CN116284440A - Ccp肽段及其应用以及ccp抗原和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本申请涉及免疫检测领域，公开了一种CCP肽段及其应用以及CCP抗原和试剂盒。本申请所述CCP肽段具有NH2‑S1‑M‑S2‑COOH所示结构；其瓜氨酸抗原表位区M包含天然的β‑turn或random‑turn结构，保证CCP构象的稳定性，同时肽段特异位置氨基酸突变成瓜氨酸，提高瓜氨酸抗原表位区特异性识别抗体活性。肽段序列中除瓜氨酸抗原表位区外，其两侧侧翼环化接头氨基酸残基区S1和S2包含带电氨基酸，降低瓜氨酸抗原表位区外其他氨基酸序列的抗原性，减少其他无关抗体识别概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在类风湿关节炎疾病临床免疫诊断中的灵敏性与特异性。
Description
技术领域
本申请涉及免疫检测领域，尤其涉及一种CCP肽段及其应用以及CCP抗原和试剂盒。
背景技术
类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因不明的，以炎性滑膜炎为主的慢性、系统性自身免疫疾病。该疾病可造成关节软骨、关节囊等关节结构破坏，导致关节畸形、功能丧失等一系列疾病，严重影响患者生活质量，是造成劳动力人口丧失和致残的主要原因。类风湿性关节炎全球发病率约为0.5％～1％，其中75％约为女性，早诊断、早干预、早治疗是降低疾病进程的关键。
对于类风湿关节炎的诊断有多种方法，其中血清学检测是主要的检测方法。在血清学检测中，较早且常用的是类风湿因子(rheumatoid factor,RF)检测，但此检测方法特异性不高。近年来，随着对RA的不断深入研究，逐步发现抗环瓜氨酸肽(cycliccitrullinated peptide,CCP)抗体检测的特异性与敏感性远高于RF，特别适合用于RA的早期检测。
最初使用的环瓜氨酸肽(CCP)抗原是来源于丝聚蛋白的含19个氨基酸的直链线性瓜氨酸肽段(SHQESTCitGRSRGRSGRSGS)，由于此肽段不能吸附于聚苯乙烯板孔上，因此不能用来作为ELISA检测方法的包被抗原。为了提高瓜氨酸肽链抗原活性，Schellekens GA将上述19个氨基酸残基组成的瓜氨酸直链肽段中的两个丝氨酸突变成半胱氨酸，并使半胱氨酸形成二硫键，将瓜氨酸直链肽段环化成类似β-turn结构，形成环瓜氨酸肽(cycliccitrullinated peptide,CCP),即为第一代CCP抗原。此CCP抗原具有较高的诊断特异性，但敏感性仅为约40％。究其原因为，包被于聚苯乙烯板孔中的环瓜氨酸肽抗原表位有限，存在漏检情况。瓜氨酸抗原表位区中瓜氨酸所处位置、数量、周围氨基酸序列和结构也影响其与抗体的结合活性。
为了提高血清检测的敏感性，研究者构建大量含有瓜氨酸的多肽文库，并在瓜氨酸肽文库中挑选出模拟真正构象表位的环状表位合成新的CCP，此CCP即为第二代CCP抗原。第二代CCP抗原包含多条CCP肽段，临床检测敏感性有较大程度提高，敏感性达到70％以上，但仍为80％以下。同时由于引入多条CCP肽段，引入更多非必须抗原表位，特异性较第一代CCP抗原更差。通过大量临床研究发现，抗环瓜氨酸肽抗体在多种非RA疾病中出现，且具有一定的阳性检出率，因此也会降低特异性。
针对上述技术问题，现有专利CN109929009A公开了一种CCP肽段NH2-S3-S1-X-S2-S4-COOH。其中，X为含瓜氨酸的抗原表位区，S1和S2为含瓜氨酸的抗原表位区的侧翼区，S1和S2中至多一个为带电氨基酸残基，S3和S4为用于连接成环从而形成CCP肽段的氨基酸残基区域，并具体公开了17个CCP肽段，用于免疫检测时相对于第二代CCP抗原明显提高特异性，同时具有一定的敏感性，但仍未超过66％，为此该专利技术联合使用多条肽段将其敏感性提高至70％以上，但这样无形中提高了试剂盒的制作成本。
因此，仍有必要对现有CCP抗原进行改进，同时提高环瓜氨酸肽的敏感性和特异性，进一步提高抗CCP抗体检测的应用价值。
发明内容
有鉴于此，本申请的目的在于提供一种CCP肽段，使得所述CCP肽段能够同时保证较高的环瓜氨酸肽的敏感性和特异性，并且无需多个CCP抗原性位点或CCP肽段联合使用；
