JP6687391B2

JP6687391B2 - リウマチ性関節炎（ｒａ）の存在を決定するためのサンプルの測定方法

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Publication number: JP6687391B2
Application number: JP2015555811A
Authority: JP
Inventors: アフバニッシム; デービットペレット; ポールジーウィンヤード; バレリエエムコリガル; ガブリエルエスパナニ
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Priority date: 2013-02-05
Filing date: 2014-02-05
Publication date: 2020-04-22
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Description

本発明はリウマチ性関節炎（rheumatoid arthritis:ＲＡ）と変形性関節症（osteoarthritis:ＯＡ）のためのバイオマーカーに関する。
本発明は特には、そのようなバイオマーカーを、ＲＡとＯＡを診断する方法で使用して薬剤に対するＲＡの患者の反応を予測するための使用に関連する。

本発明の背景
リウマチ性関節炎（ＲＡ）は、最も一般的な自己免疫性慢性関節炎であり、人口の０．５から１％までに影響する。本症は、関節の慢性炎によって特徴付けられて、軟骨と骨の滑膜炎とびらんをともなう。損傷は炎症誘発性サイトカイン、フリーラジカル、およびマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）の作用にかかわる。炎症関節に浸潤する代謝的に活性な免疫細胞の高い流入は、増加する量の酸素を消費し、レスピレイトリーバーストと反応性酸化剤の生成を伴う。炎症関節に存在しているいくつかの主要な反応性酸素分子種（ＲＯＳ）は過酸化物ラジカル（Ｏ_２ ⁻）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）、水酸ラジカル（・ＯＨ）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、一酸化窒素ラジカル（ＮＯ・）、および過酸化窒素（ＯＮＯＯ⁻）である。それらは急性および慢性の炎症にかかわる。さらに、高血糖の不存在にもかかわらず、グリケート化によるコラーゲン酸化の結果としての軟骨損傷と、進行グリケーション最終産物（advanced glycation end-products：ＡＧＥ）の形成は明白である。

ＯＡは全身性炎症性疾患ではないが、一般的に滑膜炎はＲＡほど激しくない。軟骨細胞、滑膜細胞、および浸潤する免疫細胞は、炎症を起こしているＲＡ関節に存在する物に類似する炎症仲介物質をＯＡ関節内に生成する。ＯＡ軟骨細胞は、代謝的にアクティブであり、高水準のＲＯＳを製造する。事実上、ＯＡとＲＡの両方で、グリケート化（glycation)によるコラーゲン酸化の結果としての軟骨損傷と、進行グリケーション最終産物（ＡＧＥ）の形成は明白である。

コラーゲンＩＩ型（ＣＩＩ）はヒト関節軟骨の主成分である。したがって、このタンパク質は炎症関節のＲＯＳによる化学翻訳後修飾（chemical post-translational modification）のための重要な目標であり、ＲＯＳ（ＲＯＳ−ＣＩＩ）により翻訳後修飾された製品ＣＩＩをもたらす。ネイティブＣＩＩはよく研究されたＲＡ内の自己抗原(auto-antigen)である。それにもかかわらず、本発明者は、以前に、ＲＯＳ−ＣＩＩに対する自己免疫性反応性を報告した(Nissim et al. Arthritis & Rheumatism 52: 3829-38, 2005)。化学翻訳後修飾と異なり、ＲＡにおける免疫応答を調節することにおける酵素の翻訳後修飾の関連性が示された。環状シトルリン化ペプチド（ＡＣＰＡ）に対する抗体とタンパク質は、ＲＡで重要な診断薬および予後徴候ツールになった（Pruijn et al. Arthritis Research & Therapy 12(1): 203, 2010)。ＲＡをもっている多くの患者で、シトルリン化ＣＩＩ（citrullinated CII）はＡＣＰＡ反応性の一部でもある。シトルリン化されたタンパク質の起源と、その疾病病因への貢献はまだ不完全にしか理解されていない。
さらに、ＡＣＰＡの診断鋭敏度は約６０％であり、いくつかのセンターは診断時点で最小４０％のＡＣＰＡの正値性を報告している。どのような場合でも、有意の割合のＲＡ患者がＡＣＰＡ陰性である。その上、ＡＣＰＡのレベルは、疾病進行の間、治療の後にさえ有意に変化しない。したがって、ＲＡ患者の改善された診断および予後に関する新手法のための必要が当技術分野にある。

発明の要約
本発明者は、たとえばＲＯＳ−ＣＩＩのような酸化されたＣＩＩの自己抗体がＲＡのバイオマーカーとして使用されることを確証した。特に、患者内の酸化されたＣＩＩに対する抗体の存在は、ＲＡの診断に使用することができる。またそれらは、ＲＡ患者のある種の薬物に対する反応を予測するのに使用される。

第１の態様では、本発明は以下を含む、リウマチ性関節炎（ＲＡ）を診断する方法を提供する：
被検者からのサンプルを、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在について試験すること、
ここで、サンプル内の酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在は被検者のＲＡを示す。

第１の態様では、本発明はＲＡの診断方法に関する。言い換えれば、本発明は被検者にＲＡがあるかどうか決定する方法、またはＲＡに関する検査方法に関する。また、本発明の方法はアッセイとしても記述されている。発明者は、本発明の第１の態様の方法は、初期段階で正確にＲＡを診断するのに使用できることを見いだした。例えば、典型的には疾病（例えば、臨床的な滑膜炎の始まりで決定される）疾病発現の１年以内に診断できる。したがって、本発明方法は、ＲＡを持っていると疑われる被検者からのサンプルに対して典型的に行われる。例えば、被検者は関節痛（joint pain）、関節の痛み（arthralgia）、関節腫脹（例えば関節滲出）、滑膜炎（滑膜の炎症）、筋骨格痛、関節のこわばり感、疲労感、被刺激性、鬱病、貧血および／またはインフルエンザ様症状などのＲＡの１種以上の症状を示すことがある。本発明方法は、たとえば疾患修飾抗リウマチ薬物類（disease-modifying anti-rheumatic drugs：ＤＭＡＲＤｓ）または生物学的製剤（biologics）のようなＲＡのための任意の薬物類で治療されていない被検者からのサンプルに対して典型的に行われる。

また発明者は、ＲＡのための診断手段としての被検者の酸化されたＣＩＩに対する抗体の存在が、被検者での環状シトルリン化ペプチドに対する抗体（ＡＣＰＡ）の存在または、Ｃ反応性蛋白質（ＣＲＰ）、ＤＡＳ２８またはリウマトイド因子（ＲＦ）などのＲＡのいかなる他の古典的な既存の診断検査法とも独立していることが驚くべき事にわかった。したがって、本発明の第１の態様の方法によって、環状シトルリン化ペプチド（ＡＣＰＡ）に抗体を持っていない患者、すなわちＡＣＰＡ陰性である患者の診断における使用を見いだした。

患者におけるＡＣＰＡの存在または不存在を決定するテストは当技術分野で知られている。これらは第二世代ＣＣＰテスト（ＣＣＰ２テスト）を含んでいる。そのようないくつかのテストは商業的に利用可能であり、たとえばAxis-Shield Diagnostics Limited, Dundee, UKからのDiastat（登録商標）、Eurodiagnostica, Malmo, SwedenからのImmunoscan-CCP Plus（登録商標）と、InovaからのQuanta Liteがあげられる。ＡＣＰＡ検定方法は、たとえばPruijn他、Arthritis Research & Therapy, 12(1):203 (2010)に記載されている。

本明細書に記載されたように、ＡＣＰＡはＲＡで重要な診断薬、および予後徴候ツール（prognostic tools）になったが、ＡＣＰＡの診断鋭敏度は高くない（約６０％）。したがって、ＡＣＰＡ陰性の患者を診断するのに使用されることができるので、本発明は、ＲＡの改良された診断のための新手法を提供する。

本発明の第１の態様の方法は、酸化されたコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）に対する抗体の存在または不存在のために被検者からのサンプルを試験することを含む。

酸化されたコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）は、非酵素学的グリケート化によるか、反応性酸素分子種（ＲＯＳ）によるか、またはアルデヒドを含む反応によるか、またはそれの組み合わせにより酸化された翻訳後修飾コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）である。抗応性酸素分子種としては、たとえばスーパーオキシドラジカル（Ｏ_２・⁻）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）、遷移金属イオンと組み合わせた脂質ヒドロペルオキシド（例えば、二価鉄、三価鉄、第一銅または第２銅の塩）、水酸ラジカル（・ＯＨ）これは遷移金属イオン（例えば、二価鉄、三価鉄、第一銅または第２銅の塩）を過酸化水素と組み合わせることにより生物学系でしばしば発生される、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜臭素酸（ＨＯＢｒ）、一酸化窒素ラジカル（ＮＯ・）、二酸化窒素ラジカル（ＮＯ_２・）および過酸化窒素（ＯＮＯＯ⁻）があげられるが、これらに限定されない。技術分野の何人かの研究者は、ＲＯＳのサブグループを区別するために「反抗応性窒素種」（例えば、ＮＯ・）や「反応性塩素種」（例えば、ＨＯＣｌ）などの用語を使用するが、本書では私たちは最も広い意味でＲＯＳという用語を使用している。グリケート化（Glycation）はグルコース、リボースまたは他の糖類によって典型的に引き起こされる。また、ＣＩＩはアルデヒド、たとえばマロンアルデヒドおよび／または４ヒドロキシノネナールを含む反応により化学変性されることができる。

