JP4854088B2 - 抗dnp抗体を用いたコレステロール結合剤 - Google Patents
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Description
生体組織のコレステロール分布は蛍光を発する抗生物質フィリピン(Fillipin)で観察できる。しかしフィリピンの蛍光は弱く、すぐに消退してしまう。またフィリピンは細胞膜のコレステロールとは反応するが、細胞内の脂肪滴コレステロールとは反応せず、細胞内全体のコレステロール分布の観察には適していない。
ジニトロフェニル基(DNP)を認識する抗体はいくつか知られており、市販もされている(特許文献1など)。しかしながら、ジニトロフェニル基を認識する抗体がコレステロールの検出に使用できることは全く知られていなかった。
特開2002-267672号公報
(1)ジニトロフェニル基を認識する抗体からなるコレステロール結合剤。
(2)(1)のコレステロール結合剤を含む、コレステロール検出キット。
(3)コレステロールを含む試料にジニトロフェニル基を認識する抗体を添加して試料中に含まれるコレステロールを検出することを特徴とする、コレステロール検出方法。
なお、ジニトロフェニル基としては2,4−ジニトロフェニル基が好ましい。
なお、本発明において、モノクローナル抗体とは、モノクローナル抗体、モノクローナル抗体のフラグメント、F(ab')2化抗体、F(ab')化抗体、短鎖抗体(scFv)、ダイアボディ(Diabodies)およびミニボディ(Minibodies)を含むものとする。
コレステロール結合剤の用途としては、コレステロールの回収、検出などが挙げられる。コレステロールの回収方法としては、例えば、抗DNP抗体を適当な担体などに結合させて対象試料と接触させ、抗DNP抗体を介して担体に結合したコレステロールを回収する方法が挙げられる。
また、コレステロールを検出する方法としては、コレステロールを含む試料に抗DNP抗体を添加して抗DNP抗体と試料中のコレステロールとの複合体を形成させ、複合体中のコレステロールを標識された2次抗体などを用いて検出する方法などが挙げられる。
検出の対象はコレステロールを含有しうる試料であれば特に制限されないが、コレステロールを含有しうる生体試料が好ましく、コレステロールを含有しうる細胞や組織切片がより好ましい。
特に、コレステロールが高濃度に集積した形質膜、内分泌顆粒膜を効率よく検出することができる。
コレステロールを含有しうる細胞や組織切片におけるコレステロールの量や分布を検出する具体的方法としては、例えば、以下のような方法が挙げられる。
ホルマリン等で固定化された細胞または組織切片に抗DNP抗体を反応させる。洗浄後、標識された2次抗体を反応させ、その標識に基づいて検出する。抗DNP抗体の添加量は抗体の検出感度(力価)によって調整される。
標識された2次抗体としては、蛍光標識抗体や酵素標識抗体を使用することができる。蛍光標識抗体を用いた場合、蛍光顕微鏡などを用いて検出することができる。一方、酵素標識抗体を用いたときは、酵素の基質を添加して基質分解反応によって生じる発光や発色に基づいて検出することができる。
あらかじめ既知量のコレステロールで検量線を作成しておくことにより、コレステロールの定量も可能である。
本発明のコレステロール検出キットは研究目的のみならず、高コレステロール血症などの診断目的に使用することもできる。例えば、抗DNP抗体を用いたELISAによって血中のコレステロール濃度を測定することができる。
0、0.02、0.2、2.0、および20μgのコレステロールの溶液を、それぞれ膜(Protoran:Schleicher & Schuell BioScience Inc)にドットブロットした。また、比較対照として、それぞれ20μgのフォスファチジルコリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルイノシトール、フォスファチジルセリンおよびスフィンゴミエリンを膜にブロットした。得られた膜に1%BSA(ウシ血清アルブミン)/PBSを加えて30分間ブロッキングを行った。次に、1%BSA/PBSで1000倍に希釈した10μg/mlの抗DNP抗体(抗DNP-BSAウサギポリクローナル抗体(SIGMA D-9656)、抗DNP-BSAヤギポリクローナル抗体(Biogenesis 3599-9594)、抗DNP-KLHウサギポリクローナル抗体(Molecular Probes A-6430)のそれぞれ)を加えて4℃で一晩インキュベートした。次に、PBSで5分間洗浄する操作を3回繰り返した後、1%BSA/PBSで1:500に希釈したペルオキシダーゼ標識2次抗体(抗ウサギ二次抗体:Jackson社、または抗ヤギ二次抗体:Jackson社)を添加して室温で2時間インキュベートした。PBSで5分間洗浄する操作を3回繰り返した後、発光基質(ECL Western Blotting Detection kit; Amersham Biosciences社)を加えて検出を行った。結果を図1に示した。それによると、いずれの抗DNP抗体もコレステロールに濃度依存的に結合することがわかった。一方、抗DNP抗体は比較対照の脂質のいずれにも反応せず、抗DNP抗体が特異的にコレステロールに結合することがわかった。
次に、抗DNP抗体を用いて蛍光組織染色を行い、インスリンの蛍光パターンと比較した。
MIN6細胞(マウス膵β細胞由来)を2日間培養後、ホルムアミドを用いて固定化し、1%BSA/PBSを加えて30分間ブロッキングを行った。次に、1%BSA/PBSで1000倍に希釈した抗DNP抗体(抗DNP-BSAウサギポリクローナル抗体(SIGMA D-9656)、もしくは抗DNP-KLHウサギポリクローナル抗体(Molecular Probes A-6430))、または1%BSA/PBSで500倍に希釈した抗インスリン抗体(SIGMA社)を加えて4℃で一晩インキュベートした。次に、PBSで5分間洗浄し、これを3回繰り返した。次に、1%BSA/PBSで1:500に希釈したDNPに対する2次抗体(Redx anti-rabbit IgG:Jackson社)、1:1000に希釈したインスリンに対する2次抗体(Alexa488 anti-guinea pig IgG: Molecular Probes社)を添加して室温で2時間インキュベートした後、蛍光顕微鏡で蛍光を観察した。結果を図2に示した。
それによると、抗DNP抗体による染色パターンはインスリンの染色パターンと類似し
ており、コレステロールが細胞内の内分泌小胞に存在していることが確認できた。
Claims (3)
- ジニトロフェニル基を認識する抗体からなるコレステロール結合剤。
- 請求項1に記載のコレステロール結合剤を含む、コレステロール検出キット。
- コレステロールを含む試料にジニトロフェニル基を認識する抗体を添加して試料中に含まれるコレステロールを検出することを特徴とする、コレステロールの検出方法。
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