CN115616211A - 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒 - Google Patents

一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒 Download PDF

Info

Publication number
CN115616211A
CN115616211A CN202210535427.6A CN202210535427A CN115616211A CN 115616211 A CN115616211 A CN 115616211A CN 202210535427 A CN202210535427 A CN 202210535427A CN 115616211 A CN115616211 A CN 115616211A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peptidyl
prolyl cis
trans isomerase
antibody
antigen
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210535427.6A
Other languages
English (en)
Inventor
叶青
毛建华
张俊峰
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Zhejiang University ZJU
Original Assignee
Zhejiang University ZJU
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zhejiang University ZJU filed Critical Zhejiang University ZJU
Priority to CN202210535427.6A priority Critical patent/CN115616211A/zh
Publication of CN115616211A publication Critical patent/CN115616211A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/564—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for pre-existing immune complex or autoimmune disease, i.e. systemic lupus erythematosus, rheumatoid arthritis, multiple sclerosis, rheumatoid factors or complement components C1-C9
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N21/00—Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
    • G01N21/75—Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
    • G01N21/76—Chemiluminescence; Bioluminescence
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54326—Magnetic particles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/99—Isomerases (5.)
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/34—Genitourinary disorders
    • G01N2800/347—Renal failures; Glomerular diseases; Tubulointerstitial diseases, e.g. nephritic syndrome, glomerulonephritis; Renovascular diseases, e.g. renal artery occlusion, nephropathy

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Rehabilitation Therapy (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Plasma & Fusion (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明提供一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体的检测试剂盒。通过被检测血清样本与靶抗原peptidyl‑prolyl cis‑trans isomerase D(肽基脯氨酰基顺反异构酶D)多肽或其结合片段相接触，发生免疫反应，形成抗原抗体复合物，通过对形成的抗原抗体复合物进行抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG自身抗体的检测。本发明首次在儿童肾病综合征中鉴定了针对抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体，并针对该抗体提供了检测试剂盒。为国内外针对与抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D‑IgG抗体有关的自身免疫性肾病综合征的鉴别提供一种较好的检测方法。

