CN110092824B - 氨基末端脑钠肽前体多肽、抗体及其制备方法、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种氨基末端脑钠肽前体多肽，氨基末端脑钠肽前体多肽通过在天然氨基末端脑钠肽前体的特定氨基酸序列的氨基末端附近和羧基末端附近分别添加第一半胱氨酸和第二半胱氨酸形成，第一半胱氨酸和第二半胱氨酸能够形成二硫键，特定氨基酸序列选自如SEQ ID NO.1所示多肽序列中的一段或多段，和/或特定氨基酸序列选自如SEQ ID NO.2所示多肽序列中的一段或多段，氨基末端附近为特定氨基酸序列的氨基末端的1～3个氨基酸，羧基末端附近为特定氨基酸序列的羧基末端的1～3个氨基酸。本发明还公开一种抗体及其制备方法。本发明还公开了一种检测试剂盒。本发明还公开了一种氨基末端脑钠肽前体检测方法。

Description

氨基末端脑钠肽前体多肽、抗体及其制备方法、检测试剂盒及 检测方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种氨基末端脑钠肽前体多肽、抗体及其制备方法、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

氨基末端脑钠肽前体(简称为NT-proBNP)来自心室肌细胞，最初合成的为前脑钠肽原(pre-proBNP)，是由134个氨基酸组成的多肽链。前脑钠肽原在心肌细胞中裂解为脑钠肽前体(proBNP，108个氨基酸)和信号肽(26个氨基酸)。当心肌细胞受到刺激时，proBNP在活化酶的作用下裂解为由76个氨基酸组成的无活性的直线多肽NT-proBNP和32个氨基酸组成的活性环状多肽BNP，释放入血循环。NT-proBNP半衰期长(60-120min)，与BNP相比更容易被检测到，即检测的敏感性提高，NT-proBNP更容易反映早期或者轻微心脏功能的变化。NT-proBNP具有更低的个体差异，不受个体生理性节律的影响。因此，临床上将NT-proBNP作为心衰诊断及临床预后的生物标志物。

目前多采用免疫法检测样品中的NT-proBNP浓度，即通过NT-proBNP抗体与样品中的NT-proBNP特异性结合的性质检测NT-proBNP浓度。NT-proBNP抗体可以采用天然的NT-proBNP蛋白免疫动物制备，但天然NT-proBNP蛋白免疫动物产生的抗体，大多对糖基化位点敏感，导致检测结果假阴。采用线性多肽的免疫动物制备抗体可以避免糖基化位点的影响，但该方法制备的抗体与样品中天然的NT-proBNP的亲和力差，导致检测灵敏度低，检测结果不准确。

发明内容

基于此，有必要提供一种对NT-proBNP检测灵敏度高、检测结果准确的氨基末端脑钠肽前体多肽组合物、抗体及其制备方法、检测试剂盒及检测方法。

一种氨基末端脑钠肽前体多肽，所述氨基末端脑钠肽前体多肽通过在天然氨基末端脑钠肽前体的特定氨基酸序列的氨基末端附近和羧基末端附近分别添加第一半胱氨酸和第二半胱氨酸形成，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸能够形成二硫键，所述特定氨基酸序列选自如SEQ ID NO.1所示多肽序列中的至少部分序列，/或所述特定氨基酸序列选自如SEQ ID NO.2所示多肽序列中的至少部分序列，所述氨基末端附近为所述特定氨基酸序列的氨基末端的1～3个氨基酸，所述羧基末端附近为所述特定氨基酸序列的羧基末端的1～3个氨基酸。

在其中一个实施例中，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸能够形成二硫键，从而使得所述氨基末端脑钠肽前体多肽能够形成环状多肽。

在其中一个实施例中，所述氨基末端脑钠肽前体多肽的序列长度为10～35个氨基酸。

在其中一个实施例中，所述氨基末端脑钠肽前体多肽的序列长度为15～25个氨基酸。

在其中一个实施例中，所述特定氨基酸序列为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQID NO.5所示多肽序列。

在其中一个实施例中，所述氨基末端脑钠肽前体多肽为如SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7或SEQ ID NO.8所示多肽。

