CN114088940A - 一种非洲猪瘟病毒elisa抗体检测试剂盒 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒elisa抗体检测试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，属于病毒检测技术领域，所述试剂盒包括包被有抗原的酶标板，所述抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白。本发明的试剂盒的酶标板包被有抗原，抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54三种蛋白，采取极低的抗原含量进行包被，且经特异性试验，试剂盒与其他主要猪病无交叉反应，特异性好；灵敏度较高、重复性好、保存期长，非洲猪瘟病毒p72、p30和p54三种蛋白的组合使用对不同时期抗体均能够有效检出，为临床猪群感染情况提供依据，对于预防和控制非洲猪瘟病毒感染具有重要作用。

Description

一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒
技术领域
本发明属于病毒检测技术领域。
背景技术
非洲猪瘟（Afican swine fever,ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fevervirμs,ASFV）引起的猪的一种急性、热性、高度致死性传染病。其特征为病程短、病死率可高达100％，临床症状和病理变化均类似于急性猪瘟，表现高热、皮肤充血发绀、流产、水肿及脏器出血，在诊断时极易误诊。
1921年，ASF最初出现在肯尼亚，上世纪五、六十年代在非洲、欧洲、南美洲等国家流行。近几年，ASF传播到格鲁吉亚、亚美尼亚、阿塞拜疆、俄罗斯联邦等我国周边国家，有不断蔓延趋势，使我国养猪业面临严重威胁。
非洲猪瘟病毒是ASF样病毒科的唯一成员，病毒粒子的直径为175～215纳米，呈20面体对称，有囊膜，基因组为双股线状DNA，病毒基因组全长为170～190kb，中央有125kb 左右的保守区，两端为可变区，含有末端反转重复序列，这些重复序列的增加或者缺失是造成不同分离株基因组长度差异的主要原因。该病毒主要以巨噬细胞为感染靶细胞，并以其特有基因数量众多、机制复杂的病毒蛋白参与ASFV吸附、入侵宿主细胞、病毒复制与装配、逃避宿主免疫防御系统等功能，使病毒能够更有效地感染宿主细胞，引起猪的急性、热性、出血性的临床症状和病理损害。此外，非洲猪瘟存在复杂的感染循环方式，隐性感染猪以及受猪瘟病毒污染的生猪产品及其制品是非洲猪瘟引入健康地区猪群的重要传播媒介，该病毒还可感染野猪和软蜱，可在家猪与野猪之间、野猪与软蜱之间以及家猪与软蜱之间循环传播。
由于ASFV感染机制复杂，目前尚无有效疫苗可以用于预防及治疗，短期内，依靠早期诊断与区域化防控管理来进行防制，采用严格的监测计划，一经发现采取大范围扑杀方式切断传染源。迄今为止，非洲猪瘟主要的诊断是在病毒基因检测的基础上，通过RT-PCR和部分基因组序列分析进行的，在病毒含量低的情况下不能及时给出是否感染的准确判断，另外，由于弱毒变异株的出现以及个体并非持续排毒，给核酸检测带来不小的挑战，再者，非洲猪瘟病毒的免疫原性很低，只有少数蛋白具有免疫原性，而且，不同个体蛋白的免疫敏感性不一致，单纯使用一种蛋白或两种蛋白进行检测，易造成漏检情况，因此，临床上需开发出快速准确、特异、敏感有效的检测手段。
发明内容
针对目前现有技术存在的问题，本发明目的在于提供一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒。
基于上述目的，本发明采取以下技术方案：
一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗原的酶标板，所述抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白。
所述非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白的质量比为1:1:1。
包被有抗原的酶标板的制备方法，包括以下步骤：用包被液将抗原稀释成浓度为0.1μg/ml的抗原溶液后，酶标板每孔中添加100μL抗原溶液(抗原包被量10ng)，封板，于2-8℃下，包被16-24h，洗涤酶标板，除水分，加入封闭液，封闭、干燥，得包被有抗原的酶标板。
所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、显色液、酶标记结合物、终止液、非洲猪瘟病毒阳性猪血清对照和非洲猪瘟病毒阴性猪血清对照。
所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述封闭液为含3%BSA的磷酸盐缓冲液，酶标记结合物为酶标羊抗猪二抗。
所述样品稀释液的配制：取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、纯化水600ml、Proclin-300 1ml、新生牛血清200ml，混合，补加纯化水定容至1000ml；洗涤液的配制：氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、吐温20 0.5ml、纯化水400-800ml，混合，补加纯化水定容至1000ml；显色液包括显色剂A液和显色剂B液。
