CN105085628B - 人ad7c-ntp抗原表位多肽、抗体及其体外诊断试剂盒 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种人AD7C‑NTP抗原表位多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所述；还涉及一种能与上述人AD7C‑NTP抗原表位多肽特异性结合的人AD7C‑NTP抗体，以及应用有上述人AD7C‑NTP抗体的人AD7C‑NTP体外诊断试剂盒。本发明制备的人AD7C‑NTP抗原表位多肽具有良好的抗原性，用其制备的抗原免疫动物生产的抗体能高度特异性的与尿液样本中的AD7C‑NTP结合，本发明中制备的人AD7C‑NTP体外诊断试剂盒能有效检测尿液中的AD7C‑NTP水平，对阿尔茨海默病患者的早期诊断和临床治疗具有重要意义。

Description

人AD7C-NTP抗原表位多肽、抗体及其体外诊断试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及人AD7C-NTP抗原表位多肽、抗体及其体外诊断试剂盒。

背景技术

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)又称老年痴呆症，是一种原发性中枢神经系统慢性退行性疾病，以神经元细胞缺失、弥散性大脑皮质萎缩、神经元外老年斑，沉积、神经元内神经原纤维缠结脚，形成、突触变性为特征，是老年人的一种常见病。AD的临床综合征是其漫长病程的后期阶段，各种致病因子和保护因子在不同时期起着各自的作用，最终导致的神经病理改变和相应的临床表现，如记忆障碍、失语、失用、失认、视空间技能损害、执行功能障碍以及人格和行为改变等。由上可见，阿尔茨海默病确诊时己存在明显的神经元损害，因此预防性治疗应在临床前期尽早实施，如能早期诊断，采取一定的防治措施，可改善其预后。然而，迄今为止，AD的早期诊断十分困难，原因如下：(1)需做脑脊液检查，取材不便；(2)虽然脑脊液中磷酸化的Tau蛋白和其它骨架蛋白增加，但并无特异性，在其它神经系统疾病中也有变化；而Aβ42在AD早期无变化，随病情加重而减少，不便于测定；(3)其它各种蛋白质包括酶的测定对诊断无指导意义。

AD7c-NTP是神经丝蛋白(Alzheimer-associated neuronalthread protein,AD7c-NTP)家族的一个成员。1997年，Delamonte等首次从AD患者的脑组织中分离出AD7C-NTP(AD 7th clone neuronal thread protein)的cDNA，其编码产物由375个氨基酸构成，分子质量约为41kD，等电点为9.89(Monet SM,et al.1997)，AD7c-NTP蛋白富含丝氨酸(11.7％)和脯氨酸(8.8％)，有4个跨膜区和4个长度在9～23个氨基酸且序列一致性在83-91％的重复抗原区，有两个丝氨酸苏氨酸蛋白激酶区(6～48位和272～294位氨基酸残基)，生物信息学预测认为AD7c-NTP蛋白可能存在个跨膜区，其N端朝向胞质，属II型跨膜蛋白。

大量研究表明，阿尔茨海默病相关神经丝蛋白(AD7c-NTP)在AD患者的神经元纤维缠结(NFT)中大量存在，并在患者脑中呈分泌性上调表达，因此，推测它可能与AD的病理过程有关(Munzar M,et al.2002；Levy S,et al.2007；Dela Monte SM,et al.2001)。增高的AD7c-NTP可从早期或相对严重的AD患者脑脊液及尿样本中检测到，而且脑脊液及尿液中AD7c-NTP水平与痴呆的严重程度相关(Munzar M,et al.2001，2002；Kahle PJ,etal.2000)。AD7c-NTP在阿尔茨海默病人的脑脊液及尿液中选择性地提高，且与AD病理进程密切相关，表明AD7c-NTP可能在AD的早期诊断中有重要的应用价值(Monet SM,etal.2001；Ghanbari H,et al.1998)，AD患者尿样中AD7c-NTP的检测能达到与脑脊液检测同样的效果，尿样中AD7c-NTP检测作为一种无创性的检查更易被患者接受,也易于在临床上推广。

