CN112899219A - 一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法 - Google Patents
一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112899219A CN112899219A CN202011415326.2A CN202011415326A CN112899219A CN 112899219 A CN112899219 A CN 112899219A CN 202011415326 A CN202011415326 A CN 202011415326A CN 112899219 A CN112899219 A CN 112899219A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- follicle
- follicular
- follicles
- solution
- fluid
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 230000003325 follicular Effects 0.000 claims abstract description 48
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 32
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 claims abstract description 32
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 32
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 claims abstract description 32
- 239000012530 fluid Substances 0.000 claims abstract description 29
- 230000035800 maturation Effects 0.000 claims abstract description 28
- 210000000287 oocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 23
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims abstract description 19
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims abstract description 18
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims abstract description 18
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims abstract description 16
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 claims abstract description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 claims abstract description 12
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 claims abstract description 11
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 claims abstract description 11
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 45
- 239000000499 gel Substances 0.000 claims description 41
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 26
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 19
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 claims description 18
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 210000002394 ovarian follicle Anatomy 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000005662 Paraffin oil Substances 0.000 claims description 7
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 claims description 7
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 7
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 6
- 102000013361 fetuin Human genes 0.000 claims description 6
- 108060002885 fetuin Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 5
- 210000002503 granulosa cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 4
