CN113004421A - 一种检测抗瓜氨酸肽抗体的ccp抗原及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原及其制备方法，CCP抗原由多肽和载体蛋白按照一定比例进行偶联得到；多肽部分具有如下所示的结构：NH2‑S1‑S2‑(GGGS)5GGG‑S3‑S4‑COOH；其中，S1、S2、S3和S4均为含瓜氨酸小肽；S1和S4包括环化的半胱氨酸。本抗原的多肽中含有多个抗原性位点，通过序列N和C端的半胱氨酸侧链巯基形成二硫键，产生环状结构，同时通过连接子将4个含有瓜氨酸的短肽进行串联嵌合，使结构更稳定，避免空间位阻；环化的多肽序列与载体蛋白进行偶联，可以更好的包被于硝酸纤维素膜上，增加与抗瓜氨酸肽抗体结合的能力，满足临床检验的需求。

Description

一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原及其制备方法
技术领域
本发明属于生物学检测技术领域，具体涉及一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原及其制备方法。
背景技术
类风湿性关节炎(RA)是一种系统自身免疫性疾病，常累及周围关节炎及多系统，会对骨关节造成不可逆转的损伤，给患者带来极大的伤害。目前，我国类风湿关节炎发病率可达到0.33％，并且有逐年增加的趋势。因此，早期诊断并积极治疗类风湿性关节炎对提高预后质量具有十分重要的意义。诊断类风湿性关节炎的方法主要包括依靠临床症状、实验室检查和X线检测进行确诊，其中，临床诊断受主观因素影响比较大，加上疾病在个体上临床表现的多样性，同时早期临床症状不明显，经常出现误诊或者漏诊；X线检测也只是在有症状之后才能观察出异样并确诊；而实验室检查则因其特异性和灵敏度为类风湿关节炎确诊和治疗提供了便利。
用于诊断RA的主要指标为类风湿因子(RF)，检测灵敏度可以达到60～80％，但特异性较低，仅能达到60％，并且难以正确区分RA与感染性疾病、重叠疾病等。随着医疗技术的不断发展，临床研究发现环化瓜氨酸多肽(CCP)抗原在RA诊断中敏感性及特异性均较高，相关研究表明CCP诊断RA特异性为96％，敏感性仅为60～70％，早期可达80％阳性率。1964年，人们通过人颊粘膜细胞为抗原底物的免疫荧光法间接测得抗核周因子(APF)，其对类风湿关节炎具有专一性；1979年抗角质蛋白抗体(AKA)被证实是一种类风湿关节炎专一性角质蛋白抗体。经研究证实两种抗体对应的抗原是一致的，APF的目标抗原是Profilaggrin，AKA的抗原为Filaggrin。
现有的抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒使用的抗原是基于AKA和APF基础上，人工合成的环化瓜氨酸肽，一般长度为12～19个氨基酸。这么短的多肽序列进行环化对合成公司是一个不小的考验，同时环化的效果又影响着抗原的活性，从而导致合成环化的CCP抗原出现极大的批间差。12～19个氨基酸多肽抗原分子量小于2KD，同时又是环化的状态，是很难固相包被到孔径大的硝酸纤维素膜等固相载体上，这就限制了多肽抗原在胶体金层析和胶体金荧光等平台的应用。即使通过改善包被液提高多肽抗原的包被效果，但是由于多肽片段很小很容易导致位点的覆盖。抗原位点一般由6～8氨基酸构成，12～19个氨基酸多肽抗原最多有3个位点，但是经前人验证抗瓜氨酸抗体的抗原成分不仅仅是3个位点，所以必须对多条多肽进行混合包被，或者把多肽进行嵌合。但是在多肽形成混合物进行包被时很容易造成前面提到的位点包被覆盖。即使进行多肽位点的嵌合，如果连接子选择不合适，很容易在环化的过程中产生空间位阻。
综上所述，目前市面上的CCP抗原主要存在以下缺点：现有技术中CCP抗原多为不同抗原位点的瓜氨酸肽简单组合，这种组合容易造成包被覆盖，同时简单进行嵌合也容易造成空间位阻；另外由于分子量太小，同时又是环化结构，不容易包被到孔径比较大的硝酸纤维素膜上。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术中存在的上述问题，提出了一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原及其制备方法，该CCP抗原含有多个抗原位点，避免被覆盖和空间位阻且易于包被到固相载体上，对抗瓜氨酸抗体有很好的特异性和敏感性，从而进一步提高抗瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测敏感性和特异性。
本发明的技术方案是：
一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原，所述CCP抗原由多肽和载体蛋白按照一定比例进行偶联得到；所述多肽部分具有如下所示的结构：