典型的に、酸化されたコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）は、反応性酸素分子種（ＲＯＳ）で酸化された翻訳後修飾コラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）、すなわちＲＯＳ−ＣＩＩである。本発明のこの実施態様では、ＲＯＳは典型的に次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）である。また、本明細書に使用されるとき、「酸化されたコラーゲンＩＩ」という用語は、酸化されたコラーゲンＩＩのフラグメントを含む。すなわち、ＲＯＳまたは非酵素的グリケート化、または本明細書に記載された他の方法で修飾されたＣＩＩのフラグメントを含む。ＲＯＳによって変更されたそのようなフラグメントは、本明細書では”ＲＯＳ−ｆＣＩＩ”と呼ばれる。したがって、本発明は、酸化されたコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）またはそれのフラグメントに対する抗体の存在または不存在について被検者からのサンプルを試験することを含む。酸化されたＣＩＩのフラグメントは、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰｓ）またはＲＯＳによる切断で発生させることができ、さらに追加のＲＯＳにより修飾することができる。

本発明方法は、酸化されたコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）に対する抗体の存在または不存在について被検者からのサンプルを試験することを含む。試験される抗体は、テストされる被検者に存在している酸化されたＣＩＩに対する自己抗体である。抗体は、典型的には免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）イソタイプまたは異なるＩｇＭまたはＩｇＡイソタイプのものである。サンプルは酸化されたコラーゲンＩＩに対して自己抗体を含むことができる被検者からの任意のサンプルである。典型的に、サンプルは滑液（ＳＦ）、血清、血漿または全血のサンプルである。好適な実施例では、サンプルは、血清またはＳＦのサンプルである。代替の実施態様では、サンプルは炎症関節へ浸潤した免疫体のサンプル、軟骨生険または滑膜生険からの組織試料である。

酸化されたＣＩＩに対する抗体の存在または不存在は、任意の適切な方法またはアッセイで決定できる。サンプル中の自己抗体を測定するのに使用されるさまざまな異なったタイプの利用可能な免疫学的アッセイがある。典型的に、そのような抗体の存在または不存在が、ＥＬＩＳＡアッセイまたはWestern Blottingなどの抗体抗原結合性に基づくアッセイを使用することで決定できる。典型的なＥＬＩＳＡアッセイでは、抗原は表面に付けられている。したがって、本発明では、ＲＯＳ−ＣＩＩまたはＣＩＩのフラグメントなどの酸化されたＣＩＩ、たとえばＲＯＳで修飾されたＣＩＩのフラグメント（ＲＯＳ−ｆＣＩＩ）が表面に付けられる。特異性抗体（第一次抗体）は、次に表面に適用されて、抗原に結合する。本発明では、患者から取られたサンプル中に抗体があるので、方法のこの工程においてサンプルが表面に適用される。第二抗体（第二次抗体）が加えられ、それは第一次抗体に結合する。第二次抗体が酵素に結合し、次に該酵素の基体を含む物質が加えられる。次の反応は検出可能な信号、典型的に基体の色変化をもたらす。信号の強度は第一次抗体の量を示している。検出可能な信号が色変化であるときに、スペクトロメーターは、色濃度の定量値を与えるためにしばしば使用される。

１つの実施態様では、発明の第１の態様によるアッセイは以下を含む：
酸化されたＣＩＩと被検者からのサンプルを接触させること；
抗酸化ＣＩＩ抗体（anti-oxidised CII antibodies）に結合する標識抗体を加え、複合体を形成すること；および
抗酸化ＣＩＩ抗体と標識抗体の間での複合体の形成を検出すること；
ここで、前記複合体の検出が被検者のＲＡを示す。

本発明における使用のためのＥＬＩＳＡアッセイなどの抗体抗原結合性アッセイは、酸化されたＣＩＩを使用して行われ、例えば、ＲＯＳ−ＣＩＩを、被検者から取られたサンプルの抗体のための目標として使用する。そのようなアッセイでは、ＣＩＩは抗体目標として、化学修飾で調製され、例えば、ＨＯＣｌ、ＯＮＯＯ⁻、・ＯＨなどのＲＯＳまたはリボースを使用して調製され、酸化されたＣＩＩを生産する。適当なＥＬＩＳＡアッセイでは、ＥＬＩＳＡプレートは酸化されたＣＩＩで餌としてコーティングされ、例えばＳＦまたは血清試料のようなサンプルからの自己抗体と結合する。そして、必要に応じてバッファが加えられている状態で、サンプルはＥＬＩＳＡプレートに加えられる。そして、必要に応じて、未反応タンパク質が、酸化されたＣＩＩでコーティングが施されないままで残っているＥＬＩＳＡプレートのすべての表面をブロックするために加えられる。ついで、西洋ワサビペルオキシダーゼなどの酵素が加えられる。酵素は典型的にサンプルからの抗体に結合するために抗ヒトＩｇＧ抗体に共役結合する。最終的に、基体（例えば、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンなどの発色基質）が加えられる。そして、活性を、例えば、光学濃度(ＯＤ)の測定などの適切な方法を使用することで決定する。あるいはまた、発けい光性または電気化学発光が適宜使用できる。酸化されたＣＩＩのための、適当なＥＬＩＳＡ検定方法は本明細書の実施例に記載される。または、Nissim et al.Arthritis & Rheumatism 52:3829-38, 2005 に記載されている。

他の酸化されたＣＩＩのための適当な検定方法としては以下があげられる：Meso Scale Discoveryから利用可能な、ＭＵＬＴＩ−ＡＲＲＡＹＲ（登録商標）技術に基づいた、同時に多くの異なった抗原（例えば、異なった修飾を有するＣＩＩ）のアッセイを許容するマルチプレックス検定方法；ビードベースの流動細胞計測法、例えばＢＤ（登録商標）細胞数測定ビード配列（Cytometric Bead Array：ＣＢＡ）；例えば、Biacoreから利用可能な、表面プラスモン共鳴法（surface plasmon resonance：ＳＰＲ）ベースシステム。

本発明のいくつかの実施態様では、被検者からのサンプルはコントロールまたは対照試料と比較される。対照試料は、例えば、健康対照者被検者のような、ＲＡにかかっていないことが知られている被検者から取られたサンプルである。しかしながら、対照試料は、例えば本明細書に実施例に使用されるように、関節痛にもかかわらず、滑膜炎の臨床上の証拠がないＡＣＰＡ陽性の個人またはＯＡ患者からのサンプルであることができる。対照試料は、たとえば乾癬性関節炎、全身性エリテマトーテス（ＳＬＥ）、強直性脊椎炎、回帰性の炎症性関節腫脹、強皮症、ベーチェット病、原発性シェーグレン症候群、繊維筋痛、炎症性関節炎、腱炎または反応性関節炎などの他の炎症性関節炎状態の患者からのサンプルであることができる。更なる実施態様では、陽性および／または陰性の参照サンプルが使用される。他の実施態様では、ネイティブＣＩＩ（すなわち、酸化していないＣＩＩ）が対照として使用される。他の実施態様では、ネイティブヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ＲＯＳ修飾ＢＳＡまたはＨＳＡがコントロール抗原として使用される。

本発明の第１の態様の方法と本明細書に記載された本発明の他の態様の方法では、酸化されたコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）に対する抗体の存在または不存在が、コントロールまたは対照試料、典型的には酸化されたＣＩＩに対して抗体を含まないことが知られている対照試料との比較により決定される。被検者からのサンプルが酸化されたＣＩＩまたはそれのフラグメントに対して、対照試料より有意に多量の抗体を含んでいるなら、これは被検者での酸化されたＣＩＩに対する抗体の存在を確認する。逆に、被検者からのサンプルが酸化されたＣＩＩまたはそれのフラグメントに対して、対照試料より有意に多量の抗体を含んでいないなら、これは被検者での酸化されたＣＩＩに対する抗体の不存在を確認する。

酸化されたＣＩＩまたはそれのフラグメントに対する抗体の存在が、たとえばサンプル中の抗体の量と対照試料中の抗体の量との有意差を見い出すことにより決定される。当技術分野で知られていた統計的検査法、例えば、ウィルコクソンサインドランクサムテスト（Wilcoxon signed rank sum test）またはマンホイットニー検定（Mann-Whitney test）が使用できる。

