KR101471272B1

KR101471272B1 - ＣｙｐＤ를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트

Info

Publication number: KR101471272B1
Application number: KR1020130009864A
Authority: KR
Inventors: 송인성; 김형규; 정승훈; 이성률; 김나리; 한진
Original assignee: 인제대학교 산학협력단
Priority date: 2013-01-29
Filing date: 2013-01-29
Publication date: 2014-12-11
Also published as: KR20140097711A

Abstract

본 발명은 CypD(Cyclophilin D)를 포함하는 다발성 골수종 치료제로 사용되는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것으로서, CypD(Cyclophilin D) 유전자, 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하며, 상기 조성물을 포함하는 보르테조밉 내성 진단 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 다발성 골수종 환자 시료로부터 CypD(Cyclophilin D) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하여 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는 보르테조밉 내성 진단 방법을 제공한다.

Description

ＣｙｐＤ를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트{Biomarker composition for diagnosis of bortezomib resistance comprising Cyclophilin D and diagnostic kit using the same}

본 발명은 CypD(Cyclophilin D)를 포함하는 다발성 골수종 치료제로 사용되는 보르테조밉(bortezomib; 상품명 벨케이드(velcade)) 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것이다.

다발성 골수종은 백혈병, 림프종과 함께 대표적인 혈액종양으로 B림프구의 성숙형태인 형질세포가 증식하는 혈액암이다. 평균 65세 이상의 고령에서 발병하며, 비교적 동양인에서는 낮은 발병율을 보이며, 1980년대 우리나라 발병율은 연간 100명 이내로 매우 낮았다. 하지만, 급속한 산업화에 따른 공해, 환경호르몬에 노출증가, 고령화로 인해 다발성 골수종 환자는 지속적으로 증가하고 있다. 지난 20년간 다른 암종의 발생률은 5배의 증가에 머물렀으나, 다발성 골수종의 경우, 약 30배 이상의 발생증가를 보이고 있다.

이러한 다발성 골수종의 치료는 멜팔란과 프레드니존을 이용한 표준화학요법 (MP요법), 65세 이하의 환자에 적용되는 고용량 화학요법 및 조혈모세포 이식요법, 기존치료에 반응하지 않는 불응암이나 재발된 골수종에 대한 표적치료가 있다. 그러나 현재 사용되는 약물들에 내성암 및 불응암이 발생하여 다발성 골수종으로 인한 사망률이 매우 높다. 특히 최근 2차 약제로 FDA 승인을 얻은 표적치료제인 보르테조밉(bortezomib; 상품명 벨케이드(velcade))가 치료불응암 및 재발암에 효과가 높은 것으로 보고되었으나, 전체 반응율은 35%, 완전 관해율은 10%로 미미한 실정이며 이미 이 약물의 내성암이 보고되고 있다. 따라서 이러한 다발성 골수종의 치료불응이나 재발암을 효과적으로 치료하여 다발성 골수종환자의 생존율을 획기적으로 증가시킬 수 있는 치료요법의 개발이 시급하다. 한편, 미토콘드리아는 세포사멸에 중요한 인자로 작용하는 것으로 알려져 있음에도 불구하고 보르테조밉 내성과 관련된 연구는 거의 없는 실정이다.

한편, 한국특허출원 제10-2007-7008837호(출원일 2007.04.18)는 보르테조밉 및 표피 성장 인자 수용체 키나아제 억제제로의 병용 치료에 관한 것으로서, 다른 항암 약물 또는 방사선요법과 같은 추가 제제 또는 치료법과 함께 또는 없이, 치료적 유효량의 EGFR 키나아제 억제제 및 보르테조밉이 사용되는 것을 특징으로 하는 환자의 종양 또는 종양 전이 치료를 위해 의도된 약제의 제조방법을 제공한다고 개시하고 있으나, 본 발명의 CypD를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물에 대한 언급은 없다.

따라서, 본 발명자들은 보르테조밉의 내성세포주와 민감성 세포주를 구분하여 미토콘드리아 유전자의 발현을 확인하고, 동정된 유전자들의 발현과 보르테조밉에 의한 세포사멸과의 상관관계 증명을 통해 보르테조밉 약효 예측 인자로 정하였으며, 다발성 골수종 세포주들의 보르테조밉 민감성을 조사하여 이중 KMS20세포주는 내성을, KMS28BM 세포주는 민감한 반응을 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 CypD(Cyclophilin D) 유전자, 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 포함하는 보르테조밉 내성 진단 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 다발성 골수종 환자 시료로부터 CypD(Cyclophilin D) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하여 정상 대조구 시료와 비교하는 단계를 포함하는 보르테조밉 내성 진단 방법을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CypD(Cyclophilin D) 유전자, 또는 상기 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단용 바이오 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는 보르테조밉 내성 진단 키트를 제공한다. 상세하게는 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 한다.

