CN117447601A - 猪IgM的抗体、抗体组合物及其应用 - Google Patents
猪IgM的抗体、抗体组合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及抗体技术领域，具体涉及猪IgM的抗体、抗体组合物及其应用。本发明提供的猪IgM的抗体能够特异性结合猪IgM，与其他类似蛋白无交叉反应，与猪IgM具有较高的亲和力，且具有较高的稳定性；基于该抗体利用双抗夹心ELISA法检测猪IgM具有较高的灵敏度、特异性和准确性，能够实现准确、高通量地检测猪血清或其他含有猪IgM的血清类似物或产品中的IgM含量，在猪IgM检测中具有较好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，尤其涉及猪IgM的抗体、抗体组合物及其应用。
背景技术
IgM是动物个体发育过程中最早合成和分泌的抗体，在抗原刺激诱导的体液免疫应答中，IgM也是最先产生的抗体。IgM作为检测指标有助于猪细菌性及病毒性疾病感染的早期诊断。在血液制品和临床诊断中，快速、准确地检测猪血清中IgM的含量具有重要意义。
由于各种疾病对机体免疫系统影响的复杂性，早期诊断是避免猪群遭受严重危害的重要途径，尽管早期诊断的方法很多，但对于进出境或区域性贸易的活猪传染性疾病却仍缺乏及时而又全面的诊断方法。抗体检测对于猪传染病流行情况监测、疫苗免疫效果评价及免疫程序的优化至关重要。利用猪IgM的检测技术不仅能够检测出群体对疫苗的应答效果，同时对早期感染的检测、特别是早期快速检测方法的建立也有很强的针对性。而猪IgM的检测技术中，抗体的性能是影响检测效果的关键因素。因此，开发对猪IgM具有高亲和力和特异性的抗体对于猪IgM的灵敏、准确的检测具有重要意义。
发明内容
本发明提供猪IgM的抗体、抗体组合物及其应用。
本发明以猪IgM蛋白为抗原免疫小鼠，经细胞融合和杂交瘤细胞筛选，获得了对猪IgM蛋白具有高亲和力和高特异性的抗体，并基于该抗体开发了用于检测猪IgM的试剂盒和方法。
具体地，本发明提供以下技术方案：
第一方面，本发明提供猪IgM的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示。
上述抗体能够特异性结合猪IgM，具有较高的亲和力，且稳定性较高，基于上述抗体开发的双抗夹心ELISA法检测试剂盒可用于检测猪IgM的含量，具有较广的检测浓度范围和较高的线性相关性，且具有较高的灵敏度、特异性和准确性。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示或与如SEQ ID NO.13所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQID NO.14所示或与如SEQ ID NO.14所示序列具有至少80%的相似性。
上述序列相似性优选为至少85%，更优选为至少90%，更优选为至少95%，更优选为至少98%，更优选为至少99%，更优选为至少99.5%。
在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示。
优选地，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或单链抗体。
第二方面，本发明提供编码以上所述的抗体或其抗原结合片段的核酸分子。
根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。
在本发明的一些实施方式中，编码所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，编码所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。
第三方面，本发明提供含有以上所述的核酸分子的生物材料，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
上述表达盒可通过在所述核酸分子的上游连接启动子等转录或翻译调控元件和/或在其下游连接终止子等转录或翻译调控元件得到。
上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。
上述宿主细胞包括微生物细胞、昆虫细胞或其它动物细胞。
第四方面，本发明提供抗体偶联物，所述抗体偶联物为将以上所述的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
第五方面，本发明提供猪IgM的抗体组合物，所述抗体组合物包含以下（1）和（2）中的抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11、12所示。
优选地，上述（1）中所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示或与如SEQ ID NO.13所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.14所示或与如SEQ ID NO.14所示序列具有至少80%的相似性。
上述（2）中所述的抗体的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.15所示或与如SEQ ID NO.15所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示或与如SEQ ID NO.16所示序列具有至少80%的相似性。