- 238000005303 weighing Methods 0.000 claims description 4
- 102000002322 Egg Proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 108010000912 Egg Proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 210000000683 abdominal cavity Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004681 ovum Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims 1
- 238000011161 development Methods 0.000 abstract description 7
- 210000001733 follicular fluid Anatomy 0.000 abstract description 4
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 3
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 abstract description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 abstract description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical class [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000012154 double-distilled water Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N heavy water Substances [2H]O[2H] XLYOFNOQVPJJNP-ZSJDYOACSA-N 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 208000017443 reproductive system disease Diseases 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 2
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 2
- 238000012935 Averaging Methods 0.000 description 1
- 102000029816 Collagenase Human genes 0.000 description 1
- 108060005980 Collagenase Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 210000001015 abdomen Anatomy 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 239000002250 absorbent Substances 0.000 description 1
- 230000002745 absorbent Effects 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000011712 cell development Effects 0.000 description 1
- 229960002424 collagenase Drugs 0.000 description 1
- 238000013400 design of experiment Methods 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 description 1
- 230000008217 follicular development Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 239000000413 hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 230000035992 intercellular communication Effects 0.000 description 1
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N metformin hydrochloride Chemical compound Cl.CN(C)C(=N)N=C(N)N OETHQSJEHLVLGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 230000003076 paracrine Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0608—Germ cells
- C12N5/0609—Oocytes, oogonia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2513/00—3D culture
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法，提供了一种用于体外培养小鼠腔前卵泡的试剂组合，该试剂组合包含：藻酸盐溶液、CaCl2凝胶液、卵泡分离液(DM)、卵泡平衡液(MM)、卵泡酶解液(EM)、卵泡生长液(GM)、卵泡成熟液(MM1)和透明质酸酶。采用该试剂组合建立了一种小鼠腔前卵泡三维培养体系，该三维培养体系以藻酸盐凝胶为基质，以藻酸盐与Ca2+形成的凝胶滴为卵泡发育提供立体结构，再通过在不同的培养基质中进行培养，得到发育成熟的卵泡，进一步得到成熟的卵母细胞。