所述显色剂A液的配制：取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于400-800ml纯化水，混合，补加纯化水定容至1000ml；显色剂B液的配制：取四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇10ml、400-800ml纯化水，混合，补加纯化水定容至1000ml。
所述终止液为2M的H2SO4。
P72蛋白是非洲猪瘟病毒的重要抗原蛋白和主要结构蛋白，也是组成病毒20面体衣壳的主要成分，P72蛋白占病毒颗粒总重33％左右，是非洲猪瘟病毒含量最多的蛋白，蛋白序列高度保守，具有良好的抗原性，常用于血清学诊断和疫苗开发。P30蛋白是非洲猪瘟病毒早期分泌的重要功能蛋白之一，在整个感染期间持续表达，具有良好的抗原性。P54蛋白是非洲猪瘟病毒表达的早期膜蛋白，研究发现与细胞凋亡有关，具有免疫原性，常用作诊断抗原。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的试剂盒的酶标板包被有抗原，抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54三种蛋白，采取极低的抗原含量进行包被，且经特异性试验，试剂盒与其他主要猪病无交叉反应，特异性好；灵敏度较高、重复性好、保存期长，非洲猪瘟病毒p72、p30和p54 三种蛋白的组合使用对不同时期抗体均能够有效检出，为临床猪群感染情况提供依据，对于预防和控制非洲猪瘟病毒感染具有重要作用。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明。
本发明实施例中，碳酸盐缓冲液的pH值为9.6，其1L碳酸盐缓冲液的配制方法：Na2CO3 1.59g、NaHCO3 2.93g，蒸馏水加至1L；磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，1L磷酸盐缓冲液的配制方法：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、Na2HPO4.12H2O 2.9g、KH2PO4 0.24g，蒸馏水加至1L。
本发明中所用的化学试剂均为分析纯，购自国药集团。本发明所述的实验方法，若无特殊说明，均为常规方法；所述的生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒检测方法的判定标准为：
S/P值=OD样品/OD阳性血清均值
其中，OD表示OD450-630，即OD450-OD630的值，当OD参考阳性血清≥0.3，OD阴性血清≤0.1时，结果成立；当血清样本的S/P值≥0.5时为阳性，当S/P值＜0.5时为阴性。
实施例1 原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白的制备
1.1非洲猪瘟病毒p72蛋白的制备
1. 1.1重组大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pet28a-p72的构建
将p72蛋白基因序列送由华大基因科技有限公司进行全序列合成，并连接到pet28a质粒上，连接后的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为工程菌E.coli BL21/pet28a-p72。
蛋白的表达
将E.coli BL21/pet28a-p72菌种0.5ml，接种至50ml含卡那霉素的LB液体培养基内，37℃ 220转/分钟震荡4-5小时，OD600至0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG溶液，诱导培养5h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体湿中加入20ml裂解液（20mmol/LTris缓冲液，0.15mol/L NaCl，20mmol/L咪唑 pH8.0）的比例重悬菌体，在冰浴中超声破碎20min，破碎液于4℃，10000r/min离心20min后收集上清，过滤后用Ni-NTA亲和层析柱纯化。
非洲猪瘟病毒p30蛋白的制备
1. 2.1重组大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pet30a-p30的构建
将p30蛋白基因序列送由华大基因科技有限公司进行全序列合成，并连接到pet30a质粒上，连接后的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为工程菌E.coli BL21/pet28a-p30。
蛋白的表达
将E.coli BL21/pet28a-p30菌种0.5ml，接种至50ml含卡那霉素的LB液体培养基内，37℃ 220转/分钟震荡4-5小时，OD600至0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG溶液，诱导培养5h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体湿中加入20ml裂解液（20mmol/LTris缓冲液，0.15mol/L NaCl，20mmol/L咪唑 pH8.0）的比例重悬菌体，在冰浴中超声破碎20min，破碎液于4℃，10000r/min离心20min后收集上清，过滤后用Ni-NTA亲和层析柱纯化。
非洲猪瘟病毒p54蛋白的制备
1.3．1重组大肠杆菌工程菌E.coli BL21/pet28a-p54的构建
将p54蛋白基因序列送由华大基因科技有限公司进行全序列合成，并连接到pet28a质粒上。连接后的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3），挑取单克隆在含有100μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养过夜，提取质粒后测序分析，阳性克隆即为工程菌E.coli BL21/pet28a-p54。
．2 P54蛋白的表达
将E.coli BL21/pet28a-p54菌种0.5ml，接种至50ml含卡那霉素的LB液体培养基内，37℃ 220转/分钟震荡4-5小时，OD600至0.6-0.8，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG溶液，诱导培养5h。菌液培养完成后离心收集菌体，按每克菌体湿中加入20ml裂解液（20mmol/LTris缓冲液，0.15mol/L NaCl，20mmol/L咪唑 pH8.0）的比例重悬菌体，在冰浴中超声破碎20min，破碎液于4℃，10000r/min离心20min后收集上清，过滤后用Ni-NTA亲和层析柱纯化。
实施例2
一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括包被有抗原的酶标板、封闭液、样品稀释液、洗涤液、显色液、酶标记结合物、终止液、非洲猪瘟病毒阳性猪血清对照和非洲猪瘟病毒阴性猪血清对照，所述抗原为实施例1制得的原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白。
包被有抗原的酶标板的制备方法，包括以下步骤：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将实施例1制得的原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白按照质量比1:1:1稀释成浓度为0.1μg/mL的抗原溶液后，酶标板每孔中添加100μL稀释后抗原溶液(抗原包被量10ng)，用封板膜封板，于2-8℃下，包被16-24h，弃酶标板的孔中液体，用洗涤液洗涤酶标板1次，300μL/孔，在吸水纸上拍干以除水分，然后酶标板的每孔加入150μL含3%BSA的磷酸盐缓冲液，37℃封闭2h，置18-26℃，相对湿度30%以下干燥3-6小时，得包被有抗原的酶标板。
所述样品稀释液的配制：取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、纯化水600ml、Proclin-300 1ml、新生牛血清200ml，混合，补加纯化水定容至1000ml；洗涤液的配制：氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、吐温20 0.5ml、纯化水400-800ml，混匀，补加纯化水定容至1000ml。
显色液包括显色剂A液和显色剂B液。显色剂A液的配制：取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于800ml纯化水，混匀，补加纯化水定容至1000ml；显色剂B液的配制：取四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇10ml、800ml纯化水，混匀，补加纯化水定容至1000ml。
所述终止液为2M的H2SO4。
酶标记结合物为酶标羊抗猪二抗。
非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：
1）样品稀释：将猪血清或血浆用样品稀释液100倍（v/v）稀释，用移液器混匀，100μl/孔加样；
2）样品孵育：用封板膜封板后，置37℃孵育30min；
3）洗板：揭掉封板膜，用洗涤液洗酶标板（可采取机洗或人工洗，机洗：用洗板机洗涤5遍，最后一次吸水纸上拍干；手洗：弃去孔中液体，每孔加入洗涤液300μl，浸泡30s，弃洗涤液，反复洗板5次，然后吸水纸上拍干）；
4）酶标孵育：酶标板上每孔加入酶标羊抗猪二抗100μl，空白对照孔除外。用封板膜封板后，置37℃孵育30min；
5）洗板：同步骤3）；
6）显示：显色剂A液和显色剂B液按体积比1:1混匀，100μl/孔，37℃避光孵育15min；
7）每孔加入50μl终止液反应；
8）读数：用酶标仪读取OD450-630，根据判定标准进行判定。
实施例3 试剂盒的特异性、灵敏度等测试实验