在其中一个实施例中，所述氨基末端脑钠肽前体检测抗体采用所述的氨基末端脑钠肽前体多肽与载体蛋白偶联形成的偶联蛋白经动物免疫形成。

一种所述的抗体的制备方法，包括：

将所述偶联蛋白注射入小鼠皮下组织得到免疫小鼠；

将骨髓瘤细胞与所述免疫小鼠的脾脏细胞进行融合得到杂交瘤细胞；

筛选能够产生NT-proBNP抗体的阳性杂交瘤细胞；

将所述阳性杂交瘤细胞注射入其它小鼠腹腔进行培养，在所述培养后的小鼠的腹水中得到所述氨基末端脑钠肽前体抗体。

一种氨基末端脑钠肽前体检测试剂盒，包括：

第一抗体包被的固相载体；和

化学发光分子标记的第二抗体，

所述第一抗体和所述第二抗体选自所述的氨基末端脑钠肽前体检测抗体，且所述第一抗体与所述第二抗体不同。

在其中一个实施例中，所述固相载体的表面具有羧基，所述固相载体能够通过所述羧基与所述第一抗体的氨基结合。

在其中一个实施例中，所述第一抗体标记有生物素，所述固相载体标记有亲和素。

在其中一个实施例中，所述固相载体选自磁性颗粒。

在其中一个实施例中，所述化学发光分子选自吖啶酯和吖啶磺酰胺中的一种或多种。

在其中一个实施例中，氨基末端脑钠肽前体检测试剂盒还包括校准品、清洗剂以及激发剂中的一种或多种，所述激发剂用于使所述化学发光分子发光。

一种氨基末端脑钠肽前体的检测方法，采用所述的氨基末端脑钠肽前体检测试剂盒，并包括以下步骤：

将检测样品、所述第一抗体包被的固相载体和所述化学发光分子标记的第二抗体混合得到混合物；

从所述混合物中分离所述固相载体；

检测所述分离得到的所述固相载体的发光信号；以及

将所述发光信号带入到氨基末端脑钠肽前体浓度与发光信号关系的标准曲线中，得到所述检测样品中的氨基末端脑钠肽前体浓度。

在其中一个实施例中，所述将检测样品、所述第一抗体包被的固相载体和所述化学发光分子标记的第二抗体混合得到混合物的步骤包括：

将所述检测样品与所述第一抗体包被的固相载体混合孵育预定时间得到第一混合物；

用清洗液清洗所述第一混合物；

从所述清洗后的所述第一混合物中分离所述固相载体；以及

将从所述第一混合物中分离的所述固相载体与所述化学发光分子标记的第二抗体混合孵育得到第二混合物。

本发明的所述氨基末端脑钠肽前体多肽为通过在天然氨基末端脑钠肽前体的特定氨基酸序列的氨基末端附近和羧基末端附近分别设置第一半胱氨酸和第二半胱氨酸形成的改造的多肽，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸能够形成二硫键，从而使得所述氨基末端脑钠肽前体多肽能够形成环状多肽。环状多肽相较于线性多肽能够实现更特异性的识别，增加了多肽的免疫原性，免疫原性即多肽引起免疫应答形成特异性抗体的性能，使用所述环状的氨基末端脑钠肽前体多肽进行动物免疫制备氨基末端脑钠肽前体抗体时，能够提高形成的所述氨基末端脑钠肽前体抗体对目标氨基末端脑钠肽前体的亲和性，提高对目标氨基末端脑钠肽前体的检测灵敏度和检测结果准确性。所述特定氨基酸序列选自与糖基化无关的序列，避免糖基化对于氨基末端脑钠肽前体检测结果的影响。根据特定氨基酸序列的长度、序列不同或半胱氨酸的添加位置的不同，可以形成多种氨基末端脑钠肽前体多肽。

将本发明得到的不同的所述氨基末端脑钠肽前体多肽经动物免疫可以得到对应的多种种类的抗氨基末端脑钠肽前体的抗体，所述多种种类的抗氨基末端脑钠肽前体的抗体分别包被固相载体和标记化学发光分子，可以采用夹心法检测样品中的所述氨基末端脑钠肽前体浓度，第一抗体包被固相载体，第二抗体标记化学发光分子，第一抗体和第二抗体分别与目标氨基末端脑钠肽前体结合，增加了目标氨基末端脑钠肽前体检测的特异性和精准性。所述固相载体作为结合的场所，有利于结合后产物的转移和清洗等，目标氨基末端脑钠肽前体结合固相载体上的第一抗体的同时和标记有化学发光分子的第二抗体结合，化学发光分子作为检测标志物，通过化学发光分子的发光量表征目标氨基末端脑钠肽前体的浓度，化学发光分子的发光量与目标氨基末端脑钠肽前体的浓度成正比。

附图说明

图1为本发明一实施例的天然氨基末端脑钠肽前体的糖基化位点照片；

图2为本发明一实施例的氨基末端脑钠肽前体浓度与发光值的关系标准曲线照片。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本发明的氨基末端脑钠肽前体多肽、抗体及其制备方法、检测试剂盒及检测方法进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种氨基末端脑钠肽前体多肽，所述氨基末端脑钠肽前体多肽通过在天然氨基末端脑钠肽前体的特定氨基酸序列的氨基末端附近和羧基末端附近分别添加第一半胱氨酸和第二半胱氨酸形成，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸能够形成二硫键，所述特定氨基酸序列选自如SEQ ID NO.1所示多肽序列中的至少部分序列，和/或所述特定氨基酸序列选自如SEQ IDNO.2所示多肽序列中的至少部分序列，所述氨基末端附近为所述特定氨基酸序列的氨基末端的1～3个氨基酸，所述羧基末端附近为所述特定氨基酸序列的羧基末端的1～3个氨基酸。