Description
技术领域：
本发明属于胚胎工程技术领域，具体涉及一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法和应用。
背景技术：
动物卵泡发育过程中不足1％的卵泡能发育并排卵，而绝大多数卵泡发生闭锁。在畜牧生产中，这种不仅会造成优秀母畜遗传资源的浪费，还阻碍了以优质卵母细胞为主要材料的胚胎工程技术的发展。母畜卵巢中腔前卵泡经生物材料包被后，外层形成保护膜，提供卵泡一个支撑力，维持了卵泡的立体结构和细胞间的通讯联系，保证旁分泌通路的正常运行，卵泡发育环境与体内类似，保证了充足的营养与能量供应，促进了其生长和成熟过程。鼠作为理想的模式动物是研究人与家畜资源的理想动物，建立成熟的小鼠卵泡三维培养体系，不仅可充分利用优良种母畜，加快畜生产中品种改良，还可以为深入研究环境因素对卵泡细胞发育的影响及其机制，为繁殖疾病例如PCOS提供更直接有效的研究模型。
发明内容：
本发明的目的在于提供一种用于体外培养小鼠腔前卵泡的试剂组合及其应用，本发明采用该试剂组合建立了一种小鼠腔前卵泡三维培养体系，该三维培养体系以藻酸盐凝胶为基质，以藻酸盐与Ca2+形成的凝胶滴为卵泡发育提供立体结构，再通过在不同的培养基质中进行培养，得到发育成熟的卵泡，进一步得到成熟的卵母细胞。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种用于体外培养小鼠腔前卵泡的试剂组合，该试剂组合包含：藻酸盐溶液、CaCl2凝胶液、卵泡分离液(DM)、卵泡平衡液(MM)、卵泡酶解液(EM)、卵泡生长液(GM)、卵泡成熟液(MM1)和透明质酸酶。
作为一种优选技术方案，所述藻酸盐溶液的浓度为0.8～1.2g/100ml；所述CaCl2凝胶液的浓度为40～60mM；进一步优选的所述藻酸盐溶液的浓度为1g/100ml；所述CaCl2凝胶液的浓度为50mM。作为一种具体的制备例：藻酸盐溶液(1g/100ml)的制备方法：称取0.5g藻酸盐(Alginate sodium)于锥形瓶中，加入0.25g活性炭粉末，50ml双蒸水；置于磁力搅拌器上，过夜搅拌；溶液通过0.22μM滤器去除活性炭，溶液-20℃保存。CaCl2凝胶液 (50mM)的制备方法：称取0.7350g CaCl2·2H2O粉末和0.8180g进口NaCl于100ml双蒸水中，于4℃保存。但不限于此。
作为一种优选技术方案，所述卵泡分离液(DM)的制备方法为：将L-15、双抗和FBS混匀，于4℃保存；所述L-15、双抗和FBS的体积比为200：1：2。作为一种具体的制备例：在50ml无菌离心管中加入30ml L-15、150μl双抗、300μl FBS，混匀，于4℃保存。
所述卵泡平衡液(MM)的制备方法为：将α-MEM、F-12和FBS混匀，于4℃保存；所述α-MEM、F-12和FBS的体积比为50：50：1。作为一种具体的制备例：在50ml无菌离心管中加入15mlα-MEM、15ml F-12、300μl FBS，混匀，于4℃保存。
所述卵泡酶解液(EM)的制备方法为：将L-15、双抗、collagenase和DNase混匀，于4℃保存；所述L-15、双抗、collagenase和DNase的体积比为500：5：1：1。作为一种具体的制备例：在10ml无菌离心管中加入5ml L-15、50μl双抗、10μl collagenase，10μl DNase，混匀，于4℃保存。
所述卵泡生长液(GM)的制备方法为：将α-MEM、F-12和100×ITS混匀后，称取fetuin 和BSA加入上述混合液，缓慢溶解，0.22μM过滤器过滤，加入FSH，混匀，于4℃保存；所述α-MEM、F-12、100×ITS和FSH的体积比为500：500：10：1；所述fetuin与α-MEM 的质量体积比为2mg/ml；所述BSA与α-MEM的质量体积比为6mg/ml。作为一种具体的制备例：在50ml无菌离心管中加入15mlα-MEM、15ml F-12、300μl ITS(100x)，称取30 mg fetuin、90mg BSA加入上述混合液，缓慢溶解，0.22μM过滤器过滤，加入30μl FSH，混匀，于4℃保存。
所述卵泡成熟液(MM1)的制备方法为：将α-MEM、EGF、hCG、FBS和FSH混匀，于 4℃保存；所述α-MEM、EGF、hCG、FBS和FSH的体积比为1000：2.5：1：100：1。作为一种具体的制备例：在10ml无菌离心管中加入5mlα-MEM、12.5μl EGF、5μl hCG、500μl FBS、5μl FSH，混匀，于4℃保存。
所述透明质酸酶的浓度为0.3％。作为一种具体的制备例：称取0.03g透明质酸酶，溶于10ml L-15，300μl/管，于-20℃保存。
上述的试剂组合在体外培养小鼠腔前卵泡中的应用。
一种体外培养小鼠腔前卵泡的方法，包括以下步骤：
(1)准备培养盘
向细胞培养板的每孔加入100μl卵泡生长液(GM)，再加入石蜡油封层，培养孔四周每孔加入100μl PBS，PBS的加入是为了防止在培养时水分蒸发，保持培养板中的水分平衡，最终保持卵泡生长液中各成分含量不变。
使用卵泡平衡液(MM)在培养皿做滴并用石蜡油封层；将细胞培养板、培养皿、剩余卵泡平衡液(MM)、剩余卵泡生长液(GM)、CaCl2凝胶液、藻酸盐溶液、卵泡酶解液(EM)一起放入培养箱平衡，平衡时间一般为2h；
(2)卵巢的分离
取37℃加热的卵泡分离液(DM)到培养皿中；打开雌性ICR小鼠(约2周龄)腹腔，剪取卵巢放在卵泡分离液(DM)中；去除子宫、输卵管和脂肪，得到干净卵巢；
(3)卵泡的分离选取
将干净卵巢加入平衡过的卵泡酶解液(EM)中酶处理后；将卵泡酶解液(EM)中的卵巢移至卵泡分离液(DM)使用1ml的注射器进行卵泡分离；然后使用捡卵针将分离的卵泡移入卵泡分离液(DM)滴中，重复3-4次直至分离理想数目卵泡；
(4)卵泡的封装
