CN201666897U

CN201666897U - 人骨唾液酸蛋白elisa检测试剂盒

Info

Publication number: CN201666897U
Application number: CN2009202635827U
Authority: CN
Inventors: 王捷; 夏冰
Original assignee: General Hospital of Guangzhou Military Command
Current assignee: General Hospital of Guangzhou Military Command
Priority date: 2009-11-27
Filing date: 2009-11-27
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2019-11-27

Abstract

本实用新型涉及人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒，包括盒体和96孔酶标板、盖板膜、13瓶试剂和模具(1)，其特征是：酶标板是在微孔条上预包被鼠抗人BSP单抗制成的检测板；13瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗浓缩液，1瓶羊抗兔IgG-HRP浓缩液，1瓶显色液，1瓶终止液、1瓶浓缩洗涤液和1瓶样本缓冲液；模具(1)包括13个下凹瓶位，对应关系分别是浓缩洗涤液位于下凹瓶位(2)、兔抗人BSP多抗浓缩液位于下凹瓶位(3)、羊抗兔IgG-HRP浓缩液位于下凹瓶位(4)、样本缓冲液位于下凹瓶位(5)、显色液位于下凹瓶位(6)、终止液位于下凹瓶位(7)、标准品溶液和高浓度标准品溶液位于下凹瓶位(8)。本实用新型具有结构简单、成本低廉，以及快速、简便、准确地检测血清BSP含量的特点。

Description

人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒

技术领域

本实用新型涉及人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒，是一种人血清中骨重吸收相关标志物骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)的检测试剂盒。

背景技术

骨唾液酸蛋白(bone sialoprotein，BSP)是细胞外基质中的一种酸性糖蛋白，其组织分布相对局限，主要分布在矿化组织(如骨、牙齿)和钙化的软骨与骨的交界区，其含量约占骨细胞外基质中非胶原蛋白质的15％。近年研究发现BSP的表达水平与骨质疏松症和肿瘤骨转移等疾病关系较为密切，血清BSP含量有望作为骨质疏松症和乳腺癌、肺癌、肾癌、前列腺癌、甲状腺癌等肿瘤骨转移预测的标志物之一。

目前，检测血清BSP含量方法包括放射免疫分析法和ELISA法二种。其中，放射免疫分析法不仅需要特定的仪器、操作较为复杂，而且工作人员在操作时存在受到放射性损害的风险，环境存在受到放射性污染的可能，因此安全性较差；而现有技术的ELISA检测法需要依赖进口试剂盒，由于这种进口试剂盒结构复杂、价格昂贵，因此其应用受到一定限制，不适宜推广应用。

实用新型内容

本实用新型目的，是为了克服现有技术的ELISA检测法存在进口试剂盒结构复杂、价格昂贵的缺点，提供一种廉价、简便的人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒，并具有操作简单、检测快速、准确，灵敏度高、成本低和稳定好的特点。

本实用新型的目的主要通过以下技术方案实现：

人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔酶标板、一张盖板膜、13瓶试剂和放置试剂瓶的模具，其结构特点在于：96孔酶标板是在微孔条上预包被鼠抗人BSP单抗(一抗)制成的检测板；13瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗浓缩液(二抗)，1瓶羊抗兔IgG-HRP浓缩液(酶标三抗)，1瓶显色液，1瓶终止液、1瓶浓缩洗涤液和1瓶样本缓冲液；所述模具包括13个下凹瓶位，其与13瓶试剂一一对应。

本实用新型的目的还可以通过以下技术方案实现：

本实用新型的一种实施方式是：盒体是硬纸盒；96孔酶标板由96孔聚苯乙烯酶标板构成、放于真空铝箔袋内；盖板膜是透明硬塑料贴膜；6个浓度标准品溶液和高浓度标准品溶液分别用自然色透明聚丙烯微量离心管装载，兔抗人BSP多抗浓缩液用红色透明聚丙烯微量离心管装载，羊抗兔IgG-HRP浓缩液用黄色透明聚丙烯微量离心管装载，浓缩洗涤液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶装载，样本缓冲液用蓝色帽的白色聚乙烯塑料瓶装载，显色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶装载，终止液用绿色帽的白色聚乙烯塑料瓶装载；下凹瓶位用塑料泡沫制成。