请参阅图1，天然的氨基末端脑钠肽前体的氨基酸序列具有糖基化位点，天然NT-proBNP蛋白免疫动物产生的抗体，大多对糖基化位点敏感，导致检测结果假阴。本发明实施例的所述特定氨基酸序列选自糖基化位点对应氨基酸序列两侧的序列，即SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2中的至少部分序列，避开糖基化位点对应氨基酸序列，利用所述氨基末端脑钠肽前体多肽制备得到的抗体检测目标氨基末端脑钠肽前体能够增加检测结果的准确性。

本发明实施例的所述氨基末端脑钠肽前体多肽通过在天然氨基末端脑钠肽前体的特定氨基酸序列的氨基末端附近和羧基末端附近分别设置第一半胱氨酸和第二半胱氨酸形成，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸能够形成二硫键，从而使得所述氨基末端脑钠肽前体多肽能够形成环状多肽。环状多肽相较于线性多肽能够实现更特异性的识别，增加了多肽的免疫原性，免疫原性即多肽引起免疫应答形成特异性抗体的性能，使用所述环状的氨基末端脑钠肽前体多肽进行动物免疫制备氨基末端脑钠肽前体抗体时，能够提高形成的所述氨基末端脑钠肽前体抗体对目标氨基末端脑钠肽前体的亲和性，提高对目标氨基末端脑钠肽前体的检测灵敏度和检测结果准确性。所述特定氨基酸序列选自与糖基化无关的序列，避免糖基化对于氨基末端脑钠肽前体检测结果的影响。根据特定氨基酸序列的长度、序列不同或半胱氨酸的添加位置的不同，所述氨基末端脑钠肽前体多肽可以形成多种种类。

在一实施例中，所述氨基末端脑钠肽前体多肽的序列长度可以为10～35个氨基酸，即所述特定氨基酸序列的长度为8～33个氨基酸。所述多肽的氨基酸序列的长度对于多肽的免疫原性有很大影响，长度太短会造成多肽的特异性差，多肽形成非特异性免疫，产生的抗体为氨基末端脑钠肽前体的非特异性抗体，造成检测结果不准确。多肽长度太长则影响免疫位点的识别，造成多肽的免疫原性差，降低多肽形成抗体的性能。优选的，所述氨基末端脑钠肽前体多肽的序列长度可以为15～25个氨基酸。

优选的，所述特定氨基酸序列可以为如第一氨基酸片段SEQ ID NO.3、第二氨基酸片段SEQ ID NO.4或第三氨基酸片段SEQ ID NO.5所示多肽序列。所述特定氨基酸序列为氨基末端脑钠肽前体区别于其他蛋白的更特异性氨基酸序列，因而所述特定氨基酸序列免疫产生的抗体对氨基末端脑钠肽前体的识别和亲和力更强，利用所述特定氨基酸序列免疫产生的抗体对于目标氨基末端脑钠肽前体的检测灵敏度更高。

半胱氨酸分别添加在所述特定氨基酸序列的氨基末端附近和羧基末端附近，形成的氨基末端脑钠肽前体多肽的氨基末端附近的第一半胱氨酸和羧基末端附近的第二半胱氨酸形成二硫键，从而使所述氨基末端脑钠肽前体多肽形成环状多肽，增加免疫原性。半胱氨酸设置在所述氨基末端脑钠肽前体多肽的氨基末端和羧基末端附近，在基本不会破坏所述特定氨基酸序列的特异性的同时增加了多肽的免疫原性，提高了多肽免疫形成抗体的性能。

在一实施例中，所述氨基末端脑钠肽前体多肽为如第一多肽SEQ ID NO.6、第二多肽SEQ ID NO.7或第三多肽SEQ ID NO.8所示多肽。SEQ ID NO.6为在特定氨基酸序列SEQID NO.3的正数第一位氨基酸之前添加第一半胱氨酸，在倒数第一位氨基酸之前添加第二半胱氨酸。SEQ ID NO.7为在特定氨基酸序列SEQ ID NO.4的正数第一位氨基酸之前添加第一半胱氨酸，在倒数第一位氨基酸之前添加第二半胱氨酸。SEQ ID NO.8为在特定氨基酸序列SEQ ID NO.5的正数第一位氨基酸之前添加第一半胱氨酸，在倒数第一位氨基酸之前添加第二半胱氨酸。SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8的氨基酸序列如表1所示。