AD7c-NTP在正常成人颞叶和额叶皮质的神经元中，用AD7c-NTP的探针可检测到的表达，脑皮质和白质的胶质细胞中也可检测到低水平的AD7c-NTP转录产物，但是肺、胰腺、肾脏、脾脏、胃肠道、肝脏、输卵管、子宫、卵巢、骨胳肌、甲状腺、睾丸和胸腺没有表达。AD7c-NTP在神经元中表达,定位于神经细胞发生的轴突(Monet SM,et al.1997)。体外实验表明，AD7c-NTP基因在转染的神经细胞的过度表达导致神经炎的发生和细胞的死亡。人类组织学研究也揭示，AD7c-NTP在脑颞叶和额叶的表达水平比对照组高,并且通过原位杂交和免疫组化染色发现,在组织学尚完整的变性神经元中出现AD7c-NTP表达的增加。从而证明,在神经变性的早期即出现AD7c-NTP的异常表达,而且脑脊液中AD7c-NTP的表达水平与痴呆的严重程度呈显著的相关性(Monet SM,et al.1997)。在早期或中度AD患者的皮层神经元,脑组织抽提物,脑脊液中都有升高,并且其含量与痴呆的严重程度成正比。

1998年Ghanbari等首次用ELISA法测定尿样本中AD7c-NTP含量，66例AD和134例非AD患者尿样中AD7c-NTP含量的检测结果表明，二者平均浓度分别为2.5ng/ml和0.8ng/ml岁，如果以1.5ng/ml为标准，对诊断的特异性是91％，灵敏度是80-85％(Ghanbari H,etal.1998)。2000年Fitzpatrich等通过对58例AD及30例正常对照组研究表明，AD组的平均浓度是正常对照组的3倍，对诊断特异性为96.8％，灵敏度为91％。通过对患者脑脊液和尿液中AD7c-NTP含量的检测，对AD诊断有较高的特异性和灵敏度，AD7c-NTP作为一种生物标记对的早期诊断很有价值(Fitzpatrich J,et al.2000)。因此，有人称AD7c-NTP实验为“7CGold”，可见AD7c-NTP对于诊断AD是一项精确的生物标记，而且对老年人进行风险的常规临床评价同样有帮助。

因此，研究并确定AD7c-NTP蛋白的抗原表位，获得其单克隆抗体，并以此为基础基于该抗原表位的AD7c-NTP蛋白ELISA诊断方法及其诊断试剂，通过检测脑脊液和尿液、血清中AD7C-NTP水平可作为早期AD的初筛试验，以达到AD患者的早期诊断，具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对现有技术而提供一种抗原性强的人AD7C-NTP抗原表位多肽。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对现有技术而提供一种特异性强的人AD7C-NTP抗体。

本发明所要解决的第三个技术问题是针对现有技术而提供一种应用上述人AD7C-NTP抗体的用于阿尔茨海默病诊断的人AD7C-NTP体外试剂盒。

本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种人AD7C-NTP抗原表位多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所述。

本发明利用计算机软件从Genebank(AAC08737.1)中获得的人AD7c-NTP蛋白序列(如SEQ ID NO:3所述)中筛选识别表位。表位识别的主要依据是蛋白质或多肽氨基酸序列的亲水性、表面度、柔韧度、Chou-Fasman的螺旋、片状和转角、Robson-Garnier的二级结构及C-和N-末端来预测抗原综合数据(Antigenic Index，AI)。根据人AD7c-NTP蛋白序列，利用网络资源(如：http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)及生物学软件，如DNAStar(Madison，Wisconsin，USA)，预测它的抗原区(AI)。

通过化学合成法制备上述抗原表位：采用Fmoc方法，通过固相合成技术合成制备，固相肽合成的主要思想是：先将所要合成肽链的羧基末端氨基酸的羧基以共价键形式同一个不溶性的高分子化合物(树脂)相连接，然后以此结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组份，经过脱去氨基保护基并同过量的活化羧基组份反应，接长肽链，上述步骤可以反复地多次进行，最后达到所需要合成的肽链的长度(该方法的具体步骤参见Eur.J.Immunol.1994,24,3188-3193；J.Org.Chem.1972,37，3404-3409；《多肽合成》,黄惟德,陈常庆,北京:科学出版社,1985)。