被検者は典型的にヒト被験者である。しかしながら、本発明の方法は獣医学の分野でも使用でき、したがって、たとえば馬、牛および羊などの農業獣類、猫や犬などのコンパニオン・アニマルなどの、典型的には哺乳動物におけるリウマチ性関節炎を診断するのに使用されることができる。

本発明の方法は先に被検者から入手されたサンプルについて典型的に行われる。したがって、サンプルの取得は典型的に本発明の方法の一部を形成しない。本発明の方法は被検者から入手されたサンプルに対して行われる。しかしながら、本発明のいくつかの実施態様では、本発明方法は、例えば、血液試料または滑液のサンプル、浸潤免疫体、軟骨または滑膜生険サンプルなどを、被検者から取得することを含む。例えば、滑膜流体試料は膝関節鏡視下手術または膝関節吸引で集められる。

また、発明者は、酸化されたＣＩＩへの反応性と疾患修飾抗リウマチ薬物類（disease-modifying anti-rheumatic drugs：ＤＭＡＲＤｓ）への反応との間に相関関係があることを驚くべき事に発見した。特に、酸化されたＣＩＩに反応しない患者（すなわち、酸化されたＣＩＩに対する自己抗体のない患者）が、ＤＭＡＲＤ治療に良好に反応する。
したがって、酸化されたＣＩＩに対する自己抗体は、患者がＤＭＡＲＤｓでの治療に反応するかどうかに関する指標として使用される。

従って、第２の態様では、本発明は被検者が疾患修飾抗リウマチ薬物類（ＤＭＡＲＤ）に応答するかどうかを同定するための、以下を含む方法を提供する；
酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在の確認のために被検者からのサンプルを試験すること；
ここで、サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の不存在は、被検者がＤＭＡＲＤに応答することを示す。

疾患修飾抗リウマチ薬物類（ＤＭＡＲＤｓ）は、リウマチの疾病進行を減速させるための使用により定義され、その他の点では関係ない薬物類のカテゴリである。ＤＭＡＲＤｓとしては、金塩オーラノフィン、ソジウムアウロチオマレート、アザチオプリン（イムラン）、抗マラリア性クロロキン、およびハイドロキシクロロキン（Plaquenil）、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、レフルノミド（Arava）、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ミノサイクリン（Minocin）、ペニシラミン、およびスルファサラジン（ＳＳＺ、アザルフィジン）があげられる。１つの実施態様では、ＤＭＡＲＤはメトトレキサートである。

本発明の第２の態様の方法は、被検者がそのようなＤＭＡＲＤに応答するかどうかを同定するものである。「ＤＭＡＲＤに応答する」は、ＤＭＡＲＤｓでの治療に応答するの意味であり、言い換えれば、ＤＭＡＲＤｓの使用がＲＡの症状の厳しさを減少させるか、または患者のＲＡを全体的に排除することを意味する。ＤＭＡＲＤでの治療に応答するか否かは、ＤＭＡＲＤでの治療の前後での疾病重症度を評価することによって決定できる。例えば、疾病重症度は、Fransen et al, Arthritis & Rheumatism (Arthritis Care & Research), vol. 49, no. 5S, pp S214-S224, 2003 に記載される、疾患活動性スコア（ＤＡＳ）を使用することで評価される。ＤＡＳはＲＡ疾患活性の一つの測定を総合的で連続した測定と組み合わせる。ＤＭＡＲＤでの治療に応答する被検者は、例えば、ＤＭＡＲＤでの治療後にＤＡＳを使用して決定された時に、低い疾病活性を達成するものとして分類されることができる。ＤＭＡＲＤでの治療に応じない被検者は、例えば、ＤＭＡＲＤでの治療後にＤＡＳを使用して決定された時に、高い疾病活性を維持しているものとして分類されることができる。

本発明の第２の態様のこの方法は、ＲＡを持っているのが知られている被検者からのサンプルについて典型的に行われる。従って、本発明の第２の態様の１つの実施態様では、被検者はＲＡを持っている。たとえば、方法は、本発明の第１の態様の方法を使用することでＲＡを持っているとして同定された患者に関して行われることができる。したがって、いくつかの実施態様では、本発明の第１の態様の方法と組み合わせて本発明の第２の態様の方法が行われる。別の実施態様では、被検者はＲＡを持っていると疑われ、例えば、被検者は関節痛（関節痛）、筋骨格痛、関節腫脹（関節滲出液のために）、滑膜炎（滑膜の炎症）、関節のこわばり感、疲労感、被刺激性、鬱病、貧血および／またはインフルエンザ様症状などのＲＡの１種以上の症状を示す。

また、本発明の第２の態様の方法は、以前に１種以上のＤＭＡＲＤｓで治療されるか、または現在治療されている被検者からのサンプルに対して典型的に行われる。この態様では、本発明は、患者が１種以上のＤＭＡＲＤｓの治療に応答するか否かをモニターする方法に関する。代替の態様では、被検者は現在又は過去において１種以上のＤＭＡＲＤｓで治療されていない。この態様は、本発明は患者が１種以上のＤＭＡＲＤｓでの治療に応答するかどうかを予測する方法に関する。

本発明の第２の態様では、サンプルは典型的に滑液（ＳＦ）のサンプルである。本発明の第２の態様の方法は、患者がＤＭＡＲＤに応答するかどうかに関する指標を与える。
したがって、また、本発明の第２の態様はＤＭＡＲＤで患者を治療する更なる工程を含む方法を包含する。この実施態様では、被検者が酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体を有せず、したがってＤＭＡＲＤでの治療に応答することが決定され、次に、被検者がＤＭＡＲＤとで治療される（または、さらに治療される）。典型的な本発明の第２の態様では、被検者は１種以上のＤＭＡＲＤｓで、以前に治療されているか、または現在治療されている。従って、本発明のこの態様はＲＡでの効果的治療実験計画書の指標を患者に提供する。

従って、この実施態様では、本発明は以下の工程を含む、必要とする被検者にリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する方法を提供する；
被検者からの、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のためのサンプルを試験すること；
サンプル中の、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の不存在を同定すること；および
ＤＭＡＲＤを被検者に投与すること。

また、逆の場合にも本発明のこの態様が利用される。すなわち、テストがサンプルでの抗体の存在を示す場合には、患者が酸化されたＣＩＩに対する自己抗体を有することを意味する。これは、患者がＤＭＡＲＤでの（さらなる）治療に応じないで、したがって、代替の薬で治療されるべきであることを示す。

従って、この実施態様では、本発明は以下の工程を含む、必要とする被検者にリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する方法を提供する；
被検者からの、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のためのサンプルを試験すること；
サンプル中の、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在を同定すること；および
非ＤＭＡＲＤＲＡ薬（non-DMARD RA drug）を被検者に投与すること。

非ＤＭＡＲＤＲＡ薬は典型的には生物学的製剤（biologic）である。「生物学的製剤」であるとは、（化学合成ではなく）生物学的工程によって作成される薬または医薬品であることを意味する。１つの実施態様では、生物学的製剤は抗体である。本発明のこの態様による使用のための適当な非ＤＭＡＲＤＲＡ薬物としては以下があげられる。アバタセプト（abatacept）（オレンシア：Orencia）、アダリムマブ（adalimumab）（フミラ：Humira）、アナキンラ（anakinra）（キネレット：Kineret）、セルトリズマブペゴル（certolizumab pegol）（シムジア：Cimziａ）、エタナーセプト（etanercept）（エンブレル：Enbrel)、ゴリブマブ（golimumab）（シンポニ：Simponi）、インフリシマブ（infliximab）（レミケード：Remicade)、リツキシマブ（rituximab）（リツキサン：Rituxan)、およびトシリズマブ（tocilizumab）（アクテムラ：Actemra）。第１のラインの生物学の治療は、典型的には抗ＴＮＦ（腫瘍壊死因子）抗体、またはそれのフラグメントである。
抗ＴＮＦ生物学的製剤としては以下があげられる；アダリムマブ(Humira)、セルトリズマブペルゴ(Cimzia)、エタナーセプト(Enbrel)、ゴリブマブ(Simponi)およびインフリクスマブ(Remicade)。異なった方法で作用する生物学的製剤、すなわちそれらの目標としてＴＮＦがないものとしては以下があげられる：アバタセプト(Orencia)、アナキンラ(Kineret)、リツキシマブ(Rituxan)、およびトシリズマブ(Actemra)。

典型的に、本発明のこの態様では、被検者は、１種以上のＤＭＡＲＤｓで以前に治療されているか、または現在治療されている。

あるいはまた、本発明のこれらの態様は以下の通り表現される。
必要とされる被検者のリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する、以下を含む方法における使用のためのＤＭＡＲＤ：
酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在の確認のために被検者からのサンプルを試験すること；
サンプル中での、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の不存在を同定すること；および
ＤＭＡＲＤを被検者に投与すること。