表1氨基酸序列表

名称	序列
		SEQ ID NO.1	HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHLQGKLSELQVEQ
SEQ ID NO.2	EGIRGHRKMVLYTLRAPR
		SEQ ID NO.3	HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNHL
SEQ ID NO.4	ETSGLQEQRNHLQGKLSELQVE
		SEQ ID NO.5	GIRGHRKMVLYTLRAPR
SEQ ID NO.6	<u>C</u>HPLGSPGSASDLETSGLQEQRNH<u>C</u>L
		SEQ ID NO.7	<u>C</u>ETSGLQEQRNHLQGKLSELQV<u>C</u>E
SEQ ID NO.8	<u>C</u>GIRGHRKMVLYTLRAP<u>C</u>R

所述氨基末端脑钠肽前体多肽可通过人工合成的方法制备。

本发明实施例还提供一种氨基末端脑钠肽前体检测抗体，所述氨基末端脑钠肽前体检测抗体采用所述的氨基末端脑钠肽前体多肽与载体蛋白偶联形成的偶联蛋白经动物免疫形成。

多肽作为半抗原，只有抗原性而无免疫原性，当多肽与载体蛋白结合后形成大分子，可以获得免疫原性。半抗原多肽与载体形成的免疫原，即可诱导动物免疫产生能够与多肽的特异性结合的抗体和针对载体蛋白的特异性抗体。由于所述多肽与氨基末端脑钠肽前体的特定氨基酸序列基本相同，所述能够与多肽的特异性结合的抗体能够与所述氨基末端脑钠肽前体特异性结合。

在一实施例中，所述氨基末端脑钠肽前体多肽分别为所述第一多肽、所述第二多肽和所述第三多肽，形成的所述偶联蛋白分别为所述第一偶联蛋白、所述第二偶联蛋白和所述第三偶联蛋白，经动物免疫形成的所述氨基末端脑钠肽前体多肽抗体分别为抗第一多肽抗体、抗第二多肽抗体和抗第三多肽抗体，所述抗第一多肽抗体、抗第二多肽抗体和抗第三多肽抗体均能够与所述氨基末端脑钠肽前体特异性结合。

根据所述氨基末端脑钠肽前体多肽具有的自由基团的种类，所述氨基末端脑钠肽前体多肽与载体蛋白的偶联方法不同。所述氨基末端脑钠肽前体多肽具有自由羧基或者可羧化的基团时，所述偶联方法可以选自混合酸酐法和碳二亚胺法中的一种。所述氨基末端脑钠肽前体多肽具有自由氨基或者可还原硝基时，所述偶联方法可以选自戊二醛法和重氮化法中的一种。所述氨基末端脑钠肽前体多肽具有自由羟基时，所述偶联方法可以选自琥珀酸酐法和羰基二咪唑法中的一种。具体偶联方法可以根据所述氨基末端脑钠肽前体多肽的种类进行确定。

在一实施例中，所述载体蛋白可以选自KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin)、牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)和OVA(Ovalbumin)中的一种或多种。

本发明实施例还提供一种所述的抗体的制备方法，包括：

S110，将所述偶联蛋白注射入小鼠皮下组织得到免疫小鼠；

S120，将骨髓瘤细胞与所述免疫小鼠的脾脏细胞进行融合得到杂交瘤细胞；

S130，筛选能够产生NT-proBNP抗体的阳性杂交瘤细胞；以及

S140，将所述阳性杂交瘤细胞注射入其他小鼠腹腔进行培养，在所述培养后的小鼠的腹水中得到所述氨基末端脑钠肽前体抗体。

本发明实施例还提供一种氨基末端脑钠肽前体检测试剂盒，包括：第一抗体包被的固相载体和化学发光分子标记的第二抗体，且所述第一抗体与所述第二抗体不同。

将本发明实施例的种类不同的所述氨基末端脑钠肽前体多肽的经动物免疫可以得到对应的多种种类的抗氨基末端脑钠肽前体的抗体，所述不同的抗氨基末端脑钠肽前体的抗体分别包被固相载体和标记化学发光分子，可以采用夹心法检测样品中的所述氨基末端脑钠肽前体浓度，第一抗体包被固相载体，第二抗体标记化学发光分子，第一抗体和第二抗体分别与目标氨基末端脑钠肽前体结合，增加了目标氨基末端脑钠肽前体检测的特异性和精准性。所述固相载体作为结合的场所，有利于结合后产物的转移和清洗等，目标氨基末端脑钠肽前体结合固相载体上的第一抗体的同时和标记有化学发光分子的第二抗体结合，化学发光分子作为检测标志物，通过化学发光分子的发光量表征目标氨基末端脑钠肽前体的浓度，化学发光分子的发光值与目标氨基末端脑钠肽前体的浓度成正比。待测样品得到的目标氨基末端脑钠肽前体的发光值可以带入到氨基末端脑钠肽前体校准品测定的氨基末端脑钠肽前体浓度与发光值关系的标准曲线中，从而得到待测样品中的氨基末端脑钠肽前体浓度。