본 발명에서 "보르테조밉(bortezomib)"은 다발성 골수종 치료제로 사용되고 있으며, 상품명은 벨케이드(velcade)이다.

본 발명에서 용어, "진단" 은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 본 발명의 목적상, 진단은 다발성 골수종 치료제인 보르테조밉에 대한 내성 여부를 확인하는 것이다.

본 발명에서 용어, "진단 마커, 진단용 마커 또는 진단용 바이오 마커" 란 보르테조밉 내성 세포를 정상세포(감수성 세포)와 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포(감수성 세포)에 비하여 내성 세포에서 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산 (예: mRNA 등), 지질, 당지질, 당단백질 또는 당 (단당류, 이당류, 올리고당류 등) 등과 같은 유기 생체 분자들을 포함한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커는 정상 세포에 비하여, 내성 세포에서 특이적으로 낮은 수준의 발현을 보이는 CypD(Cyclophilin D) 유전자이다.

CypD(Cyclophilin D)는 펩티틸프롤린 이성화효소 F(peptidylprolyl isomerase F)를 인코딩하는 유전자로서, 미토콘드리아 막 투과 전이 포어(mitochondrial membrane permeabilization transition pore)를 형성하는 단백질의 하나이다. CypD 유전자 및 단백질 정보는 NCBI (National Center for Biotechnology Information) 에 등록되어 있다 (GeneID: 45439321, NM_005729.3). 본 발명에서는 CypD의 유전자 및 아미노산 서열을 각각 서열번호 1과 서열번호 2에 나타내었다.

또한, 본 발명은 다발성 골수종 환자 시료로부터 CypD(Cyclophilin D) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계; 상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계; 및 상기 환자 시료의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료보다 낮을 경우 보르테조밉에 내성이 있다고 판단하는 단계를 포함하는 보르테조밉 내성 진단 방법을 제공한다.

상세하게는, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩 등이 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인한다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS, 단백질 칩(protein chip) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 용어 “환자 시료”란 보르테조밉 내성 바이오 마커 유전자인 CypD의 발현 수준이 차이 나는 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 CypD(Cyclophilin D)를 포함하는 다발성 골수종 치료제로 사용되는 보르테조밉 내성 진단용 바이오 마커 조성물 및 이를 이용한 진단 키트에 관한 것으로서, 다발성 골수종 환자에 대한 보르테조밉 사용의 적합성을 미토콘드리아 유전자의 발현을 통해 환자에게 투약 전 예측하여 보르테조밉 내성과 불응성의 가능성을 극복할 수 있는 약제 등을 동시에 처리함으로써 치료효과를 높이고 환자의 부담을 줄여 다발성 골수종 환자의 생존률을 높이고자 하였다.

도 1은 다발성 골수종 세포에 따른 보르테조밉의 세포사멸 효과를 확인한 결과이다. a, 보르테조밉을 농도별로 처리한 후의 FACS 결과 및 정량 그래프; b, 50nM 보르테조밉 처리 후 시간별로 FACS 분석한 결과; c, 농도별로 보르테조밉 처리 48시간 후 자가세포사멸된 세포의 수 측정 결과.
도 2는 다발성 골수종의 보르테조밉에 의한 세포 사멸 감수성 차이를 웨스턴 블랏 분석을 통해 확인한 결과이다.
도 3은 다발성 골수종 세포에 따른 미토콘드리아 기능 차이를 확인한 결과이다.
도 4는 마이크로어레이를 통해 얻어진 결과로부터 후보 유전자를 확보하고, 이들 유전자에 대한 발현 양상을 실시간 RT-PCR을 통해 확인한 결과이다(A). 특히 내성 세포주와 감수성 세포주 간의 발현 차이를 보이는 CypD(Cyclophilin D)를 선별하여 발현 변화를 비교한 결과이다(B).
도 5는 CypD 발현 억제(knockdown)에 따른 보르테조밉 효과를 확인한 결과이다.

이하, 하기 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 다만, 이러한 실시예에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 다발성 골수종 세포에 따른 보르테조밉의 세포사멸 효과 확인

1. 세포 배양

다발성 골수종 세포주 KMS20과 KMS28BM 세포주는 보르테조밉에 대한 반응 및 미토콘드리아 기능 관련 유전자, CypD의 특이적 발현을 확인하고, 상기 유전자의 기능을 확인하기 위해 배양하였다. KMS20과 KMS28BM 세포주는 일본 Kawasaki medical school에서 다발성 골수종 환자로부터 확립된 세포주로 이들로부터 분양받아 본 실험을 위해 사용하였다. KMS20과 KMS28BM 세포들은 RPMI1640 (Lonza, USA)에서 배양되었으며, 상기 세포주들은 10% 우태아 혈청, 100 mg/ml 스트렙토마이신, 그리고 100 IU/ml 엠피실린이 포함된 배지에서 배양되었다.