上述抗体组合物可用于作为双抗夹心ELISA法检测猪IgM的配对抗体，抗体组合物中的两个抗体分别作为包被抗体和标记抗体。利用上述抗体组合物采用双抗夹心ELISA法检测猪IgM，具有较高的特异性、灵敏度和准确性。
在本发明的一些实施方式中，上述（1）中的抗体作为包被抗体，上述（2）中的抗体作为标记抗体。
第六方面，本发明提供以上所述的抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物或所述抗体组合物在制备用于检测猪IgM在样品中的存在或其水平的产品中的应用。
以上所述的样品包括来源于猪的生物样本（例如血液、血清、血清类似物等），还包括体外制备的含有猪IgM的产品（例如含有猪IgM的药物、饲料、饲料添加剂等）。
以上所述的产品可用于疾病诊断目的，例如，通过检测来源于猪的生物样本中IgM的含量对猪细菌性及病毒性疾病进行早期诊断；也可用于非疾病诊断目的，例如，检测体外制备的含有猪IgM的产品中猪IgM的含量，以进行产品生产、质量控制等。
上述产品包括检测试剂或试剂盒。
第七方面，本发明提供以上所述的抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或抗体组合物的以下任一种应用：
（1）在非疾病诊断目的的检测猪IgM在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在疫苗免疫原性或免疫效果检测中的应用；
（3）在含有猪IgM的产品的质量控制中的应用。
上述（1）中，非疾病诊断目的的检测包括检测体外制备的含有猪IgM的产品中猪IgM的含量，以进行产品生产、质量控制等。其中，含有猪IgM的产品包括药物、饲料、饲料添加剂等。
上述（2）中，可通过检测来源于猪的生物样本中猪IgM的含量，检测疫苗免疫原性或免疫效果。
本发明中，检测猪IgM的方法可以为酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等检测方法。
第八方面，本发明提供一种试剂盒，其包含以上所述的抗体或其抗原结合片段，或包含所述抗体偶联物，或包含所述抗体组合物。
优选地，所述试剂盒为双抗夹心ELISA检测试剂盒。
优选地，所述试剂盒包含包被抗体和标记抗体，所述包被抗体的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示；所述标记抗体的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11、12所示。
为便于检测，上述标记抗体还可包括可检测的标记（例如HRP标记）；所述试剂盒还可包括携带可检测的标记的第二抗体以检测所述抗体或其抗原结合片段。
所述试剂盒还可包含用于ELISA检测的其他试剂，这些试剂包括但不限于酶标板、猪IgM标准品、PBST洗液、封闭液、显色液、终止液等。
目前常用的免疫学检测方法包括血清中和试验（SN）、间接血凝试验（IHA）和ELISA，其中，中和试验操作繁琐；间接血凝操作简便、适合临床使用，但敏感性稍低；而ELISA方法具有操作简便、敏感性高、适于大规模样品检测等优势，在临床上得到广泛应用。本发明建立的双抗夹心ELISA方法具有特异、灵敏、重复性好的优势，为猪免疫后抗体水平检测以及细菌或病毒的早期感染检测提供了有力的工具。
采用基于双抗夹心ELISA法检测猪IgM含量的原理如下：将猪IgM的抗体包被在酶标板上；分别加入梯度稀释的标准品和预稀释的样本，标准品和样本中的猪IgM会与酶标板上的包被抗体充分结合；洗板后加入HRP标记的猪IgM的抗体，该抗体会与酶标板上包被抗体捕获的标准品和样本中的猪IgM发生特异性结合；洗板后加入显色剂底物TMB，若反应孔中样品存在不同浓度的猪IgM，则HRP会使无色TMB变成不同深浅（正相关）的蓝色物质，加入终止液后反应孔会变成黄色；最后，在λmax=450 nm（OD=450 nm）处测定反应孔样品吸光度（OD），样本中的猪IgM的浓度与OD成正比，通过标准曲线便可计算出样本中猪IgM的浓度。该方法借助了酶显色放大体系，其检测灵敏度较高，加之高亲和力抗体的使用，可以检测猪IgM含量比较低的样本。
血清学检测在评估适应性免疫反应中起着核心作用，不仅对评估疫苗的免疫原性和免疫效果至关重要，而且对接触病原体以及与其他病毒的交叉反应也具有指导意义。本发明提供的抗体或其抗原结合片段、抗体偶联物、抗体组合物和试剂盒能够实现猪IgM的定量检测，具有较高的特异性和灵敏度，是诊断猪早期感染和评价疫苗免疫效果的重要工具。
对本发明的试剂盒进行37℃加速稳定性实验，13天内试剂盒未发生显著变化，稳定性高；类似蛋白交叉实验结果显示，试剂盒表现特异，不识别猪IgA、IgG、IgE，人IgM、IgG、IgA、IgE，小鼠IgM、IgG、IgE，大鼠IgM、IgG、IgA、IgE，牛IgM、IgG、IgA，鸡IgM、IgG、IgA以及兔IgM、IgG、IgA。该试剂盒与目前已有同类试剂盒相比，拟合曲线与样本检测准确性均明显更优。该试剂盒的检测范围为3.125-200ng/mL，R2为0.9999，最低可检测猪IgM浓度达132pg/mL。利用该试剂盒检测健康猪血清、细胞培养上清的结果显示，其加标回收率以及线性稀释回收率均在70%-130%的正常范围内。