以下を含む方法における、必要とされる被検者のリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する方法におけるＤＭＡＲＤの使用：
酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在の確認のために被検者からのサンプルを試験すること；
サンプル中での、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の不存在を同定すること；および
ＤＭＡＲＤを被検者に投与すること。

以下を含む方法により、必要とされる被検者のリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する、以下を含む方法において使用されるための非ＤＭＡＲＤＲＡ薬：
酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在の確認のために被検者からのサンプルを試験すること；
サンプル中での、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在を同定すること；および
非ＤＭＡＲＤＲＡ薬を被検者に投与すること。

必要とされる被検者のリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する、以下を含む方法における非ＤＭＡＲＤＲＡ薬の使用：
酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在の確認のために被検者からのサンプルを試験すること；
サンプル中での、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在を同定すること；および
非ＤＭＡＲＤＲＡ薬を被検者に投与すること。

本発明者は、酸化されたコラーゲンＩＩに対する自己抗体のレベルが、抗ＴＮＦ治療に応じない患者において高いことがわかった。
したがって、酸化されたコラーゲンＩＩに対する自己抗体は、患者が抗ＴＮＦ生物学的製剤での治療に応答するかどうかに関する指標として使用される。

従って、３番目の態様では、本発明は以下を含む、被検者が抗ＴＮＦ生物学的製剤での治療に応答するかどうかを同定する方法を提供する：
酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在の確認のために被検者からのサンプルを試験すること；
ここで、サンプルの酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の不存在は、被検者が抗ＴＮＦ生物学的製剤（anti-TNF biologic）に応答することを示す。

本発明の３番目の態様の方法は、被検者が抗ＴＮＦ生物学的製剤に応答するかどうかを同定するものである。「抗ＴＮＦ生物学的製剤に応答する」とは、抗ＴＮＦ生物学的製剤での治療に応答する事を意味し、言い換えれば、抗ＴＮＦ生物学的製剤の使用は、ＲＡの症状の厳しさを減少させるか、または全体的にＲＡを排除することを意味する。抗ＴＮＦ生物学的製剤での治療への応答は、抗ＴＮＦ生物学的製剤での治療の前後に疾病重症度を評価することによって決定することができる。本明細書にＤＭＡＲＤｓと関連して記載されたように、これは行われる。本発明の３番目の態様では、ＲＡを有することが知られている被検者からのサンプルに対して典型的に行われる。

本発明の３番目の態様の方法は、また、１種以上の抗ＴＮＦ生物学的製剤で以前に治療されたか、または現在治療されている被検者からのサンプルについて典型的に行われる。また、被検者は以前に、ＤＭＡＲＤで治療されていることができる。例えば、被検者は本発明の第２の態様の方法を使用してＤＭＡＲＤ免疫不応答者として同定されることができる。

抗ＴＮＦ生物学的製剤としては以下があげられる；アダリムマブ（フミラ：Humira）、セルトリズマブペゴル（シムジア：Cimzia）、エタナーセプト（エンブレル：Enbrel)、ゴリブマブ（シンポニ：Simponi）、およびインフリシマブ（レミケード：Remicade)。

本発明の３番目の態様の方法は患者が抗ＴＮＦ生物学的製剤に応答するかどうかに関する指標を与える。したがって、また、本発明の３番目の態様は抗ＴＮＦ生物学的製剤で患者を治療する更なる工程を含む方法を包含する。この実施態様では、被検者が酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体を持たないこと、したがって抗ＴＮＦ生物学的製剤で治療に応答することが決定され、次に、被検者は抗ＴＮＦ生物学的製剤で治療される（または、さらに治療される）。典型的に、本発明のこの態様では、被検者は、１種以上の抗ＴＮＦ生物学的製剤で以前に治療されているか、または現在治療されている。従って、本発明のこの態様はＲＡを有する患者に効果的な治療実験計画書を提供する。

従って、この実施態様では、本発明は、以下を含むリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する方法を必要な被検者に提供する：
被検者からのサンプルについて、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のために試験すること；
サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の不存在を同定すること；および
抗ＴＮＦ生物学的製剤を被検者に投与すること。

また、逆の場合にも本発明のこの態様は利用される。すなわち、テストがサンプル中の抗体の存在を示し、患者がコラーゲンＩＩに自己抗体を有することを意味する場合である。これは、患者が抗ＴＮＦ生物学的製剤での（一層）の治療に応じないで、したがって、ＴＮＦをブロックすることによって作用しない（すなわち、非−抗ＴＮＦ生物学的製剤（non-anti-TNF biologic））、抗ＲＡ生物学的製剤代替え物で治療されるべきであることを示す。

したがって、また、本発明のこの態様は、以下を含む、必要とする被検者のリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する方法を提供する：
被検者からのサンプルについて、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のために試験すること；
サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在を同定すること；および
非−抗ＴＮＦ生物学的製剤を被検者に投与すること。

非−抗ＴＮＦの生物学的製剤、すなわちそれらの目標としてＴＮＦを有しないものとしては以下があげられる；アバタセプト（オレンシア：Orencia）、アナキンラ（キネレット：Kineret）、リツキシマブ（リツキサン：Rituxan)、トシリズマブ（アクテムラ：Actemra）。

典型的に、本発明のこの態様では、被検者は、１種以上の抗ＴＮＦ生物学的製剤で以前に治療されているか、または現在治療されている。

あるいはまた、本発明のこれらの態様は以下の通り表現される。
必要な被検者のリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する以下を含む方法において使用される抗ＴＮＦ生物学的製剤：
被検者からのサンプルについて、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のために試験すること；
サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対して抗体の不存在を同定すること；および
抗ＴＮＦ生物学的製剤を被検者に投与すること。

以下を含む方法による必要とする被検者における、抗ＴＮＦ生物学的製剤のリウマチ性関節炎（ＲＡ）治療のための医薬の製造における使用；
被検者からのサンプルについて、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のために試験すること；
サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対して抗体の不存在を同定すること；および
抗ＴＮＦ生物学的製剤を被検者に投与すること。

必要な被検者のリウマチ性関節炎（ＲＡ）を治療する以下を含む方法における非−抗ＴＮＦ生物学的製剤の使用：
被検者からのサンプルについて、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のために試験すること；
サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対して抗体の存在を同定すること；および
非−抗ＴＮＦ生物学的製剤を被検者に投与すること。

以下を含む方法による必要とする被検者における、非−抗ＴＮＦ生物学的製剤のリウマチ性関節炎（ＲＡ）治療のための医薬の製造における使用；
被検者からのサンプルについて、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のために試験すること；
サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対して抗体の存在を同定すること；および
非−抗ＴＮＦ生物学的製剤を被検者に投与すること。

これらの方法の結果は、被検者のＲＡが本発明の３番目の態様と関連して説明したように、ＤＭＡＲＤまたは生物学的製剤などの非ＤＭＡＲＤＲＡ薬、例えば、抗ＴＮＦ生物学的製剤または非−抗ＴＮＦ生物学的製剤を使用することで治療されるということである。「治療する」とは、ＲＡの症状の厳しさを減少させるか、または全体的にＲＡを排除することを意味し、ＲＡの症状の厳しさは疾患活動性スコア（ＤＡＳ）を使用することで評価される。
本発明の方法はヒトおよび動物に使用でき、本発明はヒト用医薬品と動物用医薬品の両方に使用する事ができる。

望ましくは、「治療的有効量」で被検者にＤＭＡＲＤまたは非ＤＭＡＲＤＲＡ薬を投与する。これは被検者へ利益を示すに十分な量であり、および／またはＲＡの１種以上の症状を改善するか、排除するか、または防ぐことができる。本明細書において使用される時、「治療」は人間または非人間の動物、望ましくは哺乳動物のために利益を与えるどんな体制も含んでいる。治療は、存在する状態に関するか、または予防的（予防的な処置）であることができる。治療では、典型的にはそれを必要とする被検者または患者、すなわち、ＲＡに悩む被検者に投与される。

この実施態様では、ＤＭＡＲＤまたは非ＤＭＡＲＤＲＡ薬は、あらゆる適切なルートで被検者に投与され、例えば、経口（口腔剤または舌下剤を含む）、直腸、鼻、局所的（経皮剤を含む）、非経口的（皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内または、皮内を含む）ルートにより投与されることができるが、典型的には経口により投与される。ＤＭＡＲＤまたは非ＤＭＡＲＤＲＡ薬は、製薬の技術分野で知られている任意の方法で調製されることができ、例えば、無菌状態の下でキャリアまたは賦形剤とＤＭＡＲＤまたは非ＤＭＡＲＤ活性成分を混合することによって調製されることができる。従って、１つの実施態様では、被検者はＤＭＡＲＤまたは非ＤＭＡＲＤＲＡ薬と１種以上のキャリアおよび／または付形剤を含む医薬品組成物が投与される。