在卵泡分离液(DM)滴中，挑选符合标准(形态结构良好、多层颗粒细胞完整、直径在 140μm左右)的卵泡，用藻酸盐溶液做两个滴，一个作为“洗滴”，一个作为“封装滴”，将符合标准的卵泡先移入洗滴清洗后，再移入封装滴形成由卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴；将卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴移入CaCl2凝胶液中进行交联；交联后将凝胶滴转入卵泡分离液 (DM)中清洗多余的CaCl2凝胶液，再将凝胶滴移入平衡好的卵泡平衡液(MM)中平衡后，再移入细胞培养板上已经平衡好的卵泡生长液(GM)滴中，卵泡的封装完成，拍照记录卵泡状态；
作为一种具体实施例，将球滴移入CaCl2凝胶液中进行交联的详细过程为：将移液器调制5μl，先吸取适量藻酸盐溶液，再吸取选好的卵泡，再吸取适量的藻酸盐溶液，将卵泡保持在枪头的中段，然后使用无菌的吸水纸擦干枪头的液体，将枪头垂直于CaCl2凝胶液液面，按压枪头，将凝胶液挤压成球状，将球滴接触CaCl2凝胶液液面(注意枪头不要碰到液面)；
将卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴移入CaCl2凝胶液中交联2min，将凝胶滴转入卵泡分离液(DM)中清洗多余的CaCl2凝胶液，再将胶滴转入平衡好的卵泡平衡液(MM)中，放入培养箱平衡30min，再移入96孔培养板中已经平衡好的卵泡生长液(GM)滴中，拍照记录卵泡状态；
(5)卵泡成熟培养
封装卵泡在37℃，5％CO2条件下于卵泡生长液(GM)中培养8天，每隔一天更换50％培养基(卵泡生长液50μl)，检查卵泡存活情况和直径，拍照记录，如果颗粒细胞变黑或碎裂，则断定卵泡死亡；
卵泡培养8天后，将符合成熟条件的卵泡(直径＞300μm)胶滴移入37℃加热的卵泡分离液(DM)中，随后使用吸卵针移入已平衡的卵泡成熟液(MM1)中，培养16-18h；
(6)收集成熟卵母细胞
在显微镜下观察经过成熟培养后的卵泡存活情况，剥开包被完好的卵泡胶滴将成熟的卵泡细胞置于卵泡分离液(DM)中，随后使用1ml注射器和镊子剥开卵泡将卵母细胞剥离；然后移入0.3％的透明质酸酶液滴中，脱去卵丘颗粒细胞后，得到成熟卵母细胞(MⅡ)，并统计成熟率，MⅡ卵母细胞可用于后续的各种试验。
本发明的有益效果：
动物卵泡发育过程中不足1％的卵泡能发育并排卵，而绝大多数卵泡发生闭锁。卵泡闭锁不仅造成优良母畜遗传资源的浪费，还阻碍了以优质卵母细胞为主要材料的胚胎工程技术的发展。本发明建立卵泡三维培养体系，不仅可以充分利用优良种母畜的卵泡资源，加快品种改良；还可以为深入研究环境因素对卵泡发育的影响及其机制和繁殖疾病(如PCOS)提供更直观有效的研究模型。
附图说明：
图1为14日龄雌鼠卵巢剥离示意图。
图2为卵泡封装示意图。
图3为藻酸盐与Ca2+胶联示意图。
图4为鼠卵泡体外三维培养体系的培养效果图。
图5为不同批次试验获得的MⅡ卵母细胞。
具体实施方式：
以下结合具体实施例对本发明做出详细的描述。根据以下的描述和这些实施例，本领域技术人员可以确定本发明的基本特征，并且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明做出各种改变和修改，以使其适用各种用途和条件。
实施例1卵泡体外三维培养体系的建立
1.实验动物
选取13-15日龄的ICR雌性小鼠，用小鼠专用颗粒饲料采用自由采食的方式饲喂，保证其充足的饮水，鼠房温度维持在25℃，相对湿度控制在70％左右，保证鼠房独立通风。
2.实验试剂
试验所需试剂见表1。
表1建立卵泡体外三维培养体系所需试剂
Table 1Reagents needed to establish 3-D culture system of folliclesin vitro
3.溶液配制
藻酸盐溶液(1g/100ml)：称取0.5g藻酸盐(Alginate sodium)于锥形瓶中，加入0.25 g活性炭粉末，50ml双蒸水；置于磁力搅拌器上，过夜搅拌；溶液通过0.22μM滤器去除活性炭，溶液-20℃保存。
CaCl2凝胶液(50mM)：称取0.7350g CaCl2·2H2O粉末和0.8180g NaCl于100ml双蒸水中，于4℃保存。
卵泡分离液(DM)：在50ml无菌离心管中加入30ml L-15、150μl双抗(Penicillin-Streptomycin)、300μl FBS，混匀，于4℃保存。
卵泡平衡液(MM)：在50ml无菌离心管中加入15mlα-MEM、15ml F-12、300μl FBS，混匀，于4℃保存。
卵泡酶解液(EM)：在10ml无菌离心管中加入5ml L-15、50μl双抗(Penicillin-Streptomycin)、10μl collagenase，10μl DNase，混匀，于4℃保存。
卵泡生长液(GM)：在50ml无菌离心管中加入15mlα-MEM、15ml F-12、300μl ITS(100x)，称取30mg fetuin、90mg BSA加入上述混合液，缓慢溶解，0.22μM滤器过滤，加入30μl FSH，混匀，于4℃保存。
卵泡成熟液(MM1)：在10ml无菌离心管中加入5mlα-MEM、12.5μl EGF、5μl hCG、500μl FBS、5μl FSH，混匀，于4℃保存。
0.3％透明质酸酶：称取0.03g透明质酸酶，溶于10ml L-15，300μl/管，于-20℃保存。
4.实验仪器
试验仪器见表2。
表2建立卵泡体外三维培养体系所需仪器
Table 2Apparatus needed to establish 3-D culture system of folliclesin vitro
5.实验方法
5.1.准备培养盘
用紫外灯提前照射超净台杀菌，向96孔板每孔加入100μl卵泡生长液(GM)，上面用200μl枪加入3滴石蜡油封层，培养孔四周每孔加入100μl PBS；剩余卵泡生长液(GM)保留。
使用卵泡平衡液(MM)在30mm培养皿做滴，50μl/滴，一般做4滴，上面用石蜡油封层，剩余卵泡平衡液(MM)保留。将96孔板、培养皿、剩余卵泡平衡液(MM)、剩余卵泡生长液(GM)、3ml CaCl2凝胶液、藻酸盐溶液、卵泡酶解液(EM)一起放入培养箱平衡2h。