NH2-S1-S2-(GGGS)5GGG-S3-S4-COOH；其中，S1、S2、S3和S4均为含瓜氨酸小肽；S1和S4包括环化的半胱氨酸。
进一步的，所述S1的序列如SEQ ID NO：1所示；S2序列为如SEQ ID NO：2所示；S3序列如SEQ ID NO：3所示；S4序列如SEQ ID NO：4所示；所述S1、S2、S3和S4中间通过连接子(GGGS)5GGG嵌合。
目前抗环瓜氨酸肽抗体试剂盒使用的抗原一般长度为12～19个氨基酸的环化肽，高纯度的短的环化肽对化学合成工艺是一个很大的考验，容易出现批间活性的差别，同时也增加复溶后多肽的稳定性；本发明选择多个抗原位点进行嵌合合成，但是嵌合合成很容易造成位点的遮挡造成位阻，因此，选择一个合适的连接子成为嵌合多肽抗原的决定因素。
本发明在实验基础上，选择GGGSGGGSGGGSGGGSGGGSGGG为连接子。该连接子包括23个氨基酸，并且是GGGS的一个重复，二级结构上是延展和螺旋的一个交替；CCP肽链的环化也通过模拟β转角的结构形成二硫键。
本发明的连接子在二级结构上更进一步利用CCP肽链抗原位点的暴露，即使利用多个位点的嵌合，肽链长度也仅仅有61个氨基酸，蛋白大小有6KD左右，还是不能满足胶体金和荧光层析的固相包被，因此利用CCP多肽和载体蛋白进行偶联，提高包被的结合能力。
进一步的，所述CCP抗原的多肽部分是环化结构，氨基酸序列包含来源于filaggrin氨基酸序列中能被类风湿关节炎特异性识别的抗原位点。所述CCP抗原为环化的多肽与载体蛋白根据一定比例进行偶联，所述载体蛋白包括但不限于牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和血蓝蛋白(KLH)等。
进一步的，所述CCP抗原的多肽部分是由FMOC固相合成方法合成，经高效液相色谱法分析和纯化，抗原浓度达到90％以上；其中，S1和S4中的半胱氨酸进行环化。
进一步的，所述CCP多肽与载体蛋白进行偶联的比例为摩尔比80:1～20:1。
进一步的，所述偶联采用的偶联试剂包括但不限于EDC、戊二醛和SPDP中的任一种；优选的，所述偶联试剂为EDC；所述偶联采用的催化剂为MES。
一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原的制备方法，其特征在于，先采用FMOC固相合成方法合成环化的多肽部分，然后CCP环化多肽与偶联剂进行偶联反应，偶联反应包括如下步骤：
(1)溶液配制：首先配制浓度为0.08～0.12M的MES缓冲液，然后利用配制好的MES缓冲液作溶剂，配制终浓度为5～10mg/ml的EDC溶液，同理利用配制好的MES缓冲液作溶剂，配制终浓度为5～10mg/ml的载体蛋白溶液；
上述配制好的溶液于-20℃保存备用；
(2)将上述溶液放置室温平衡；向一定质量的CCP环化多肽中加入一定体积载体蛋白溶液并混匀，然后缓慢加入一定体积EDC溶液，再次混匀；
(3)室温下反应一段时间后，在PBS缓冲液中透析一定时间，终止偶联；收集后无菌过滤保存，即得CCP抗原。
本发明中CCP抗原的制备方法，为先用FMOC固相合成方法合成环化的多肽部分，再用偶联剂在合适的缓冲系统中进行偶联，偶联方法选择化学法，但不限于化学法，同时不限于蛋白氨基酸之间羧基和氨基的反应，还可以是氨基和巯基反应等。
进一步的，所述步骤(1)中溶液配制步骤为：
MES缓冲液：称取3.12～4.69g MES，然后用纯水定容至200ml，终浓度为0.08～0.12M；
EDC溶液：称取0.5～1.0g EDC，用MES缓冲液定容至100ml，配制成5～10mg/ml终浓度；
载体蛋白溶液：称取0.5～1.0g载体蛋白，用MES缓冲液定容至100ml，配制成5～10mg/ml终浓度。
进一步的，所述步骤(2)中将上述溶液放置室温平衡；向0.5～2.5mg CCP环化多肽中加入100～300μl载体蛋白溶液并混匀，然后缓慢加入2～5ml EDC溶液，再次混匀。
进一步的，所述步骤(3)中室温下反应2.5～3.5h后，在PBS缓冲液中透析58～62h，痛过透析终止偶联；收集后无菌过滤保存，即得CCP抗原；优选的，反应时间为3h，透析时间为60h。
试剂盒，其包括上述任一项权利要求所述或制备得到的CCP抗原。本发明所述的CCP抗原在抗瓜氨酸抗体检测中的应用为，所述的抗瓜氨酸抗体的检测方法包括但不限于胶体金标记免疫层析法，还包括免疫荧光法和化学发光法等。本试剂盒采用胶体金免疫层析技术及捕获法原理检测样本中抗瓜氨酸IgG抗体。
本发明的有益效果：
(1)本发明所提供的CCP抗原包含4个抗原性位点，包含filaggrin能被类风湿关节炎血清特异识别的抗原表位；不需要进行不同抗原表位肽链的混合，而且具有更高的特异性和灵敏度；该抗原多肽含有61个氨基酸，同时又进行环化，结构更稳定；