Description

一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒
本申请是申请号为202110743527.3，申请日为2021年7月1日，发明名称为一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒的分案申请。
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，涉及一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒。
背景技术
原发性肾病综合征(primary nephrotic syndrome,PNS)是多种因素引起肾小球基底膜通透性增加，进而血浆蛋白滤出增多，从尿液中丢失，并由此造成一系列病理改变的临床综合症。PNS是儿童常见的肾小球疾病，根据报道其年发病率为1.15～16.9/10,0000。病理类型表现为微小病变性肾病综合征(minimal change nephrotic syndrome,MCNS)是其中最常见的，依据PNS对于激素治疗的反应效果，分为激素敏感型(SSNS)、激素依赖型(SDNS)、激素耐药型(SRNS)。尽管绝大多数患儿对激素治疗反应敏感，预后良好，但仍有约10％～20％的患儿对激素治疗的反应为依赖或耐药，若不进行其他药物干预治疗，可进展为肾小球硬化，最终进展为终末期肾病，严重影响患儿健康，家庭及社会难以承担沉重的经济负担。且该病的发病机制目前尚不十分清楚。PNS其临床症状通常表现为水肿、大量蛋白尿、低蛋白血症以及高脂血症等，然而引起这些临床表现的病因非常复杂，给明确PNS的诊断带来困难。因此，若能够寻找到引起PNS确切的病因，那么就能够在病因上对PNS进行尽早诊断，从而尽早干预与治疗，这将具有重要的临床意义。
目前，临床上给予激素和免疫抑制剂进行治疗的绝大多数PNS患儿病情能有所好转，间接地提示了PNS与患者的自身免疫存在密切的联系。众所周知，B淋巴细胞在体液免疫中发挥着最为重要的作用，然而PNS患儿肾脏的局部在过去数年间缺乏抗体的沉积，因此忽视了B淋巴细胞介导的体液免疫在PNS疾病中的作用。近年来的研究发现，在复发的激素敏感型肾病综合征患者中发现外周血中的B细胞的数量显著增加，被活化的B细胞在激素依赖型肾病综合征患者体内大量增加，然而对于处在缓解期的激素依赖型肾病综合征患者体内，其B细胞数量明显下降，提示B淋巴细胞功能异常在PNS中扮演着重要的作用。近些年，全球多地的研究发现，利用特异性针对CD20+B细胞的利妥昔单抗治疗儿童难治性肾病综合征中取得了显著的治疗效果。然而利用利妥昔单抗治疗SDNS的过程中发现，其清除B细胞的功效能维持5个月左右，但是在6，7个月的时候，由于B细胞数量回升患者的病情随即复发。由此提示PNS患者体内发生病理性的B细胞克隆，如果可以鉴别和精准的清除这些病理性的B细胞克隆，那么对于PNS病情的恢复是有利的，同样也减少了利用利妥昔单抗等方法无差别的清除B细胞造成体液免疫缺陷的风险。
然而，迄今为止，PNS患儿体内病理性B细胞针对的靶抗原仍然不是很清楚。从病理特征上来说，微小病变型肾病或局灶节段性肾小球硬化被认为是由于足细胞功能丧失或改变，导致大量蛋白尿的足细胞病。足细胞为肾脏肾小球上皮细胞，附着在肾小球的基底膜的外侧。它是阻止蛋白质丢失的最后屏障，足细胞损伤通常会引起大量的蛋白尿。
Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D由肽基脯氨酰异构酶F基因编码的线粒体基质蛋白质，是线粒体通透性转换孔的调控开关。既往通过小鼠的动物实验发现，当敲低peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D基因，小鼠表现出抵抗缺血再灌注诱导的心肌损伤；过表达，则表现出心肌肥大，心肌细胞功能下降，可能是通过线粒体途径调控细胞坏死或通过抗氧化途径发挥作用。Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D敲除小鼠对高脂肪饮食诱导的肥胖或肝脂肪变性具有抵抗力(Wang X，et al.Cyclophilin Ddeficiency attenuates mitochondrial perturbation and ameliorates hepaticsteatosis.Hepatology,2018Jul；68(1):62-77.)。此外，peptidyl-prolyl cis-transisomerase D在人类卵巢癌、子宫癌、乳腺癌、肝癌、肾癌等肿瘤细胞中均出现特异性的表达。
目前peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D与肾脏疾病的关系多集中于急性肾损伤方面的研究。比如，在一项环孢菌素A诱导的急性肾损伤研究中，peptidyl-prolylcis-trans isomerase D通过抵抗氧化应激产生肾脏保护作用(Jelena Klawitter，etal.Cyclophilin D knockout protects the mouse kidney against cyclosporin A-induced oxidative stress.Am J Physiol Renal Physiol，2019Sep；317(3)：F683-F694)。在另一项，顺铂诱导的急性肾损伤研究中，peptidyl-prolyl cis-trans isomeraseD通过调节脂肪酸β-氧化起到保护肾脏的作用。脂肪酸氧化是肾脏的首选能量来源，在急性肾损伤期间被抑制。Peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D可能在调节整体细胞代谢(包括葡萄糖和脂肪酸代谢)以及线粒体生物能量学(包括三羧酸循环、电子转运体链和以组织/器官特异性方式在细胞中的氧化磷酸化)方面发挥关键作用(Hee-Seong Jang,etal.Proximal tubule cyclophilin D regulates fatty acid oxidation in cisplatin-induced acute kidney injury.Kidney Int,2020Feb；97(2):327-339.)。
然而，关于peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D与肾病综合征的关系未见报道。在现有技术中，通过检测血清抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体鉴别出自身免疫性肾病综合征的研究目前也是空白的。
发明内容