3.1 特异性试验
将实施例2制备的非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒对猪瘟病毒抗体阳性血清、猪圆环病毒2型抗体阳性血清、猪繁殖与呼吸综合症病毒抗体阳性血清、猪伪狂犬病毒抗体阳性血清、猪细小病毒抗体阳性血清、非洲猪瘟病毒抗体阳性血清样品进行ELISA检测，每个样品做3个重复，并同时设置阳性对照（非洲猪瘟病毒阳性猪血清对照）和阴性对照（非洲猪瘟病毒阴性猪血清对照）。
检测结果表明，除了非洲猪瘟病毒临床抗体阳性血清和阳性对照OD均值分别为1.106和1.087外，其余样本试剂盒检测的OD值均小于0.1，说明本发明的试剂盒与其他主要猪病无交叉反应，特异性好。
灵敏度试验。
将非洲猪瘟病毒抗体阳性血清样品做1:10、1:50、1:100、1:200、1:400、1:800倍 （v/v）稀释。用试剂盒进行ELISA检测。
血清稀释倍数 1:10 1:50 1:100 1:200 1:400 1：800
OD值 1.937 1.736 1.256 0.698 0.234 0.084
当非洲猪瘟病毒抗体阳性血清样品稀释到1:200倍时，各试剂盒通过ELISA检测显色后用肉眼即可判断结果，在酶标仪上读数时检出结果均为阳性，而在1:400血清稀释度检测结果为阴性。表明试剂盒的灵敏度较高。
批内重复性试验
选取10份抗体阳性样品，用实施例2中的试剂盒按照实施例2建立的方法检测，每个样品做10次重复。用统计学分析OD值发现批內重复变异系数在6.7-8.4%之间，均小于10%，说明该方法重复性好。
批间重复性试验
用3个批次的试剂盒对10个抗体阳性样品进行测定，经统计学进行分析，3批次的试剂盒的实验结果差异不显著，变异系数在5.4-8.9%之间，均小于10%，说明该检测方法重复性好。
保存期试验
将包被有抗原的酶标板一式四份封好后，置于2-8℃下，分别保存3、6、9和12个月，即试剂盒的实时稳定性试验。对不同时间保存的酶标板用10份背景相同的已知样品进行检测。
经统计学分析，结果表明：各酶标板对每一样品进行检测时，3个月、6个月、9个月和12个月的结果均无明显差异，由此说明，本发明的试剂盒在2-8℃条件下，至少可保存12个月。
上述实施例只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此类技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括包被有抗原的酶标板，所述抗原为原核表达的非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白。
2.如权利要求1所述的非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述非洲猪瘟病毒p72、p30和p54蛋白的质量比为1:1:1。
3.如权利要求2所述的非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，包被有抗原的酶标板的制备方法，包括以下步骤：用包被液将抗原稀释，酶标板每孔中抗原包被量10ng，封板，于2-8℃下，包被16-24h，洗涤酶标板，除水分，加入封闭液，封闭、干燥，得包被有抗原的酶标板。
4.如权利要求3所述的非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括样品稀释液、洗涤液、显色液、酶标记结合物、终止液、非洲猪瘟病毒阳性猪血清对照和非洲猪瘟病毒阴性猪血清对照。
5.如权利要求4所述的非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，所述封闭液为含3%BSA的磷酸盐缓冲液，酶标记结合物为酶标羊抗猪二抗。
6.如权利要求5所述的非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述样品稀释液的配制：取氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、纯化水600ml、Proclin-300 1ml、新生牛血清200ml，混合，补加纯化水定容至1000ml；洗涤液的配制：氯化钠8g、磷酸氢二钠2.9g、磷酸二氢钾0.24g、氯化钾0.2g、吐温20 0.5ml、纯化水400-800ml，混合，补加纯化水定容至1000ml；显色液包括显色剂A液和显色剂B液。
7.如权利要求6所述的非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述显色剂A液的配制：取磷酸氢二钠14.7g、柠檬酸9.3g、过氧化脲0.3g，溶于400-800ml纯化水，混合，补加纯化水定容至1000ml；显色剂B液的配制：取四甲基联苯二胺0.2g、无水乙醇10ml、400-800ml纯化水，混合，补加纯化水定容至1000ml。
8.如权利要求7所述的非洲猪瘟病毒ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述终止液为2M的H2SO4。
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