CN103995125B - 检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法。方法步骤为：1）利用悬挂棉绳法，采集唾液，处理后获得唾液一抗；2）将唾液一抗，按编号加入抗原包被的反应板上，37℃饱和湿度反应1小时，洗涤；3）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG‑FC抗体，按顺序加入到反应板上，37℃饱和湿度避光反应30分钟，洗涤；4）将二甲氧联苯胺显色剂，按顺序加入到反应板上，避光反应15分钟，加入终止液；5）放入酶标仪中，读取OD405数据，判定结果。本发明避免了单个动物采血的问题，适用于猪群大面积的伪狂犬病毒gB蛋白抗体调查。

Description

检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法。
背景技术
伪狂犬病（Pseudorabies）是目前危害我国养猪业最重要的疾病，在世界上的大部分地区呈地方性流行。伪狂犬病由伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起，也称奥耶斯基氏病（Aujeszky's disease），发生于牛而称“疯痒病”（mad itch）。伪狂犬病病毒潜伏在受感染猪的唾液和鼻腔分泌物中并主要通过口鼻传播。感染伪狂犬病的猪通常不会表现出症状，但伪狂犬病病毒会导致流产、仔猪的高死亡率以及仔猪和成年猪的咳嗽、喷嚏、高烧、便秘、精神不振、抽搐、转圈和流涎过度。低于1月龄的仔猪死亡率接近100%，而1-6月龄的猪死亡率低于10%。怀孕母猪可能会吸收胎儿、分娩出木乃伊胎、死胎和弱小仔猪。
目前，已有成熟的gE基因缺失伪狂犬病毒疫苗，广泛用于临床免疫，是目前控制该病最主要的手段。一方面，兽医可以通过检测伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体，以检测疫苗的免疫效果；另一方面，对gE蛋白特异性抗体的监测，可以很好的监控猪群中伪狂犬病毒野毒德感染情况。
采集免疫后猪只血液样本，分离血清，并检测伪狂犬病毒gB蛋白特异性的血清抗体，是目前监控伪狂犬疫苗免疫效果效果的最主要手段，对免疫程序制定、流行状态监测均具有重要意义。然而这种采样方式存在诸多限制，一方面这种采集血液、分离血清的方法费时费力，采集的样本数量不大，占猪群的比例不高，且对动物的应激非常大。固定一头体重在50公斤左右的生长猪，并从前腔静脉采集血液，通常需要2-3个人，平均花费10分钟左右。而本专利设计的唾液样本采集方法，则以同一栏的猪为单位采集（15-20头），只需一个人，平均花费5分钟，悬挂和收集唾液采集绳，即可。相对而言，唾液采集法获得的样本可覆盖整群动物，数据基本可代表整群动物的平均免疫情况，更能反映猪群抗体的总体水平。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法。
检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法包括如下步骤：
1）利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗；
2）将唾液一抗，以PBST溶液1:2稀释后，按编号加入伪狂犬病毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加150ul，37℃饱和湿度反应1小时, 以PBST洗涤3次；
3）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以 PBST溶液1:1500稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤3次；
4）将5%的二甲氧联苯胺显色剂，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul，避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸；
5）放入酶标仪中，读取OD405数据，判定结果。
所述的步骤1）为：以6股、直径3mm、长1m的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。
所述的步骤5）为：将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD405数值，并根据以下公式判定结果：S/P值=(样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)。S/P值≥0.2，判为阳性，对应群体阳性率≥80%；S/P值＜0.2，判为阳性，对应群体阳性率＜80%。
本发明提供的伪狂犬病毒唾液抗体采集和检测方法，避免了对单个动物采血的问题，相对于传统的血清抗体采集和检测方法，具有以下优点：1）唾液抗体的棉绳采集法对猪群没有任何应激，2）节省采样时间达 80%以上，3）节省2/3的采样人员，4）唾液样品对温度、环境、污染物的抵抗力更强，运输和保存更方便，4）可以对整个猪群实行大面积采样，所得结果更客观全面，5）伪狂犬病毒gB蛋白病毒唾液抗体检测与血清抗体检测的符合率在100%。
附图说明
图1是检测猪唾液中伪狂犬病毒gB特异性抗体的方法的过程示意图；
图2是本发明的利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗的示意图。
具体实施方式
检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法包括如下步骤：
1）利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗；
2）将唾液一抗，以PBST溶液1:2稀释后，按编号加入伪狂犬病毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加150ul，37℃饱和湿度反应1小时, 以PBST洗涤3次；
3）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以 PBST溶液1:1500稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤3次；
4）将5%的二甲氧联苯胺显色剂，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul，避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸；
5）放入酶标仪中，读取OD405数据，判定结果。
所述的步骤1）为：以6股、直径3mm、长1m的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集与无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。
所述的步骤5）为：将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD405数值，并根据以下公式判定结果：S/P值=(样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)。S/P值≥0.2，判为阳性，对应群体阳性率≥80%；S/P值＜0.2，判为阳性，对应群体阳性率＜80%。
实施例
1）以定制全棉绳索（6股、直径3mm、长1m）悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外，用力拧绳索，挤出浸润在绳索上的唾液，并收集于无菌的50ml离心管中，用于初步保存和运输（常温下、6小时内，或4℃下、72小时内运至实验室）。将唾液以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，并与4℃（<7d）或-20℃（<60d）保存备用，见图２。
3）将处理备用的唾液一抗，以PBST(1:2)稀释后，按编号加入抗原包被的反应板上(购自荷兰biochek，货号S109)，100ul/孔，每个样品3个重复，同时设置PBST阴性和血清阳性抗体对照个3个孔。饱和湿度下，37℃孵育1h。随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 ul洗液（PBST），洗涤5 min×3次，拍干ELISA板，备用，见图1。
4）将辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以PBST为稀释液，作1:2000倍稀释后，按100ul/孔加入到上述一抗包被的反应孔中，37℃/饱和湿度反应30分钟， 随后弃去包被液，拍干ELISA板，每孔加入PBST 150 ul洗液（PBST），洗涤5 min×3次，拍干ELISA板，备用，见图1。
5）将二甲氧联苯胺显色剂（5%）按50ul/孔加入到上述反应孔中，室温避光反应15min，随后加入50ul/孔终止液（2M浓硫酸），终止反应，见图1。
5）将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD405数值，并根据以下公式判定结果：S/P值=(样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)。S/P值≥0.2，判为阳性，对应群体阳性率≥80%；S/P值＜0.2，判为阳性，对应群体阳性率＜80%。
本发明以相同的抗原包被板和分别优化的反应程序，对浙江省某4000头基础母猪的地规模化猪场，进行了唾液抗和血清抗体的检测对照实验。实际采样覆盖动物180头，采集唾液样本17个，采集血清样本180份。如表1所示，相对血清抗体的采集（前腔静脉采血），唾液抗体样本的采集在时间和人力需求上，具有明显优势。如表2所示，唾液抗体和血清抗体在最终结果的判断上，符合率在100%，完全可以满足临床大样本的抗体调查需要。
表 1 两种抗体田间采样所需人员和时间的对比
抗体采集方法 采样覆盖动物数 实际采样数 实际操作人员 耗时
唾液采集 180头 17个 1人 2小时
前腔静脉采血 180头 180个 3人 8小时
表 2 两种抗体检测方法的符合率比较