本发明提供一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒，即检测血清抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG自身抗体的检测试剂盒，所述试剂盒通过与peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D(肽基脯氨酰基顺反异构酶D)抗原蛋白(特别根据序列识别号SEQ ID NO.1所示)的免疫反应，对被检测样品中的抗体进行检测。
本发明所述试剂盒包括：peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白，标记抗体液(酶标记或化学发光剂标记的抗人IgG溶液)，包被peptidyl-prolyl cis-transisomerase D抗原的固相载体、样本稀释液，抗体稀释液，抗原稀释液，底物显色液，洗涤液，终止液，标准品，阳性质控品，阴性质控品。
所述peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白的序列如SEQ ID NO：1所示：
FADIVPKTAENFRALCTGEKGIGHTTGKPLHFKGCPFHRIIKKFMIQGGDFSNQNGTGGESIYGEKFEDENFHYKHDREGLLSMANAGRNTNGSQFFITTVPTPHLDGKHVVFGQVIKGIGVARILENVEVKGEKPAKLCVIAECGELKEGDDGGIFPKDGSGDSHPDFPEDADIDLKDVDKILLITEDLKNIGNTFFKSQNWEMAIKKYAEVLRYVDSSKAVIETADRAKLQPIALSCVLNIGACKLKMSNWQGAIDSCLEALELDPSNTKALYRRAQGWQGLKEYDQALADLKKAQGIAPEDKAIQAELLKVKQKIKAQKDKEKAVYAKMFA。
根据本发明，所述peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白经分子筛、凝胶过滤层析、亲和层析、离子交换柱、疏水柱纯化。
本发明所述peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白可以是融合蛋白，使用具有生物学或物理功能的标签，特别是N-末端或C-末端标签，优选C-末端标签。这些标签有利于抗原蛋白纯化，固定，沉淀。优选实施方案中，所述标签为能够与配体特异性地结合的序列或结构域，所述的标签肽选自：His标签、GST标签、麦芽糖结合蛋白、硫氧还蛋白和荧光标签或生物素标签。
根据本发明，所述抗原蛋白peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D可表达于细菌如大肠杆菌、真菌酵母、哺乳动物细胞中。
在一个优选的实施方案中，本发明所述peptidyl-prolyl cis-trans isomeraseD抗原蛋白是以固定化的形式呈现，术语“经固定化的”是指在水溶液中与不可溶的固体载体相结合。优选的，通过静电相互作用、疏水相互作用、共价键结合。所述固相载体优选的，聚苯乙烯、材料微孔板、硝酸纤维素膜、磁珠。
所述peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白固定方式包括可逆的固定方式或不可逆的固定方式。例如，分子通过可裂解的共价键(如可添加含硫醇的试剂来裂解的二硫键)结合，这种固定是可逆的。另外，如分子通过在水性溶液中不会裂解的共价键(通过环氧化物基团与将赖氨酸侧链偶联至亲和柱的胺基团的反应形成的键)固定于载体，则固定是不可逆的。固定还可以是间接方式固定蛋白质：如固定对所述分子具有特异性亲和力的抗体，然后形成复合物以达到固定分子-抗体复合物的效果。
本发明所述peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白固定方法为直接包被法：(1)抗原通过物理吸附方式或非共价键结合到硝酸纤维素膜或聚苯乙烯微孔板上；(2)带有羧基功能团的磁微粒带与蛋白质氨基结合，抗原通过化学偶联方式结合在磁微粒上。
所述底物显色液为TMB、鲁米诺、过氧化氢、吖啶酯；所述抗原稀释液为：1xPBS，pH7.40；所述抗体稀释液为：0.15％BSA+0.01M PBS(pH7.40)；所述样本稀释液为：6％胎牛血清+0.01M PBS(pH7.40)；所述洗涤液为：1xPBS(pH7.40)+0.1Tween-20；所述终止液为：2M硫酸。
本发明一个实施方案中，所述标准品和阳性质控品，优选的从与人同源的抗原中制备得到，为重组人抗标签肽免疫球蛋白G或其片段、或从病人血清中提取抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体作为阳性质控品和标准品，阴性质控品为健康体检者血清。
本发明所述标记抗体液可以是辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)标记抗人IgG、生物素标记抗人IgG、吖啶酯标记抗人IgG。
根据本发明，所述被检测样品是含有抗体的液体样品，优选的，胸水、腹水、尿液、全血、血浆，最优选的，血清。所述血清为哺乳动物血清，优选的，人血清。在检测之前，可以对被检测样品进一步的加工，包括分级分离、离心或富集。
本发明是一种将利用基因重组的方法表达并纯化得到的重组蛋白peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D作为试剂盒中的抗原蛋白，然后包被于固相载体上，加入阳性质控品或标准品或待检血清进行孵育，再加入标记二抗反应后，通过与血清中的抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体结合形成包被抗原peptidyl-prolylcis-trans isomerase D-待检血清抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体-标记抗人IgG抗体复合物，通过光学方法如光显色法、化学发光法、荧光发光法来检测光信号，进行定性或定量分析血清中抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体浓度的检测试剂盒。
应用本发明试剂盒，首次在部分自身免疫性肾病综合征患者体内检测到了一种抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG自身抗体，且确定了该自身抗体针对的靶抗原为肾小球足细胞上peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D。因此，本发明的试剂盒可用于抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG自身抗体的检测，为研究自身免疫性肾病综合征提供依据。