本实用新型的一种实施方式是：96孔酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆装式12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装式微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被鼠抗人BSP单抗；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶、1ml/瓶，浓度分别为2，8，16，32，64，128ng/ml；高浓度标准品溶液1瓶、1ml/瓶；兔抗人BSP多抗浓缩液1瓶，200μl/瓶；羊抗兔IgG-HRP浓缩液1瓶，200μl/瓶；显色液1瓶、15ml/瓶，终止液1瓶、15ml/瓶；浓缩洗涤液1瓶、100ml/瓶；样本缓冲液1瓶、15ml/瓶。

本实用新型的一种实施方式是：盒内还设有一个自封袋、一份说明书和一份质检报告书。

本实用新型具有的有益效果如下：

1、本实用新型具有结构简单、成本低廉，以及快速、简便、准确地检测血清BSP含量的特点。

2、实验表明本实用新型试剂盒具有很高的灵敏度：血清的最低检测限为1.5ng/ml，标准曲线的线性范围为2-100ng/ml，回收率为80.5％±11.2％，相对于放射免疫分析法和进口的同类ELISA试剂盒，本试剂盒无放射性污染，更安全，成本低，灵敏度高。

附图说明

图1为本实用新型中模具的结构俯视图。

具体实施例

图1构成具体实施例的模具。

本实施例公开一种人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的一块96孔酶标板、一张盖板膜、13瓶试剂和放置试剂瓶的模具，96孔酶标板是在微孔条上预包被鼠抗人BSP单抗(一抗)制成的检测板；13瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗浓缩液(二抗)，1瓶羊抗兔IgG-HRP浓缩液(酶标三抗)，1瓶显色液，1瓶终止液、1瓶浓缩洗涤液和1瓶样本缓冲液；所述模具包括13个下凹瓶位，其与13瓶试剂一一对应。盒内还设有一个自封袋、一份说明书和一份质检报告书。

如图1所示，泡沫塑料模具1有13个下凹瓶位，与13瓶试剂一一对应，其对应位置依次为：50ml浓缩洗涤液位于下凹瓶位2,200μl二抗浓缩液位于下凹瓶位3,200μl酶标三抗浓缩液位于下凹瓶位4,15ml样本缓冲液位于下凹瓶位5,15ml显色液位于下凹瓶位6,15ml终止液位于下凹瓶位7，6种浓度1ml/瓶标准品溶液及1ml高浓度标准品溶液位于下凹瓶位8。

本实施例中：

96孔酶标板由96孔聚苯乙烯酶标板构成、放于真空铝箔袋内；盖板膜是透明硬塑料贴膜；6个浓度标准品溶液和高浓度标准品溶液分别用自然色透明聚丙烯微量离心管装载，兔抗人BSP多抗浓缩液用红色透明聚丙烯微量离心管装载，羊抗兔IgG-HRP浓缩液用黄色透明聚丙烯微量离心管装载，浓缩洗涤液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶装载，样本缓冲液用蓝色帽的白色聚乙烯塑料瓶装载，显色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶装载，终止液用绿色帽的白色聚乙烯塑料瓶装载；下凹瓶位用塑料泡沫制成。

96孔酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆装式12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装式微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被鼠抗人BSP单抗；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶、1ml/瓶，浓度分别为2，8，16，32，64，128ng/ml；高浓度标准品溶液1瓶、1ml/瓶；兔抗人BSP多抗浓缩液1瓶，200μl/瓶；羊抗兔IgG-HRP浓缩液1瓶，200μl/瓶；显色液1瓶、15ml/瓶，终止液1瓶、15ml/瓶；浓缩洗涤液1瓶、100ml/瓶；样本缓冲液1瓶、15ml/瓶。