第九方面，本发明提供一种猪IgM的检测方法，所述方法包括：利用所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物或所述抗体组合物或所述试剂盒对待测样品中的猪IgM的含量进行检测。
上述检测的方法可选自酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测或免疫色谱法等。
本发明的有益效果至少包括：本发明提供的猪IgM的抗体能够特异性结合猪IgM，与其他类似蛋白无交叉反应，与猪IgM具有较高的亲和力，且具有较高的稳定性；基于该抗体利用双抗夹心ELISA法检测猪IgM具有较高的灵敏度、特异性和准确性，能够实现准确、高通量地检测猪血清或其他含有猪IgM的血清类似物或产品中的IgM含量，在猪IgM检测中具有较好的应用前景。
附图说明
为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例1中单克隆抗体4B9和6A11的SDS-PAGE检测结果，其中，M为蛋白质分子量标准。
图2为本发明实施例3中双抗夹心ELISA试剂盒检测猪IgM的标准曲线。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1 抗猪IgM单克隆抗体的制备
1、动物免疫
使用天然提取的猪血清IgM蛋白为抗原（100 μg/只）与等体积的弗氏完全佐剂乳化，乳化后向4-6周龄雌性BALB/c小鼠背部皮下多点注射，共免疫4只小鼠。间隔3周后换用不完全弗氏佐剂乳化抗原后免疫，免疫3次后取血测效价。冲击免疫在左侧腹腔注射抗原，三天后进行细胞融合。
2、细胞融合
将冲击免疫的小鼠眼眶放血处死，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇（PEG）。在聚乙二醇作用下，各种淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，形成杂交瘤细胞，具体操作如下：
（1）饲养细胞的制备
取一只未免疫的BALB/c小鼠，眼眶放血，收集血清为阴性血清。向小鼠腹腔内注入10 mL HAT培养基，缓慢吸出后置于96孔培养板中备用，该液中含有腹腔巨噬细胞。
（2）骨髓瘤（SP2/0）细胞活化
复苏液氮中冻存的SP2/0细胞，重悬于营养液（RPMI-1640，含20%小牛血清）中，置于37℃、5%CO2条件下培养箱培养，观察细胞生长情况，待细胞呈圆形透亮，轻微贴壁生长时，收集细胞并悬浮于RPMI-1640培养液中，计数后取0.5~1×106个注射于BALB/c小鼠背部皮下，持续培养9~10 d。待背部肿瘤体积增大至直径约0.8 cm，将小鼠拉颈处死，75%酒精浸泡5 min后无菌操作取瘤。
剪下肿瘤块置于灭菌的匀浆器中，加5 mL RPMI-1640培养液充分研磨后补加10mL RPMI-1640培养液，静置2 min，待较大的组织团块沉于管底后吸取上层的细胞悬液置于另一离心管中，补加10 mL RPMI-1640培养液，重复研磨两次后将上述取得的细胞悬液于1000 r/min离心10 min，弃上清后用RPMI-1640培养液重悬，定容至30 mL。
于另一离心管中加入15mL淋巴细胞分离液，将上述细胞缓慢加入在分离液之上（比例为1:2~1:1）；随后1200 r/min离心15min，吸管深入在致密的白色细胞层吸取，然后用RPMI-1640培养液清洗细胞2遍再重悬于10mL RPMI-1640培养液中，计数后备用。
（3）免疫脾细胞的制备
将冲击免疫后的BALB/c小鼠眼眶放血处死（收集血清，即为阳性血清），然后置于75%酒精中浸泡5min消毒，随后用无菌的小刀和镊子将其固定在解剖板上，取出脾脏剪破外膜，置于灭菌的匀浆器中；加入30mL RPMI-1640培养液于匀浆器中，研磨（不要太剧烈，以免损伤脾细胞，可选用比较松的匀浆器），挤压出脾细胞，取出匀浆棒，补加10mL RPMI-1640培养液，于1200 r/min离心5 min后去上清，清洗细胞2遍。
（4）细胞融合
将SP2/0与脾细胞于按5：1于50mL离心管中混匀，1200 r/min离心5 min。弃净上清后置于37℃水浴锅中，轻轻敲击管底，使细胞沉淀略加松动（便于PEG充分作用于细胞），将1mL预温至37℃的50% PEG（Sigma）缓慢加入混匀，搅拌后静置30s。随后将37℃ 预温的RPMI-1640培养液在2分钟内逐滴滴入1mL，然后在1分钟内滴加1 mL，1分钟滴加5 mL，定容至40mL终止融合。混匀后在1000 r/min离心5 min，弃上清后于37℃水浴锅中放置5-8 min。随后分种于上述饲养细胞中，100 μL/孔，置于37℃、5% CO2培养箱中培养观察。融合后第5天长成一定大小的集落换成HT培养基继续培养。待融合细胞集落长至培养孔1/4时，细胞团状态良好，进行抗体效价检测。
3、杂交瘤阳性克隆的筛选、细胞的克隆化和单克隆抗体的制备
采用间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞，其步骤如下：
（1）包被已知抗原：用包被缓冲液将纯化的包被用抗原稀释至2 μg/mL；向微孔中每孔加100 μL，4℃冰箱过夜；第二天拍干孔内液体；磷酸盐吐温缓冲液（PBST）洗涤4次，每次2～3分钟。