在一实施例中，所述化学发光分子可以选自但不限于吖啶酯和吖啶酰胺中的一种或多种。

在一实施例中，所述检测试剂盒还包括校准品、清洗剂以及激发剂中的一种或多种。

所述校准品为特定浓度梯度的天然氨基末端脑钠肽前体溶液，所述氨基末端脑钠肽前体溶液中的溶剂可以包括Tris-HCl缓冲液和牛血清白蛋白溶液中的一种或多种。

所述清洗液用于清洗未结合到所述固定载体上的试剂。所述清洗剂可以包括吐温和的Tris-HCl缓冲液中的一种或多种。

所述激发剂用于与所述化学发光分子反应从而使所述化学发光分子发光。在一实施例中，所述化学发光分子选自吖啶酯和吖啶磺酰胺中的一种或多种，所述激发剂可以包括双氧水、硝酸和氢氧化钠。在碱性双氧水溶液中，所述化学发光分子受到过氧化氢离子进攻时，生成不稳定的二氧乙烷，二氧乙烷分解为CO₂和电子激发态的N-甲基吖啶酮，当N-甲基吖啶酮回到基态时发出最大发射波长为430nm的光子。优选的，所述试剂盒还可以包括发光增强剂，所述发光增强剂可以为表面活性剂，所述表面活性剂可以选自曲拉通(TritonX-100)、十六烷基三甲基氯化铵(CTAC)和吐温20中的一种或多种。

所述固相载体和所述第一抗体的包被方式可以为通过所述固相载体表面的活性基团与所述第一抗体结合或者通过对所述固相载体和所述第一抗体分别进行分子标记，通过标记分子进行结合。所述活性基团可以包括氨基、羧基和羟基中的一种或多种。在一实施例中，所述固相载体的表面具有羧基，所述固相载体能够通过所述羧基与所述第一抗体的氨基结合。所述分子标记可以为生物素和亲和素标记，所述生物素和所述亲和素可以特异性结合。在另一实施例中，所述第一抗体标记有生物素，所述固相载体标记有亲和素。所述亲和素可以选自链霉亲和素。每个链霉亲和素可以结合4个生物素，从而扩大固相载体结合所述第一抗体的容量。

在一实施例中，所述固相载体为所述氨基末端脑钠肽前体检测的结合反应的载体，目标氨基末端脑钠肽前体与第一抗体、第二抗体的结合集成在所述固相载体上，有利于转移、清洗和分离结合后的产物，使得操作更便利。所述固相载体可以为粒子状，粒子状的固相载体的表面积大，提供更多的结合位点从而提高反应容量，并且粒子状的固相载体更适用于液相反应，为检测的实施提供便利。所述固相载体颗粒选自聚苯乙烯粒子和磁性粒子中的一种或多种。优选的，所述固相载体选自磁性颗粒。磁性颗粒作为固相载体具有易于分离的特点，能够适用于自动化生产的需求。并且磁性颗粒的良好的环境抗性使得它可以适应从酸到碱的苛刻反应环境，从而使得反应体系具有更大的包容性。

优选的，所述第一抗体的种类和所述第二抗体的种类通过将所述氨基末端脑钠肽前体检测抗体的全部种类分别包被磁性颗粒和标记化学发光分子，然后将所述包被磁性颗粒和标记化学发光分子的所述氨基末端脑钠肽前体检测抗体进行两两配对组合筛选得到所述第一抗体的种类和所述第二抗体的种类最佳组合。

本发明实施例还提供一种氨基末端脑钠肽前体的检测方法，采用所述的氨基末端脑钠肽前体检测试剂盒，并包括以下步骤：

S210，将检测样品、所述第一抗体包被的固相载体和化学发光分子标记的第二抗体混合得到混合物；

S220，从所述混合物中分离所述固相载体；

S230，检测所述分离得到的所述固相载体的发光信号；以及

S240，将所述发光信号带入到氨基末端脑钠肽前体浓度与发光信号关系的标准曲线中，得到所述检测样品中的氨基末端脑钠肽前体浓度。

优选的，所述将检测样品、所述第一抗体包被的固相载体和所述化学发光分子标记的第二抗体混合得到混合物的步骤可以包括：

S211，将所述检测样品与所述第一抗体包被的固相载体混合孵育预定时间得到第一混合物；

S212，用清洗液清洗所述第一混合物；

S213，从所述清洗后的所述第一混合物中分离所述固相载体；以及

S214，将从所述第一混合物中分离的所述固相载体与所述化学发光分子标记的第二抗体混合孵育得到第二混合物。

通过先将所述第一抗体包被的固相载体和待测样品混合，清洗后再与化学发光分子标记的第二抗体集合，步骤S211使得待测样品中的氨基末端脑钠肽前体与第一抗体结合而固定在所述固相载体上，然后经过步骤S212和步骤S213将未结合到固相载体上的试剂清洗，避免未结合的化学发光分子的干扰。

所述待测样品、所述第一抗体包被的固相载体和所述化学发光分子标记的第二抗体的质量比可以根据待测样品中的氨基末端脑钠肽前体浓度的大致情况进行确定。

实施例

(1)免疫原准备(氨基末端脑钠肽前体多肽合成)：

通过上海吉尔生化生物化学合成以下3段多肽，第一多肽SEQ ID NO.6、第二多肽SEQ ID NO.7和第三多肽SEQ ID NO.8分别偶联载体蛋白BSA得到第一偶联蛋白、第二偶联蛋白和第三偶联蛋白。

(2)氨基末端脑钠肽前体单克隆抗体制备：

步骤(1)得到的第一偶联蛋白、第二偶联蛋白和第三偶联蛋白分别作为免疫原免疫小鼠，同时选择天然蛋白NT-proBNP(欣百诺生物有限公司提供)免疫小鼠作为对照，制备抗第一多肽单克隆抗体、抗第二多肽单克隆抗体、抗第三多肽单克隆抗体和抗天然蛋白单克隆抗体。

具体制备方法为：

将第一偶联蛋白、第二偶联蛋白和第三偶联蛋白或天然蛋白分别与弗氏佐剂等量混合充分乳化后各分别注射到3只Balb/c小鼠，每只小鼠25μg，共免疫3次，间隔时间15天，得到免疫小鼠。

细胞融合、选择性培养、筛选：在注射偶联蛋白或天然蛋白后的第3天后取出免疫小鼠的脾脏细胞，将2.0×10⁷个SP2/0骨髓瘤细胞与2.0×10⁸个经免疫的Balb/c小鼠的脾脏细胞混匀，离心，弃上清，轻微振荡混匀。于37℃水浴中，在90秒内滴加1ml体积浓度为50％的聚乙二醇-1500水溶液，然后滴加20mL1640培养基，离心，弃上清，再洗一次，离心，弃上清，得到杂交瘤细胞。使用HAT选择培养基在96孔细胞培养板上培养杂交瘤细胞，显微镜下检测总融合率＞95％。在96孔板挑选具有单克隆细胞的孔，采用包被天然NT-proBNP蛋白对单克隆细胞孔的上清进行检测，挑取OD450＞0.8的孔内细胞进行亚克隆，最终获得对天然NT-proBNP反应阳性率＞99％的细胞克隆，作为分泌抗NT-proBNP单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株。

细胞克隆：对获得的阳性杂交瘤细胞株进行克隆，使用有限稀释法，克隆3次，最后得到产生高效价的抗NT-proBNP单克隆抗体杂交瘤细胞系7株，扩大培养，冻存。

腹水制备：6-8周龄雌性Balb/c小鼠用石蜡处理10天后，取阳性杂交瘤细胞以2×10⁶个细胞/只小鼠进行腹腔注射。10天后从小鼠腹腔中获取富含NT-proBNP抗体的腹水，测定腹水效价＞10⁵。

纯化：采用protein G亲和层析法。首先制备protein G亲和层析柱，用PBS平衡柱子后，取腹水过柱，然后用PBS清洗柱子，以50nmol/L的甘氨酸盐酸盐溶液洗脱，收集洗脱液，测定各收集管的OD值，保留峰值区的洗脱液，峰值区洗脱液经透析后收集。经SDS-PAGE电泳鉴定为纯化的单克隆抗体，纯度为98％以上。

(3)抗体效价检测

天然蛋白、第一多肽、第二多肽、第三多肽免疫小鼠所得到的抗体分别命名：抗天然蛋白单克隆抗体、抗第一多肽单克隆抗体、抗第二多肽单克隆抗体、抗第三多肽单克隆抗体。包被天然NT-proBNP 1ug/mL作为抗原，对纯化后的抗天然蛋白单克隆抗体、抗第一多肽单克隆抗体、抗第二多肽单克隆抗体、抗第三多肽单克隆抗体分别进行效价间接检测。抗原稀释浓度为3ug/mL、1ug/mL、0.33ug/mL、0.11ug/mL、0.036ug/mL、0.012ug/mL，使用间接法检测多株抗体效价，酶联免疫法检测结果见表2-5。分别选择2株效价最高的抗体，标记辣根过氧化物酶(HRP)，进行进一步的抗体配对筛选实验。

表2抗天然蛋白单克隆抗体效价

选择第一株(1#)和第二株(2#)抗第一多肽单克隆抗体进行进一步的抗体配对筛选试验。

表3抗第一多肽单克隆抗体效价

选择第一株(1#)和第二株(2#)抗第一多肽单克隆抗体进行进一步的抗体配对筛选试验。

表4抗第二多肽单克隆抗体效价

选择第一株(1#)和第二株(2#)抗第二多肽单克隆抗体进行进一步的抗体配对筛选试验。

表5抗第三多肽单克隆抗体效价

选择第一株(1#)和第二株(2#)抗第三多肽单克隆抗体进行进一步的抗体配对筛选试验。

(4)抗体标记HRP

由于配对筛选的工作量大、试剂使用量多。本实施例采用HRP标记抗体代替吖啶酯标记筛选第一抗体和第二抗体的最佳配对组合。

每株抗体总量200ug，体积200ul，装进透析袋，在50mM碳酸盐(CB)缓冲液(pH9.6)中透析4℃低温过夜，第二天早上更换CB缓冲液。配置5mg/ml的NaIO₃和5mg/ml的HRP溶液，两者搅拌混匀，添加乙二醇终止反应，即为氧化的HRP。每株抗体加160μl氧化的HRP到透析抗体的透析袋里面，上下混匀，4℃下边透析边反应3h得到HRP标记的抗体(反应1h后换CB缓冲液)。取出透析袋中HRP标记的抗体，记录其体积V。配置5mg/ml的NaBH₄溶液。每抗体加入8μl的NaBH₄溶液，低温4℃混匀1h。按HRP标记抗体的体积V，加入1/2V的牛血清和V的饱和硫酸铵，混匀，4℃静置30min。12000rpm，离心10min，弃上清。先加100μl(80％PBS+20％牛血清)复溶，再加100μl甘油，最后HRP标记抗体的浓度为1mg/ml。

(5)抗体配对筛选

选取步骤(3)的2株高效价的多肽抗体，分别包被磁性颗粒和进行HRP标记，用天然蛋白NT-proBNP作为抗原进行抗体，采用夹心法进行抗体配对筛选。具体实验数据如表6所示。选择检测值最高的配对，进行进一步实验。

表6多肽抗体配对效价比较

从表6可以看出，第一株抗第一多肽单克隆抗体包被磁性颗粒和第一株抗第二多肽单克隆抗体标记的组合、第二株抗第三多肽单克隆抗体包被磁性颗粒和第一株抗第二多肽单克隆抗体标记的组合采用夹心法测定的效价最高。

(6)NT-proBNP检测试剂盒制备

第一抗体包被磁性颗粒的制备：

取50mg羧基化的磁性颗粒(粒径为0.05-1um)悬浮液，磁分离，留沉淀，然后使用20mM，pH5.5 2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)缓冲液重悬，加入1mL新鲜制备的10mg/mL的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)水溶液，活化磁性颗粒表面羧基，加入4mg第一抗体(抗第一多肽单克隆抗体、抗第一多肽单克隆抗体或抗第一多肽单克隆抗体)，室温下混悬6h，磁分离，去上清，用含2％BSA的100mM pH8.0的Tris缓冲液重悬到1mg/mL，得到第一抗体包被的磁性颗粒，按5mL/瓶分装，4℃保存备用。

标记吖啶酯的第二抗体的制备：

取50ul 25mg/mL的第二抗体(抗第一多肽单克隆抗体、抗第一多肽单克隆抗体或抗第一多肽单克隆抗体，非第一抗体)，加入150ul 0.1M pH9.0-9.5的碳酸盐缓冲液，混匀，然后加入1.5ul 5mg/mL的吖啶酯混匀，室温下避光反应，1.5h后取出，用5mL GE Desalting预装柱脱盐处理，先使用TBS平衡层析柱，然后加入反应后的吖啶酯溶液，收集蛋白峰样品保存，按5mL/瓶分装，4℃保存备用。

NT-proBNP校准品的制备：

用缓冲液(40mM Tris-Cl，0.5％BSA，1％NaCl，pH8.0)将制备的NT-proBNP溶液配制成浓度为0pg/mL、120pg/mL、2000pg/mL，每瓶1mL分装冻干，4℃保存备用。

(7)人NT-proBNP化学发光免疫检测方法：

本发明以化学发光测定仪为检测工具，步骤(6)的试剂盒为检测试剂，方法学模式为夹心法，即仪器依次加入检测样品、第一抗体包被的磁性颗粒、标记吖啶酯的第二抗体，反应10min后，进行磁分离，仪器将反应混合物送入暗室，依次加入化学发光预激发液、化学发光激发液进行发光反应，最后记录发光强度，从标准曲线计算出检测样品的NT-proBNP浓度。