本实施例的制作方法如下：采用预包被鼠抗人BSP单抗的96孔酶标反应微孔条制成检测板，放入真空铝箔袋中，以塑料硬贴膜为盖板膜，将50ml浓缩洗涤液，15ml样本缓冲液，1ml高浓度标准品溶液，不同浓度标准品溶液6瓶，1ml/瓶，200μl兔抗人BSP多抗浓缩液，200μl羊抗兔IgG-HRP浓缩液等试剂用不同大小和颜色的塑料瓶和微量离心管盛装，并按照图1所示位置分别固定于泡沫塑料模具1中，与试剂板、盖板膜一同封装于纸盒内。其中，6个浓度标准品溶液和高浓度标准品溶液均用自然色透明聚丙烯微量离心管，兔抗人BSP多抗浓缩液用红色透明聚丙烯微量离心管，羊抗兔IgG-HRP浓缩液用黄色透明聚丙烯微量离心管，浓缩洗涤液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶，样本缓冲液用蓝色帽的白色聚乙烯塑料瓶，显色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶，终止液用绿色帽的白色聚乙烯塑料瓶；每一个试剂盒中的试剂足够进行96次测定(包括标准分析孔)，既可一次同时检测多个样品，也可拆开微孔条进行多次检测。检测时，样本中BSP将被酶标板上预包被的一抗捕获，加入二抗后，二抗被BSP捕获，然后加入酶标三抗，被捕获于板上的二抗与酶标三抗结合，最后用TMB显色。样本吸光度值与样本中的BSP含量呈正相关，与标准曲线比较，再乘以稀释倍数10，即可得出血清样品中BSP含量，其操作简便易行。

将本实用新型试剂盒用于血清BSP含量的检测的具体步骤如下：

一、样本准备：将人血清按照1∶10体积比进行稀释(1份血清+9份样本缓冲液)，存于-20℃待测。

二、试剂准备：

洗涤工作液：用去离子水将20×浓缩洗涤液按照1∶20体积比进行稀释(或按需要量稀释)，(1份10×浓缩洗涤液+19份去离子水)，稀释后将工作液存放于密封瓶中，在2-8℃可保存1个月，用于酶标板的洗涤和抗体的稀释。

三、试剂盒的操作步骤：

1、从4℃冷藏环境取出所需试剂，置室温(20-25℃)平衡30min以上。

2、取出框架和所需数量的微孔条，将不用的微孔条放回自封袋，保存于2-8℃。

3、编号：将样本和标准品对应的微孔按序编号，每个标本和标准品做2孔平行，并记录各孔的位置。

4、加标准品/样本：加标准品/样本100μl/孔到各自的微孔中，用盖板膜盖板后，避光，37℃孵育2hr。空白孔只加样本缓冲液。

5、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液，250μl/孔，洗5次；最后一次甩出孔内液体后，将微孔条反扣于吸水纸上拍干。