（2）封闭酶标孔中未被抗原包被的位置：每孔加250 μL 2%BSA封闭酶标板，室温静置1h，甩掉孔内液体；
（3）加样：PBST洗涤4次，拍干后加入待测的杂交瘤细胞上清，每孔50 μL按顺序加入酶标孔中，于37℃恒温箱孵育1h，洗涤，拍干。
（4）加酶标抗抗体：二抗用羊抗小鼠IgG，PBST稀释至1：5000，每孔加入100 μL，轻轻摇匀，置于37℃孵育1h；然后洗涤，拍干。
（5）加显色液和终止液：每孔加入100 μL TMB显色液，室温5min后，每孔加入50 μL终止液。
（6）判定结果：将酶标板在酶标仪OD450下进行读数，大于阴性孔2.1倍可判定为阳性。
采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化，具体步骤如下：
克隆前制备小鼠饲养细胞层；将待克隆的杂交瘤细胞从培养孔内轻轻吹下，用血细胞计数板计数活细胞数；将细胞用完全培养基稀释到5、10、30个细胞/毫升；将上述三个浓度的细胞悬液分别加入已制备好的饲养细胞的96孔培养板，100μL/孔，使相应的每孔分别含0.5、1和3个细胞。培养到第4天补液一滴，第5-6天仔细观察各孔内细胞的生长情况，并记录。
特异性抗体的检测：在克隆后第7~9天，细胞克隆长满1/3~1/2个视野时，即可检测；挑选阳性孔的单个细胞团再克隆，2~3次克隆后挑选效价高、状态好的单个细胞团扩大培养，冻存备用，接种于小鼠腹腔中制备腹水，产生并回收抗体。
单克隆抗体的大量制备：上述细胞用0.5 mL磷酸缓冲盐溶液（PBS）洗涤并悬起，腹腔注射于石蜡油致敏过的小鼠，肚子隆起并发青后收集腹水。取出的腹水于4℃、3500 r/min离心5min。小心吸出腹水收集于离心管中，-20℃保存备用。
经筛选获得两株特异性结合猪IgM的单克隆抗体，分别命名为单克隆抗体4B9和6A11。
4、单克隆抗体4B9和6A11的可变区序列测定
收集杂交瘤细胞数量大于106，送至北京擎科生物进行后续构建及测序。测序结果显示：单克隆抗体4B9的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ IDNO.4、5、6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示；重链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.17所示，轻链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.18所示；单克隆抗体6A11的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11、12所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ IDNO.15所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.16所示；重链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.19所示，轻链可变区的编码基因序列如SEQ ID NO.20所示。
5、单克隆抗体4B9和6A11的纯化
将建株后的杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，7天左右收集腹水，采用Protein G亲和层析纯化抗体，并用SDS-PAGE对抗体纯度进行鉴定，结果如图1所示。
实施例2 单克隆抗体的亲和力检测
对单克隆抗体4B9和6A11的相对亲和常数进行测定，具体方法如下：
将猪IgM抗原包被到酶标板上并封闭。PBST洗板后将单克隆抗体4B9和6A11稀释至饱和浓度加入到酶标板中，100μL/孔，室温静置孵育2h。PBST洗板后依次加入0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0mol/L的NaSCN（硫氢酸钠）溶液60μl/孔，室温静置孵育15 min。PBST洗板后，加HRP标记的山羊抗小鼠IgG，室温静置孵育45min显色检测。经洗脱后450nm处OD值下降至未经洗脱的50%所对应的硫氰酸钠浓度即为该抗体的相对亲和力常数，用mol/L表示。结果显示单克隆抗体4B9和6A11的相对亲和常数均不低于1.5mol/L（表1），亲和力良好。
表1
实施例3 用于猪IgM含量检测的双抗夹心ELISA试剂盒的建立
1、单克隆抗体6A11的HRP标记
将单克隆抗体6A11加入到透析袋中，4℃浸入0.01M的碳酸盐缓冲液（CBS）中过夜透析。取10mg HRP，溶于2mL水中。配制新鲜的0.1mol/L高碘酸钠（NaIO4）溶液，取0.4mL0.1mol/L的NaIO4加入至2mL辣根过氧化物酶（HRP）溶液中，混匀，室温避光45min，浸入10mM的醋酸钠（NaAc）缓冲液中4℃过夜透析。取出过夜透析的抗体和HRP溶液，加入0.1mL0.2mol/L pH 9.5的CBS，然后立即在HRP溶液中加入已经取出的抗体，室温避光轻轻搅拌2小时。称取0.04g硼氢化钠（NaBH4）溶于10mL水中，取0.4mL加入反应液中，混匀，置于4℃，2小时。取出放于透析袋中，于0.01mol/L PBS中透析，2小时后换一次液，4℃过夜透析。取出过夜透析的标记液，加入等体积甘油，放于-20℃保存。
2、单克隆抗体4B9包被酶标板的制备