また、他の１種以上の治療的活性剤、たとえば１種以上の他のＤＭＡＲＤまたは非ＤＭＡＲＤ抗リウマチ薬物類と組み合わせてＤＭＡＲＤまたは非ＤＭＡＲＤＲＡ薬を投与することができる。従って、本発明のこの態様による使用のための医薬品組成物はＤＭＡＲＤまたは生物学的製剤などの非ＤＭＡＲＤＲＡ薬に加えて他の１種以上の治療的活性剤を含むことができる。

本発明における使用のためのＤＭＡＲＤ、非ＤＭＡＲＤＲＡ薬、そして／または、医薬品組成物の用量は広い範囲で変化することができる。例えば、使用される特定のＤＭＡＲＤ、非ＤＭＡＲＤＲＡ薬、患者の年齢、病期に応じて広い範囲で変化し、医師が最終的に適切な使用用量を決定する。

この投与は適宜繰り返される。副作用が起こった場合には、通常の臨床実務にしたがって、投与量の量、そして／または頻度を減少することができる。また、発明者は、グリケイテッドＣＩＩ(glycated-CII)への自己抗体がＯＡのバイオマーカとして使用されることを驚くべき事に発見した。

従って、４番目の態様では、本発明は以下を含む、変形性関節症（diagnosing osteoarthritis：ＯＡ）を診断する方法を提供する。
被検者からのサンプルについて、グリケイテッドコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在のために試験すること；
ここで、サンプルのグリケイテッドコラーゲンＩＩに対する抗体の存在が被検者における変形性関節症を示している。

本発明の４番目の態様の方法は診断ＯＡに関する方法である。言い換えれば、本発明方法は、被検者にＯＡがあるかどうか決定する方法またはＯＡに関する検査方法である。この方法は慢性的疼痛または関節痛と対照的に関節症の存在を決定するために患者を検査するのにおいて有用である。方法は炎症性のＯＡの診断で特に有用である。

この方法はＯＡを持っていると疑われる被検者からのサンプルについて典型的に行われる。例えば、被検者はＯＡの１種以上の症状、たとえば関節痛（joint pain）、関節の痛み（arthralgia）、関節のこわばり感、動かした時の関節のこすれ合い感（grating or grinding sensations）、および／または関節の膨張（swelling in the joints）を示す。

本発明の４番目の態様の方法は、グリケイテッドコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）に対する抗体の存在または不存在について被検者からのサンプルを試験することを伴う。グリケイテッドコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）は、非酵素的グリケーション、典型的にはリボースによって酸化されたＣＩＩである。

本発明方法は、グリケイテッドコラーゲンＩＩ（ＣＩＩ）に対する抗体の存在または不存在について被検者からのサンプルを試験することを伴う。試験される抗体は、被検者に存在しているグリケイテッドＣＩＩに対する自己抗体である。

グリケイテッドＣＩＩに対する抗体の存在または不存在は、本明細書に本発明の第１の態様と関連して記載された任意の適切な方法またはアッセイで決定することができる。典型的には、そのような抗体の存在または不存在は、ＥＬＩＳＡアッセイなどの抗体抗原結合性に基づくアッセイを使用することで決定する。本発明の４番目の態様における使用のための典型的なＥＬＩＳＡアッセイでは、例えば、リボースを使用することで製造されたグリケイテッドＣＩＩが、表面に取り付けられる。グリケイテッドＣＩＩは被検者から取られたサンプルの自己抗体のための目標として使用される。

１つの実施態様では、本発明の４番目の態様によるアッセイは以下を含む：
グリケイテッドＣＩＩと被検者からのサンプルを接触させること；
抗グリケイテッドＣＩＩ抗体に結合する標識抗体を加え、複合体を形成すること；および
抗グリケイテッドＣＩＩ抗体と標識抗体の間の複合体の形成を検出すること；
ここで、前記複合体の検出が被検者のＯＡを示す。

本発明のこの実施態様では、サンプルは典型的に血清試料である。本発明の第４の実施態様のいくつかでは、本発明の第１の実施態様で記載されたように、被検者からのサンプルが対照または対照サンプルと比較される。対照サンプルは、典型的にはＲＡまたはＯＡに苦しんでいないのが知られている被検者、例えば、健康な対照者から取られたサンプルである。他の実施態様では、ネイティブＣＩＩ（すなわち、酸化していないＣＩＩ）が対照として使用される。被検者からのサンプルが対照試料よりも有意に多くのグリケイテッドＣＩＩを含んでいるなら、これは被検者でグリケイテッドＣＩＩに対する抗体の存在を確認し、被検者にはＯＡがあるのを示す。逆に、被検者からのサンプルが対照試料よりも有意に多くのグリケイテッドＣＩＩを含んでいないなら、これは被検者でグリケイテッドＣＩＩに対する抗体の不存在を確認し、被検者にはＯＡがないことを示す。

また、本発明の４番目の態様の方法は、ＯＡの患者を治療する追加の工程を含む本発明の４番目の態様の方法に対応する、ＯＡを治療する方法を包含する。ＯＡに関する治療は例えば痛み止め、例えば非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤｓ）での治療を含むことができる。非ステロイド性抗炎症薬としては、たとえばイブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナック、セレコキシブ（celecoxib）およびエトリコキシブ（etoricoxib）、オピオイド痛み止め、たとえばコデイン、ジヒドロコデイン、およびトラマドール、局所用カプサイシンクリーム、またはステロイド（例えば関節内に投与される）があげられる。

本発明の２番目、３番目、および４番目の態様のための好ましい特徴は第１の態様のものに準じる。例示の目的でのみ存在している以下の実施例の参照を通して、さらに本発明について説明する。実施例では、図を参照する。

図１は早期ＲＡからの血清試料の中のＲＯＳ−ＣＩＩへの結合と、対照の関節痛、変形性関節症（ＯＡ）、および健康対照者（ＨＣ）との比較を示す。Ａ．診断後１２カ月未満でＤＭＡＲＤの使用の前の患者から、早期のＲＡのサンプルを取った。シトルリン化されたペプチド（ＡＣＰＡ）に対する抗体の存在に従って、サンプルは分類された：ＡＣＰＡ陽性（ＡＣＰＡ＋、ｎ＝４９）、ＡＣＰＡ陰性（ＡＣＰＡ−、ｎ＝３６）。早期ＲＡ患者の反応性は、関節痛、ＯＡおよびＨＣより有意に高かった（ｐ＜０．０００１）。さらに、ＡＣＰＡ＋またはＡＣＰＡ−に拘わらず、ＲＯＳ−ＣＩＩへの反応性がネイティブＣＩＩより有意に高かった（ｐ＜０．００１）。ＮＴ−ＣＩＩはネイティブＣＩＩである。ＧＬＹはリボースによって修飾されたＣＩＩである。そして、ＨＯＣｌは、ＨＯＣｌによって修飾されたＣＩＩである。Ｂ．ＡＣＰＡ＋（黒い三角形）またはＡＣＰＡ−（白い正方形）（ＡＣＰＡ−およびＡＣＰＡ−のそれぞれについてρ＝０．０３、ρ＝−０．１０；ｐ＞０．５８）にかかわらず抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性（anti-ROS-CII reactivity）とＤＡＳ２８のレベルとの相関関係は全く観測されなかった。

図２は証明されたＲＡ患者からのサンプルの抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性を示している。Ａ．証明されたＲＡをもっている患者からの血清と滑液（ＳＦ）のサンプルは、ＤＭＡＲＤに応じた患者（ＤＭＡＲＤ−Ｒ）とＤＭＡＲＤに応じなかった患者（ＤＭＡＲＤ−ＮＲ）に分類された。より高い反応性は血清とＳＦのサンプルの両方でＤＭＡＲＤ−ＮＲで観測された（ｐ＜０．０１）。また、血清と比べて、ＳＦにおけるより高いＲＯＳ−ＣＩＩ自動反応が観測された（ｐ＜０．０５）。ＮＴ−ＣＩＩはネイティブＣＩＩである。ＧＬＹはリボースによって修飾されたＣＩＩである。そして、ＨＯＣｌは、ＨＯＣｌによって修飾されたＣＩＩである。Ｂ．抗−ＲＯＳ−ＣＩＩの反応性は、マッチされたＳＦと血清試料の中でテストされた。抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性のレベルは、マッチされた血清とＳＦにおける、ＩｇＧの総量に対して規格化された。ＳＦにおける、より高い反応性が見られた（ｐ＝０．００１）。Ｃ．ＭＡＲＤ−Ｒ（黒い三角形）またはＤＭＡＲＤ−ＮＲ（白い三角形）であるにかかわらず、抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性のレベルと、ＡＣＰＡのレベル（ＤＭＡＲＤ−ＮＲ、およびＤＭＡＲＤ−Ｒのそれぞれについてρ＝０．３２、ρ＝−０．２２、；ｐ＞０．１３４）、およびＣＲＰ（ＤＭＡＲＤ−ＮＲ、およびＤＭＡＲＤ−Ｒのそれぞれについてρ＝０．０８、ρ＝０．１２；ｐ＞０．７４）との相関関係はなかった。さらに、ＲＦ陽性患者（黒丸、ＲＦ＋）の反応性は、ＲＦ陰性のサンプルの反応性と同様であった（白ダイヤモンド形、ＲＦ−、ｐ＞０．０５）。