与现有技术相比本发明试剂盒的有益之处如下：
(1)本发明首次鉴定了针对自身免疫性肾病综合征患者体内抗peptidyl-prolylcis-trans isomerase D-IgG自身抗体的存在，并针对该抗体发明了检测试剂盒。目前，国内外与peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体有关的研究仅限于分子机制研究，该发明填补了国内外针对peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体检测的空白。
(2)本发明试剂盒涉及定性检测血清中抗peptidyl-prolyl cis-transisomerase D-IgG抗体，其中固相膜免疫定性检测操作简便，试剂用量较少，微量的抗原能被NC膜极强的吸附能力所吸附，吸附的NC膜可长期保存(-20℃可保存半年)，且不影响其活性。适用于大规模筛选。
(3)本发明涉及磁微粒化学发光免疫分析定量检测试剂盒，利用磁微粒为固相载体，其直径仅为1.0μm，这就大大增加了包被表面积，增加了抗原的吸附量，提高了反应速度，也使清洗分离更简便，从而减少污染，降低交叉感染概率。另一方面，采用吖啶酯发光剂直接标记抗人IgG，其化学反应简单、快速、无须催化剂；吖啶酯化学发光为闪光型，其通过起动发光试剂(H2O2、NaOH)0.4s后发射强度即可达到最大，半衰期为0.9s，2s内基本结束，便于快速检测。
(4)本发明首次发现在肾病综合征中存在peptidyl-prolyl cis-transisomerase D-IgG自身抗体，明确了自身免疫性的病因。本发明使该自身免疫性肾病综合征有了一种无创性的检测方法，相比于现有的肾活检检测方法来说，本发明试剂盒的应用填补了空白，将会减轻患者的痛苦及经济负担。
附图说明
图1：足细胞上的peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D蛋白是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的靶抗原。图1A：一抗为健康人血清的二维电泳蛋白点；图1B：一抗为自身免疫性肾病综合征患者血清的二维电泳蛋白点；图1C：靶抗原peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D蛋白的质谱鉴定。
图2：表达的重组peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白的SDS-PAGE鉴定图。
图3：固相膜免疫试剂盒检测自身免疫性肾病综合征患者血清中抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体膜条图。
图4：磁微粒化学发光试剂盒检测抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体原理图。
图5：抗原蛋白peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D的包被羧基磁微粒示意图。
图6：不同肾病病人抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体的检出情况，其中NC：健康者；HP：过敏性紫癜；HPN：紫癜性肾炎；IgAN：IgA肾病；NS：自身免疫性肾病综合征。
图7：ROC曲线评估抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体用于检出自身免疫性肾病综合征的应用价值。
具体实施方式
以下结合附图和具体实施例，对本发明作进一步说明。以下实施例仅用于阐述本发明而非用于限制本发明的范围。
实施例1足细胞上的peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D是自身免疫性肾病综合征病人体内自身抗体针对的靶抗原
(1)肾小球足细胞总蛋白的提取：培养足细胞株(MPC5)，用PBS洗涤2-3次，然后用聚焦超声仪(Covaris S220,Gene)在含有30mm Tris-HCl、8m尿素、4％CHAPS和蛋白酶抑制剂(#ab65621；Abcam，1：200稀释)的裂解缓冲液中冰上进行充分裂解，然后将样本置于离心机，12000g，4℃，离心30min。收集上清，即为收集到的肾小球足细胞总蛋白。利用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定收集到的肾小球足细胞总蛋白浓度。(2)二维电泳：提取肾小球足细胞总蛋白进行二维电泳后转到硝酸纤维素膜上，分别用自身免疫性肾病综合征病人和健康人的血清作为一抗进行孵育，之后加上二抗进行显影，见图1A，1B。(3)基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析：将步骤(2)显影后进行阳性点的差异分析，选取二维电泳胶上肾病综合征病人强阳性，而健康人阴性或者弱阳性的蛋白点，从凝胶上剪下选中的蛋白点，将干燥后的凝胶用胰蛋白酶(0.1μg/μL)进行消化，然后向反应混合物中加入10μL的25mM碳酸氢铵，37℃孵育过夜，然后用三氟乙酸(0.1％)从凝胶中提取肽。用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱分析(MALDI-TOF-MS)质谱仪对提取的肽进行分析，得到肽质量图谱，鉴定为peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D蛋白，见图1C。
实施例2重组peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白的表达及纯化
利用基因工程的方法以编码peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D蛋白的基因为模板，进行PCR扩增，然后构建表达载体进行蛋白表达。本发明表达的抗原蛋白上含有His标签的标签肽。表达的重组蛋白经镍柱亲和层析、离子亲和层析法、疏水柱、分子筛等进行纯化，最后利用SDS-PAGE鉴定重组蛋白peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D的分子量为41KDa，结果见图2。
实施例3本发明采用正交试验设计对试剂盒反应条件的优化