上述抗原表位还可以通过与其它多肽或蛋白形成融合蛋白抗原，融合蛋白抗原可以通过基因工程方式制得，即通过目标融合蛋白的DNA转导/转化至基因工程菌株，如：大肠杆菌(E.coli)、酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)中表达并纯化，或在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、COS细胞、小仓鼠肾(BHK)细胞、小鼠骨髓瘤SP2/O细胞、小鼠NSO胸腺瘤细胞等哺乳动物细胞中表达并纯化后，得到将其中一种抗原C末端，经由酰胺键(amide bond)和另一种抗原N末端首尾相连的融合蛋白产物(Protein Expr.Purif.，2008，59，189-196)。基因工程方法制备蛋白质抗原的克隆、表达以及纯化可通过多种方法进行，具体方法参见《分子克隆实验指南》(第三版)，科学出版社，2002，第1217-1270页，适宜的原核表达载体如pEGX系列原核表达载体(Amersham Pharmacia)、pET系列原核表达载体(Novagen)等。

本发明解决第二个技术问题所采用的技术方案为：一种人AD7C-NTP抗体，其能特异性地结合上述的抗原表位。该抗体为单克隆抗体。

上述人AD7C-NTP抗体的制备过程如下：

(1)将上述的AD7c-NTP蛋白抗原表位多肽与载体蛋白结合制备抗原来免疫动物；

(2)取经免疫的动物脾细胞与瘤细胞融合，得到可稳定分泌抗AD7c-NTP蛋白的杂交瘤细胞；

(3)收集、纯化杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体，即为抗AD7c-NTP蛋白的单克隆抗体。

本发明解决第三个技术问题所采用的技术方案为：一种应用上述的人AD7C-NTP抗体的体外诊断试剂盒，该试剂盒可以基于免疫方法对人体组织、细胞或体液中的AD7C-NTP进行检测，优选对尿液标本中的AD7C-NTP进行检测。

与现有技术相比，本发明的优点在于：

(1)本发明中的人AD7C-NTP抗原表位多肽制备的抗原能有效激活分别INF-γ的T细胞，预测该抗原表位多肽为人AD7C-NTP蛋白T淋巴细胞和B淋巴细胞重叠表面。

(2)本发明中的人AD7C-NTP抗原表位多肽(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)具有良好的抗原性，用其制备的抗原免疫动物能够产生高度特异性的单克隆抗体。

(3)本发明中制备的各种人AD7C-NTP抗体能高度特异性的与尿液样本中的AD7C-NTP结合。

(4)本发明中的人AD7C-NTP体外诊断试剂盒能有效检测尿液中的AD7C-NTP水平，对阿尔茨海默病患者的早期诊断和临床治疗具有重要意义。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：人AD7C-NTP蛋白中抗原表位的筛选与合成

(1)多肽序列的选定：利用计算机软件从Genebank(AAC08737.1)中获得的人AD7c-NTP蛋白序列(如SEQ ID NO:3所述)中筛选识别表位。表位识别的主要依据为：蛋白质或多肽氨基酸序列的亲水性、表面度、柔韧度、Chou-Fasman的螺旋、片状和转角、Robson-Garnier的二级结构及C-和N-末端来预测抗原综合数据(Antigenic Index，AI)。根据人AD7c-NTP蛋白序列，利用网络资源(如：http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/)及生物学软件，如DNAStar(Madison，Wisconsin，USA)，预测它的抗原区(AI)。

进过分析，选定如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所述的氨基酸序列作为人AD7C-NTP抗原表位。

上述选定的氨基酸序列通过化学合成法制备：利用多肽合成仪合成后，再经HPLC纯化得到纯度大于95％的多肽。

实施例2：人AD7C-NTP单克隆抗体制备

将上述制备的任意一种人AD7C-NTP抗原表位多肽通过BDB(双偶氮联苯胺二氯化物Bis-diazotizedbenzidine dichloride)交联到血兰蛋白(KLH)上作为抗原来制备抗体，具体过程如下：

(1)腹腔注射免疫小鼠

选取6～8周龄BALB/c雌性小鼠，计划共注射六只小鼠。首次腹腔注射将AD7c-NTP抗原多肽和福氏完全佐剂(CFA)按照体积比1:1混匀，注射剂量为100ug/只。14天后进行第二次免疫，将AD7c-NTP抗原和福氏不完全佐剂(IFA)按照体积比1:1混匀，注射剂量为100ug/只。二次免疫14d后进行第三次免疫，将AD7c-NTP抗原和福氏不完全佐剂(IFA)按照体积比1:1混匀，注射剂量为100ug/只。第三次免疫九天后断尾采血，分离血清进行抗体效价分析。分离脾脏4～6天前加强免疫一次，将AD7c-NTP抗原和福氏不完全佐剂(IFA)按照体积比1:1混匀，注射剂量为100ug/只。