図３は、変形性関節症（ＯＡ）の患者からの血清と滑液（ＳＦ）での、抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性を示している。Ａ．血清の中のより高い反応性において、ＯＡにおけるＲＯＳ−ＣＩＩへの結合はＲＡとは傾向が異なっていた。炎症性（ＩＮＦ）ＯＡからのサンプルは、非炎症性（ＮＯＮ）ＯＡと比較して、ＲＯＳ−ＣＩＩに対してより高い反応性を持っていた（ＳＦについてｐ＜０．００５、血清についてｐ＝０．０５）Ｂ．マッチされたＯＡＳＦと血清試料では反応性の有意差を全く示さなかった（ｐ＝０．２７２）。ＳＦと血清では、より高いか低い反応性を示していた。マッチされた血清とＳＦにおける、抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性のレベルはそれらのそれぞれのＩｇＧの総量に対して規格化された。

図４は慢性の長年のＲＡにおける抗ＲＯＳ−ＣＩＩ自動反応性の長期的追跡を示している。Ａ．４人の異なった患者の抗−ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性は長期的変化を示す例として示されている。ＡＣＰＡ陽性試料では反応性は、ＳＦ（黒い正方形）で血清（白丸）より高いが、ＡＣＰＡの陰性のサンプルでは血清と比べて、類似的かまたは低い。高値と中央値はそれぞれ高いか中程度の疾病活性を有する患者である。Ｂ．すべての試験されたサンプルについてＥＬＩＳＡＯ．Ｄが、黒から明るい灰色の傾斜で示された。黒が最も高く明るい灰色が最も低いＯＤを示す。それぞれの患者から集められたマッチされたＳＦと血清試料は、組として示される（ＦがＳＦを表し、Ｓは血清を表す）。ＳＦでは、より高いＯＤの傾向がＡＣＰＡの陽性のグループで観測されたが、ＡＣＰＡ陰性のグループでは観測されなかった。Ｃ．ＤＡＳ２８と抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性の間に、血清（白丸）とＳＦ（黒い正方形）の両方で、およびＡＣＰＡ陽性とＡＣＰＡ陰性の患者の両方で相関関係は全く観測されなかった（ＡＣＰＡ陰性患者からのＳＦおよび血清についてρ＝０．３００６；ｐ＝２１７３、ρ＝０．３１７１８；ｐ＝０．１７３６；ＡＣＰＡ陽性患者からのＳＦおよび血清についてρ＝０．０４５８１；ｐ＝０．８１３４、ρ＝０．０６９６；ｐ＝０．５３４６）。患者は高値（ＤＡＳ２８＞５．１）、中程度（３．２＜ＤＡＳ２８＜５．１）、そして低い（２．６＜ＤＡＳ２８＜３．２）の疾患活動性に分類された。２人は不明であった。

実施例１
患者および方法
患者と臨床標本
血清試料は以下のセンターから集められた：カロリンスカ研究所、スウェーデン；リウマチおよび筋骨格系疾患のリード部門、英国（Leeds Division of Rheumatology and Musculoskeletal diseases, UK）；英国、ロンドンのバーツ病院；英国、リウマチ学のケネディ研究所、およびイタリアのパヴィア医科大学。患者はＡＣＲ１９８７評価基準によって定義され、診断はリウマチ専門医によってされた。かかわるすべての臨床のセンターから倫理的な承認を得た。そして、すべての個人から告知同意を得た後、血液または滑液（ＳＦ）のサンプルを採取した。ＳＦのサンプルは膝関節鏡視下手術または直接膝関節吸引で集められた。

テストされたサンプルは以下の通り分類された：
１）１２カ月未満の兆候期間を有する、疾患修飾抗リウマチ薬物（ＤＭＡＲＤ）−未治療早期ＲＡ患者。専門家クリニックへの最初の訪問でＤＭＡＲＤの使用前に血液を取った（ｎ＝８５、血清試料）。患者は、ＡＣＰＡ陽性（ｎ＝４９）またはＡＣＰＡ陰性（ｎ＝３６）のどちらかであった。
２）以下に分類された１年以上の罹病期間をもっている確立されたＲＡ患者からのサンプル：
２ａ）ＤＭＡＲＤ応答者（ＤＭＡＲＤ−Ｒ）：ＤＭＡＲＤでの治療（ｎ＝２６、血清、およびｎ＝１０、ＳＦ）の後に低い疾患活動性を達成（ＬＤＡＳ＜３．２）。
２ｂ）ＤＭＡＲＤ不応答者（ＤＭＡＲＤ−ＮＲ）：治療にも拘わらずＤＡＳ＝＜３．２を維持した（ｎ＝２４、血清およびｎ＝１０、ＳＦ）。
３）確立された長年のＲＡの長期間の追跡：
最長４３年にわたり長期間で追跡された３０人の確立された長年のＲＡ患者のマッチされたＳＦと血清（患者あたり２−１１のサンプル）。１５人の患者がＡＣＰＡ陽性で、１５人の患者がＡＣＰＡ陰性であった。患者はＤＡＳ２８≧５．１の高い疾病活性；３．２≦ＤＡＳ２８≦５．１の中程度の疾患活性、およびＤＡＳ２８≦３．２の低い疾患活性に分類された。ほとんどの患者が試料採取時点で、生物学的製剤で既に治療されていた。

グループ２と３については、血液採取とＤＡＳ２８測定は、クリニック訪問時に行われた。

含まれた対照群：
４）関節痛にもかかわらず、滑膜炎に関する臨床上の証拠のないＡＣＰＡ陽性の個人（ｎ＝５８、血清試料）。個人は新たな筋骨格痛病訴（通常、１または２関節にかかわる）または関節痛の患者から編成された。患者がＣＣＰ−２テストによるＡＣＰＡ陽性であったときに、彼らは経験豊富なリウマチ専門医によって診察された。そのリウマチ専門医は、滑膜炎に関する臨床上の証拠の不存在を確立した。また、ＣＲＰ＜１０ｍｇ／Ｌ（局所的な範囲）の正常レベルが確認された。
５８人の個人のうちの１１人は、ＯＡの徴候を示したが、３６カ月滑膜炎の兆候なしで続けられた。

５）ＯＡ膝のＡＣＲ評価基準（アルトマン他、Arthritis&Rheumatism 29(8): 1039-1049、1986）を有するＯＡ患者からの血清試料（ｎ＝４９）とＯＡＳＦ（ｎ＝５２）サンプル。詳細な臨床情報が利用可能である場合、症状、滑膜炎そして／または関節滲出の症状の存在または不存在に従って炎症性であるかまたは炎症性でないか、ＯＡ患者は分類された。すべての身体活動レベルでの膝痛および日常的に睡眠を妨げる激しい膝痛を伴う患者、または関節内注射によるステロイドおよび経口抗炎症剤の投与にもかかわらず持続性関節滲出を示す患者は炎症性として分類された。間欠の軽症膝痛、四頭股筋強化訓練そして／または、パラセタモールに応答した膨潤だけを有する患者は非炎症性ＯＡとして分類された。

６）健常人（ＨＣ、ｎ＝５１）からの性別と年令がマッチされた血清は、炎症関節病のないことが報告されたさまざまなボランティアから集められた。ＯＡはいくつかのより年齢が高いが、症状を軽減するために必要な薬物投与なしの個人に存在することができる。ＣＣＰ−２テストはすべてのＨＣ個人で陰性であった（リウマトイド因子（ＲＦ）データを得ることができなかった）。