(2)本发明的抗原多肽进行嵌合的时候选择连接子(GGGS)5GGG，利用环化后的结构稳定，并且避免空间位阻；
(3)本发明所提供的抗原的多肽中含有多个抗原性位点，通过序列N和C端的半胱氨酸侧链巯基形成二硫键，产生环状结构；同时通过连接子(GGGS)5GGG把4个含有瓜氨酸的短肽进行串联嵌合，使结构更稳定，并且避免空间位阻；最终环化的多肽序列与载体蛋白进行偶联，可以更好的包被于硝酸纤维素膜上，增加与抗瓜氨酸肽抗体结合的能力，可满足临床检验的需求。
具体实施方式
下面将结合本发明的实施例和试验例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
为了进一步理解本发明，将结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1
一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原，CCP抗原由多肽和载体蛋白按照摩尔比80:1～20:1的比例进行偶联得到；多肽部分具有如下所示的结构：
NH2-S1-S2-(GGGS)5GGG-S3-S4-COOH；其中，S1、S2、S3和S4均为含瓜氨酸小肽；中间通过连接子(GGGS)5GGG嵌合。S1和S4包括环化的半胱氨酸。
S1的序列如SEQ ID NO：1所示，为HSCDSERHX；S2序列如SEQ ID NO：2所示，为GXSRNHHGS；S3序列如SEQ ID NO：3所示，为HQCHQKRAX；S4序列如SEQ ID NO：4所示，为HXRAACGRSGS；X为瓜氨酸。
实施例2
一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原的制备
1、CCP抗原环化多肽的合成
应用类风湿性关节炎患者血清筛选出四个针对类风湿关节炎的抗原位点S1、S2、S3和S4，然后经连接子(GGGS)5GGG进行中间连接。S1和S4中的半胱氨酸形成二硫键。最终形成CCP抗原的多肽部分。多肽由多肽合成公司采用FMOC固相合成方法合成，经HPLC分析和纯化，抗原纯度达到90％以上。具体序列如下：NH2-S1-S2-(GGGS)5GGG-S3-S4-COOH。
2、CCP抗原的制备步骤
(1)主要溶液配制，-20℃保存备用。
MES缓冲液：称取3.90g MES，然后用纯水定容至200ml，终浓度为0.1M；
EDC溶液：称取1g EDC，用MES缓冲液定容至100ml，最终配置成10mg/ml终浓度；
BSA溶液：称取1g BSA，用MES缓冲液定容至100ml，最终配置成10mg/ml终浓度；
(2)将上述配制好的所有溶液放置室温平衡。称取2.0mg CCP环化多肽，并向其中加入100μl的BSA溶液，用移液器混匀，并缓慢加入4ml的EDC溶液，并用移液器混匀；
(3)室温下反应3小时后，在PBS缓冲液中进行透析，并通过透析终止偶联，透析时间为60小时；收集后无菌过滤保存，最终得到的抗原为CCP抗原。
实施例3
一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原的制备
1、CCP抗原环化多肽的合成
应用类风湿性关节炎患者血清筛选出四个针对类风湿关节炎的抗原位点S1、S2、S3和S4，然后经连接子(GGGS)5GGG进行中间连接。S1和S4中的半胱氨酸形成二硫键。最终形成CCP抗原的多肽部分。多肽由多肽合成公司采用FMOC固相合成方法合成，经HPLC分析和纯化，抗原纯度达到90％以上。具体序列如下：NH2-S1-S2-(GGGS)5GGG-S3-S4-COOH。
2、CCP抗原的制备步骤
(1)主要溶液配制，-20℃保存备用。
MES缓冲液：称取3.90g MES，然后用纯水定容至200ml，终浓度为0.1M；
EDC溶液：称取0.8g EDC，用MES缓冲液定容至100ml，最终配置成8mg/ml终浓度；
BSA溶液：称取0.8g BSA，用MES缓冲液定容至100ml，最终配置成8mg/ml终浓度；
(2)将上述配制好的所有溶液放置室温平衡。称取2.0mg CCP环化多肽，并向其中加入100μl的BSA溶液，用移液器混匀，并缓慢加入4ml的EDC溶液，并用移液器混匀；
(3)室温下反应3小时后，在PBS缓冲液中进行透析，并通过透析终止偶联，透析时间为60小时；收集后无菌过滤保存，最终得到的抗原为CCP抗原。
实施例4
一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原的制备
1、CCP抗原环化多肽的合成