用0.05M pH 9.6的碳酸盐包被缓冲液将单克隆抗体4B9稀释至2μg/mL。在96孔聚苯乙烯试剂板反应孔中加0.1mL，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。经过上述步骤后，加入2%BSA溶液封闭反应板的每个孔，每孔0.3mL，室温放置2h。弃去孔内溶液，置于干房干燥后抽真空，4℃保存。
3、双抗夹心ELISA方法的建立
于实验前30 min，取出单克隆抗体4B9包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μL不同稀释浓度的猪IgM标准品，猪IgM稀释浓度为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL，并设空白对照。封板后于室温静置孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μL酶标记抗体HRP-6A11工作液至反应孔中，封板后于室温静置孵育45 min，洗板4次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室避光显色15min，加入50μL终止液（2M硫酸溶液），即刻（5分钟内）用酶标仪450nm波长下测量OD值。以不同浓度的猪IgM标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果显示，其检测范围为3.125-200ng/ml，R2为0.9999（图2）。
4、双抗夹心ELISA试剂盒的灵敏度检测
在实验前30 min，取出单克隆抗体4B9包被好的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μL不同稀释浓度的猪IgM标准品，猪IgM稀释浓度为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL，并设20孔空白对照。封板后于室温静置孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μL酶标记抗体HRP-6A11工作液至反应孔中，封板后于室温静置孵育45 min，洗板4次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μL终止液（2M硫酸溶液），即刻使用酶标仪进行双波长检测（5分钟内）。检测20个零标准品浓度OD的平均值加上两个标准差，计算相应的可检测浓度，灵敏度为132pg/mL（表2）。
表2
5、双抗夹心ELISA试剂盒的特异性检测
于实验前30 min，取出单克隆抗体4B9包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。加入100μL猪IgM结构类似蛋白，包括猪IgA、IgG、IgE，人IgM、IgG、IgA、IgE，小鼠IgM、IgG、IgE，大鼠IgM、IgG、IgA、IgE，牛IgM、IgG、IgA，鸡IgM、IgG、IgA，兔IgM、IgG、IgA。封板后于室温静置孵育2 h，洗板4次并甩干。加入100μL酶标记抗体HRP-6A11工作液至反应孔中，封板后于室温静置孵育45 min，洗板4次并甩干。加入100μL显色底物TMB 至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μL终止液（2M硫酸溶液），即刻（5分钟内）用酶标仪450nm波长下测量OD值。结果显示，单克隆抗体4B9和6A11不与其他类似蛋白反应（表3）。
表3
6、双抗夹心ELISA试剂盒的稳定性检测
将单克隆抗体4B9包被的酶标板、HRP标记的单克隆抗体6A11、及标准品猪IgM放于37℃进行加速稳定性实验，放置13天（相当于4℃放置15个月）。随后取出检测，检测方法如下：取出酶标板洗板3次并甩干。加入100μL不同稀释浓度的猪IgM标准品，猪IgM稀释浓度为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL，并设空白对照。封板后于室温静置孵育2h，洗板4次并甩干。加入100μL酶标记抗体HRP-6A11工作液至反应孔中，封板后于室温静置孵育45 min，洗板4次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μL终止液（2M硫酸溶液），即刻（5分钟内）用酶标仪450nm波长下测量OD值。以不同浓度的猪IgM标准品为横坐标，以相对应的OD值为纵坐标绘制标准曲线，建立回归方程。结果显示，考核13天内，试剂盒OD值变化不大且梯度良好，表明试剂盒稳定性良好（表4）。
表4
7、加标回收率检测
于实验前30 min，取出单克隆抗体4B9包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。选择猪血清4份（编号为1、2、3、4号）和含猪IgM的细胞上清1份，加入三个不同浓度的猪IgM，分别为80ng/mL、20ng/mL、5ng/mL，并设空白对照。封板后于室温静置孵育2h，洗板4次并甩干。加入100 μL酶标记抗体HRP-6A11工作液至反应孔中，封板后于室温静置孵育45min，洗板4次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15min，加入50μL终止液（2M硫酸溶液），即刻（5分钟内）用酶标仪450nm波长下测量OD值。检测结果显示，加标回收率均在70%-130%的正常范围内（表5）。