2. FACS 분석

다발성 골수종 세포주 KMS20과 KMS28BM에서 보르테조밉 처리에 의한 세포사멸을 분석하기 위하여 Annexin V-FITC/PI 염색법을 이용하여 사멸세포를 염색한 후 이를 FACScanto (BD)를 이용하여 분석하였다. Annexin V-FITC는 자가세포사멸시 일어나는 현상으로 세포막에 존재하는 포스파티딜세린(phosphatidylserine)이 세포사멸시 방향이 세포 바깥쪽으로 역전되는 것을 인식하여 세포를 염색시키며, 프로피디움 이오디드(propidium iodide; PI)는 그 자체로는 세포 안으로 들어가지 못하나 세포사멸시 세포막이 붕괴되면 세포 내로 들어가 염색체를 염색시킨다. 따라서 자가세포사멸 (apoptosis)은 Annexin V-FITC에 의해 세포괴사 (necrosis)는 PI에 의해 검출된다. 각 세포들을 처리 시간에 따라 혹은 보르테조밉 농도에 따라 배양한 후 원심분리기를 통해 세포를 모은 후, Annexin V-FITC/PI 시약을 사용하여 염색하여 FACS 분석기를 이용하여 세포사멸을 측정하였다.

3. 결과

보르테조밉에 대한 내성과 미토콘드리아와의 상관관계분석을 위해 먼저 보르테조밉에 내성을 갖는 세포주와 감수성이 높은 세포주로 구분하여 실험을 수행하기 위해서 보르테조밉을 시간과 농도별로 처리하였다. 보르테조밉을 농도별로 처리하고 48시간 동안 배양한 후, 세포사멸 정도를 Annexin V-FITC/PI 염색시약으로 염색하고 이를 FACScanto (BD)를 사용하여 분석하였다(도 1a). FACS분석결과, KMS28BM 세포주는 처리 농도에 따라 세포사멸이 증가한 반면, KMS20세포주는 50nmole/l에서도 거의 세포사멸이 일어나지 않는 것을 확인할 수 있었다. 50nmole/l 농도의 보르테조밉을 시간별로 처리한 후 Annexin V-FITC/PI 염색시약으로 염색하고 이를 FACScanto (BD)를 사용하여 분석한 결과, KMS28BM 세포주는 처리 시간에 따라 세포사멸이 증가한 반면, KMS20세포주는 72시간 후에도 거의 세포사멸이 일어나지 않았다(도 1b).

한편, 보르테조밉을 농도별로 48시간 처리한 후 세포사멸을 PI 염색 후 DNA 농도를 측정하여 자가세포사멸된 세포의 수를 측정한 결과, 세포사멸이 KMS28BM에서만 증가되었으며, KMS20세포주는 내성을 나타내었다(도 1c).

< 실시예 2> 다발성 골수종의 보르테조밉에 의한 세포사멸 감수성 차이 확인

1. 웨스턴 블랏 분석

보르테조밉에 의한 세포사멸이 자가세포사멸임을 확인하기 위하여 자가세포사멸의 특징인 카스파아제 절단 여부를 웨스턴 블랏법을 사용하여 확인하였다. 보르테조밉을 처리하여 배양된 세포들을 모아 세포에 용해 완충용액 A(lysis buffer A)[20mM HEPES(pH7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 2mM EGTA, 1% 트립톤(Triton) X-100, 10% 글리세롤(glycerol), 프로테아제 칵테일(protease cocktail) I, II(Sigma, USA)]를 첨가한 후 4℃에서 20분간 방치하였다. 세포 용해물(cell lysate)을 새 튜브(tube)에 옮긴 후, 4℃, 15000 rpm, 10분간 원심분리하여 단백질을 얻는다. 상기 세포 용해물을 5X 시료 완충용액(sample buffer)을 첨가하여 95℃에서 10분간 끊여 겔 적재 시료(gel loading sample)로 만들어 SDS PAGE 겔(gel)에 전기영동하였다. 상기 전기영동으로 분자량에 따라 분리된 단백질 밴드(band)들은 니트로셀룰로오즈 막(nitrocellulose membrane)으로 transfer kit(biorad, USA)을 사용하여 이동(transfer)시킨 후, 5% 탈지유(skim milk)로 1시간 동안 블라킹(blocking)시켰다. 그리고 도 2에 표시된 항체를 처리하여 각각의 단백질을 검출하였다.