酵素結合免疫吸着剤アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
ＣＩＩは先に記載されたようにして修飾され、ＨＯＣｌ、ＯＮＯＯ⁻、・ＯＨまたはリボースでＣＩＩ翻訳後修飾されたＣＩＩを生成させた（ニッシム他、Arthritis&Rheumatism52:3829-38、2005）。ウシ血清アルブミン（BSA、Sigma）とヒト血清アルブミン（HSA、Sigma）は、同様に修飾されて、コントロール抗原として使用された。ＨＯＣｌ（ＨＯＣＬ−ＣＩＩ）で修飾されたＣＩＩとグリケイテッドＣＩＩ（Ｇｌｙ−ＣＩＩ）についてのデータを、ネイティブＣＩＩ（ＮＴ−ＣＩＩ）と比較されたＲＯＳ−ＣＩＩのための例として結果が示された。ＥＬＩＳＡは、先に説明した目標としてＲＯＳ−ＣＩＩまたはネイティブＣＩＩを使用して実行された（ニッシム他、Arthritis&Rheumatism５２：３８２９−３８、２００５）。簡潔に言えば、ＥＬＩＳＡプレートが、餌として１０マイクロｇ／ｍｌのＲＯＳ−ＣＩＩまたはネイティブＣＩＩでコーティングされ、ＳＦまたは血清試料からの自己抗体と結合した。ＢＳＡ、ＲＯＳ−修飾ＢＳＡ（ＲＯＳ−ＢＳＡ）、ＨＳＡ、およびＲＯＳ−修飾ＨＳＡ（ＲＯＳ−ＨＳＡ）について得られたＥＬＩＳＡ視光学密度測定（ＯＤ）は、ネイティブおよびＲＯＳ−ＣＩＩのためにそれぞれのＥＬＩＳＡＯＤを規格化するバックグラウンドコントロールとして使用された。さらに、アッセイ変動を制御するために、私たちは比較される予定の全てのグループにも修飾−ＣＩＩの同じバッチを使用してＥＬＩＳＡを実行した。それぞれのアッセイは公知の陽性または陰性対照試料を含んでいた。同じ個人からの長期的サンプル（血清とＳＦ）は、同じ日にＲＯＳ−ＣＩＩの同じバッチを使用してテストされた。

絶対標準（ＣＣＰ２キットのような）がないとき、ＥＬＩＳＡにより滴定を測定できなかった。したがって、任意のＯＤ値が使用された。したがって、抗ＲＯＳ−ＣＩＩ自己抗体（以下で「バインダー」と簡略化される）に対して陽性の患者は、カットオフセットをＯＤ＝０．２８として、健康対照者ＥＬＩＳＡＯＤと２標準偏差（ＳＤ）の９５番目のパーセンタイルを使用することで定義された。

組にされた血清とＳＦがテストされたとき、任意のＥＬＩＳＡＯＤユニットはそれらのそれぞれのＩｇＧレベルに規格化された。ＩｇＧレベルは、メーカーの指示に従って、ヒトＩｇＧＥＬＩＳＡ定量セット（Human IgG ELISA Quantitation set：ケンブリッジバイオサイエンス、ケンブリッジ、英国）を使用することで測定された。

ＡＣＰＡＥＬＩＳＡは、抗−ＣＣＰ２測定キット（英国のサンプル）、およびAxis Shield Diagnostics株式会社（ダンディー、イギリス）またはEurodiagnostica（スウェーデンから入手されたサンプル、マルモ（スウェーデン））を使用して、メーカーの指示に従って実行された。ＣＣＰ−２テストの陽性または陰性かの結果に関する決定は、それぞれのセンターで医薬品の臨床試験の実施の基準の規格により、各地の臨床診療（イギリスとスウェーデン）にしたがった。

統計分析
変数は正規分布しないので、ノンパラメトリックテストが使用された。ウィルコクソンサインドランクサムテスト（Wilcoxon signed rank sum test）が、ネイティブとＲＯＳ−ＣＩＩの間の反応性を比較するのに使用された。マンホイットニー検定（Mann-Whitney tests）が、様々なグループの間で比較するのに使用された。相関関係は、スピアマンテスト（Spearman test）、ノンパラメトリック相関試験を使用することで測定された。早期ＲＡ、関節痛、ＯＡおよびＨＣの間の診断薬の区別を決定するために、臨床診断（早期ＲＡ対健康対照者；早期ＲＡ対関節痛；早期ＲＡ対ＯＡ）に対して陽性の自己抗体の分割表（contingency table）を構成するのに０．２８ＯＤユニットのカットオフポイントを使用した。フィッシャーの抽出試験（Fisher’s Exact Test）でそれをテストした。傾向を調べるためのノンパラウィルコクソンタイプ検査（Wilcoxon-type test）が、それぞれの個人に対して、抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性の長期間の追跡をテストするのに使用された。統計分析は、グラフパッドプリズムソフトウェアパッケージ（GraphPad Prism software package：GraphPad Software、San Diego, CA) および Stata 12 (StataCorp. 2011. Stata Statistical Software: Release 12. College Station, TX: StataCorp LP)）を使用して行われた。

結果
早期ＲＡ、ＨＣ、関節痛、およびＯＡからのサンプル中のＲＯＳ−ＣＩＩへの結合
ＲＯＳ−ＣＩＩへの、ＤＭＡＲＤナイーブ早期ＲＡにおける反応性は、ＡＣＰＡ陽性の関節痛、ＯＡとＨＣよりかなり高く（図１、ｐ＜０．０００１）、ＨＯＣｌ−ＣＩＩへ９０．５％で結合し、６１％でグリケイテッドＣＩＩに結合し、ＡＣＰＡのステイタスとは関係なかった（表１）。これは、ＡＣＰＡ依存するバイオマーカとしてＲＯＳ−ＣＩＩを使用するＲＡのためのルーチン検査が、高い検出能力を持っていることを示唆する。

対照的に、ネイティブＣＩＩへの結合は、ＲＯＳ−ＣＩＩへの結合より有意に低く（ｐ＜０．０００１）、１８．８％だけの結合だった。ＲＯＳ−ＣＩＩへの結合については、ＤＭＡＲＤナイーブ早期ＲＡＡＣＰＡ陽性（ｎ＝４９）とＡＣＰＡ陰性（ｎ＝３６）において、ＨＯＣｌ−ＣＩＩに対する結合では９３％と８６％であり、有意差がなかった（ｐ＞０．０５）（図１、表１）。グリケイテッドＣＩＩへの反応性は、ＡＣＰＡ陰性より、ＡＣＰＡ陽性では若干高く、それぞれ４７％と７１％だった（ｐ＝０．０２４）。ＡＣＰＡ陽性の関節痛では、健康対照者より有意に高いＨＯＣｌ−ＣＩＩへの結合を観測し、６．８％の結合だった（ｐ＜０．００１）。一方、グリケイテッドおよびネイティブＣＩＩでは１．７％だけが結合した（図１）。ＯＡの患者は早期ＲＡに比較して有意に低い反応性を持っていたが（ｐ＜０．００１）、３０．６％がグリケイテッドＣＩＩに結合した（図１）。しかしＨＯＣｌ−ＣＩＩには１４．２％しか結合しなかった（表１）。性別または年齢差による有意の差は、ＨＣと、ＯＡ、早期ＲＡ、関節痛、ＤＭＡＲＤナイーブ患者との間では見られなかった（表１）。
表１ＲＯＳ−ＣＩＩへのバインダーの分布
ＤＭＡＲＤ−Ｒ：ＤＭＡＲＤに応答する確定されたＲＡ患者；ＤＭＡＲＤ−ＮＲ：ＤＭＡＲＤに応答しない確定されたＲＡ患者；ＳＦ：滑液；炎症性ＯＡは重傷のＯＡであり、非炎症性ＯＡは中程度のＯＡである。

自己抗体の早期ＲＡのＲＯＳ−ＣＩＩへの結合の感受性と特異性（グリケイテッドＣＩＩとＨＯＣｌ−ＣＩＩの両方で定義された）は、ＨＣと比べて、それぞれ９０％と１００％（ＯＲ９３６［９５％ＣＩ５３−１６６３９］、ｐ＜０．０００１）であった。関節痛と比較して早期ＲＡでは、感受性および特異性はそれぞれ９０％と９３％（ＯＲ１２９．９［９５％ＣＩ３７．２−４５３．５］、ｐ＜０．０００１）であった。ＯＡに関して、抗ＣＩＩ−ＨＯＣｌの反応性に対する特異性と感受性は、８５％と９０％（ＯＲ５７．７５［９５％ＣＩ１９．７−１７０．４］、ｐ＜０．０００１）であった。しかしながら、グリケイテッドＣＩＩに対する反応性は、早期ＲＡではＯＡと比較して特異性は低く、感受性と特異性はそれぞれ６１％と６７％だった（ＯＲ３．２５［９５％ＣＩ１．５−６．８］、ｐ＝０．００２）。

修飾コラーゲンへの自動反応性（auto-reactivity）の存在が新規な診断薬バイオマーカーであるか否かを審査するために、自己抗体に疾患活動性（disease activity）があるかどうか、またはＤＡＳ２８値によって反映される炎症のレベルについて調査した。ＡＣＰＡが陰性または陽性で有るかどうか(ACPA+ または ACPA-に対してそれぞれ、ρ＝０．０３、ρ＝−０．１０；ｐ＞０．５８、図1B）にかかわらず、抗ＲＯＳ−ＣＩＩＯＤｓとＤＡＳ２８の間には、相関が全くなかった。

確定したＲＡをもっている患者での抗−ＲＯＳ反応性
ＤＭＡＲＤ−ＲとＤＭＡＲＤ−ＮＲグループの間の年令と性別における類似性（表１）にもかかわらず、衝撃的な相違点がテストされた血清試料の中のＲＯＳ−ＣＩＩに対する観測された自動免疫反応（auto-immune-reactivity）に観察された（図２）。ＤＭＡＲＤ−ＮＲで見られる最も強いＨＯＣｌ−ＣＩＩへの反応性は５４％であり、これに対してＤＭＡＲＤ−Ｒでは７．４％だった（ｐ＜０．０１、表１）。同様に、ＤＭＡＲＤへの患者の反応に従って分類されたＳＦのサンプルは、反応性の同じパターンを示したが、ＤＭＡＲＤ−ＮＲとＤＭＡＲＤ−ＲＳＦにおける抗ＲＯＳ−ＣＩＩ自動反応のレベルは、血清におけるより有意に高く（それぞれｐ＜０．０５とｐ＜０．００７）、ＤＭＡＲＤ−ＮＲとＤＭＡＲＤ−Ｒ中のＨＯＣｌ−ＣＩＩに対してそれぞれ７０％と５０％の結合であった（図２Ａ）。ＳＦにおける増加した結合が、ＳＦと血液中の免疫グロブリンのレベルの相違に関係する人工的な物でないことを確認するため、それらの対応するレベルのＩｇＧに従ってＨＯＣｌ−ＣＩＩに対する結合が規格化された１セットのＳＦと血清試料を試験した。血清と比較されたＳＦにおける増加する抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性は、１セットのＳＦと血清試料中でさらに確認された（図２Ｂ、ｐ＝０．００１）。

患者はともにＡＣＰＡ陽性および陰性であった。ＤＭＡＲＤ−ＮＲおよびＤＭＡＲＤ−Ｒのどちらでも、抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性とＡＣＰＡステイタスとの間に関連のないことが観察された（ρ＝０．３２、ρ＝−０．２２、ＤＭＡＲＤ−ＮＲまたはＤＭＡＲＤ−Ｒのそれぞれについて；ｐ＞０．１３４）、または CRP (ρ＝０．０８、ρ＝０．１２、ＤＭＡＲＤ−ＮＲまたはＤＭＡＲＤ−Ｒのそれぞれについて；ｐ＞０．７４) (図２Ｃ)。さらに、ＲＦ陽性患者での反応性はＲＦ陰性患者における反応性と同様であった（ｐ＞０．０５、図２Ｃ）。

非炎症性ＯＡと炎症性ＯＡにおける抗−ＲＯＳ−ＣＩＩ結合
抗ＲＯＳ−ＣＩＩ抗体の存在は、ＯＡにおける滑膜炎、激痛または持続性流出物に関する臨床上の証拠の存在に関して詳細に調べられた（表１、図３Ａ）。重症炎症性ＯＡと軽症非炎症性ＯＡの血清試料の中のＨＯＣｌ−ＣＩＩへの反応性は、それぞれ１４．２％と１１．４％の結合であり、それぞれ低かった。しかしながらグリケイテッドＣＩＩへの反応性は、重症炎症性のＯＡと軽症非炎症性ＯＡのグリケイテッドＣＩＩについては高く、それぞれ４２．８％と２５．７％の結合であった（図Ａ、表１）。さらに、ＯＡ中のＲＯＳ−ＣＩＩに結合するパターンは、ＲＡの場合とは反対に、血清においてＳＦより高い反応性を示す傾向がある。ＲＡと対照的に、マッチされたＯＡＳＦと血清試料はＳＦにおけるより高い反応性に向かう傾向を全く示さないで、サンプルは、より高いか低い反応性を示した（ｐ＝０．２７２、図３Ｂ）。

慢性の長年の疾病を伴う患者のＲＯＳ−反応性の長期研究
さらに抗ＲＯＳ−ＣＩＩ反応性と病気の進行との相関関係を研究するために、慢性のＲＡをもっている３０人の患者から長期間集められた、マッチされたＳＦと血清試料を分析した。図４Ａ−Ｂで見られるように、抗ＨＯＣｌ−ＣＩＩ反応性は顕著に異なる。また、同様の変異性はグリケイテッドＣＩＩについても示された（データは示されない）。ＡＣＰＡ陰性基のＳＦと比べて、より高い反応性の傾向がＡＣＰＡ陽性のグループのＳＦで観察された。しかしながら、両群の血清中の抗−ＲＯＳ−ＣＩＩの反応性は類似している（図４Ｂ）。それにもかかわらず、ＲＯＳ−ＣＩＩ自動反応性と試料採取時点の疾患活動性（ＤＡＳ２８）のレベルの間の相関関係がなく（ＡＣＰＡ陰性患者からのＳＦと血清について、ρ＝０．３００６；ｐ＝２１７３、およびρ＝０．３１７１８、ｐ＝０．１７３６；ＡＣＰＡ陽性の患者からの血清とＳＦについて、ρ＝−０．０４５８１；ｐ＝０．８１３４およびρ＝０．０６９６；ｐ＝０．５３４６、ＤＡＳ２８はすべての試験されたサンプルについて利用可能でなかった、図４Ｃ）。

個人によって層にされた（stratified）傾向のためのノンパラメトリック検定は、時間がたつにつれた、抗−ＲＯＳ反応性における傾向に関する証拠を示さなかった（ｐ＝０．６３４）。同様に多レベルモデルがデータにフィットされた時、調整されていないモデル（ｐ＝０．８３４）、ＡＣＰＡステイタスとＤＡＳカテゴリ（ｐ＝０．６３１）が調整されたモデルの両方において、診断からの時間は抗ＲＯＳ反応性の有意の予測を示さなかった。低ＤＡＳスコアと比較して高いＤＡＳスコア有するものだけが、抗ＲＯＳ反応性の有意の予測であった（ｐ＝０．０２５）。

結論として、これらの結果は、抗−ＲＯＳ−ＣＩＩ自己抗体が、以下を可能とする新規な、血清学的なバイオマーカーを提供することを示している。
ａ）ＲＡ診断、特にＡＣＰＡ陰性患者で診断を容易にする；
ｂ）よりよいＲＡ副分類を導く；
ｃ）ＲＡ患者において、疾病結果およびＤＭＡＲＤへの反応と、抗ＴＮＦ治療の予測を容易にする；および
ｄ）ＯＡ診断を容易にする。

Claims

リウマチ性関節炎（ＲＡ）の存在を決定するために、酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在について被検者からのサンプルを測定する方法であって、
サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在は、被検者のＲＡを示し、
ここで被検者は環状シトルリン化ペプチド（ＡＣＰＡ）に対する抗体を有していない、測定方法。
以下を含む、被検者が疾患修飾抗リウマチ薬（ＤＭＡＲＤ）に応答するかどうかを同定するための方法：
酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在について被検者からのサンプルを試験すること；
ここでサンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の不存在は、被検者がＤＭＡＲＤに応答することを示し、
サンプル中の酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在は、被検者がＤＭＡＲＤに応答しないことを示す。
ＤＭＡＲＤが、オーラノフィン、ソジウムアウロチオマレート、アザチオプリン、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、シクロスポリン（シクロスポリンＡ）、レフルノミド、メトトレキサート（ＭＴＸ）、ミノサイクリン、ペニシラミン、およびスルファサラジン（ＳＳＺ）から成る群から選択される、請求項２記載の方法。
被検者がリウマチ性関節炎（ＲＡ）を持っている、請求項２または３記載の方法。
被検者が以前に１種以上のＤＭＡＲＤｓで治療されているか、または現在１種以上のＤＭＡＲＤｓで治療されている、請求項２から４のいずれか１項記載の方法。
サンプルが血清、血漿、全血または滑液のサンプルである、請求項１から５のいずれか１項記載の方法。
酸化されたコラーゲンＩＩが非酵素学的グリケーションまたは反応性酸素分子種（ＲＯＳ）またはアルデヒドにかかわる反応で酸化された、請求項１から６のいずれか１項記載の方法。
ＲＯＳがスーパーオキシドラジカル（Ｏ_２・⁻）、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）、脂質ヒドロペルオキシド（ＬＯＯＨ）、遷移金属イオンと組み合わせた脂質ヒドロペルオキシド、遷移金属イオンと組み合わせた過酸化水素、水酸基ラジカル（・ＯＨ）、次亜塩素酸（ＨＯＣｌ）、次亜臭素酸（ＨＯＢｒ）、一酸化窒素ラジカル（ＮＯ・）、二酸化窒素ラジカル（ＮＯ_２・）および過酸化窒素（ＯＮＯＯ⁻）から成る群から選択される、請求項７記載の方法。
グリケーションがグルコース、リボースまたは他の糖類によって引き起こされる、請求項７記載の方法。
アルデヒドがマロンアルデヒドおよび４−ヒドロキシノネナールから成る群から選択される、請求項７記載の方法。
酸化されたコラーゲンＩＩに対する抗体の存在または不存在が、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定される、請求項１から１０のいずれか１項記載の方法。