort ook tot de uitvinding.

Een andere toepassing van de onderhavige elektroforetische profileringstechniek die ook interessant is, is de toepassing voor het onderscheiden tussen besmetting met wild-type pathogeen en immunisatie met een gemodificeerd vaccin, waarbij verschuiving en/of verdwijning van alle voor infectie kenmerkende banden van het bandenpatroon van het incubatiemengsel ten opzichte van het bandenpatroon van de referentie aangeeft dat infectie met wild-type-pathogeen heeft plaatsgevonden en waarbij gelijk-blijven van ten minste een voor infectie kenmerkende band aangeeft dat tegen ten minste één voor immuunreactie bepalend antigeen van het pathogeen geen antistoffen zijn gemaakt, hetgeen aangeeft dat bij het proefobject niet tegen het wild-type pathogeen, maar tegen het gemodificeerd vaccin een immuunreactie is opgewekt. In het onderhavige geval wordt met een gemodificeerd vaccin een vaccin bedoeld dat, hetzij ten minste een eiwit mist dat bij besmetting met het wild-type pathogeen een kenmerkende immuunreactie opwekt, hetzij ten minste een zodanig gemuteerd eiwit omvat, dat geen binding meer optreedt met het antilichaam dat tegen het overeenkomstige wild-type eiwit bij infectie wordt opgewekt.

Met de elektroforetische profileringstechniek volgens de uitvinding is het mogelijk - zowel de aan- als afwezigheid van pathogenen vast te stellen, - de reactie van het lichaam van een proefobject op pathogenen, delen van pathogenen, antigenen of haptenen naar keuze vast te stellen en - de gezondheidsstatus van het proefobject ten opzichte van de gekozen pathogenen, delen van pathogenen, eiwitten, haptenen of antigenen vast te stellen.

De techniek is algemeen toepasbaar bij de diagnosestelling van mens en dier waar het eiwitten betreft die in lichaamsvloeistoffen aanwezig zijn. Dergelijke lichaamsvloeistoffen kunnen serum, bloed, bloedcellen, urine, moedermelk en speeksel zijn.

De werkwijze volgens de uitvinding is meer specifiek toepasbaar bij - eradicatieprogramma's; - het aantonen van verschillen tussen natuurlijke immuniteit en immuniteit ten gevolge van gemodificeerde vaccins; - het preventief screenen van populaties met inbegrip van bedrijfspopulaties op het voorkomen van pathogenen of het voorkomen van immuunreacties tegen pathogenen.

Claims (8)

1. Werkwijze voor het bij een proefobject detecteren van de eventuele aanwezigheid van ten minste een hapteen, een macromolecuul, een pathogeen of een immuunreactie opwekkend deel daarvan, voor het detecteren van een immuunreactie op ten minste een hapteen, een macromolecuul, een pathogeen of een immuunreactie opwekkend deel daarvan, waarbij men a) een vloeistofmonster van het te onderzoeken proefobject neemt of bereidt, b) het monster incubeert met een stockoplossing, welke stockoplossing ten minste een kenmerkend antigeen van het te onderzoeken pathogeen, van een deel van het te onderzoeken pathogeen, van het te onderzoeken eiwit of van het te onderzoeken hapteen omvat of welke stockoplossing ten minste een antistof omvat, welke antistof specifiek is voor het te onderzoeken pathogeen, voor een deel van het te onderzoeken pathogeen, voor het te onderzoeken macromolecuul of voor het te onderzoeken hapteen, c) het geïncubeerde mengsel na incubatie aanbrengt op een voor niet-denaturerende elektroforese geschikte drager, d) op dezelfde drager dezelfde stockoplossing die men in stap b) toepast als referentie aanbrengt, e) het mengsel van stap c) en de stockoplossing van stap d) onderwerpt aan elektroforese, waarbij scheiding van de componenten van incuba-tiemengsel en stockoplossing optreedt, f) bij één van de bovengenoemde stappen de componenten van incubatie-mengsel en stockoplossing detecteerbaar maakt en g) de na elektroforese resulterende bandenpatronen van incubatiemeng-sel en stockoplossing vergelijkt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarbij elk kenmerkend antigeen of specifieke antistof van de stockoplossing van b) is voorzien van een merkmiddel.

3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij men natieve PAGE uitvoert in stap e).

4. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, waarbij men IEF uitvoert ia stap e).

5· Werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies, waarbij de stockoplossing ten minste het pathogeen zelf omvat.

6. Toepassing van een werkwijze volgens een van de voorgaande conclusies voor het screenen op aanwezigheid van of besmetting en eventueel ook infectie met ten minste een pathogeen, waarbij detectie van een verschuiving en/of verdwijning van ten minste een band van het bandenpatroon van het incubatiemengsel in vergelijking met die van de referentie na elek-troforese besmetting met het toegepaste pathogeen aangeeft.

7· Toepassing van een werkwijze volgens een van de conclusies 1-4 voor het screenen op allergie tegen ten minste een hapteen of antigeen, waarbij detectie van een verschuiving van ten minste een band van het bandenpatroon van het incubatiemengsel in vergelijking met die van de referentie na elektroforese allergie tegen het toegepaste hapteen of allergeen aangeeft.

8. Toepassing van een werkwijze volgens een of meer van conclusies 1-5 voor het onderscheiden tussen infectie met wild-type pathogeen en immuni-satie met een gemodificeerd vaccin, waarbij verschuiving en/of verdwijning van alle voor infectie met wild-type pathogeen kenmerkende banden van het bandenpatroon van het incubatiemengsel ten opzichte van het bandenpatroon van de referentie aangeeft dat infectie met wild-type-patho-geen heeft plaatsgevonden en waarbij gelijkblijven van ten minste een voor infectie kenmerkende band aangeeft dat tegen ten minste een voor immuunreactie bepalend antigeen van het pathogeen geen antistoffen zijn gemaakt, hetgeen aangeeft dat het proefobject niet met wild-type geïnfecteerd is, maar een immuunreactie heeft gehad naar aanleiding van contact met gemodificeerd vaccin.