또한, 미토콘드리아의 세포사멸 관련성을 확인하기 위하여 세포질분획법을 이용하여 세포질 단백질과 미토콘드리아 단백질을 분획한 후 미토콘드리아 단백질인 사이토크롬 c(cytochrome c)의 세포질내로의 방출 여부를 확인하였다. 이는 미토콘드리아가 세포사멸에 관여함을 의미하는 것이다.

2. 결과

보르테조밉에 의한 세포사멸이 자가세포사멸에 의한 것이고, 미토콘드리아를 경유한 세포사멸이라는 것을 웨스턴 블랏을 통해 확인하였다(도 2). 도 2A는 자가세포사멸임을 나타내는 카스파아제 절단(caspase cleavage)를 웨스턴 블랏으로 확인한 것으로 KMS28BM 세포주는 50nM에서 절단되는 반면 KMS20 세포주는 75nM에서 일부분이 절단되는 것을 확인하였다. 이는 KMS20이 KMS28BM에 비해 보르테조밉에 대해 내성을 갖는다는 것을 나타내는 결과이다. 또한, 이러한 보르테조밉에 의한 자가세포사멸이 미토콘드리아 분획을 통해 미토콘드리아 단백질인 사이토크롬 c(cytochrome c)가 세포질로 방출되는 미토콘드리아 매개 세포사멸임을 도 2b를 통해 확인 하였다.

< 실시예 3> 다발성 골수종 세포에 따른 미토콘드리아 기능 차이 검증

1. 유세포 분석

다발성 골수종 세포에 따른 미토콘드리아 기능 차이를 검증하기 위하여, 유세포분석기를 이용하여 미토콘드리아 기능에 영향을 미치는 중요 인자를 확인하였다. 이러한 인자로는 세포질 활성산소종, 미토콘드리아 산소종, 미토콘드리아 칼슘, 그리고 미토콘드리아 막전압 등이 있다. 유세포분석은 이러한 인자를 확인하기 위하여 사용되는 염색시약에 염색된 세포들을 염색 정도에 따라 세포를 구분하여 세포내 인자들의 양을 검출하는 방법이다. 보르테조밉 등과 함께 배양된 세포들은 각각의 염색시약으로 염색된 후 유세포분석기 사용법에 따라 분석되었다.

2. 공초점 형광현미경( confocal microscopy ) 분석

공초점 형광현미경은 각각의 인자를 검출할 수 있는 염색시약에 염색된 세포를 현미경으로 염색 정도를 확인하는 것으로 평면적인 세포 모양 뿐만 아니라 세포를 Z-section (일정한 두께로 이미지를 절단) 하여 3차원적 이미지와 염색된 인자의 정확한 위치를 구분할 수 있는 실험 기법이다. 배양된 세포를 염색시약으로 염색한 후 공초점 형광현미경을 사용하여 이미지를 분석하였다. 도3b에서는 미토콘드리아 칼슘 특이적 염색시약인 Rhod-2AM과 미토콘드리아 마커인 Mito-tracker를 사용하여 염색한 후 공초점 형광현미경으로 이미지를 분석한 것으로 미토콘드리아 특이적 칼슘임을 검증한 실험이었다.

3. 미토콘드리아 내막 전압 및 칼슘 수치 분석

미토콘드리아 내막전압은 특이적인 형광염색시약인 TMRE (tetramethylrhodamine, ethyl ester, percholrate)를 사용하여 세포를 염색한 후, 유세포분석기 또는 공초점 현광현미경을 사용하여 측정하였다. 다발성 골수종 세포는 200nM TMRE에 20분간 37℃에서 염색된 후, 유세포분석기 또는 공초점현광현미경을 사용하여 측정되었다. 또한 미토콘드리아 칼슘 수치는 미토콘드리아 칼슘 특이적 염색시약인 Rhod-2AM을 사용하여 측정되었다. 다발성 골수종 세포는 5uM Rhod-2AM을 4℃에서 120분간 처리한 후 37℃에서 30분간 더 방치한 후 공초점 형광현미경 또는 유세포분석기를 사용하여 측정되었다.

4. 결과

다발성 골수종세포의 미토콘드리아 기능을 확인하기 위해서 미토콘드리아 내막 전압과 칼슘수치를 염색시약을 이용하여 측정하였다. 미토콘드리아 내막전압은 미토콘드리아의 ATP 생성을 위해 적절히 유지되어야 하고, 탈분극에 의해 내막전압이 감소하는 현상은 세포사멸의 특징 중 하나이다. 또한 미토콘드리아 내 칼슘의 증가는 막 투과 전이(membrane permeabilization transition; MPT)를 일으키는 원인중 하나인데, 세포 사멸은 MPT를 통해 일어나는 것으로 알려져 있다.