5.2.卵巢的分离
取3ml 37℃加热的卵泡分离液(DM)到30mm培养皿中；脊椎脱臼处死2周龄雌性ICR小鼠，使用酒精消毒腹部，打开腹腔，在肾下侧找到卵巢，剪取，放在卵泡分离液(DM) 中；在显微镜下，使用胰岛素注射器针头去除子宫、输卵管和脂肪，得到完整的干净卵巢 (如图1)。
5.3.卵泡的分离选取
将干净卵巢加入平衡过的卵泡酶解液(EM)中，酶处理40min；将卵泡酶解液(EM)中的卵巢移至卵泡分离液(DM)后，使用1ml的注射器分离卵泡，左手握针将组织固定在皿底部，右手握针轻轻分离卵泡。尽量在不刺破卵泡的情况下切除周围的大部分基质，将分离卵泡使用捡卵针移入卵泡分离液(DM)滴中，重复3-4次直至分离理想数目卵泡。
5.4.卵泡的封装
在卵泡分离液(DM)滴中，挑选符合标准(形态结构良好、多层颗粒细胞完整、直径在 140μm左右)的卵泡。用藻酸盐溶液做两个滴，一个作为“洗滴”，一个作为“封装滴”，先将符合条件的卵泡移入洗滴清洗后，再移入封装滴形成由卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴(如图 2)；用移液枪将卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴移入CaCl2凝胶液进行交联；交联2min后将凝胶滴转入卵泡分离液(DM)中清洗多余的CaCl2凝胶液，再将胶滴转入平衡好的卵泡平衡液 (MM)中，放入培养箱平衡30min，再移入96孔培养板中已经平衡好的卵泡生长液(GM)滴中，卵泡的封装完成，拍照记录卵泡状态。
5.5.卵泡成熟培养
封装卵泡在37℃，5％CO2条件下于卵泡生长液(GM)中培养8天，每隔一天更换50％的卵泡生长液(GM)(50μl)。检查卵泡存活情况和直径，拍照记录。如果颗粒细胞变黑或碎裂，则断定卵泡死亡。
首先将卵泡分离液(DM)放入37℃水浴锅中加热，然后将卵泡成熟液(MM1)加入96孔板中，100μl/孔，上面用200μl枪加入3滴石蜡油封层，培养孔四周每孔加入100μl PBS，置入37℃培养箱中平衡20min。
卵泡培养8天后，将符合成熟条件的卵泡(直径＞300μm)胶滴移入37℃加热的卵泡分离液(DM)液滴中，随后使用吸卵针移入已平衡的卵泡成熟液(MM1)中，成熟培养16-18h。
5.6.收集成熟卵泡
在显微镜下观察经过成熟培养后的卵泡存活情况，将包被完好的卵泡胶滴用胰岛素注射器和镊子剥开胶滴(左手持镊子固定胶滴，右手持胰岛素注射器剥开胶滴，注意不要划伤卵泡细胞)，之后将成熟的卵泡细胞置于卵泡分离液(DM)中，随后使用1ml注射器和镊子剥开卵泡将卵母细胞剥离；然后移入0.3％的透明质酸酶液滴中，脱去卵丘颗粒细胞后，得到成熟卵母细胞(MⅡ)，并统计成熟率，MⅡ卵母细胞可用于后续的各种试验。
5.7.实验设计
本试验共计收集60枚卵泡细胞(分6次，10枚/每次，分批次培养与观察成熟情况(见图5)。
6.结果
6.1.卵泡体外三维培养体系的建立
本次实验成功利用海藻酸盐与钙离子发生交联时形成的水凝胶包埋分离好的卵泡建立了小鼠卵泡体外三维培养体系(图4)。在培养8天后，转入成熟滴，成熟培养16-18h后，成功剥开卵泡后得到了MⅡ卵母细胞(图4F)。
6.2.卵泡体外三维培养体系中卵母细胞的成熟率情况
共从小鼠分离出的卵巢中选取了60枚符合要求的卵泡进行封装。37℃、5％CO2条件下，在GM中经过8天，然后转移至MM1中培养18h后获得了MⅡ卵母细胞平均为4.17 枚，成熟率达到41.7％(表3)。
表3卵泡体外三维培养体系中卵母细胞的成熟率
Table 3Oocyte maturation rate in three-dimensional follicular culturesystem in vitro
Claims (10)
1.一种用于体外培养小鼠腔前卵泡的试剂组合，其特征在于，该试剂组合包含：藻酸盐溶液、CaCl2凝胶液、卵泡分离液、卵泡平衡液、卵泡酶解液、卵泡生长液、卵泡成熟液和透明质酸酶。
2.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述藻酸盐溶液的浓度为0.8～1.2g/100ml；所述CaCl2凝胶液的浓度为40～60mM；优选的所述藻酸盐溶液的浓度为1.0g/100ml；所述CaCl2凝胶液的浓度为50mM。
3.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述卵泡分离液的制备方法为：将L-15、双抗和FBS混匀，于4℃保存；所述L-15、双抗和FBS的体积比为200：1：2。
4.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述卵泡平衡液的制备方法为：将α-MEM、F-12和FBS混匀，于4℃保存；所述α-MEM、F-12和FBS的体积比为50：50：1。
5.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述卵泡酶解液的制备方法为：将L-15、双抗、collagenase和DNase混匀，于4℃保存；所述L-15、双抗、collagenase和DNase的体积比为500：5：1：1。
6.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述卵泡生长液的制备方法为：将α-MEM、F-12和100×ITS混匀后，称取fetuin和BSA加入上述混合液，缓慢溶解，0.22μM过滤器过滤，加入FSH，混匀，于4℃保存；所述α-MEM、F-12、100×ITS和FSH的体积比为500：500：10：1；所述fetuin与α-MEM的质量体积比为2mg/ml；所述BSA与α-MEM的质量体积比为6mg/ml。
7.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述卵泡成熟液的制备方法为：将α-MEM、EGF、hCG、FBS和FSH混匀，于4℃保存；所述α-MEM、EGF、hCG、FBS和FSH的体积比为1000：2.5：1：100：1。
8.根据权利要求1所述的试剂组合，其特征在于，所述透明质酸酶的浓度为0.3％。