6、二抗稀释：将二抗浓缩液用洗涤工作液按1∶100体积比进行稀释(1份抗体浓缩液+99份洗涤工作液)。

7、加二抗：加入二抗工作液100μl/孔，37℃孵育1hr，重复洗板步骤6。

8、稀释酶标三抗：将酶标三抗浓缩液用洗涤工作液按1∶100体积比进行稀释(1份抗体浓缩液+99份洗涤工作液)。

9、加酶标三抗：加入酶标三抗工作液100μl/孔，37℃孵育1hr，重复洗板步骤6。

10、显色：加入底物液100μl/孔，用盖板膜盖板后，37℃避光，显色5-15min。

11、测定吸光度值：加入终止液50μl/孔，轻轻振荡均匀，在酶标仪450nm处测每孔的OD值，参考波长620nm(20min内读完数据)。

12、计算结果：

12.1标准曲线绘制：以标准品OD值为纵坐标，以BSP标准品浓度(ng/ml)的对数为横坐标，绘制标准曲线。

12.2计算：将样品OD值代入标准曲线中，从标准曲线上读出对应的浓度，乘以稀释倍数10，即为样品中BSP含量。

注意事项：

1、在洗板过程中如果出现板孔干燥情况，则会出现标准曲线不成线性、重复性不好的现象，所以洗板拍干后应立即进行下一步操作。

2、每加一种试剂前需将其摇匀。

3、反应终止液为1M硫酸，应避免接触皮肤。

4、不要使用过了有效日期的试剂盒，也不要使用过期试剂盒中的任何试剂，否则可能引起灵敏度降低；不要交换使用不同批号试剂盒中的试剂。

5、储存条件：本试剂盒存于2-8℃，不可冷冻；将不用的微孔条放进自封袋重新密封；显色剂对光敏感，因此要避免直接暴露于光线下。

6、显色剂使用前应无色，有任何颜色均表明已经变质，应当弃之。

7、加入底物液后，一般显色时间为5-15min。若颜色较浅，可延长反应时间到20min或更长，但不要超过30min.反之，则减短反应时间。

8、本试剂盒中试剂含叠氮钠作为杀菌剂，该物质有毒。酶显色反应底物TMB也有毒性，且有致癌性，避免接触皮肤和粘膜。

Claims

1.人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒，包括盒体和盒内的96孔酶标板、盖板膜、13瓶试剂和放置试剂瓶的模具(1)，其特征是：96孔酶标板是在微孔条上预包被鼠抗人BSP单抗制成的检测板；13瓶试剂分别为6瓶标准品溶液、1瓶高浓度标准品溶液、1瓶兔抗人BSP多抗浓缩液，1瓶羊抗兔IgG-HRP浓缩液，1瓶显色液，1瓶终止液、1瓶浓缩洗涤液和1瓶样本缓冲液；模具(1)包括13个下凹瓶位，其与13瓶试剂的对应关系分别是浓缩洗涤液位于下凹瓶位(2)、兔抗人BSP多抗浓缩液位于下凹瓶位(3)、羊抗兔IgG-HRP浓缩液位于下凹瓶位(4)、样本缓冲液位于下凹瓶位(5)、显色液位于下凹瓶位(6)、终止液位于下凹瓶位(7)、6瓶标准品溶液和1瓶高浓度标准品溶液位于下凹瓶位(8)。

2.根据权利要求1所述的人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒，其特征是：盒体是硬纸盒；96孔酶标板由96孔聚苯乙烯酶标板构成、放于真空铝箔袋内；盖板膜是透明硬塑料贴膜；6个浓度标准品溶液和高浓度标准品溶液分别用自然色透明聚丙烯微量离心管装载，兔抗人BSP多抗浓缩液用红色透明聚丙烯微量离心管装载，羊抗兔IgG-HRP浓缩液用黄色透明聚丙烯微量离心管装载，浓缩洗涤液用透明帽的半透明聚乙烯塑料瓶装载，样本缓冲液用蓝色帽的白色聚乙烯塑料瓶装载，显色液是用黑色帽的黑色聚乙烯塑料瓶装载，终止液用绿色帽的白色聚乙烯塑料瓶装载；下凹瓶位用塑料泡沫制成。

3.根据权利要求1所述的人骨唾液酸蛋白ELISA检测试剂盒，其特征是：96孔酶标板由外框支撑架及放置其上的可拆装式12条酶标反应微孔条组成，每个可拆装式微孔条有8个反应孔，每个反应孔预包被鼠抗人BSP单抗；盖板膜大小与酶标板横切面大小一致；标准品溶液6瓶、1ml/瓶，浓度分别为2，8，16，32，64，128ng/ml；高浓度标准品溶液1瓶、1m/瓶；兔抗人BSP多抗浓缩液1瓶，200μl/瓶；羊抗兔IgG-HRP浓缩液1瓶，200μl/瓶；显色液1瓶、15ml/瓶，终止液1瓶、15ml/瓶；浓缩洗涤液1瓶、100ml/瓶；样本缓冲液1瓶、15ml/瓶。