미토콘드리아 칼슘 수치를 Rhod2AM 염색시약을 사용하여 염색한 후, 유세포분석 장비를 이용하여 분석하였다. 그 결과, 자극이 없는 상태의 미토콘드리아 칼슘 수치는 내성세포주인 KMS20 세포가 현저히 높았으며, 보르테조밉 자극에 의한 칼슘 수치는 KMS28BM이 2배 정도 높게 증가하였다(도 3a).

도 3a에서 측정된 칼슘이 미토콘드리아 내에 칼슘인지를 확인하기 위하여 미토콘드리아 마커인 MitoTracker와 Rhod2AM 칼슘 염색 시약을 동시에 염색한 후, 공초점 형광현미경(confocal microscopy)을 사용하여 확인하였다. Merge 결과에서 보이듯이 미토콘드리아 마커와 칼슘이 같은 위치에서 염색되어 주황색으로 나타냄으로써 측정된 칼슘이 미토콘드리아 칼슘이라는 것이 확인되었다(도 3b).

보르테조밉 내성 세포주인 KMS20과 세포사멸 효과가 높은 KMS28BM 세포의 미토콘드리아 내막 전압을 TMRE 염색시약을 사용하여 염색한 후, FACS 분석을 통해 확인하였다. 그 결과, 자극 전 KMS20 내성 세포주의 내막전압이 현저히 높았으며, 보르테조밉 자극에 의한 탈분극화는 KMS28BM 세포주에서 현저히 증가 되는 것을 확인하였다(도 3c).

이를 통해 다발성 골수종 세포에 따라 미토콘드리아 칼슘 및 내막전압 등이 세포사멸과 관련되어 있다는 것을 확인하였다. 또한 다발성 골수종 세포에 따라 자극에 관계없이 기본적인 미토콘드리아 기능이 차이가 있고, 특히, 내막전압이 증가 되어 있어 세포사멸 자극에 의한 탈분극에 대한 수용능력(capacity)이 높아 세포가 살아남을 수 있는 여지를 제공하는 것으로 사료된다. 이는 많은 연구에서 제기한 것으로서, 즉 암의 악성화가 진행될수록 내막전압이 높게 유지되는 것과 동일한 현상으로 보르테조밉 내성 역시 이러한 관점으로 풀이될 수 있다.

< 실시예 4> 다발성 골수종 환자의 미토콘드리아 관련 유전자 발현 조사

1. 마이크로어레이 ( microarray ) 분석

다발성 골수종환자의 미토콘드리아 기능 분석을 위하여 다발성 골수종 환자로부터 다발성 골수종 세포를 분리하였으며, 이를 이용하여 RNA를 추출하여 이를 이용하여 마이크로 어레이 실험을 수행하였다. 다발성 골수종 환자 4명으로부터 세포를 각각 분리하였으며, 마이크로어레이 역시 4 그룹으로 나뉘어 실시하였다. 얻어진 결과는 미토콘드리아 특이적인 유전자 군으로 구분하여 분석하여 정리하였다.

2. 결과

미토콘드리아 기능 변화의 원인 유전자를 동정하고, 이의 조절이 세포사멸에 영향을 미치는 지를 확인하기 위해서 먼저 다발성 골수종 환자로부터 획득된 다발성 골수종세포의 마이크로어레이를 통해 미토콘드리아 관련 유전자 발현을 확인하였다.

그 결과, 표 1에서 나타낸 바와 같이 환자에 따라 상이한 발현 패턴을 보이는 것을 알 수 있었다. 세포 생존과 관련된 유전자들 역시 다른 패턴으로 나타났다. CypD(Cyclophilin D) 발현은 2번 환자가 매우 낮게 발현되고, 3번 환자가 매우 높게 발현되었다. 이를 통해 2번 환자의 항암치료 예후가 3번에 비해 매우 좋지 않을 것으로 예상된다. 이는 CypD(Cyclophilin D)는 미토콘드리아 막 투과 전이 포어(mitochondrial membrane permeabilization transition pore)를 형성하는 단백질의 하나로서, CypD가 없을 경우 MPT가 일어나지 않아 세포사멸이 감소 되기 때문이다. 따라서 환자들의 유전자 발현 패턴을 정리하여 이들에 따라 필요한 항암제를 선택적으로 사용하는 것이 바람직할 것으로 판단된다.