9.权利要求1～8中任意一项所述的试剂组合在体外培养小鼠腔前卵泡中的应用。
10.一种体外培养小鼠腔前卵泡的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)准备培养盘
向细胞培养板的每孔加入100μl卵泡生长液，再加入石蜡油封层，培养孔四周每孔加入100μlPBS；
使用卵泡平衡液在培养皿做滴并用石蜡油封层；将细胞培养板、培养皿、剩余卵泡平衡液、剩余卵泡生长液、CaCl2凝胶液、藻酸盐溶液、卵泡酶解液一起放入培养箱平衡；
(2)卵巢的分离
取加热的卵泡分离液到培养皿中；打开雌性ICR小鼠腹腔，剪取卵巢放在卵泡分离液中；去除子宫、输卵管和脂肪，得到干净卵巢；
(3)卵泡的分离选取
将干净卵巢加入平衡过的卵泡酶解液中酶处理后；将卵泡酶解液中的卵巢移至卵泡分离液进行卵泡分离；然后将分离的卵泡移入卵泡分离液滴中，重复3-4次直至分离理想数目卵泡；
(4)卵泡的封装
在卵泡分离液滴中，挑选符合标准的卵泡，用藻酸盐溶液做两个滴，一个作为“洗滴”，一个作为“封装滴”，将符合标准的卵泡先移入洗滴清洗后，再移入封装滴形成由卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴；将卵泡和藻酸盐溶液做成的球滴移入CaCl2凝胶液中进行交联；交联后将凝胶滴转入卵泡分离液中清洗多余的CaCl2凝胶液，再将凝胶滴移入平衡好的卵泡平衡液中平衡后，再移入细胞培养板上已经平衡好的卵泡生长液滴中，卵泡的封装完成，拍照记录卵泡状态；
(5)卵泡成熟培养
封装卵泡在37℃，5％CO2条件下于卵泡生长液中培养8天，每隔一天更换50％培养基，检查卵泡存活情况和直径，拍照记录，如果颗粒细胞变黑或碎裂，则断定卵泡死亡；
卵泡培养8天后，将符合成熟条件的卵泡胶滴移入加热的卵泡分离液中，随后使用吸卵针移入已平衡的卵泡成熟液中，培养16-18h；
(6)收集成熟卵母细胞
在显微镜下观察经过成熟培养后的卵泡存活情况，剥开包被完好的卵泡胶滴将成熟的卵泡细胞置于卵泡分离液中，随后剥开卵泡将卵母细胞剥离；然后移入0.3％的透明质酸酶液滴中，脱去卵丘颗粒细胞后，得到成熟卵母细胞(MⅡ)，并统计成熟率，MⅡ卵母细胞可用于后续的各种试验。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011415326.2A CN112899219A (zh) | 2020-12-07 | 2020-12-07 | 一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202011415326.2A CN112899219A (zh) | 2020-12-07 | 2020-12-07 | 一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112899219A true CN112899219A (zh) | 2021-06-04 |
Family
ID=76111450
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202011415326.2A Pending CN112899219A (zh) | 2020-12-07 | 2020-12-07 | 一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112899219A (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070020755A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Teresa Woodruff | Stage specific follicle maturation systems |
| CN102023217A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-04-20 | 扬州大学 | 牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素elisa检测试剂盒及使用方法 |
| CN105039245A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-11-11 | 浙江大学 | 一种利用3d打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法 |
| US20180057796A1 (en) * | 2014-01-28 | 2018-03-01 | Northwestern University | 3d microphysiologic system |
| CN108823152A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-11-16 | 河南牧业经济学院 | 一种小鼠卵母细胞的体外成熟培养液及体外成熟培养方法 |
| CN111235095A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-06-05 | 天津博裕力牧科技有限公司 | 改进牛卵母细胞体外成熟的方法 |
-
2020
- 2020-12-07 CN CN202011415326.2A patent/CN112899219A/zh active Pending
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20070020755A1 (en) * | 2005-07-07 | 2007-01-25 | Teresa Woodruff | Stage specific follicle maturation systems |
| CN102023217A (zh) * | 2010-12-01 | 2011-04-20 | 扬州大学 | 牛病毒性腹泻病毒双抗夹心生物素-亲和素elisa检测试剂盒及使用方法 |