根据抗原peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D包被浓度(50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL四个包被浓度)、各反应时间(30min、45min)和温度(25℃、35℃)、酶标二抗最佳稀释度(1：100、1：500、1：1000、1：1500四个稀释度)等4个因素选择正交表，每个因素按2水平重复测定标准阳性血清和标准阴性血清。选择阳性血清的最高发光值(P)和阴性血清的最低发光值(N)的比值(P/N)。重复测定的平均P/N值，经统计处理确定最佳包被条件及二抗的最佳稀释度进行正交优化条件，显著提高了标准阳性血清的阳性检出率。通过正交设计我们得到了本试剂盒最佳抗原包被浓度为100μg/mL、最佳抗原抗体反应温度为25℃、最佳抗原抗体反应时间45分钟及最佳标记抗人IgG抗体最佳工作稀释度为1：500。
实施例4用于检测抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体的固相膜免疫试剂盒的制备
4.1用于检测抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG的固相膜免疫试剂盒的组成：
1、包被peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白的硝酸纤维素膜，
2、标准品：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)，
3、抗体稀释液，
4、抗原稀释液，
5、辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，
6、洗涤液，
7、TMB显色剂，
8、终止液。
4.2检测步骤如下：
4.2.1包被、封闭：抗原用pH7.4的0.01M PBS稀释取10微升点在硝酸纤维素膜上，放置于37℃温箱，30分钟，将硝酸纤维素膜置于板槽中，加入150微升3％BSA放于37℃温盒中封闭15分钟，吸去封闭液后，用洗涤液洗膜2次。
4.2.2血清温育(第一次温育)：取100微升经抗原释液稀释的标准品与被检测血清标本加样于反应槽内，同时做阴性对照与阳性对照，加样器管嘴勿碰触膜表面，注意每加一份血清更换一个管嘴。将加完样品的反应槽置于摇床上，室温(20-25℃)孵育45分钟。
4.2.3清洗(第一次清洗)：倾倒掉反应槽内的液体，用稀释好的洗涤液冲洗约10秒钟；冲洗时，使洗涤液充分的流过反应槽。重复清洗5次，倾倒液体及冲洗时注意让液体顺着反应槽流下，避免交叉污染。清洗完后将反应槽甩干。
4.2.4二抗工作液温育(第二次温育)：用抗体稀释液稀释辣根过氧化物酶标记的抗人IgG抗体，经然后在反应槽内加入6滴(300微升)二抗工作液，置于摇床上室温(20-25℃)孵育45分钟。
4.2.5清洗(第二次清洗)：过程同步骤3。
4.2.6.显色温育(第三次温育)：在试剂条内加入6滴(300微升)显色溶液，置于摇床上室温(20-25℃)孵育20分钟。
4.2.7.终止反应：流水冲洗反应槽，终止反应。
4.2.8.判读结果：取出测试条用电吹风吹干(约5分钟)或置于37℃-50℃烘箱内烘干20分钟以上。进行肉眼定性判定，出现明显棕色斑点者为阳性，(见图3)或将膜条置于显影仪上扫描，显影仪自带的分析软件以参考标准品浓度作为纵坐标、仪器读取的灰度值作为横坐标，绘制标准曲线对血清中抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG水平进行半定量分析。
实施例5用于检测抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体的化学发光免疫试剂盒的制备
5.1用于检测抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG的化学发光免疫试剂盒的组成：
1、包被peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D抗原蛋白的磁微粒溶液，
2、标准品：人抗His标签免疫球蛋白G(购自湖州英创)，
3、样本稀释液，
4、吖啶酯标记抗人IgG溶液，
5、质控品，
6、预激发液，
7、激发液，
8、洗涤液。
5.2检测原理：本试剂盒采用间接法，对人血清中抗peptidyl-prolyl cis-transisomerase D-IgG抗体检测，整个过程包含两步反应：第一步，将磁珠液与稀释样本混合，特异性抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体结合到磁珠上，洗涤去除残留液。第二步，加入吖啶酯标记抗人IgG抗体，形成磁珠-抗原-抗peptidyl-prolyl cis-transisomerase D-IgG抗体-吖啶酯抗体复合物，洗涤去除残留液后，加入预激发液(H2O2)和激发液(NaOH)进行发光反应，记录发光值，抗体浓度与发光值成正比，通过校准曲线计算浓度测值(见图4)。
5.3本试剂盒固相载体为含羧基官能团的磁微粒。
5.4本试剂盒抗原包被方式是羧基磁微粒经过EDC/Sulfo-NHS活化，与抗原(氨基残基)共价结合，形成磁微粒溶液。包被步骤为：
a)400微升0.05M磷酸盐缓冲液中加入40微升磁珠原液，混匀8分钟后磁铁分离，弃去上清；
b)取200微升2％葡聚糖溶液，加入200微升10mg/mL高碘酸钠发生反应；
c)反应结束后加磷酸盐缓冲液配制的10mg/mL EDC溶液与10mg/mLSulfo-NHS溶液，混匀60分钟；
d)磁铁分离，弃去上清，取400微升0.05M磷酸盐缓冲液洗涤磁珠后加入400微升封保液定容保存。
将上述活化后的磁珠弃上清，加入预冷的1ml 20mM MES继续清洗磁珠2次；取200μL 2mg/mL的抗原蛋白peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D加入到活化好的磁珠中，充分混匀，室温静置反应16小时；反应结束后，加入含有0.2％Tween20的pH 7.4PBS缓冲液，重复清洗磁珠2次；然后再加入含有0.2％Tween20、0.2％BSA的的pH 7.4PBS缓冲液，至磁珠终浓度为10mg/mL，充分混匀，室温静置反应30min；反应结束后，弃上清，并用含有0.2％Tween20、0.2％BSA的的pH 7.4PBS缓冲液重悬磁珠，活化磁珠与抗原蛋白peptidyl-prolylcis-trans isomerase D交联完成(见图5)。
5.5吖啶酯标记抗人IgG溶液，步骤为：
a)利用二甲基甲酰胺配制2mg/mL吖啶酯溶液；
b)利用0.2M(PH8.0)碳酸盐缓冲液配制1mg/mL抗人IgG抗体；
c)取摩尔比为4:1的吖啶酯与抗人IgG抗体混匀搅拌，反应40分钟；
d)加入20微升含有5％赖氨酸的碳酸盐缓冲液30分钟终止反应；
e)通过脱盐除杂，得到吖啶酯标记抗人IgG溶液。
5.6检测步骤如下：
5.6.1将样本按一定比例稀释；