< 표 1 >

< 실시예 5> 미토콘드리아 유전자 동정

1. 실시간 RT - PCR 분석

상업적으로 판매되는 시스템인 RNeasy total RNA 키트 (Qiagen Inc., 독일)를 사용하여 다발성 골수종 세포로부터 total RNA를 추출하였다. 다발성 골수종 특이적 발현 미토콘드리아 유전자를 확인하기 위하여 실시간 RT-PCR 방법을 사용하였다. 총 RNA 1ug을 주형으로 하고 올리고 dT를 프라이머로 하여 역전사 반응을 수행하였다. 이어서 생성된 cDNA를 1/50 으로 희석한 후 희석된 cDNA를 2ul를 첨가한 후 CypD를 비롯한 각각의 유전자 프라이머를 가지고 PCR반응을 수행하였다. 반응액의 조성은 다음과 같았다. 2X SYBR premix EX Taq (Takara, 일본) 5ul, 프라이머 각 0.2uM, 주형 cDNA 2ul. 실시간 RT-PCR 반응의 조건은 95℃에서 2분간 초기 변성 시행 후, 95℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 30초간 증폭반응을 하였고, 증폭반응은 CFX96 real time system (Bio-rad)을 이용하여 시행하였으며, 증폭신호의 검출을 위해서 측정파장 530 nm, 분석파장 530/705 nm로 설정하여 결합반응에서의 형광신호를 단발적으로 측정하였다 (single fluorescence measurement).

2. 결과

마이크로어레이를 통해 확인된 유전자 발현이 실제 보르테조밉 세포사멸 내성과 관련되어 있는지를 검증하기 위해서, 내성세포주와 민감성 세포주를 실시간 유전자 분석법(real time RT-PCR)을 사용하여 비교 분석하였다.

마이크로어레이를 통해 얻어진 결과로부터 후보 유전자들을 확보하였고, 이들을 포함하여 미토콘드리아 기능과 관련한 여러 유전자들의 발현 양상을 내성 세포주(KMS20)와 감수성 세포주(KMS28BM)에서 실시간 유전자 증폭기법(real time RT-PCR)을 사용하여 확인하였다. 미토콘드리아 대사 관련 유전자의 발현이 내성세포주인 KMS20에서 상대적으로 높게 유지되며, CypD의 경우 감수성 세포주에 비해 내성세포주에서 현저히 감소하였고, SOD2와 MCU의 경우 반대로 내성 세포주에서 증가하였다.

내성 세포주와 감수성 세포주간의 차이가 있는 유전자 중 CypD(cyclophilin D)를 선별하여 보르테조밉 자극에 대한 발현변화를 비교하였다(도 4B). CypD(cyclophilin D)의 경우, 내성 세포주에서 발현양이 낮았으며, 보르테조밉 자극에 의해 발현양이 더 감소하는 것을 확인하였다. 이러한 발현 감소는 보르테조밉에 의해 유도되는 미토콘드리아 매개 세포사멸 기전에서 미토콘드리아 막 전압 유지에 기여함으로써 세포 생존을 유도하게 되는 것으로 판단된다.

< 실시예 6> 미토콘드리아 기능 조절 유전자 CypD 발현 억제( knockdown )에 따른 보르테조밉 효과 확인

1. CypD 유전자의 발현 억제( knockdown )

Cyclophilin D유전자의 small interfering RNA (siRNA)를 세포에 형질감염(transfection) 방법에 따라 주입하여 이 유전자의 발현을 억제하였다. CypD의 염기서열 중에서 19개의 뉴클레오티드로 이루어진 siRNA를 제작하였다. siCYPD 서열은 5′-ctgctaaattgtgcgttat-3′이다. 다발성 골수종세포에서 CypD 유전자 발현을 억제하기 위해서 lipofectamine RNAiMax reagent를 사용하여 CypD siRNA를 세포내로 도입하였다. 그 후, 48시간 동안 배양 한 후 보르테조밉을 각각의 농도와 시간에 따라 처리하였다. 또한, 웨스턴 블랏을 통해 발현억제 여부를 확인하였다.

2. 결과

동정된 CypD 유전자에 의한 미토콘드리아 기능 변화가 보르테조밉 내성과 관련되어있는지 확인하기 위해서, CypD 유전자의 발현을 siRNA를 사용하여 억제하고 보르테조밉를 처리하여 감수성 변화가 생기는지 여부를 알아보았다.

CypD siRNA의 녹다운(knockdown) 효과를 웨스턴 블랏 분석법을 사용하여 확인하였는데, 그 결과 siRNA 도입에 의해 효과적으로 CypD가 녹다운(knockdown) 되었으며 KMS20에서의 발현양이 KMS28BM 세포주에 비해 낮게 발현됨을 확인하였다(도 5A).

한편, KMS20 세포주에서 CypD siRNA를 이용하여 녹다운(knockdown) 후 보르테조밉을 농도별로 처리하여 세포사멸 효과를 확인한 결과, KMS20 내성 세포주의 경우 이미 CypD 발현이 매우 낮은 상태로 siRNA에 의한 녹다운(knockdown) 효과로 75nM 처리에서 세포사멸이 감소하는 것으로 나타났다. 그러나, 낮은 발현양에 의해 내성을 보이는 세포주로써 녹다운(knockdown)에 의한 효과는 크지 않았다(도 5B).

보르테조밉에 민감한 KMS28BM 세포주에서 CypD siRNA를 사용하여 녹다운(knockdown)한 후에 보르테조밉을 농도별로 처리한 결과, 녹다운(knockdown) 효과가 없는 siRNA를 형질감염(transfection) 시킨 것에 비해 세포사멸이 현저히 감소하였다(도 5C). 이러한 결과로부터 CypD(Cyclophilin D)의 발현 정도가 보르테조밉의 세포사멸 효과를 결정하는 인자임을 확인할 수 있었다.

따라서 앞서 언급한 바와 같이 CypD(Cyclophilin D)의 발현을 조사하여 보르테조밉에 내성이 있는지 여부를 진단하고, 내막 전압변화를 조절하는 항암제를 선별하여 보르테조밉과 병용처리한다면 다발성 골수종 환자의 치료 효율을 높일 수 있을 것으로 판단된다.

<110> Inje university industry-academic cooperation foundation <120> Biomarker composition for diagnosis of bortezomib resistance comprising Cyclophilin D and diagnostic kit using the same <130> DP-2012-0735 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 2213 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 gcgggactcg gccttctggg cgcgcgcgac gtcagtttga gttctgtgtt ctccccgccc 60 gtgtcccgcc cgacccgcgc ccgcgatgct ggcgctgcgc tgcggctccc gctggctcgg 120 cctgctctcc gtcccgcgct ccgtgccgct gcgcctcccc gcggcccgcg cctgcagcaa 180 gggctccggc gacccgtcct cttcctcctc ctccgggaac ccgctcgtgt acctggacgt 240 ggacgccaac gggaagccgc tcggccgcgt ggtgctggag ctgaaggcag atgtcgtccc 300 aaagacagct gagaacttca gagccctgtg cactggtgag aagggcttcg gctacaaagg 360 ctccaccttc cacagggtga tcccttcctt catgtgccag gcgggcgact tcaccaacca 420 caatggcaca ggcgggaagt ccatctacgg aagccgcttt cctgacgaga actttacact 480 gaagcacgtg gggccaggtg tcctgtccat ggctaatgct ggtcctaaca ccaacggctc 540 ccagttcttc atctgcacca taaagacaga ctggttggat ggcaagcatg ttgtgttcgg 600 tcacgtcaaa gagggcatgg acgtcgtgaa gaaaatagaa tctttcggct ctaagagtgg 660 gaggacatcc aagaagattg tcatcacaga ctgtggccag ttgagctaat ctgtggccag 720 ggtgctggca tggtggcagc tgcaaatgtc catgcaccca ggtggccgcg ttgggctgtc 780 agccaaggtg cctgaaacga tacgtgtgcc cactccactg tcacagtgtg cctgaggaag 840 gctgctaggg atgttagacc tcggccagga cccaccacat tgcttcctaa tacccaccct 900 tcctcacgac ctcatttctg ggcatctttg tggacatgat gtcacccacc ccttgtcaag 960 cattgcctgt gattgcccag cccagattca tctgtgcctt ggacatggtg atggtgatgg 1020 gttgccatcc aagtgaaagt cttttccttg accaaggggg acagtcagtt ttgcaaaagg 1080 actctaatac ctgtttaata ttgtcttcct aattgggata atttaattaa caagattgac 1140 tagaagtgaa actgcaacac taacttcccc gtgctgtggt gtgacctgag ttggtgacac 1200 aggccacaga ccccagagct tggcttttga aacacaactc agggcttttg tgaaggttcc 1260 cccgctgaga tctttcctcc tggttactgt gaagcctgtt ggtttgctgc tgtcgttttt 1320 gaggagggcc catgggggta ggagcagttg aacctgggaa caaacctcac ttgagctgtg 1380 cctagacaat gtgaattcct gtgttgctaa cagaagtggc ctgtaagctc ctgtgctccg 1440 gagggaagca tttcctggta ggctttgatt tttctgtgtg ttaaagaaat tcaatctact 1500 catgatgtgt tatgcataaa acatttctgg aacatggatt tgtgttcacc ttaaatgtga 1560 aaataaatcc tattttctat ggaagactgg tacctggttt ctggaagagg ggtctgtgac 1620 ttggagctga tctttactga gctcgccgtg gcagatgcca tgctcaggac gttcatgtgg 1680 atggtttcat gtcatcgtgc tggcaacttg tcctccctgc cttagagatg aggctcagac 1740 aaacgacctt agcacccata gcctatgcca tgagcactgg ctccaccctg aatcccagct 1800 cctcccctta gtgaccccaa gtctgtttcc ctcagctgca taaggaggcg atatagtttg 1860 aatatttgtc cccagccaaa tctcatgttg aactgtaatc cccagtgctg gaggtggggc 1920 ctgctacgag gtgtttggat catggggacg ggtatttcat ggcttggtgc tgttttcttg 1980 atggtgaatt attgcaagat acggtcattt aaaattgtgt ggcacctccc cctgccccct 2040 tcttgctcct gctttcacca tgtgacatgc ctgatccccc ttcacctttt gccatggtca 2100 taagcttcct gaggcctccc tggaagctga gcagatgcca gcaccatgct tcctgtacat 2160 cctgcagaac cataagccaa ttaaaccttt ttaataataa aaaaaaaaaa aaa 2213 <210> 2 <211> 207 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Ala Leu Arg Cys Gly Ser Arg Trp Leu Gly Leu Leu Ser Val 1 5 10 15 Pro Arg Ser Val Pro Leu Arg Leu Pro Ala Ala Arg Ala Cys Ser Lys 20 25 30 Gly Ser Gly Asp Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Gly Asn Pro Leu Val 35 40 45 Tyr Leu Asp Val Asp Ala Asn Gly Lys Pro Leu Gly Arg Val Val Leu 50 55 60 Glu Leu Lys Ala Asp Val Val Pro Lys Thr Ala Glu Asn Phe Arg Ala 65 70 75 80 Leu Cys Thr Gly Glu Lys Gly Phe Gly Tyr Lys Gly Ser Thr Phe His 85 90 95 Arg Val Ile Pro Ser Phe Met Cys Gln Ala Gly Asp Phe Thr Asn His 100 105 110 Asn Gly Thr Gly Gly Lys Ser Ile Tyr Gly Ser Arg Phe Pro Asp Glu 115 120 125 Asn Phe Thr Leu Lys His Val Gly Pro Gly Val Leu Ser Met Ala Asn 130 135 140 Ala Gly Pro Asn Thr Asn Gly Ser Gln Phe Phe Ile Cys Thr Ile Lys 145 150 155 160 Thr Asp Trp Leu Asp Gly Lys His Val Val Phe Gly His Val Lys Glu 165 170 175 Gly Met Asp Val Val Lys Lys Ile Glu Ser Phe Gly Ser Lys Ser Gly 180 185 190 Arg Thr Ser Lys Lys Ile Val Ile Thr Asp Cys Gly Gln Leu Ser 195 200 205