表5
8、线性稀释回收率检测
于实验前30 min，取出单克隆抗体4B9包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。选择猪血清4份（编号为1、2、3、4 号）和细胞上清1份，加入80ng/mL的高浓度猪IgM，在标准曲线动力学范围内进行稀释，评估线性。封板后于室温静置孵育2h，洗板4次并甩干。加入100 μL酶标记抗体HRP-6A11工作液至反应孔中，封板后于室温静置孵育45 min，洗板4次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μL终止液（2M硫酸溶液），即刻（5分钟内）用酶标仪450nm波长下测量OD值。检测结果显示，线性稀释回收率在94%-119%范围内，该试剂盒在较宽的稀释范围内线性良好，可以灵活地测定具有不同水平分析物的样品IgM的含量（表6）。
表6
实施例4 与其他品牌同种类型试剂盒的测试结果比较
选择市售猪IgM检测试剂盒——X品牌试剂盒（Genorise，货号：GR113235-1）进行类比测试，按照该品牌试剂盒最适的方法进行实验（完全按照其说明书进行操作）。通过以下两个方面对本发明的试剂盒与该品牌试剂盒的性能进行比较。
1、标准曲线比对：结果表明，本发明的试剂盒的拟合曲线优于X品牌试剂盒（R2=0.9990），且本发明的试剂盒的本底表现优良（零孔值为0.012），低于X品牌试剂盒的本底值（零孔值为0.017）（表7）。
表7
2、样本测定结果比对：随机选择12份猪血清样本同时进行测定（单位mg/mL），根据文献报道正常猪血清中IgM含量范围为0.3-1.6mg/mL。测定结果显示，本发明的试剂盒测定含量与正常范围相一致，在0.4-1.5mg/mL之间，而X品牌试剂盒测出的IgM含量则偏低，在0.005-0.015mg/mL之间，X品牌试剂盒的检测值已接近标准曲线的检测范围的下限值，准确性较差，与本发明的试剂盒测定值相差100倍左右，与参考范围差别也较大（表8）。
表8
实施例5 猪血清IgM含量测定
利用本发明的双抗夹心ELISA试剂盒进行猪血清IgM含量的测定，具体方法如下：
于实验前30 min，取出单克隆抗体4B9包被的酶标板，恢复至室温，洗板3次并甩干。选择健康猪血清4份（编号为1、2、3、4号），加入100μL不同稀释倍数的猪血清样本/标准品，样品稀释倍数为8000倍和10000倍，猪IgM标准品稀释浓度为200ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、3.125ng/mL，并设空白对照。封板后于室温静置孵育2h，洗板4次并甩干。加入100 μL酶标记抗体HRP-6A11工作液至反应孔中，封板后于室温静置孵育45 min，洗板4次并甩干。加入100μL显色底物TMB至反应孔中，封板后于室温避光显色15 min，加入50μL终止液（2M硫酸溶液），即刻（5分钟内）用酶标仪450nm波长下测量OD值。检测结果显示，本发明的试剂盒在不同稀释倍数下均能准确测定猪血清IgM的含量，且在标准曲线范围内具有良好的线性关系（表9）。
表9
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.猪IgM的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示。
2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示或与如SEQ ID NO.13所示序列具有至少80%的相似性，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.14所示或与如SEQ ID NO.14所示序列具有至少80%的相似性。
3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv或单链抗体。
4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。
5.生物材料，其特征在于，所述生物材料含有权利要求4所述的核酸分子；
所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。
6.抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物为将权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。
7.猪IgM的抗体组合物，其特征在于，所述抗体组合物包含以下（1）和（2）中的抗体：
（1）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2、3所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4、5、6所示；
（2）重链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.7、8、9所示，轻链可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11、12所示。