应用类风湿性关节炎患者血清筛选出四个针对类风湿关节炎的抗原位点S1、S2、S3和S4，然后经连接子(GGGS)5GGG进行中间连接。S1和S4中的半胱氨酸形成二硫键。最终形成CCP抗原的多肽部分。多肽由多肽合成公司采用FMOC固相合成方法合成，经HPLC分析和纯化，抗原纯度达到90％以上。具体序列如下：NH2-S1-S2-(GGGS)5GGG-S3-S4-COOH。
2、CCP抗原的制备步骤
(1)主要溶液配制，-20℃保存备用。
MES缓冲液：称取3.12g MES，然后用纯水定容至200ml，终浓度为0.08M；
EDC溶液：称取0.5g EDC，用MES缓冲液定容至100ml，最终配置成5mg/ml终浓度；
OVA溶液：称取0.5g OVA，用MES缓冲液定容至100ml，最终配置成5mg/ml终浓度；
(2)将上述配制好的所有溶液放置室温平衡。称取2.5mg CCP环化多肽，并向其中加入187.5μl的OVA溶液，用移液器混匀，并缓慢加入2ml的EDC溶液，并用移液器混匀；
(3)室温下反应2.5小时后，在PBS缓冲液中进行透析，并通过透析终止偶联，透析时间为58小时；收集后无菌过滤保存，最终得到的抗原为CCP抗原。
实施例5
一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原的制备
1、CCP抗原环化多肽的合成
应用类风湿性关节炎患者血清筛选出四个针对类风湿关节炎的抗原位点S1、S2、S3和S4，然后经连接子(GGGS)5GGG进行中间连接。S1和S4中的半胱氨酸形成二硫键。最终形成CCP抗原的多肽部分。多肽由多肽合成公司采用FMOC固相合成方法合成，经HPLC分析和纯化，抗原纯度达到90％以上。具体序列如下：NH2-S1-S2-(GGGS)5GGG-S3-S4-COOH。
2、CCP抗原的制备步骤
(1)主要溶液配制，-20℃保存备用。
MES缓冲液：称取4.69g MES，然后用纯水定容至200ml，终浓度为0.12M；
EDC溶液：称取1g EDC，用MES缓冲液定容至100ml，最终配置成10mg/ml终浓度；
KLH溶液：称取1g KLH，用MES缓冲液定容至100ml，最终配置成10mg/ml终浓度；
(2)将上述配制好的所有溶液放置室温平衡。称取0.5mg CCP环化多肽，并向其中加入300μl的KLH溶液，用移液器混匀，并缓慢加入5ml的EDC溶液，并用移液器混匀；
(3)室温下反应3.5小时后，在PBS缓冲液中进行透析，并通过透析终止偶联，透析时间为62小时；收集后无菌过滤保存，最终得到的抗原为CCP抗原。
实施例6
制备得到的CCP抗原在诊断试剂盒上的应用
本试剂盒采用胶体金免疫层析技术及捕获法原理检测样本中抗瓜氨酸IgG抗体，具体为：将CCP多肽抗原包被在硝酸纤维素膜上，制成胶体金标记免疫层析检测试剂盒，其组成如下：
(1)包被CCP多肽抗原的硝酸纤维素膜
(2)胶体金标记的鼠抗人IgG抗体
(3)标本稀释液
(4)抗瓜氨酸肽抗体校准品
(5)阴性及阳性对照血清。
试验例
特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)，临床特异性评估样本：健康体检样本、非RA患者样本。
敏感性＝真阳性/(真阳性+假阴性)，临床敏感性评估样本：RA患者临床阳性样本。
本检测卡对300例RA患者临床阳性样本、1000例健康体检样本以及部分非RA患者临床样本进行检测。非RA患者临床样本中系统性红斑狼疮患者22例，干燥综合征患者26例，I型自身免疫性肝炎患者18例，银屑病关节炎患者35例，原发性胆汁性肝硬化患者具体数据如下表1所示。
表1实验数据列表
Figure BDA0002943793380000071
由上表可知，本发明的CCP抗原针对RA患者临床阳性样本的敏感性为76.33％，健康体检样本的特异性则高达98.2％，针对非RA患者的临床样本能控制在4％以内，对比目前抗原灵敏度60～70％、特异性96％，有了很大的提高，本发明CCP抗原临床样本有更好的敏感度和特异性，可以进一步应用到临床检测中。
上述说明仅为本发明的优选实施例，并非是对本发明的限制，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改型等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 青岛硕景生物科技有限公司
<120> 一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原及其制备方法
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
His Ser Cys Asp Ser Glu Arg His Xaa