Claims

CypD(Cyclophilin D) 유전자를 포함하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단용 바이오 마커 조성물.
CypD(Cyclophilin D) 유전자로부터 발현되는 단백질 또는 이에 특이적인 항체를 포함하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단용 바이오 마커 조성물.
제1항 또는 제2항의 조성물을 포함하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단 키트.
제3항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트 또는 단백질 칩 키트인 것을 특징으로 하는 보르테조밉(bortezomib) 내성 진단 키트.
보르테조밉(bortezomib) 내성 진단에 필요한 정보를 제공하기 위하여,
다발성 골수종 환자 시료로부터 CypD(Cyclophilin D) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계;
상기 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질의 발현 수준을 정상 대조구 시료와 비교하는 단계; 및
상기 환자 시료의 mRNA 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준이 정상 대조구 시료보다 낮을 경우 보르테조밉(bortezomib)에 내성이 있다고 판단하는 단계를 포함하는 CypD 유전자 발현을 검출하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 방법은 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR(Competitive RT-PCR), 실시간 RT-PCR (Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법 (RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅 (Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 방법인 것을 특징으로 하는 CypD 유전자 발현을 검출하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 상기 단백질에 특이적인 항체를 이용하는 것을 특징으로 하는 CypD 유전자 발현을 검출하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 단백질 발현 수준을 측정하는 방법은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent asay), 방사선면역분석(Radioimmunoassay; RIA), 방사면역확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케이트(rocket) 면역전기영동, 조직면역염색, 면역침전 분석법 (Immunoprecipitation assay), 보체고정분석법 (Complement Fixation Assay), FACS 및 단백질 칩으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나를 이용하는 방법인 것을 특징으로 하는 CypD 유전자 발현을 검출하는 방법.