本申请的另外一个目的在于提供基于上述CCP肽段的CCP抗原、试剂盒以及其在免疫检测领域中的应用。
为了解决上述技术问题/达到上述目的或者至少部分地解决上述技术问题/达到上述目的，作为本申请的第一个方面，提供了一种CCP肽段，具有NH2-S1-M-S2-COOH所示结构；其中，S1和S2均为包含半胱氨酸和带电氨基酸的环化接头氨基酸残基区，S1和S2通过半胱氨酸形成二硫键连接；M为瓜氨酸抗原表位区，其由具有天然的β-turn或random-turn结构的肽段经突变部分氨基酸为瓜氨酸形成。
可选地，所述S1和S2的氨基酸残基个数分别为4-6个。
可选地，所述S1和S2的氨基酸序列分别独立选自SEQ ID No.1-2所示氨基酸序列。
可选地，所述M的氨基酸残基个数为12个，含有1-2个瓜氨酸，位于第6-8位；进一步可选地，所述M具有SEQ ID No.3-8任意一项所示的氨基酸序列。
作为本申请的第二个方面，基于本申请所述CCP肽段的同时保证较高的敏感性和特异性，提供所述的CCP肽段在制备CCP抗原或诊断类风湿性关节炎的免疫诊断产品中的应用。
可选地，所述免疫诊断产品包括化学发光免疫检测试剂盒。
作为本申请的第三个方面，提供了一种CCP抗原，在本申请所述的CCP肽段上偶联载体蛋白、生物素、异硫氰荧光素中的一种或两种以上的偶联物。
作为本申请的第四个方面，提供了一种化学发光免疫检测试剂盒，包括偶联本申请所述的CCP抗原、固相载体、发光标记物标记的二抗和发光激发液。
可选地，所述固相载体为磁微粒。
与目前现有的CCP肽段形成的抗原相比，本申请的CCP肽段瓜氨酸抗原表位区包含天然的β-turn或random-turn结构，保证CCP构象的稳定性，同时肽段特异位置氨基酸突变成瓜氨酸，提高瓜氨酸抗原表位区特异性识别抗体活性。肽段序列中除瓜氨酸抗原表位区外，其两侧侧翼环化接头氨基酸残基区包含带电氨基酸，降低瓜氨酸抗原表位区外其他氨基酸序列的抗原性，减少其他无关抗体识别概率，提高抗环瓜氨酸肽抗体在类风湿关节炎疾病临床免疫诊断中的灵敏性与特异性。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定；
图1所示为本申请CCP肽段的结构示意图；
图2所示为临床样本检测的结果。
具体实施方式
本申请公开了一种CCP肽段及其应用以及CCP抗原和试剂盒，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本申请。本申请所述方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本申请内容、精神和范围内对本文所述方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本申请技术。显然，所描述的实施例是本申请的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
需要说明的是，在本文中，如若出现诸如“第一”和“第二”、“步骤1”和“步骤2”以及“(1)”和“(2)”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。同时，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
现有技术中用于检测抗环瓜氨酸肽抗体的CCP抗原，该抗原包含单一肽段或多种混合肽段，在临床检测中存在假阳性问题，导致检测存在特异性问题，同时该抗原检测敏感性虽有提高，但仍在80％以下。为了改善抗原敏感性和特异性问题，在本申请第一个方面中，提供了一种CCP肽段，具有NH2-S1-M-S2-COOH所示结构；其中，S1和S2均为包含半胱氨酸和带电氨基酸的环化接头氨基酸残基区，S1和S2通过半胱氨酸形成二硫键连接；M为瓜氨酸抗原表位区，其由具有天然的β-turn或random-turn结构的肽段经突变部分氨基酸为瓜氨酸形成。
在现有的CCP肽段中，往往只通过瓜氨酸抗原表位区两侧的半胱氨酸形成二硫键成环。形成发卡结构与抗体表面的凹槽结合，从而进行抗原抗体反应，但这种结构容易发生断裂，恢复成线性结构，抗原性丢失；据此，本申请从蛋白结构数据库中选择具有天然β-turn或random-turn结构的肽段，呈发卡结构，并将其中的1-2个氨基酸突变为瓜氨酸形成抗原表位区，同时两侧的S1和S2依然保持形成二硫键成环，双重发卡结构保证了即使二硫键发生断裂也可保证CCP肽段的抗原性，参见示意图1。