(8)NT-proBNP检测试剂盒性能评价

采用步骤(7)的方法，对0pg/mL、120pg/mL、2000pg/mL浓度的NT-proBNP校准品进行检测，绘制标准曲线如图2所示。

接着对接着测试实际检测样品，根据检测样品发光值计算检测样品的NT-proBNP浓度。

灵敏度的检测：

参照美国临床实验室标准化委员会标准(CLSI EP17-A)文件推荐实验方案，计算NT-proBNP检测试剂盒的灵敏度，求得的灵敏度为5.0pg/mL。

线性的检测：

采用NT-proBNP检测试剂盒，对浓度为5pg/mL、100pg/mL、500pg/mL、1000pg/mL、5000pg/mL、10000pg/mL、20000pg/mL和35000pg/mL的NT-proBNP抗原做线性分析，计算线性相关系数，r＝0.9995，另外，该试剂盒对NT-proBNP样品检测的线性范围为5.0pg/mL～35000pg/mL。

精密度测定：

取浓度为120pg/mL及2000pg/mL两个NT-proBNP样品，每个样本每个浓度各做3个平行，用三批试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均小于5％。

干扰性实验：

取混合血清分别添加干扰物，干扰物包括：结合胆红素、游离胆红素、血红蛋白、抗坏血酸和甘油酯中的一种或多种，血清和干扰物添加质量比按照1：20进行，分别测定混合血清及添加了各种干扰物后混合血清的测值，计算二者之间的偏差，以±10％为可接受范围。结果表明，干扰性均达到NCCLS文件标准，可用于临床实验室NT-proBNP状况的准确评估。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

序列表

<110> 深圳市亚辉龙生物科技股份有限公司

<120> 氨基末端脑钠肽前体多肽、抗体及其制备方法、检测试剂盒及检测方法

<160> 8

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly

1 5 10 15

Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu Ser Glu Leu Gln

20 25 30

Val Glu Gln

35

<210> 2

<211> 18

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Glu Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala

1 5 10 15

Pro Arg

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser Gly

1 5 10 15

Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu

20

<210> 4

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys Leu

1 5 10 15

Ser Glu Leu Gln Val Glu

20

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala Pro

1 5 10 15

Arg

<210> 6

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Cys His Pro Leu Gly Ser Pro Gly Ser Ala Ser Asp Leu Glu Thr Ser

1 5 10 15

Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Cys Leu

20 25

<210> 7

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Cys Glu Thr Ser Gly Leu Gln Glu Gln Arg Asn His Leu Gln Gly Lys

1 5 10 15

Leu Ser Glu Leu Gln Val Cys Glu

20

<210> 8

<211> 19

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Cys Gly Ile Arg Gly His Arg Lys Met Val Leu Tyr Thr Leu Arg Ala

1 5 10 15

Pro Cys Arg

Claims (10)

1.一种氨基末端脑钠肽前体多肽，其特征在于，所述氨基末端脑钠肽前体多肽通过在天然氨基末端脑钠肽前体的特定氨基酸序列的氨基末端附近和羧基末端附近分别添加第一半胱氨酸和第二半胱氨酸形成，所述特定氨基酸序列为SEQ ID NO.3所示多肽序列，所述氨基末端附近为所述特定氨基酸序列的氨基末端的1～3个氨基酸，所述羧基末端附近为所述特定氨基酸序列的羧基末端的1～3个氨基酸，所述第一半胱氨酸和所述第二半胱氨酸能够形成二硫键，从而使得所述氨基末端脑钠肽前体多肽能够形成环状多肽。

2.根据权利要求1所述的氨基末端脑钠肽前体多肽，其特征在于，所述氨基末端脑钠肽前体多肽为如SEQ ID NO.6所示多肽。

3.一种偶联蛋白，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的氨基末端脑钠肽前体多肽，还包括与所述氨基末端脑钠肽前体多肽偶联的载体蛋白。

4.根据权利要求3所述的偶联蛋白，其特征在于，所述氨基末端脑钠肽前体多肽具有自由羧基或者可羧化的基团。

5.根据权利要求4所述的偶联蛋白，其特征在于，所述氨基末端脑钠肽前体多肽与所述载体蛋白的偶联方法选自混合酸酐法和碳二亚胺法中的一种。

6.根据权利要求3所述的偶联蛋白，其特征在于，所述氨基末端脑钠肽前体多肽具有自由氨基或者可还原硝基。

7.根据权利要求6所述的偶联蛋白，其特征在于，所述氨基末端脑钠肽前体多肽与所述载体蛋白的偶联方法选自戊二醛法和重氮化法中的一种。

8.根据权利要求3所述的偶联蛋白，其特征在于，所述氨基末端脑钠肽前体多肽具有自由羟基。

9.根据权利要求8所述的偶联蛋白，其特征在于，所述氨基末端脑钠肽前体多肽与所述载体蛋白的偶联方法选自琥珀酸酐法和羰基二咪唑法中的一种。

10.根据权利要求3～9任一项所述的偶联蛋白，其特征在于，所述载体蛋白选自KLH、牛血清白蛋白和OVA中的一种或多种。

Images