8.权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的抗体组合物在制备用于检测猪IgM在样品中的存在或其水平的产品中的应用。
9.权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求6所述的抗体偶联物或权利要求7所述的抗体组合物的以下任一种应用：
（1）在非疾病诊断目的的检测猪IgM在样品中的存在或其水平中的应用；
（2）在疫苗免疫原性或免疫效果检测中的应用；
（3）在含有猪IgM的产品的质量控制中的应用。
10.一种试剂盒，其特征在于，其包含权利要求1~3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物，或包含权利要求7所述的抗体组合物。
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103308684A (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 武汉中博生物股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒 |
| CN103308688A (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 武汉中博生物股份有限公司 | 猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及制备方法 |
| CN103364552A (zh) * | 2012-04-01 | 2013-10-23 | 武汉中博生物股份有限公司 | 猪细小病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用 |
| CN109563153A (zh) * | 2016-03-28 | 2019-04-02 | 加利福尼亚大学董事会 | 抗-ryk抗体及使用其的方法 |
| WO2019195136A1 (en) * | 2018-04-03 | 2019-10-10 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | C3-binding agents and methods of use thereof |
| WO2021191829A1 (en) * | 2020-03-24 | 2021-09-30 | Angstrom Bio, Inc. | Assays for detecting pathogens |
-
2023
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Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103308684A (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 武汉中博生物股份有限公司 | 一种猪伪狂犬病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒 |
| CN103308688A (zh) * | 2012-03-14 | 2013-09-18 | 武汉中博生物股份有限公司 | 猪圆环病毒2型IgM抗体ELISA检测试剂盒及制备方法 |
| CN103364552A (zh) * | 2012-04-01 | 2013-10-23 | 武汉中博生物股份有限公司 | 猪细小病毒IgM抗体ELISA检测试剂盒及其制备方法和其应用 |
| CN109563153A (zh) * | 2016-03-28 | 2019-04-02 | 加利福尼亚大学董事会 | 抗-ryk抗体及使用其的方法 |
| WO2019195136A1 (en) * | 2018-04-03 | 2019-10-10 | Ngm Biopharmaceuticals, Inc. | C3-binding agents and methods of use thereof |
| WO2021191829A1 (en) * | 2020-03-24 | 2021-09-30 | Angstrom Bio, Inc. | Assays for detecting pathogens |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "Monoclonal antibodies specific for pig serum and cell surface IgM", 《RESEARCH IN VETERINARY SCIENCE》, vol. 41, no. 3, 30 November 1986 (1986-11-30), pages 356 - 360 * |
| 陈飞等: "猪IgM单克隆抗体的研制与鉴定", 《动物科学与动物医学》, no. 7, 25 July 2005 (2005-07-25), pages 8 - 9 * |
Also Published As
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