Claims (3)

1.一种检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法，其特征在于为如下步骤：
1）利用悬挂棉绳法，诱导动物咀嚼，采集唾液，处理后获得唾液一抗；
2）将唾液一抗，以PBST溶液1:2稀释后，按编号加入伪狂犬病毒gB抗原包被的96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加150ul，37℃饱和湿度反应1小时, 以PBST洗涤3次；
3）将辣根过氧化物酶标记的羊抗猪IgG-FC抗体，以 PBST溶液1:1500稀释后，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加100ul，37℃饱和湿度避光反应30分钟，以PBST洗涤3次；
4）将5%的二甲氧联苯胺显色剂，按顺序加入到96孔聚苯乙烯反应板的反应孔中，每个反应孔加50ul，避光反应15分钟，随后每个反应孔加入50ul 2M浓硫酸；
5）放入酶标仪中，读取OD405数据，判定结果。
2.根据权利要求1所述的一种检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法，其特征在于，所述的步骤1）为：以6股、直径3mm、长1m的全棉绳索悬挂于猪群中间或围栏上，底端高度与动物肩部齐平，并将绳索的悬挂端解松，待猪群撕咬30min后，回收绳索，并置于无菌的样品收集袋中，用双手放在样品袋外挤出浸润在绳索上的唾液，并收集于无菌的50ml离心管中，以3000g离心15min，取上清，获得唾液一抗，保存备用。
3.根据权利要求1所述的一种检测猪唾液中伪狂犬病毒gB蛋白特异性抗体的方法，其特征在于，所述的步骤5）为：将终止后的96孔聚苯乙烯反应板，放入预热的酶标仪中，读取各反应孔的OD405数值，并根据以下公式判定结果：S/P值=(样品OD-阴性对照OD)/(阳性对照OD-阴性对照OD)，S/P值≥0.2，判为阳性，对应群体阳性率≥80%；S/P值＜0.2，判为阴性，对应群体阳性率＜80%。
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