在本申请某些实施方式中，所述环化接头氨基酸残基区S1和S2的氨基酸残基个数分别为4-6个，例如4个、5个或6个；在本申请另外一些实施方式中，所述S1的氨基酸残基个数为4个，S2的氨基酸残基个数为6个。在本申请某些实施方式中，所述环化接头氨基酸残基区S1和S2各自含有1个半胱氨酸。
在本申请某些实施方式中，所述环化接头氨基酸残基区S1和S2的氨基酸序列分别独立选自HQEC和CGRSGS，序列如SEQ ID No.1-2所示。
在本申请某些实施方式中，所述瓜氨酸抗原表位区M的氨基酸残基个数为12个，含有1-2个瓜氨酸，位于第6-8位；在本申请另外一些实施方式中，当瓜氨酸为1个时，其位于瓜氨酸抗原表位区M中的第6位、第7位或第8位氨基酸残基处；当瓜氨酸为2个时，其位于瓜氨酸抗原表位区M中的第6位和第8位，或者第6位和第8位氨基酸残基处。
在本申请某些实施方式中，所述瓜氨酸抗原表位区M具有所述M具有SEQ ID No.3-8任意一项所示的氨基酸序列：
(1)SEQ ID No.3，YTAKYXGRTFRN，β-turn结构；
(2)SEQ ID No.4，YTAKYKGXTFRN，β-turn结构；
(3)SEQ ID No.5，YTAKYXGXTFRN，β-turn结构；
(4)SEQ ID No.6，RRPSSXRQEKIT，random-turn结构；
(5)SEQ ID No.7，RRPSSWXQEKIT，random-turn结构；
(6)SEQ ID No.8，RRPSSXXQEKIT，random-turn结构；
其中，X表示瓜氨酸(Cit)。
在本申请某些实施方式中，所述CCP肽段具有SEQ ID No.9-14任意一项所示的氨基酸序列：
(1)SEQ ID No.9，HQECYTAKYXGRTFRNCGRSGS；
(2)SEQ ID No.10，HQECYTAKYKGXTFRNCGRSGS；
(3)SEQ ID No.11，HQECYTAKYXGXTFRNCGRSGS；
(4)SEQ ID No.12，HQECRRPSSXRQEKITCGRSGS；
(5)SEQ ID No.13，HQECRRPSSWXQEKITCGRSGS；
(6)SEQ ID No.14，HQECRRPSSXXQEKITCGRSGS；
其中，下划线部分即为瓜氨酸抗原表位区M，具有天然β-turn或random-turn结构，X表示瓜氨酸(Cit)；左侧为环化接头氨基酸残基区S1，右侧为环化接头氨基酸残基区S2，两个区域通过各自的半胱氨酸形成二硫键连接。
在本申请的第二个方面中，利用化学发光免疫检测方法对392份已知临床血清样本分别进行检测(已知RA患者血清样本152份，健康体检者血清样本120份，非RA患者血清样本120份)，结果显示，本申请CCP肽段的敏感性在67％以上，最高可至80％左右，特异性在91％以上，最高可至94％左右，能够在单个瓜氨酸抗原表位前提下同时保证较高的敏感性和特异性。基于本申请所述CCP肽段的优异性能，提供所述的CCP肽段在制备CCP抗原或诊断类风湿性关节炎的免疫诊断产品中的应用。
在本申请某些实施方式中，所述免疫诊断产品包括化学发光免疫检测试剂盒。
在本申请的第三个方面中，提供了一种CCP抗原，其在本申请所述的CCP肽段上偶联载体蛋白、生物素、异硫氰荧光素中的一种或两种以上的偶联物。
在本申请的第四个方面中，提供了一种化学发光免疫检测试剂盒，包括偶联本申请所述的CCP抗原、固相载体、发光标记物标记的二抗和发光激发液，所述固相载体可以通过修饰活性基团与同样修饰活性基团的CCP抗原偶联，例如生物素-链霉亲和素等方式。
在本申请某些实施方式中，所述固相载体为磁微粒，所述发光标记物为吖啶酯，所述二抗为鼠抗人IgG二抗，所述发光激发液包括鲁米诺和过氧化氢。
在本申请某些实施方式中，采用稀释液对所述的CCP抗原、固相载体、发光标记物标记的二抗进行稀释调整工作浓度，所述稀释液一般为磷酸盐缓冲液，含表面活性剂、蔗糖、牛血清白蛋白/小牛血清、金属离子螯合剂、防腐剂等成分。
在本申请提供的各组对比实验中，如未特别说明，除各组指出的区别外，其他实验条件、材料等均保持一致，以便具有可对比性。此外，本申请所用材料均可通过市售途径购买获得。
以下就本申请所提供的一种CCP肽段及其应用以及CCP抗原和试剂盒做进一步说明。
实施例1：化学发光免疫检测方法建立
1、商业化的链霉亲和素包被的磁微粒(SA-Beads),以稀释液(磷酸盐缓冲液，含表面活性剂，蔗糖，牛血清白蛋白，金属离子螯合剂，防腐剂等)稀释30倍，作为试剂组分1；
生物素化CCP抗原，以稀释液(磷酸盐缓冲液，含表面活性剂，牛血清白蛋白，防腐剂等)稀释至0.5μg/mL，作为试剂组分2；
吖啶酯标记的鼠抗人IgG二抗，以稀释液(磷酸盐缓冲液，含表面活性剂，小牛血清，防腐剂等)稀释至0.1μg/mL，作为试剂组分3；
2、组分1～3装入试剂架后，将试剂架放入全自动化学发光免疫分析仪，并设置反应参数。
检测过程：取10μL待检血清，加入50μL试剂1以及50μL试剂2，振荡混匀后，37℃孵育10min，清洗；加入100μL试剂3，振荡混匀后，37℃孵育8min，清洗；加入发光激发液1(鲁米诺)及发光激发液2(过氧化氢)各50μL，反应2min后，由仪器读取发光信号值并计算结果。
实施例2：临床样本检测
采用实施例1建立的方法对392份已知临床血清样本分别进行检测，同时与采用多个肽段的第二代CCP抗原(购自Axeshield)检测结果进行比较。已知临床样本为已知RA患者血清样本152份，健康体检者血清样本120份，非RA患者血清样本120份。本申请所用CCP抗原如SEQ ID No.9-14所示，检测结果如图2所示。
根据图2的检测结果可知，表明本申请所述CCP肽段用于检测抗环瓜氨酸肽抗体时具有良好的敏感性和特异性，并且无需多个肽段或抗原表位增强效果；市售第二代CCP抗原虽然也具有较高的敏感性和特异性，但是其包含多条CCP肽段，成本较高。
以上所述仅是本申请的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本申请。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本申请的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本申请将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种CCP肽段，其特征在于，具有NH2-S1-M-S2-COOH所示结构；其中，S1和S2均为包含半胱氨酸和带电氨基酸的环化接头氨基酸残基区，S1和S2通过半胱氨酸形成二硫键连接；M为瓜氨酸抗原表位区，其由具有天然的β-turn或random-turn结构的肽段经突变部分氨基酸为瓜氨酸形成。
2.根据权利要求1所述的CCP肽段，其特征在于，所述S1和S2的氨基酸残基个数分别为4-6个。
3.根据权利要求1所述的CCP肽段，其特征在于，所述S1和S2的氨基酸序列分别独立选自SEQ ID No.1-2所示氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的CCP肽段，其特征在于，所述M的氨基酸残基个数为12个，含有1-2个瓜氨酸，位于第6-8位。
5.根据权利要求1或4所述的CCP肽段，其特征在于，所述M具有SEQ ID No.3-8任意一项所示的氨基酸序列。
6.权利要求1-5任意一项所述的CCP肽段在制备CCP抗原或诊断类风湿性关节炎的免疫诊断产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述免疫诊断产品包括化学发光免疫检测试剂盒。
8.一种CCP抗原，其特征在于，在权利要求1-5任意一项所述的CCP肽段上偶联载体蛋白、生物素、异硫氰荧光素中的一种或两种以上的偶联物。
9.一种化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括偶联权利要求8所述的CCP抗原、固相载体、发光标记物标记的二抗和发光激发液。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述固相载体为磁微粒。
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