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gly Xaa Ser Arg Asn His His Gly Ser
1 5
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
His Gln Cys His Gln Lys Arg Ala Xaa
1 5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
His Xaa Arg Ala Ala Cys Gly Arg Ser Gly Ser
1 5 10

Claims (10)

1.一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原，其特征在于，所述CCP抗原由多肽和载体蛋白按照一定比例进行偶联得到；所述多肽部分具有如下所示的结构：
NH2-S1-S2-(GGGS)5GGG-S3-S4-COOH；其中，S1、S2、S3和S4均为含瓜氨酸小肽；S1和S4包括环化的半胱氨酸。
2.根据权利要求1所述的一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原，其特征在于，所述S1的序列如SEQ ID NO：1所示；S2序列如SEQ ID NO：2所示；S3序列如SEQ ID NO：3所示；S4序列如SEQ ID NO：4所示；所述S1、S2、S3和S4中间通过连接子(GGGS)5GGG嵌合。
3.根据权利要求1所述的一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原，其特征在于，所述CCP抗原的多肽部分为环化结构，所述CCP抗原为环化的多肽与载体蛋白根据一定比例进行偶联，所述载体蛋白包括牛血清蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)和血蓝蛋白(KLH)。
4.根据权利要求3所述的一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原，其特征在于，所述CCP多肽与载体蛋白进行偶联的比例为摩尔比80:1～20:1。
5.根据权利要求1所述的一种检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原，其特征在于，所述偶联采用的偶联试剂为EDC、戊二醛和SPDP中的任一种；优选的，所述偶联试剂为EDC；所述偶联采用的催化剂为MES。
6.权利要求1-5任一项权利要求所述的检测抗瓜氨酸肽抗体的CCP抗原的制备方法，其特征在于，先采用FMOC固相合成方法合成环化的多肽部分，然后CCP环化多肽与偶联剂进行偶联反应，偶联反应包括如下步骤：
(1)溶液配制：首先配制浓度为0.08～0.12M的MES缓冲液，然后利用配制好的MES缓冲液作溶剂，配制终浓度为5～10mg/ml的EDC溶液，同理利用配制好的MES缓冲液作溶剂，配制终浓度为5～10mg/ml的载体蛋白溶液；
上述配制好的溶液于-20℃保存备用；
(2)将上述溶液放置室温平衡；向一定质量的CCP环化多肽中加入一定体积载体蛋白溶液并混匀，然后缓慢加入一定体积EDC溶液，再次混匀；
(3)室温下反应一段时间后，在PBS缓冲液中透析一定时间，终止偶联；收集后无菌过滤保存，即得CCP抗原。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中溶液配制步骤为：
MES缓冲液：称取3.12～4.69g MES，然后用纯水定容至200ml，终浓度为0.08～0.12M；
EDC溶液：称取0.5～1.0g EDC，用MES缓冲液定容至100ml，配制成5～10mg/ml终浓度；
载体蛋白溶液：称取0.5～1.0g载体蛋白，用MES缓冲液定容至100ml，配制成5～10mg/ml终浓度。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中将上述溶液放置室温平衡；向0.5～2.5mg CCP环化多肽中加入100～300μl载体蛋白溶液并混匀，然后缓慢加入2～5ml EDC溶液，再次混匀。
9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中室温下反应2.5～3.5h后，在PBS缓冲液中透析58～62h，终止偶联；收集后无菌过滤保存，即得CCP抗原；优选的，反应时间为3h，透析时间为60h。
10.试剂盒，其包括权利要求1-5任一项所述的CCP抗原或权利要求6-9任一项所述制备方法得到的CCP抗原。
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