(2)免疫血清抗体效价分析

购买市场上AD7C-NTP检测试剂盒分析血清抗体效价：免疫小鼠血清经序列稀释(1:200，1:400，1:800，1:1600，1:3200，1:6400，1:12800)做为检测抗体或捕获抗体，ELISA检测AD7c-NTP抗原分析免疫血清抗体效价，根据ELISA结果，挑选产生抗体效价最高且健康的小鼠用于细胞融合。

(3)建立单克隆抗体细胞株

准备骨髓瘤细胞和饲养层细胞：细胞融合前3～5天，复苏骨髓瘤SP2/0细胞，确保融合时骨髓瘤细胞健康。细胞融合当天收集非免疫BALB/c雌性小鼠腹腔细胞作为饲养层细胞。

免疫脾细胞制备：选取免疫后抗体效价最高的BALB/c小鼠，通过眼球取血，收集血清备用为阳性对照。然后取出小鼠脾脏，剥离结缔、脂肪组织后放入含1640培养基的组织匀浆器内，反复研磨。用200目滤网过滤除去未分散的组织或细胞团，离心后弃上清，用1640培养基重悬细胞沉淀后计数，备用。

细胞融合：①将制备好的骨髓瘤细胞、脾细胞按1:4比例，在离心管中混匀，离心后弃上清，手指轻弹管底，使细胞沉淀松动分散。②向离心管中缓慢加入1ml 37℃预热的50％PEG1000或PEG4000，注意边加边缓慢转动离心管，使细胞与PEG混匀。37℃水浴中孵育2分钟。③6分钟内，逐滴加入30ml 37℃预热的1640培养基，终止PEG作用。④离心后弃上清，用HAT培养基重悬细胞沉淀，如初始加入1×10⁸个脾细胞，用80ml HAT培养基重悬细胞沉淀

筛选阳性杂交瘤细胞：①将HAT培养基重悬后的融合细胞加到已铺有饲养层细胞的96孔板中，每孔100ul，移置37℃、5％CO2培养箱中培养，培养期间根据细胞生长状况换液。②饲养层细胞：用HAT重悬细胞并调整细胞浓度为1×10⁵～2×10⁵cell/ml，加入96孔板中100ul/孔，总96孔板数控制在8～10内。③待融合细胞生长至孔底1/2时，用ELISA检测细胞培养上清抗体效价，筛选阳性杂交瘤细胞，并在两天后复检，对抗体效价稳定的阳性杂交瘤细胞计数后，采用有限稀释法以1个/孔接种到铺有饲养层细胞的96孔板中。注意检测细胞培养上清抗体效价，筛选出分泌抗体的单克隆杂交瘤细胞株备用。④杂交瘤细胞株扩大培养及冻存：将筛选的阳性杂交瘤细胞株扩大培养，在细胞处于对数生长期时，收集冻存，注意保留杂交瘤细胞株培养上清。

实施例3：人AD7C-NTP体外诊断试剂盒

(1)抗体对筛选

筛选抗体对：任选一株细胞、生物素或者HRP标记该细胞株分泌的抗体作为检测抗体，通过ELISA检测人AD7c-NTP抗原，分析其他细胞株分泌的抗体是否可作为捕获抗体。如果结果不理想，生物素或者HRP标记第二个抗体进行下一轮筛选，直至筛选出理想的抗体对。

抗体的类别和亚类鉴定：通过ELISA鉴定单抗免疫球蛋白重链和轻链类型，并分析单抗的理化特性即单抗对温度和PH变化的敏感性以及单抗的亲合力

单克隆抗体制备及纯化：筛选出理想的抗体对后，采用小鼠腹腔注射杂交瘤细胞法生产抗体，具体过程如下：①选取6～8周龄SPF级BALB/c，先腹腔接种降植烷或液体石蜡油，每只小鼠0.3-0.5ml。②7-10天后腹腔接种用PBS或无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠5×10⁵/0.2ml。