| US20180057796A1 (en) * | 2014-01-28 | 2018-03-01 | Northwestern University | 3d microphysiologic system |
| CN105039245A (zh) * | 2015-07-01 | 2015-11-11 | 浙江大学 | 一种利用3d打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法 |
| CN108823152A (zh) * | 2018-07-25 | 2018-11-16 | 河南牧业经济学院 | 一种小鼠卵母细胞的体外成熟培养液及体外成熟培养方法 |
| CN111235095A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-06-05 | 天津博裕力牧科技有限公司 | 改进牛卵母细胞体外成熟的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| 万旭英等: "小鼠腔前卵泡体外培养方法的建立", 卫生研究, vol. 38, no. 2, pages 5 - 6 * |
| 曾荔苹等: "小鼠腔前卵泡三维培养成熟后受精体系的建立及优化", 癌变 畸变 突变, vol. 25, no. 3, pages 211 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Baert et al. | Mouse in vitro spermatogenesis on alginate-based 3D bioprinted scaffolds | |
| Pangas et al. | Novel approach for the three-dimensional culture of granulosa cell–oocyte complexes | |
| JP2023515749A (ja) | 培養乳製品産生のための生細胞構築物およびその使用方法 | |
| Sakib et al. | Generation of porcine testicular organoids with testis specific architecture using microwell culture | |
| Lu et al. | A simplified method for ultra-low density, long-term primary hippocampal neuron culture | |
| CN113215087A (zh) | 采用阿戈美拉汀改进猪卵母细胞体外成熟发育率的方法 | |
| CN110628709A (zh) | 一种提高猪卵母细胞体外成熟质量的培养液及培养方法 | |
| US20070086986A1 (en) | Preparation of three-dimensional mammalian ovarian follicular cell and ovarin follicle culture systems in a biocompatible matrix | |
| CN113174366B (zh) | 含有丁苯羟酸的猪卵母细胞体外成熟体系及应用 | |
| Yang et al. | Production of identical twin rabbits by micromanipulation of embryos | |
| CN107937444A (zh) | 体细胞克隆犬的方法 | |
| Khunmanee et al. | Three-dimensional culture for in vitro folliculogenesis in the aspect of methods and materials | |
| Bashiri et al. | In vitro spermatogenesis in artificial testis: current knowledge and clinical implications for male infertility | |
| Park et al. | Effects of alginate hydrogels on in vitro maturation outcome of mouse preantral follicles | |
| CN112899219A (zh) | 一种小鼠腔前卵泡三维培养体系及其建立方法 | |
| CN105018418B (zh) | 含Endothelin-1的人类卵母细胞体外成熟培养液和应用 | |
| JP2009532054A (ja) | 三次元細胞培養 | |
| CN110684718B (zh) | 一种暗纹东方鲀原代肝细胞高效分离及培养方法 | |
| Faustini et al. | Boar sperm encapsulation reduces in vitro polyspermy | |
| TWI713598B (zh) | 培養容器之顯示用封件 | |
| CN101886059A (zh) | 用于胚胎体外生产的培养液以及牛胚胎体外生产的方法 | |
| TW201812003A (zh) | 清洗卵子或受精卵表面的方法 | |
| CN110438068B (zh) | 一种提高河流型水牛体外受精胚胎发育率的方法 | |
| Verdile et al. | Preparation of Biological Scaffolds and Primary Intestinal Epithelial Cells to Efficiently 3D Model the Fish Intestinal Mucosa | |
| CN102796697A (zh) | 克服牛体外胚胎早期发育阻滞的培养液配制和培养方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |