CN103635806B - 获得针对前加压素原或其片段的结合物的方法 - Google Patents
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Abstract
获得和/或验证针对的前加压素原(SEQ ID NO.1)或其至少6个氨基酸长度的片段(包括和肽素(SEQ ID NO.2))的结合物的方法,包括至少一个以下步骤:a)使用开发物产生所述结合物,所述开发物包含与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少6个氨基酸长度的氨基酸序列;b)确定所述结合物是否能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少4个氨基酸长度的氨基酸序列;c)从多种结合物选择并且任选地分离能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的氨基酸序列的结合物;d)采用所述结合物实施结合测定,以确定生物样品中前加压素原或其至少6个氨基酸长度的包括和肽素在内的片段的离体稳定性;e)采用所述结合物和另一种用于比较目的的结合物实施结合测定,以确定生物样品中前加压素原或其至少6个氨基酸长度的包括和肽素在内的片段的浓度;其中C端部分由前加压素原(SEQ ID NO.1)的第138至164位氨基酸组成,以获得能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第138至163位氨基酸相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的表位的结合物或结合物的混合物。
Description
本发明涉及获得和/或验证针对前加压素原(prepro-Vasopressin)或其包括和肽素(Copeptin)在内的片段的结合物的方法、结合物和试剂盒,所述试剂盒包含用于定性或定量检测生物样品中前加压素原或其包括和肽素在内的片段的结合物,和用于产生前加压素原或其包括和肽素在内的片段的肽。
发明背景
前加压素原可以借助信号肽切割加工成加压素原,所述加压素原可以进一步加工成加压素、神经垂体素运载蛋白-2及和肽素,后者代表前体肽的C端部分。加压素,也称作抗利尿激素(ADH),是水和电解质平衡的关键调节物。测量生物样品中的加压素在临床工作中是几乎不可能,原因是与其从循环快速清除、与血清中的血小板相互作用和小尺寸相关的巨大技术难题,见“文献”,第[0039]段,[1-3]。已经成功地建立以化学计量方式用加压素一起形成的和肽素作为加压素的替代标记。这种成功的主要原因是考虑到其极高的离体稳定性,这使得它适合于例行使用[4-6]。
临床研究已经揭示出众多适应症,其中和肽素的测量提供高度有用的诊断信息,包括心脏疾病、肺病、传染病、肾脏疾病,水和电解质平衡的病理紊乱及其他[5]。用于检测和肽素的公布方法是免疫测定法[4,6]。
前加压素原和其片段也可以在某些类型的癌症中异位表达,抗和肽素抗体可以用来检测组织样品中的表达(EP1539818A2)。
尽管已经描述了用于产生抗和肽素抗体的免疫原,关于这些抗体的实际表位知之甚少(如果有的话)。表1中列出已描述的抗人和肽素抗体。在现有技术中,未曾注意到以下问题:抗和肽素抗体的表位特异性是否或怎样可能影响使用这类抗体检测生物样品中前加压素原或其包括和肽素在内的片段的准确度和稳健性。反而总体上认为和肽素本身是非常稳定的。用于检测成熟和肽素的抗体,其表位以相当非特定方式限定为定位于“和肽素C-末端附近”,由德国海德堡Santa Cruz Biotechnology,Inc.提供并推荐用于ELISA和其他应用中。
表1
发明描述
本发明涉及如权利要求中1所述的方法、如权利要求中10所述的肽和其如权利要求11中所述的用途、如权利要求中12所述的结合物,如权利要求14中所述的所述结合物的用途和如权利要求18中所述的试剂盒。优选的实施方案在相应的从属权利要求中描述。
详细而言,在第一方面,本发明涉及一种获得和/或验证针对前加压素原(SEQ IDNO.1)或其至少6个氨基酸长度的包括和肽素(SEQ ID NO.2)在内的片段的结合物的方法,包括至少一个以下步骤:
a)使用开发物(developer)产生所述结合物,所述开发物包含与前加压素原(SEQID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少6个氨基酸长度的氨基酸序列;
b)确定所述结合物是否能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少4个氨基酸长度的氨基酸序列;
c)从多种结合物中选择并且任选地分离能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的氨基酸序列的结合物;
d)以所述结合物实施结合测定,以确定生物样品中前加压素原或其至少6个氨基酸长度的包括和肽素在内的片段的离体稳定性;
e)以所述结合物和另一种用于比较目的的结合物实施结合测定法,以确定生物样品中前加压素原或其至少6个氨基酸长度的包括和肽素在内的片段的浓度;
其中C端部分由前加压素原(SEQ ID NO.1)的第138至164位氨基酸组成,
以便获得能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第138至163位氨基酸相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的表位的结合物或结合物的混合物。
本发明的主要方面是令人惊讶的研究结果:生物样品中的前加压素原片段并且尤其和肽素本身不如现有技术认为那样是极端稳定的,但是分析物稳定性和精确及可靠检测取决于测定法中用来检测这些片段如和肽素的抗体所针对的表位。具体而言,发现就精确检测和分析物稳定性而言,排除前加压素原C端部分中的第164位氨基酸作为前加压素原或其片段(如和肽素)结合物的表位的部分是高度关键的。因而,该方法包括步骤:确定不需要第164位氨基酸在与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应的氨基酸序列(即,始于第138位氨基酸并且位于其下游的氨基酸序列)的表位中存在的那些结合物。如本发明中发现和证实,不需要表位中的第164位氨基酸用于结合的结合物导致更精确及可靠的分析结果并且因此比需要所述第164位氨基酸用于结合的结合物更适用于检测前加压素原或其片段的测定法中。
可以进一步显示,第164位氨基酸不仅可以从前加压素原的C端部分中作为针对前加压素原或其片段的结合物的表位的部分缺失,而且当丢失多于一个氨基酸时也可以获得改进的结果。更详细地,第163-164、优选地第162-164位氨基酸和最优选地第161-164位氨基酸可以从与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应的氨基酸序列缺失。即,通过本发明方法可获得的结合不需要表位中存在这些氨基酸用于结合至前加压素原或其包括和肽素(SEQ ID NO.2)在内的片段。
如本文所用的术语“前加压素原”和“和肽素”还包括例如分别与前加压素原及和肽素仅显示75%同源性、优选地至少80%同源性、更优选地至少90%同源性的氨基酸序列。这同样适用于除和肽素之外的其他前加压素原片段。前加压素原的“片段”涉及至少6个氨基酸长度,优选地至少8个、特别优选地至少10个和最优选地至少12个氨基酸残基长度的片段。
本发明的方法描述了获得和/或验证如上文所述的不需要第164位氨基酸用于结合的适合结合物的几种方式,所述结合物可以单独或彼此组合使用。第一种可能性在步骤a)中给出并且涉及使用选择性导致所需结合物的适合开发物,有目的和选择性地产生结合物。具体而言,开发物包含与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的氨基酸序列。即,该开发物包含至少6个氨基酸长度的氨基酸序列,所述氨基酸序列对应于来自前加压素原的第138至164位氨基酸、但不具有第164位氨基酸中的氨基酸序列的至少一部分。使用其中第164位氨基酸在氨基酸序列中丢失的开发物导致不需要所述第164位氨基酸用于结合的结合物或结合物的混合物。(在下文中,除非另外声明,否则术语“结合物”应当意指单一类型的结合物或不同类型结合物的混合物)。原则上,步骤a)因此选择性地并直接导致所需的结合物并且不需要额外步骤来移除需要所述第164位氨基酸用于结合的结合物。然而,这不排除在步骤a)之后可以接续额外的步骤,如表征、纯化、选择和分离步骤。
在本发明的语境下,与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的用于产生结合物的氨基酸序列可以原则上是合成制备的或天然来源的氨基酸序列。它可以是线性或折叠的。所述氨基酸序列可以原则上具有6个或更多个氨基酸的任何长度,所述长度适于产生所需结合物或适于获得与结合物高效结合。它可以原则上对应于前加压素原第138和163位氨基酸之间的任何氨基酸序列。优选地,该氨基酸序列含于前加压素原(SEQ ID NO.1)第140至163位、更优选地142至163位、特别优选地144至163位和最优选地146至163位氨基酸的序列中。适当地,该氨基酸序列具有至少8个、优选地至少10个和最优选地至少12个氨基酸。特别地,所述氨基酸序列含有至少6个、优选地至少8个、更优选地至少10个和最优选地至少12个与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第146至163位氨基酸相对应的氨基酸序列中所含有的连续氨基酸。
如本文所用,术语“结合物”指能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应的氨基酸序列中所含有的表位的任何物质。这种结合物总体上在空间上并且就表面特征,如表面电荷、疏水性、亲水性、存在或不存在路易斯供体和/或受体而言充分地成型,以特异性结合靶分子或目的分子,即,前加压素原或其包括和肽素在内的片段。因此,结合可以例如由结合物和靶分子或目的分子之间离子性、范德瓦尔斯、π-π、σ-π、疏水性或氢键相互作用或两种或更多种前述相互作用的组合介导。这类结合物可以选自但不限于抗体和适配体。
优选地,结合物是抗体,优选地单克隆抗体、多克隆抗血清、富集或纯化的多克隆抗体、重组抗体或其功能衍生物。如本文所用,除非另外指明,否则术语“抗体”用于泛指抗体分子和多种抗体衍生分子。这类抗体衍生分子包含至少一个可变区(或者重链或轻链可变区),以及单独的抗体轻链、单独的抗体重链、抗体链和其他分子之间的嵌合融合物等。有功能的本发明免疫球蛋白片段可以是Fv、scFv、二硫键连接的Fv、Fab和F(ab')2。术语“抗体”还包括多克隆抗体、单克隆抗体、优选地IgG1抗体;嵌合单克隆抗体;人源化抗体,基因修饰的单克隆抗体。功能衍生物是化学和/或生物化学修饰的具有类似功能性/结合能力的抗体变体。类似的,开发物可以是适合产生本发明结合物的任何物质。优选地,开发物是免疫原,最优选地是天然肽或合成肽,其包含与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应的氨基酸序列中所含有的至少6个氨基酸长度的氨基酸序列。
如本文所用的术语“开发物”指用于产生结合物的结合位点相关物质,例如氨基酸序列。开发物可以由如上文所述的氨基酸序列组成或可以含有这种氨基酸序列作为化合物的功能部分。例如,该开发物可以额外地包含连接部分,如另一种氨基酸序列。优选地,开发物选自由前加压素原(SEQ ID NO.1)的第146-163位(SEQ ID NO.7)、第146-162位(SEQ IDNO.8)、第146-161位(SEQ ID NO.9)、第146-160位(SEQ ID NO.10)、第146-159位(SEQ IDNO.11)、第146-158位(SEQ ID NO.12)和第146-157位(SEQ ID NO.13)氨基酸的氨基酸序列组成的肽。这些肽和它们在本发明方法中的用途也是本发明的部分。使用肽产生结合物、尤其抗体的方法通常总体上是本领域中已知的,因此不需要在此描述。
在本发明的步骤b)中,确定该结合物是否能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的氨基酸序列。在此,也在步骤c)中,将氨基酸序列和C端部分如上文步骤a)中那样定义,不同之处在于,认为该氨基酸序列中至少4个氨基酸的长度足以测定结合。优选地,该氨基酸序列具有至少6个、更优选地至少8个、甚至更优选地至少10个和最优选地至少12个与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第146至163位氨基酸相对应的氨基酸序列中所含有的连续氨基酸,并且优选地是选自前加压素原(SEQ ID NO.1)的第146-163位(SEQ ID NO.7)、第146-162位(SEQ ID NO.8)、第146-161位(SEQ ID NO.9)、第146-160位(SEQ ID NO.10)、第146-159位(SEQ ID NO.11)、第146-158位(SEQ ID NO.12)和第146-157位(SEQ ID NO.13)氨基酸的氨基酸序列。
除步骤a)之外,例如,可以使用步骤b)以验证产生步骤中获得的结合物的合适性。然而,更优选地,可以使用步骤b)以便查明一种结合物实际上能够结合与前加压素原(SEQID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少4个氨基酸长度的氨基酸序列,其中所述结合物没有使用如步骤a)中那样的选择性开发物制备并且不清楚所述结合物是否将需要表位中的所述第164位氨基酸用于结合。这也适用于结合物的混合物,其中可能需要查明是否所述混合物是否含有需要表位中的第164位氨基酸用于有效结合的结合物。如果这得到证实,则可以在稍后步骤中移除这些不想要的结合物。
步骤b)可以使用专业人员已知的任何适合的测定方法实施。确定所述结合物是否能够结合与前加压素原C端部分的氨基酸序列相对应的至少4个氨基酸长度的氨基酸序列的优选方式是表位定位。表位定位是本领域技术人员已知的方法。表位定位是确定结合物在其靶抗原上的结合位点或“表位”的方法。存在结合物用来结合抗原的两种类型的总体结构:线性和构象性。线性表位由蛋白质中的连续氨基酸序列形成,而构象表位由是蛋白质序列中不连续但三维蛋白质折叠时聚拢在一起的氨基酸组成。存在可用于定位靶抗原上结合表位的几种方法。金标准方案是X射线共结晶学,它允许直接可视化抗原和结合物之间的相互作用。然而,这种方案在技术上具有挑战性,需要大量纯化的蛋白质,并且可能是耗时和昂贵的。表位定位的替代性方案是肽扫描法。这项技术使用来自靶蛋白重叠区段的短肽序列文库并且测试它们结合目的抗体的能力。这种方法更快并相对价廉,但是主要用于定位线性表位,而非构象表位。为了测试结合物是否能够结合相应的氨基酸序列,该氨基酸序列可以直接或间接地与固相结合。为了间接结合,开发物可以由这种氨基酸序列作为化合物的功能部分。例如,该氨基酸序列可以额外地包含连接部分,如生物素。生物素酰化的氨基酸序列可以经直接结合在固相上的链霉亲和素、抗生物素蛋白、中性抗生物素蛋白或captavidin固定。由于生物素以极高亲和力和特异性与链霉亲和素,抗生物素蛋白,中性抗生物素蛋白或captavidin结合,必须就结合相应结合物进行测试的氨基酸序列因此借助生物素间接地与固相结合。表位定位的另一个方案是位点定向诱变。使用这种方案时,将系统性氨基酸突变引入蛋白质序列中,随后测量结合物的特异性结合,以便鉴定构成表位的氨基酸。这项技术具有定位线性表位和构象表位的优点,但是费力并且缓慢,一般使分析限制于低数目的氨基酸残基。全部这些方法均可以在本发明的步骤b)中使用。然而,优选地,在这种方法中,评估了针对结合区变体的结合物的结合。这类变体可以是结合区的截短、突变、延长或修饰形式,它们一般通过化学合成产生或通过分子生物学方法产生作为重组肽。不得不指出实验性表位定位数据的解读可能受所用的实验条件、例如提供的结合靶的量、所用的结合物浓度、所用的检测方法、所用的孵育条件等强烈地影响。然而这是专业技术人员已知的并且可以因此予以考虑。
如果已经证明(例如,在上文描述的确定步骤b)中-获得了结合物的混合物,或者如果知道该制备方法导致结合物的混合物并且该混合物含有需要表位中的第164位氨基酸用于有效结合的所需结合物,则应当移除或至少耗尽那些不想要的结合物。为此目的,本发明的方法包括步骤c),其中选出了不需要表位中的前加压素原第164位氨基酸用于结合并且因此导致分析结果改进的所需结合物,从而它可以与不想要的结合物分离。这种选择步骤可以是适合选择性捕获所需结合物以便与不想要的结合物相比使之富集的任何方法。一种做到这点的优选方式是亲和分离法。这种方法利用待分离分子的不同结合特性。最常见方法是亲和层析,其中对靶分子的结合位点特异的配体与惰性层析基质连接。在结合条件下,层析基质上的这种特异性配体将仅根据其特异性结合分子。全部其他样品组分将在不结合的情况下穿过层析介质。在洗涤步骤之后,随后可以通过将改变条件趋向解离或通过添加从亲和配体替换靶分子的过量物质(竞争性洗脱),释放并洗脱结合的分子。结合物可以因此以纯化形式分离。然而,本发明不限于以上的选择、纯化和分离步骤,而是也可以使用任何其他适合的方法。
查明结合物是否需要表位中的前加压素原第164位氨基酸用于结合也可以根据本发明的步骤d)和e),通过实施结合测定法实现。两种步骤均间接地表征结合物的表位特异性并且因此是验证结合物的合适性的步骤。
如本文中提到,“测定法”可以是诊断领域中应用的任何类型的测定法。这种测定法可以基于待检测的分析物以某种亲和力与一个或多个捕获探针结合。就捕获分子和靶分子或目的分子之间的相互作用而言,亲和力常数优选地大于108M-1。“捕获分子”是可以用来结合靶分子或目的分子的分子。捕获分子因此必须在空间上并且就表面特征,如表面电荷、疏水性、亲水性、存在或不存在路易斯供体和/或受体而言充分地成型,以特异性结合靶分子或目的分子。如前文提到,结合可以例如由捕获分子和靶分子或目的分子之间离子性、范德瓦尔斯、π-π、σ-π、疏水性或氢键相互作用或两种或更多种前述相互作用的组合介导。
测定法可以具有各种形式,例如放射免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定法和荧光免疫测定法、酶联免疫测定法(ELISA)、基于Luminex的珠阵列、蛋白质微阵列测定法和快速检测形式,例如免疫层析试纸条检测。
测定法可以是均相或多相测定法、竞争性和非竞争性测定法。在一个特别优选的实施方案中,测定法为夹心测定法的形式,所述夹心测定法是非竞争性免疫测定法,其中待检测和/或定量的分子与第一抗体结合并且与第二抗体结合。第一抗体可以与固相(例如珠、板孔或其他容器的表面、芯片或试纸条)结合,并且第二抗体是(例如用染料、用放射性同位素或反应性或催化活性部分)标记的抗体。随后通过适宜的方法测量与分析物结合的标记抗体的量。涉及“夹心测定法”的一般组成和程序是充分建立的并且是技术人员已知的(The Immunoassay Handbook,编者David Wild,Elsevier LTD,Oxford;第3版(2005年5月),ISBN-13:978-0080445267;Hultschig C等人,Curr Opin Chem Biol.2006Feb;10(1):4-10.PMID:16376134,通过引用方式并入本文)。
在一个特别优选的实施方案中,测定法包含两种捕获分子,优选地包含均作为分散体存在于液体反应混合物中的抗体,其中第一标记组分与第一捕获分子连接,其中所述第一标记物组分是基于荧光猝灭或化学发光猝灭或扩增的标记系统的部分,并且所述标记系统的第二标记组分与第二捕获分子连接,从而一旦两种捕获分子与分析物结合,则生成可度量信号,所述可度量信号允许检测包含样品的溶液中所形成的夹心复合物。
甚至更优选地,所述标记系统包含与荧光染料或化学发光染料、尤其花青型染料组合的稀土元素穴状化合物或稀土元素螯合物。
在步骤d)中,采用所述结合物实施结合测定法,以确定生物样品中前加压素原或其包括和肽素在内的片段的离体稳定性。如本发明中已经显示,与需要所述第164位氨基酸用于结合的那些结合物相比,使用不需要前加压素原或其片段的第164位氨基酸用于结合的结合物时,分析物稳定性更高。因此,分析物稳定性可以用来得出关于结合物类型的结论。那些具有最高稳定性的分析物是不需要第164位氨基酸用于结合的那些并且因此是本发明中优选的结合物。可以出于比较目的,使用已经已知不需要第164位氨基酸用于结合的结合物,即,可以使用与这些比较结合物相关的分析物稳定性作为对新结合物所评价的分析物稳定性与之比较的标准。
步骤e),其可以作为步骤d)的替代或额外步骤使用,也使用用于比较目的另一种结合物,并且结合测定法用这种用于比较目的的结合物和新结合物实施,以便确定前加压素原或其包括和肽素在内的片段在生物样品中的浓度。用于比较目的的结合物适当地是已经已知不需要所述前加压素原第164位氨基酸用于结合至所述表位的结合物。也不需要表位中所述前加压素原第164位氨基酸用于结合的新结合物预期在生物样品中产生这样的结果:与用于比较目的的结合物具有相似或更高浓度的前加压素原或其片段(包括和肽素),而需要所述第164位氨基酸的结合物预期产生较低浓度。
如上文已经提到,本发明的方法可以仅由步骤a)至e)的一个步骤组成。例如,它可以仅由步骤a)、步骤b)、步骤c)、步骤d)或步骤e)组成。然而,该方法也包括步骤a)至e)中两个或更多个步骤以任意顺序的组合。例如,假定产生含有所需结合物和不想要的结合物的混合物的制备步骤可以接续分析步骤,如步骤b)、d)或e),所述分析步骤则可以任选地接续根据步骤c)选择所需结合物,并且随后,如果需要,接续分离步骤,所述分离步骤导致富集的所需结合物(如上文提到,这也可以是所需结合物的混合物)。
采用本发明的方法,使用方法步骤a)至e)中的至少一个步骤,可以获得能够高效结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第138至163位氨基酸相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的表位的那些结合物,如本发明已经令人惊讶地显示,所述结合物是不需要表位中存在与前加压素原C端部分相对应的氨基酸序列的第164位氨基酸用于有效结合的那些结合物。作为结果,当使用本发明方法可获得的结合物或包含所述结合物的用于定性或定量检测生物样品中前加压素原或其包括和肽素在内的片段的试剂盒时,可以获得更可靠的分析结果。
生物样品可以是任何种类的体液并且优选地选自血清、血浆、尿、脑脊液和唾液。优选地,样品是血液样品,最优选地血清样品或血浆样品。在适宜的情况下,样品可能在本发明中使用之前需要均化或用溶剂提取以获得液体样品。液体样品因而可以是溶液或悬液。液体样品可以在本发明中使用之前经历一个或多个预处理。这类预处理包括但不限于稀释、过滤、离心、浓度、沉降、沉淀、透析。预处理也可以包括向溶液添加化学或生物化学物质,如酸、碱、缓冲剂、盐、溶剂、活性染料、去垢剂、乳化剂、螯合剂。
在本发明的情境下,“血浆”是含有抗凝血剂的血液在离心之后获得的实际上无细胞的上清液。示例性抗凝血剂包括钙离子结合化合物,如EDTA或柠檬酸盐和凝血酶抑制剂如肝素盐或水蛭素。无细胞血浆可以通过以2000至3000g离心抗凝血液(例如,柠檬酸化、EDTA或肝素化血液)至少15分钟来获得。因此,优选的是在本发明的情境下使用的血浆样品已经经历以大于1500g离心30分钟、优选地至少以2000g离心至少30分钟、更优选地至少以3000g离心至少20分钟、最优选地至少以3000g离心至少30分钟。
在本发明的情境下,“血清”是在充分凝血完成之后血液的未稀释的胞外部分。凝血通常在30分钟之后完成。血清可以通过以最小速度1500g将凝血的样品离心至少10分钟来获得。因此,优选的是在本发明的情境下使用的血清样品已经经历至少以1500g离心至少10分钟、优选地至少15分钟、更优选地至少20分钟。最优选地,血清样品已经经历以3000g离心至少20分钟。
除了本发明的结合物,可以通过使用至少一种其他结合物甚至更大地改进确定前加压素原或其片段的结果的可靠性。这种其他结合物适当地结合至与本发明结合物不同的前加压素原或其片段的另一个表位。由这种其他结合物用于结合的表位优选地是与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第126至164位氨基酸相对应的氨基酸序列中完全或部分所含有的表位。特别优选地,该表位是完全或部分地含于与前加压素原第126至146位氨基酸相对应的氨基酸序列中并且最优选地含于前加压素原的第126至137位氨基酸中。在这种情况下,“部分地含于”意指仅表位的部分位于对应于前加压素原第126至164位氨基酸的氨基酸序列内,而其他部分位于该氨基酸序列上游,朝向N端。即,表位的部分与前加压素原的所述氨基酸序列重叠,而表位的其余部分位于其上游。重叠优选地是至少6个氨基酸。额外的结合物指能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)第126至164位氨基酸相对应的氨基酸序列中完全或部分所含有的表位。优选地,额外的结合物是抗体,优选地单克隆抗体、多克隆抗血清、富集或纯化的多克隆抗体、重组抗体或其功能衍生物。
本发明将参考附图和实施例进一步描述。附图和实施例涉及本发明的优选实施方案,但是本发明不限于这些实施方案,反而包含由权利要求所涵盖的全部其他实施方案。
附图说明
图1抗PLAY17绵羊抗血清(图1(A))、亲和纯化的绵羊多克隆抗PLAY17抗体(图1(B))、mAb429/F4(图1(C))和mAb423/F10(图1(D))的表位定位。数据表述为相对于扣减非特异性结合作用的针对P146-164肽获得的结合,扣减非特异性结合(其是忽略待测试的抗体时获得的结合作用)的针对所示相应肽获得的结合作用。显示了不同稀释度/量的所测试抗血清/抗体的结果。
图2测定多克隆抗PLAY17/mc抗PATV17(图2(A))、mAb429/F4/单克隆抗PATV17(图2(B))、mAb423/F10/单克隆抗PATV17(图2(C))的剂量反应曲线。
图3用多克隆抗PLAY17/单克隆抗PATV17和mAb429/F4/mc抗PATV17(图3(A))、多克隆抗PLAY17/mc抗PATV17和mAb423/F10/单克隆抗PATV17(图3(B))、mAb423/F10/单克隆抗PATV17和mAb429/F4/单克隆抗PATV17(图3(C))测量的血清样品的相关性。
图4用多克隆抗PLAY17/单克隆抗PATV17和mAb429/F4/单克隆抗PATV17(图4(A))、多克隆抗PLAY17/mc抗PATV17和mAb423/F10/单克隆抗PATV17(图4(B))、mAb423/F10/单克隆抗PATV17和mAb429/F4/单克隆抗PATV17(图4(C))测量的EDTA血浆样品的相关性。
图5分析物稳定性。显示了用所示测定法测量样品时,相对于样品未储存(t=0)时所测量的值,在22℃储存所示时间段之后的5份血清样品的均值(SEM)。
实施例
肽
使用标准程序将以下和肽素肽化学合成、纯化和质量控制:
抗体
通过标准程序生成针对肽PAY16和PAY14的单克隆抗体(Harlow E,LaneD.Antibodies-A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor:Cold Spring HarborLaboratory,1988;Lane RD.A short-duration polyethylene glycol fusion techniquefor increasing production of monoclonal antibody-secreting hybridomas.JImmunol Methods1985;81:223-8)。
简而言之,通过使用Sulfo-MBS(间-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟琥珀酰亚胺酯),使肽与BSA缀合。采用这些缀合物,免疫并强化免疫Balb/c小鼠,并且使脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合以产生杂交瘤细胞系。对细胞系筛选它们分泌将与免疫原性肽结合的抗体的能力,其中所述免疫原性肽包被在固态聚苯乙烯相上。
采用这种方案,产生了分泌单克隆抗体429/F4(针对PAY16)和423/F10(针对PAY14)的细胞系。对于其他实验,通过蛋白G亲和层析法从培养上清液纯化单克隆抗体。
在化学发光/包被管测定法中用来如[4,7]中所描述那样检测和肽素(CT-proAVP)的针对肽PLAY17(“pc抗PLAY”)形成的绵羊抗血清和亲和纯化的相应多克隆绵羊抗体来自德国黑尼格斯多夫BRAHMS GmbH。
表位定位
抗体的表位如下定位:
a)肽的包被
通过标准程序(EP1488209A1,EP1738178A1)进行包被:将聚苯乙烯起始管(Greiner)在22℃用肽P146-164、P146-163、P146-162、P146-161、P146-159、P146-158和P146-157包被过夜(每管在300μLPBS,pH7.8中的1.5μg肽)。随后将管用含有3%Karion FP(MERCK)、0.5%无蛋白酶的BSA(Sigma)的10mmol/L磷酸钠(pH6.5)封闭并且冻干。
b)驴抗绵羊IgG和山羊抗鼠IgG抗体的标记
通过标准程序(EP1488209A1,EP1738178A1)进行标记:将驴抗绵羊(ScantibodiesLaboratory Inc.,USA)和山羊抗小鼠抗体(BiosPacific,USA)的浓度调节至1g/l,并且将抗体通过在室温以1:4摩尔比与化学发光标记物MACN-吖啶-NHS-酯(1g/l;InVent GmbH,黑尼格斯多夫,德国)孵育20分钟进行标记。通过添加1/10体积的1mol/LTris在室温持续10分钟终止反应。通过在NAP-5柱(GE Healthcare,Freiburg,德国)和Thermo BioBasic3005μmHPLC柱(Thermo Scientific)上的大小排阻层析,将标记的抗体与游离的标记物分离。
c)多克隆抗PLAY17抗血清/亲和纯化的抗体
通过在每200μl含有106相对光单位(RLU)的MACN-标记抗体的分析缓冲液PBS,0.5%无蛋白酶的牛血清白蛋白(Sigma)中稀释标记的驴抗羊IgG抗体,产生示踪剂。将多克隆抗PLAY17羊抗血清(B.R.A.H.M.S GmbH,黑尼格斯多夫,德国)用PBS,0.5%牛血清白蛋白(无蛋白酶)以1:1000、1:3000、1:9000、1:27000和1:81000的比率稀释。将亲和纯化的pc抗PLAY17绵羊抗体用PBS,0.5%无蛋白酶的牛血清白蛋白稀释至以下浓度:972、324、108、36和12ng/200μl。在第一孵育步骤中,将50μl的pc抗PLAY17绵羊抗血清抗体稀释物和200μlPBS,0.5%牛血清白蛋白(无蛋白酶)吸入管中,所示管用肽P146-164、P146-163、P146-162、P146-161、P146-159、P146-158和P146-157包被。为计算非特异性结合(NSB),仅将250μl含有0.5%牛血清白蛋白(无蛋白酶)的PBS吸入管中,所示管用肽P146-164、P146-163、P146-162、P146-161、P146-159、P146-158和P146-157包被。将管在22℃搅拌下孵育过夜。随后,将管用1mL B.R.A.H.M.S洗涤液(B.R.A.H.M.S GmbH)洗涤5次。在第二孵育步骤中,添加200μl驴抗羊IgG示踪剂并且将管在22℃搅拌下孵育2小时。随后,将管用1mL B.R.A.H.M.S洗涤液洗涤5次,并且用LB952T光度计(Berthold)测量结合的化学发光,每管1秒。
d)mAb429/F4和mAb423/F10
通过将标记的抗体山羊抗鼠IgG稀释至每200μl含有106相对光单位(RLU)的MACN标记抗体的分析缓冲液(PBS,0.5%无蛋白酶的牛血清白蛋白)中,产生示踪剂。将单克隆抗体429/F4和423/F10用PBS,0.5%牛血清白蛋白(无蛋白酶)稀释至以下浓度:972、324、108、36和12ng/200μl。
在第一孵育步骤中,将50μl的mAb429/F4/mAb423/F10稀释物和200μl PBS,0.5%牛血清白蛋白(无蛋白酶)吸入管中,所示管用肽P146-164、P146-163、P146-162、P146-161、P146-159、P146-158和P146-157包被。为计算NSB,仅将250μl PBS,0.5%牛血清白蛋白(无蛋白酶)吸入管中,所示管用肽P146-164、P146-163、P146-162、P146-161、P146-159、P146-158和P146-157包被。将管在22℃搅拌下孵育过夜。随后,将管用1mL B.R.A.H.M.S洗涤液(B.R.A.H.M.SGmbH,黑尼格斯多夫,德国)洗涤5次。在第二孵育步骤中,添加200μl山羊抗小鼠示踪剂并且将管在22℃搅拌下孵育2小时。随后,将管用1mL B.R.A.H.M.S洗涤液洗涤5次,并且用LB952T光度计(Berthold)测量结合的化学发光,每管1秒。
在图1(A)至1(D)中,显示了观察到的抗血清和抗体与肽的结合,所示肽代表和肽素C端部分的C端全长变体和截短变体。抗PLAY17绵羊抗血清、亲和纯化的绵羊多克隆抗PLAY17抗体和mAb429/F4显示出与前加压素原氨基酸位置146-164、146-163、146-162、146-161相对应的肽的类似的结合作用。对于C端更截短的肽变体,结合作用减少。减少量取决于所用抗体的浓度。对于测试的抗血清/抗体,得出结论:它们的表位不含有前加压素原的氨基酸位置161-164。相比之下,mAb423/F10的结合作用仅针对与前加压素原氨基酸位置146-164相对应的肽是高效的,并且针对C端截短的肽变体强烈地降低。因此,在mAb423/F10的表位中,含有前加压素原的氨基酸位置164。
免疫测定
单克隆抗体的标记
通过标准程序(EP1488209A1,EP1738178A1)进行标记:将纯化抗体429/F4和423/F10的浓度调节至1g/l,并且将抗体通过在室温以1:5摩尔比与化学发光标记物MACN-吖啶-NHS-酯(1g/l;InVent GmbH,Hennigsdorf,德国)孵育20分钟进行标记。通过添加1/10体积的1mol/LTris在室温持续10分钟终止反应。通过在NAP-5柱(GE Healthcare,Freiburg,德国)和Thermo BioBasic3005μm HPLC柱(Thermo Scientific)上的大小排阻层析,将标记的抗体与游离的标记物分离。
如下利用或开发三种夹心免疫测定法:
A.Pc抗PLAY17/mc抗PATV17
CT-proAVP LIA(B.R.A.H.M.S GmbH,黑尼格斯多夫,德国)如[7]中所述。
B.mAb429/F4/mc抗PATV17
通过将标记的抗体429/F4稀释至每200μl含有106个相对光单位(RLU)的MACN标记抗体的分析缓冲液(300mmol/L磷酸钾,100mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA钠,5g/l无蛋白酶的牛血清白蛋白,1g/l非特异性绵羊IgG,1g/l非特异性牛IgG,1g/l非特异性小鼠IgG,0.9g/l叠氮钠,pH7.0)中,产生示踪剂。50μl CTpro-AVP标准物(B.R.A.H.M.S GmbH,黑尼格斯多夫,德国)/样品和200μl示踪剂被吸入CTpro-AVP包被的管(B.R.A.H.M.S GmbH)中。将管在22℃搅拌下孵育2小时。随后,将管用1ml洗涤液(B.R.A.H.M.S GmbH)洗涤5次,并且用LB952T光度计(Berthold)测量结合的化学发光,每管1秒。
C.mAb423/F10/mc抗PATV17
通过将标记的抗体423/F10稀释至每200μl含有106个相对光单位(RLU)的MACN标记抗体的分析缓冲液(300mmol/L磷酸钾,100mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA钠,5g/l无蛋白酶的牛血清白蛋白,1g/l非特异性绵羊IgG,1g/l非特异性牛IgG,1g/l非特异性小鼠IgG,0.9g/l叠氮钠,pH7.0)中,产生示踪剂。50μl CTpro-AVP标准物(B.R.A.H.M.S GmbH,黑尼格斯多夫,德国)/样品和200μl示踪剂被吸入CTpro-AVP包被的管(B.R.A.H.M.S GmbH)中。将管在22℃搅拌下孵育2小时。随后,将管用1ml洗涤液(B.R.A.H.M.S GmbH)洗涤5次,并且用LB952T光度计(Berthold)测量结合的化学发光,每管1秒。
图2中显示这三种测定法的典型剂量反应曲线。
方法比较
采用上述的三种测定法,测量各种临床样品,包括来自健康个体、患有心脏病学疾病的患者和源于ICU的患者的样品。在图3(血清)和图4(EDTA-血浆样品)中显示图示法比较。当测定多克隆抗PLAY17/mc抗PATV17与测定法mAb 429/F4/mAb PATV17比较时,观察到理想的Spearman相关系数,而当测定法mAb 423/F10/单克隆抗PATV17与多克隆抗PLAY17/mc抗PATV17或测定法mAb 429/F4/单克隆抗PATV17比较时,观察到清晰差异。与采用EDTA-血浆样品相比,采用血清时的差异更显著。观察到的差异明显与抗体的表位相关:mAb 423/F10的表位含有前加压素原的氨基酸位置164,而多克隆抗PLAY17和mAb 429/F4的表位不含前加压素原的氨基酸位置161-164。显然,除了全长和肽素外,还存在出现于血清和血浆两者中的C端截短变体。由于方法比较中所用的样品已经在收获之后立即冷冻并且紧邻其测量之前融化,所以局部C端截短作用明显地因离体储存而没有发生,但是已经在体内出现。
分析物稳定性
将方法比较中所用的血清样品亚组在22℃储存不同时间并随后用三种测定法测量。通过使用mAb 423/F10/单克隆抗PATV17测定法,已经在22℃储存1日之后,回收大幅度降低。mAb 423/F10的表位含有前加压素原的氨基酸位置164。相比之下,当使用多克隆抗PLAY17/单克隆抗PATV17或mAb 429/F4/mc抗PATV17测定法时,该分析物显示稳定得多。多克隆抗PLAY17和mAb 429/F4的表位不含前加压素原的氨基酸位置161-164。
序列
SEQ ID NO.1(前加压素原)
SEQ ID NO.2(和肽素)
ASDRSNATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY
(代表前加压素原的氨基酸位置126-164)
SEQ ID NO.3(肽PAY14)
CAPEPFEPAQPDAY
(代表前加压素原的氨基酸位置152-164外加N端半胱氨酸)
SEQ ID NO.4(肽PAY16)
CAGAPEPFEPAQPDAY
(代表前加压素原的氨基酸位置150-164外加N端半胱氨酸)
SEQ ID NO.5(肽PAY33)
ATQLDGPAGALLLRLVQLAGAPEPFEPAQPDAY
(代表前加压素原的氨基酸位置132-164)
SEQ ID NO.6(肽P146-164)
LVQLAGAPEPFEPAQPDAY
(代表前加压素原的氨基酸位置146-164)
SEQ ID NO.7(肽P146-163)
LVQLAGAPEPFEPAQPDA
(代表前加压素原的氨基酸位置146-163)
SEQ ID NO.8(肽P146-162)
LVQLAGAPEPFEPAQPD
(代表前加压素原的氨基酸位置146-162)
SEQ ID NO.9(肽P146-161)
LVQLAGAPEPFEPAQP
(代表前加压素原的氨基酸位置146-161)
SEQ ID NO.10(肽P146-160)
LVQLAGAPEPFEPAQ
(代表前加压素原的氨基酸位置146-160)
SEQ ID NO.11(肽P146-159)
LVQLAGAPEPFEPA
(代表前加压素原的氨基酸位置146-159)
SEQ ID NO.12(肽P146-158)
LVQLAGAPEPFEP
(代表前加压素原的氨基酸位置146-158)
SEQ ID NO.13(肽P146-157)
LVQLAGAPEPFE
(代表前加压素原的氨基酸位置146-157)
文献
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Claims (22)
1.获得能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第146至163位氨基酸组成的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少12个氨基酸长度的表位的结合物或结合物的混合物的方法,其中所述结合物是抗体并且结合物的混合物是抗体的混合物,所述方法包括下述步骤:
a)使用具有功能部分的开发物产生所述结合物,所述功能部分由与前加压素原(SEQID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少12个氨基酸长度的氨基酸序列组成。
2.验证权利要求1的方法所获得的能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第146至163位氨基酸组成的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少12个氨基酸长度的表位的结合物或结合物的混合物的方法,其中所述结合物是抗体并且结合物的混合物是抗体的混合物,所述方法包括下述步骤:
b)确定所述结合物是否能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少12个氨基酸长度的氨基酸序列;
c)从能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的氨基酸序列的多种结合物中选择能够结合与前加压素原(SEQ IDNO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少12个氨基酸长度的氨基酸序列的结合物;
d)以所述结合物进行结合测定,以确定生物样品中前加压素原或其至少12个氨基酸长度的片段的离体稳定性,所述片段包括和肽素,其中通过以下方式确定所述结合物与所述表位结合的特异性:与用于比较目的的另一种结合物的表位特异性进行比较;或者
e)进行结合测定,以确定生物样品中前加压素原或其至少12个氨基酸长度的片段的浓度,所述片段包括和肽素,其中通过以下方式确定所述结合物与所述表位结合的特异性:与用于比较目的的另一种结合物的表位特异性进行比较。
3.根据权利要求2所述的方法,其中步骤c)中,选择并且分离能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少12个氨基酸长度的氨基酸序列的结合物。
4.根据权利要求2所述的方法,其中步骤d)和e)中,通过以下方式确定所述结合物与所述表位结合的特异性:与已知不需要前加压素原(SEQ ID NO.1)的所述第164位氨基酸来结合所述表位的结合物的表位特异性进行比较。
5.根据权利要求1或2所述的方法,其中第163-164位氨基酸从与前加压素原(SEQ IDNO.1)的C端部分相对应的氨基酸序列中缺失。
6.根据权利要求1或2所述的方法,其中第162-164位氨基酸从与前加压素原(SEQ IDNO.1)的C端部分相对应的氨基酸序列中缺失。
7.根据权利要求1或2所述的方法,其中第161-164位氨基酸从与前加压素原(SEQ IDNO.1)的C端部分相对应的氨基酸序列中缺失。
8.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述开发物的氨基酸序列和/或所述与前加压素原(SEQ ID NO.1)的C端部分相对应、但缺少第164位氨基酸的氨基酸序列中所含有的至少12个氨基酸长度的氨基酸序列是选自以下肽:由前加压素原(SEQ ID NO.1)的第146-162位氨基酸(SEQ ID NO.8)、第146-161位氨基酸(SEQ ID NO.9)、第146-160位氨基酸(SEQ IDNO.10)、第146-159位氨基酸(SEQ ID NO.11)、第146-158位氨基酸(SEQ ID NO.12)或第146-157位氨基酸(SEQ ID NO.13)组成的肽。
9.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述结合物能够结合于氨基酸序列,所述氨基酸序列具有至少12个与前加压素原(SEQ IDNO.1)的第146至163位氨基酸相对应的氨基酸序列中所含有的连续氨基酸。
10.根据权利要求1或2所述的方法,其中所述结合物能够结合于选自前加压素原(SEQID NO.1)的第146-163位氨基酸(SEQ ID NO.7)、第146-162位氨基酸(SEQ ID NO.8)、第146-161位氨基酸(SEQ ID NO.9)、第146-160位氨基酸(SEQ ID NO.10)、第146-159位氨基酸(SEQ ID NO.11)、第146-158位氨基酸(SEQ ID NO.12)和第146-157位氨基酸(SEQ IDNO.13)的氨基酸序列。
11.根据权利要求2所述的方法,其中确定步骤b)包括表位定位。
12.根据权利要求1或2所述的方法,其中,在步骤a)、b)或c)中确定所述结合物与所述表位结合的特异性。
13.根据权利要求2所述的方法,其中选择步骤c)包括亲和分离。
14.肽,选自肽:由前加压素原(SEQ ID NO.1)的第146-163位氨基酸(SEQ ID NO.7)、第146-162位氨基酸(SEQ ID NO.8)、第146-161位氨基酸(SEQ ID NO.9)、第146-160位氨基酸(SEQ ID NO.10)、第146-159位氨基酸(SEQ ID NO.11)、第146-158位氨基酸(SEQ IDNO.12)或第146-157位氨基酸(SEQ ID NO.13)组成的肽。
15.根据权利要求14所述的肽在根据权利要求1至13中任一项所述的方法中用作开发物的用途。
16.抗体,其通过根据权利要求1所述的方法或根据权利要求15所述的用途可获得。
17.根据权利要求16所述的抗体,其是单克隆抗体、多克隆抗血清、富集或纯化的多克隆抗体、重组抗体、或以上的功能衍生物。
18.根据权利要求16或17所述的抗体在制备诊断剂中的用途,所述诊断剂用于定性或定量地检测生物样品中前加压素原或其片段,所述片段包括和肽素。
19.根据权利要求18所述的用途,其中所述生物样品是选自包括血液、血清、血浆、尿、脑脊液和唾液的组的体液。
20.根据权利要求18所述的用途,其中使用至少一种额外的抗体,所述额外的抗体能够结合与前加压素原(SEQ ID NO.1)的第126至164位氨基酸相对应的氨基酸序列中完全或部分地含有的表位。
21.根据权利要求20所述的用途,其中所述至少一种额外的抗体是单克隆抗体、多克隆抗血清、富集或纯化的多克隆抗体、重组抗体、或以上的功能衍生物。
22.用于定性或定量检测生物样品中前加压素原或其片段的试剂盒,所述片段包括和肽素,所述试剂盒包含根据权利要求16或17所述的抗体。
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