5.6.2取稀释后的样本，加入磁微粒液，和样本稀释液，37℃反应12min；
5.6.3洗涤液洗涤3次；
5.6.4加入吖啶酯标记抗人IgG溶液，37℃反应12min；
5.6.5洗涤液洗涤3次；
5.6.6加预激发液(H2O2)、激发液(NaOH)进行反应，收集发光测值；
5.6.7通过校准曲线计算浓度测值。
实施例6各类肾病患者中抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体的检测情况
6.1受试者纳入从2018年6月到2020年6月诊断为自身免疫性肾病综合征的患者，健康对照组选自同时期就诊的健康体检者。血清样本取自肾病综合征患者和健康对照组。所有受试者在没有进行免疫抑制治疗之前进行第一次血清样本采集。
6.2不同肾病病人血清抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体的检测情况利用本发明试剂盒检测从2018年6月到2020年6月诊断出各类肾病的患者血清中抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体水平，包括466例肾病综合征、168例过敏性紫癜、137例紫癜性肾炎、133例IgA肾病及同时期195例健康儿童，结果显示部分自身免疫性肾病综合征病人中抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体阳性，而紫癜性肾炎、过敏性紫癜、IgA肾病病人以及健康儿童中抗peptidyl-prolyl cis-transisomerase D-IgG抗体为阴性(见图6)。
实施例7ROC曲线评估抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体作为一种血清学标志物用于检出自身免疫性肾病综合征患者的价值对实施例6的6.2中的肾病综合征患者中抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体的检测结果采用ROC曲线进行分析，以判断该抗体检出自身免疫性肾病综合征的价值。结果显示抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体作为一种血清标志物对自身免疫性肾病综合征患者的检出具有很好的价值，当诊断界值定为大于41.1时，其诊断的敏感性为63.6％，特异性为68.1％，曲线下面积为0.701(见图7)。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江大学
<120> 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒
<130> 2022.5.10
<160> 1
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 334
<212> PRT
<213> 人工序列（Unknow）
<400> 1
Phe Ala Asp Ile Val Pro Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala Leu Cys
1 5 10 15
Thr Gly Glu Lys Gly Ile Gly His Thr Thr Gly Lys Pro Leu His Phe
20 25 30
Lys Gly Cys Pro Phe His Arg Ile Ile Lys Lys Phe Met Ile Gln Gly
35 40 45
Gly Asp Phe Ser Asn Gln Asn Gly Thr Gly Gly Glu Ser Ile Tyr Gly
50 55 60
Glu Lys Phe Glu Asp Glu Asn Phe His Tyr Lys His Asp Arg Glu Gly
65 70 75 80
Leu Leu Ser Met Ala Asn Ala Gly Arg Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe
85 90 95
Phe Ile Thr Thr Val Pro Thr Pro His Leu Asp Gly Lys His Val Val
100 105 110
Phe Gly Gln Val Ile Lys Gly Ile Gly Val Ala Arg Ile Leu Glu Asn
115 120 125
Val Glu Val Lys Gly Glu Lys Pro Ala Lys Leu Cys Val Ile Ala Glu
130 135 140
Cys Gly Glu Leu Lys Glu Gly Asp Asp Gly Gly Ile Phe Pro Lys Asp
145 150 155 160
Gly Ser Gly Asp Ser His Pro Asp Phe Pro Glu Asp Ala Asp Ile Asp
165 170 175
Leu Lys Asp Val Asp Lys Ile Leu Leu Ile Thr Glu Asp Leu Lys Asn
180 185 190
Ile Gly Asn Thr Phe Phe Lys Ser Gln Asn Trp Glu Met Ala Ile Lys
195 200 205
Lys Tyr Ala Glu Val Leu Arg Tyr Val Asp Ser Ser Lys Ala Val Ile
210 215 220
Glu Thr Ala Asp Arg Ala Lys Leu Gln Pro Ile Ala Leu Ser Cys Val
225 230 235 240
Leu Asn Ile Gly Ala Cys Lys Leu Lys Met Ser Asn Trp Gln Gly Ala
245 250 255
Ile Asp Ser Cys Leu Glu Ala Leu Glu Leu Asp Pro Ser Asn Thr Lys
260 265 270
Ala Leu Tyr Arg Arg Ala Gln Gly Trp Gln Gly Leu Lys Glu Tyr Asp
275 280 285
Gln Ala Leu Ala Asp Leu Lys Lys Ala Gln Gly Ile Ala Pro Glu Asp
290 295 300
Lys Ala Ile Gln Ala Glu Leu Leu Lys Val Lys Gln Lys Ile Lys Ala
305 310 315 320
Gln Lys Asp Lys Glu Lys Ala Val Tyr Ala Lys Met Phe Ala
325 330

Claims (9)

1.能够与从所述患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物的肽基脯氨酰基顺反异构酶D(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D)多肽或其抗体结合片段在制备肾病综合征检测试剂或试剂盒方面的用途；其中，所述抗原抗体复合物包括抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体(抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体)复合物。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述肾病综合征是自身免疫性肾病综合征。
3.根据权利要求2所述的用途，其中所述肾病综合征是儿童自身免疫性肾病综合征。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述肽基脯氨酰基顺反异构酶D(peptidyl-prolylcis-trans isomerase D)抗体结合片段序列如SEQ ID NO.1所示。
5.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品是血清。
6.根据权利要求1所述的用途，其中所述生物样品是没有进行免疫治疗之前患者的生物样品。
7.能够与从所述患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物的肽基脯氨酰基顺反异构酶D(peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D)多肽或抗体结合片段在制备用于相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、IgA肾病特异性检测肾病综合征的试剂或试剂盒方面的用途；其中，所述抗原抗体复合物包括抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体(抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体)复合物。
8.一种用于诊断肾病综合征或者相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、IgA肾病特异性检测肾病综合征的试剂，包括：肽基脯氨酰基顺反异构酶D(peptidyl-prolyl cis-transisomerase D)多肽或其抗体结合片段，其能够与从所述患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物；其中，所述抗原抗体复合物包括抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体(抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体)复合物。
9.一种用于诊断肾病综合征或者相对于紫癜性肾炎、过敏性紫癜、IgA肾病特异性检测肾病综合征的试剂盒，包括：肽基脯氨酰基顺反异构酶D(peptidyl-prolyl cis-transisomerase D)多肽或其抗体结合片段，其能够与从所述患者获得的生物样品接触形成任何抗原抗体复合物；其中，所述抗原抗体复合物包括抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体(抗peptidyl-prolyl cis-trans isomerase D-IgG抗体)复合物。
CN202210535427.6A 2021-07-01 2021-07-01 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒 Pending CN115616211A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202210535427.6A CN115616211A (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110743527.3A CN113447650B (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒
CN202210535427.6A CN115616211A (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110743527.3A Division CN113447650B (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN115616211A true CN115616211A (zh) 2023-01-17