(2)试剂盒组装

试剂盒包括:人AD7C-NTP标准品，人AD7C-NTP阳性对照样品、人AD7c-NTP单抗、生物样品稀释液、洗涤液、酶标二抗(HRP标记的羊抗兔多抗)、底物显色液、终止液、酶标板。

具体说明如下:

①人AD7C-NTP标准品

全长人AD7C-NTP蛋白(如SEQ ID NO:3所述)的0.0lmol/L PBS溶液，pH为7.4，含55％甘油、0.1％BHA和0.0l％硫柳汞，人AD7C-NTP终浓度为240ug/mL，使用时用生物样品稀释液稀释至2400pg/mL、1200pg/mL、600pg/mL、300pg/mL、150pg/mL、75pg/mL六个梯度。

②人AD7C-NTP阳性对照样品

全长的人AD7C-NTP蛋白的0.0lmol/L，pH7.4的PBS溶液，含50％甘油、10％人血清、0.5％BSA，0.1％BHA和0.0l％硫柳汞，人AD7C-NTP的终浓度为5ug/mL，使用时用生物样品稀释液作1:10000稀释。

③人AD7C-NTP单抗

为人AD7C-NTP单抗的PBS溶液，含55％甘油、0.l％BHA和0.O1％硫柳汞，pH7.4，单抗的终浓度为lmg/mL，使用时用标本稀释液作1:5000稀释。

④生物样品稀释液

为含8％小牛血清、1％Triton X-100，0.0l％硫柳汞和1％人IgG的pH7.4的0.0lmol/L PBS。

⑤其他试剂：

洗涤液(pH7.4、8.0g的浓度0.0lmol/L的PBST:NaCl)：取0.3g NaH₂P0₄.2H₂0,2.9gNa₂HP0₄.12H₂O,5g Tween 200，0.1g硫柳汞，混合加双蒸水溶解并定容至1000mL，调pH至7.4。

酶标二抗：为HRP标记的羊抗兔多抗(美国R&D systems)，使用时用生物样品稀释液作1:10000稀释。

底物显色液：为TMB系统(美国SIGMA)。

终止液：为2mol/L H₂S04溶液。

⑥酶标板

为预先抗体包埋和血清封闭好的酶标板，在超净工作台上风干后真空密封包装，使用时从密封袋内取出，剩余的酶标条放回密封袋内于4℃保存。

实施例4：人AD7C-NTP诊断试剂盒应用

取阿尔茨海默病患者尿样(以门诊健康者尿样为对照)，应用实施例3中制备的人AD7C-NTP体外诊断试剂盒进行尿样中AD7C-NTP检测。

在预包被板的各孔中加入按待检的尿液标本以及标准品100μl/孔，均为双孔，同时设空白孔，37℃孵育60分钟，洗涤5次，拍干。在各孔内加入结合抗体(即上述制备的人AD7C-NTP单抗)100μl/孔，37℃孵育30分钟，洗涤5次，拍干。再在各孔内加入标记有辣根过氧化酶的抗人IgG抗体100μl/孔，37℃孵育30分钟，洗涤5次，拍干。加入显色剂A、B液每孔各50μl，混匀，37℃孵育15分钟。加终止液50μl/孔终止反应，颜色的深浅和样品中AD7C-NTP的含量呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，制作以标准品浓度的对数为X轴、吸光值为Y轴的标准曲线。计算样品中AD7C-NTP浓度:如果阳性对照样品的测定值和标示值(5ug/mL)相比较，其变异系数小于5％，说明测定过程可靠，可依据上一步骤所得的标准曲线计算所测样品中AD7C-NTP浓度。

OD比值计算：待测标本孔的OD值-空白孔的OD值，通过标准曲线计算结果。

结果判定标准：尿中AD7C-NTP的浓度≤1.5ng/ml，为阴性，尿中AD7C-NTP的浓度＞1.5ng/ml，为阳性。

从医院采集120个临床诊断样本，其中确诊AD病人60例，非AD病人60例。利用上述诊断试剂盒检测，结果表明56例尿AD7C-NTP超过2.5ng/ml，而非AD对照平均值为0.75ng/ml，二者比较p＜0.001。以1.5ng/ml为划定标准，尿AD7C-NTP诊断早期AD的特异性为93％，灵敏度为83％～87％。

Claims (1)

1.一种人AD7C-NTP抗原表位多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2所述。