Family

ID=77814618

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210535427.6A Pending CN115616211A (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒
CN202110743527.3A Active CN113447650B (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110743527.3A Active CN113447650B (zh) 2021-07-01 2021-07-01 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒

Country Status (1)

Country Link
CN (2) CN115616211A (zh)

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1393557A (zh) * 2001-06-29 2003-01-29 上海博德基因开发有限公司 一种多肽——人含肽基脯氨酸顺反异构酶特征性序列片段的蛋白－14.08和编码这种多肽的多核苷酸
WO2012155098A1 (en) * 2011-05-12 2012-11-15 Novarx Corporation Predictors of response to immunotherapy
KR101471272B1 (ko) * 2013-01-29 2014-12-11 인제대학교 산학협력단 ＣｙｐＤ를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트
EP2977758A1 (en) * 2014-07-24 2016-01-27 Université De Nice Sophia Antipolis Methods and kits for monitoring membranous nephropathy
CN105988011A (zh) * 2016-03-31 2016-10-05 刘以鹏 一种特发性膜性肾病elisa检测试剂盒及其检测方法
CN109182322A (zh) * 2018-10-25 2019-01-11 天津市湖滨盘古基因科学发展有限公司 一种人的肽基脯氨酰基顺反异构酶突变蛋白及其应用
CN110358829A (zh) * 2019-07-09 2019-10-22 江苏医药职业学院 检测重组人肽基脯氨酰顺反异构酶-h表达水平的试剂的应用和试剂盒
CN110850100B (zh) * 2019-11-25 2020-10-30 浙江大学 一种检测血清抗Annexin A2-IgG抗体的试剂盒

Also Published As

Publication number Publication date
CN113447650A (zh) 2021-09-28
CN113447650B (zh) 2022-05-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113447659B (zh) 一种检测抗蛋白酶体亚基α1-IgG抗体的试剂盒
KR102549704B1 (ko) Pivka-ii의 측정 방법, 및 pivka-ii 면역측정 시약 또는 키트의 제조 방법
CN113447658B (zh) 一种检测抗过氧化物还原酶-1-IgG抗体的试剂盒
CN113447649B (zh) 一种检测抗粘着斑蛋白-IgG抗体的试剂盒
CN113588942B (zh) 一种检测抗原肌球蛋白1-IgG抗体的试剂盒
EP1328811A2 (en) Hcv mosaic antigen composition
AU2010219698A1 (en) Method for detecting substance in biological sample
CN110178031A (zh) 寨卡病毒感染的血清学测定
CN114910647A (zh) 细丝蛋白-A-IgG抗体在制备检测血管内皮损伤试剂盒中的应用
CN113447650B (zh) 一种抗肽基脯氨酰基顺反异构酶D-IgG抗体的检测试剂盒
CN114924081A (zh) 神经母细胞分化相关蛋白-IgG在制备血管内皮损伤试剂盒中的应用
CN114910650A (zh) 检测抗膜突蛋白-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
JP2000515854A (ja) 脳タンパク質ｓ―１００の存在の測定方法
CN114910649A (zh) 检测抗α-烯醇化酶-IgG抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN114895023A (zh) 检测抗Talin-1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN114966045A (zh) 检测抗肌球蛋白轻链1-IgG自身抗体的试剂在制备检测血管内皮损伤的试剂盒中的应用
CN113447656B (zh) 检测抗丝状肌动蛋白成帽蛋白β-IgG抗体的试剂盒
CN114994308A (zh) 一种检测抗Desmoglein 1-IgG抗体的试剂盒
CN113447657B (zh) 一种检测抗乌头酸水合酶-IgG抗体的检测试剂盒
CN113466451B (zh) 一种检测抗Prelamin A/C-IgG抗体的试剂盒
CN114994330A (zh) 检测抗HSP 90-beta-IgG自身抗体的试剂盒及其应用
CA3088342A1 (en) Renal cancer detection method and test drug
CN113447648B (zh) 检测抗富含丝氨酸/精氨酸剪接因子9-IgG抗体的试剂盒
CN108948173B (zh) 一种瓜氨酸修饰肽及其应用
CN114910643B (zh) 一种鉴别结合突变型抗原的抗体的方法及试剂

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination