JP2018078903A - Khvにより引き起こされる疾患の防止のための組換えコイヘルペスウイルス(khv)およびワクチン - Google Patents
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Abstract
【課題】組換えコイヘルペスウイルス(KHV)、KHVの作製方法、KHVを含む細胞、並びにベクターとしてのKHV及びCyprinus carpio carpio又はCyprinus capio koi等のコイにおいてコイヘルペスウイルスにより引き起こされる魚における疾患の予防処置及び/又は治療処置のためのワクチンにおけるKHVの提供。
【解決手段】オープンリーディングフレーム57(ORF57)を欠損させた、弱毒化組換えKHV。病原性に寄与するか、複製にとって必須でない、少なくとも一つの追加遺伝が欠損していることが好ましいKHV。
【選択図】なし
【解決手段】オープンリーディングフレーム57(ORF57)を欠損させた、弱毒化組換えKHV。病原性に寄与するか、複製にとって必須でない、少なくとも一つの追加遺伝が欠損していることが好ましいKHV。
【選択図】なし
Description
本発明は、組換えコイヘルペスウイルス(KHV)、該KHVの作製方法、該KHVを
含む細胞、ならびにベクターとしての該KHVの使用およびシプリヌス・カルピオ・カル
ピオ(Cyprinus carpio carpio)またはシプリヌス・カルピオ・
コイ(Cyprinus capio koi)等のコイにおいてコイヘルペスウイルス
により引き起こされる魚における疾患の予防処置および/または治療処置のためのワクチ
ンにおける該KHVの使用に関する。
含む細胞、ならびにベクターとしての該KHVの使用およびシプリヌス・カルピオ・カル
ピオ(Cyprinus carpio carpio)またはシプリヌス・カルピオ・
コイ(Cyprinus capio koi)等のコイにおいてコイヘルペスウイルス
により引き起こされる魚における疾患の予防処置および/または治療処置のためのワクチ
ンにおける該KHVの使用に関する。
マゴイ(Cyprinus carpio carpio)は、主にアジア、ヨーロッ
パおよび中東において食用として最も広範囲に養殖されている魚である。対照的にニシキ
ゴイ(Cyprinus carpio koi)亜種は、個人の娯楽または品評会用の
観賞魚として、特に日本においてまた世界中で養殖されている。マゴイおよびニシキゴイ
の双方に致死的疾患(当初コイヘルペスウイルス病(KHVD)と称された)を引き起こ
すウイルスは、1996年に英国において発見された。その後、該ウイルスは、イスラエ
ル、米国およびドイツにおけるニシキゴイおよびマゴイの大量死の原因として速やかに同
定された。マゴイの集約養殖、ニシキゴイの品評会および国際貿易が、この高感染性かつ
高病原性の疾患が急速に世界的に拡散するのに寄与した。その出現以来KHVDは、ニシ
キゴイおよびマゴイの双方の養殖業において世界的に重大な財務損失および経済損失を引
き起こしてきた。
パおよび中東において食用として最も広範囲に養殖されている魚である。対照的にニシキ
ゴイ(Cyprinus carpio koi)亜種は、個人の娯楽または品評会用の
観賞魚として、特に日本においてまた世界中で養殖されている。マゴイおよびニシキゴイ
の双方に致死的疾患(当初コイヘルペスウイルス病(KHVD)と称された)を引き起こ
すウイルスは、1996年に英国において発見された。その後、該ウイルスは、イスラエ
ル、米国およびドイツにおけるニシキゴイおよびマゴイの大量死の原因として速やかに同
定された。マゴイの集約養殖、ニシキゴイの品評会および国際貿易が、この高感染性かつ
高病原性の疾患が急速に世界的に拡散するのに寄与した。その出現以来KHVDは、ニシ
キゴイおよびマゴイの双方の養殖業において世界的に重大な財務損失および経済損失を引
き起こしてきた。
該ウイルスの初期特性評価は、エンベロープおよびテグメント様構造に囲まれた、10
0〜110nmの20面体の電子密度の高いコアを有するヘルペス様構造を明らかにした
。該ウイルスのゲノムは、約295kbの直鎖状2本鎖DNA(dsDNA)を含み、コ
イ科ヘルペスウイルス1(CyHV‐1)のDNAと同様であるが、一般に125ないし
240kbの範囲の大きさである、ヘルペスウイルス科のウイルスのDNAよりは大きい
。KHVゲノムの配列は、ごく最近発表された(Aokiら、J Virol、81、ペ
ージ5058‐5065(2007))。KHVゲノムは、どんな他の既知のウイルス塩
基配列とも相同性のない相当数のDNA塩基配列を含有する。さらにそれは、ヘルペスウ
イルス、ポックスウイルス、イリドウイルスおよび他の巨大DNAウイルスといった数種
のdsDNAウイルスのポリペプチドと似たポリペプチドをコードする、非常に多様なD
NA塩基配列を含有する。
0〜110nmの20面体の電子密度の高いコアを有するヘルペス様構造を明らかにした
。該ウイルスのゲノムは、約295kbの直鎖状2本鎖DNA(dsDNA)を含み、コ
イ科ヘルペスウイルス1(CyHV‐1)のDNAと同様であるが、一般に125ないし
240kbの範囲の大きさである、ヘルペスウイルス科のウイルスのDNAよりは大きい
。KHVゲノムの配列は、ごく最近発表された(Aokiら、J Virol、81、ペ
ージ5058‐5065(2007))。KHVゲノムは、どんな他の既知のウイルス塩
基配列とも相同性のない相当数のDNA塩基配列を含有する。さらにそれは、ヘルペスウ
イルス、ポックスウイルス、イリドウイルスおよび他の巨大DNAウイルスといった数種
のdsDNAウイルスのポリペプチドと似たポリペプチドをコードする、非常に多様なD
NA塩基配列を含有する。
このウイルス独自の特性が、異なる三つの学名、すなわち第一に、その形態的発現より
コイヘルペスウイルス(KHV)、第二に魚におけるその病原作用よりコイ間質性腎炎・
鰓壊死症ウイルス(CNGV)、そして最後にCyHV‐1およびCyHV‐2との遺伝
子内容の類似性よりコイ科ヘルペスウイルス3(Cyprinid herpesvir
us 3(CyHV‐3))をもたらした。最近のウイルスゲノムの完全長塩基配列決定
によって、最後の学名がより支持されている。しかし、以下ではKHVの名称を使用する
。
コイヘルペスウイルス(KHV)、第二に魚におけるその病原作用よりコイ間質性腎炎・
鰓壊死症ウイルス(CNGV)、そして最後にCyHV‐1およびCyHV‐2との遺伝
子内容の類似性よりコイ科ヘルペスウイルス3(Cyprinid herpesvir
us 3(CyHV‐3))をもたらした。最近のウイルスゲノムの完全長塩基配列決定
によって、最後の学名がより支持されている。しかし、以下ではKHVの名称を使用する
。
KHVは、ヘルペスウイルス科(Herpesvirales)の構成メンバーの中で
これまで同定された最大のゲノムに相当する約295kbのゲノムを含有する。KHVの
最初の単離が1996年に遡るにもかかわらず、KHVの病原性における個々の遺伝子の
役割、および自然宿主の感染の生物学における役割について利用できる情報はほとんど存
在しない。
これまで同定された最大のゲノムに相当する約295kbのゲノムを含有する。KHVの
最初の単離が1996年に遡るにもかかわらず、KHVの病原性における個々の遺伝子の
役割、および自然宿主の感染の生物学における役割について利用できる情報はほとんど存
在しない。
弱毒化KHVおよびそのワクチン候補としての使用の可能性については、国際特許出願
WO 2004/061093 A1に記載されている。しかし、このワクチン候補には
一つの潜在的危険性が隠されている。この弱毒化は、インビトロでのウイルス複製の間に
生じたランダム変異の結果である。従って弱毒化の特性は解明されておらず、完全な病原
性表現型への復帰変異を排除し得ない。
WO 2004/061093 A1に記載されている。しかし、このワクチン候補には
一つの潜在的危険性が隠されている。この弱毒化は、インビトロでのウイルス複製の間に
生じたランダム変異の結果である。従って弱毒化の特性は解明されておらず、完全な病原
性表現型への復帰変異を排除し得ない。
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Costes、B.、Fournier、G.、Michel、B.、Delforge、C.、Raj、V.S.、Dewals、B.、Gillet、L.、Drion、P.、Body、A.、Schynts、F.、Lieffrig、F.、Vanderplasschen、A.、2008.Cloning of the Koi herpesvirus genome as an infectious bacterial artificial chromosome demonstrates that disruption of the thymidine kinase locus induces partial attenuation in Cyprinus carpio koi(感染性細菌人工染色体としてのコイヘルペスウイルスゲノムのクローニングはチミジンキナーゼ遺伝子座の破壊がニシキゴイ(Cyprinus carpio koi)における部分的な弱毒化を誘発することを示す).J Virol 82、4955‐4964.
Dewals、B.、Boudry、C.、Gillet、L.、Markine‐Goriaynoff、N.、de Leval、L.、Haig、D.M.& Vanderplasschen、A.(2006).Cloning of the genome of Alcelaphine herpesvirus 1 as an infectious and pathogenic bacteiral artificial chromosome(感染性および病原性の細菌人工染色体としてのアルセラパインヘルペスウイルス1(悪性カタル熱ウイルス)のゲノムのクローニング).J Gen Virol 87、509‐17.
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KHVに関する応用および基礎研究には、組換えウイルスの作製が必要である。最近、
細菌人工染色体(BAC)ベクターの使用により、巨大なヘルペスウイルスゲノムの操作
が実行可能となった(Messerleら、Proc Natl Acad Sci U
SA、94、14759‐14763(1997);Wagnerら、Trends M
irobiol、10、318‐324(2002)および下記を参照されたい)。これ
らのベクターは、大腸菌(Escherichia coli(E.coli))におけ
るウイルスゲノムの維持および効率的な変異誘発、その後に続く許容真核細胞へのBAC
プラスミドの遺伝子導入による子孫ビリオンの再構成を可能とする。BACとしてクロー
ニングされた二番目に大きなヘルペスウイルスゲノムに相当するヒトサイトメガロウイル
ス(HCMV)(230kb)を含め、これまでに、数種のヘルペスウイルスのゲノムを
、感染性のBACクローンとして増殖することに成功している(Borstら、J Vi
rol、73、8320‐8329(1999))。
細菌人工染色体(BAC)ベクターの使用により、巨大なヘルペスウイルスゲノムの操作
が実行可能となった(Messerleら、Proc Natl Acad Sci U
SA、94、14759‐14763(1997);Wagnerら、Trends M
irobiol、10、318‐324(2002)および下記を参照されたい)。これ
らのベクターは、大腸菌(Escherichia coli(E.coli))におけ
るウイルスゲノムの維持および効率的な変異誘発、その後に続く許容真核細胞へのBAC
プラスミドの遺伝子導入による子孫ビリオンの再構成を可能とする。BACとしてクロー
ニングされた二番目に大きなヘルペスウイルスゲノムに相当するヒトサイトメガロウイル
ス(HCMV)(230kb)を含め、これまでに、数種のヘルペスウイルスのゲノムを
、感染性のBACクローンとして増殖することに成功している(Borstら、J Vi
rol、73、8320‐8329(1999))。
最近、BAC技術を使用して初めて数種の組換えKHVが構築された;これらの組換え
体はPCTの特許出願WO2009/027412にすべて記載されている。この特許出
願は、ORF55:チミジンキナーゼ遺伝子;ORF12:推定腫瘍壊死因子(TNF)
受容体遺伝子;ORF16:推定Gタンパク質共役受容体(GPCR)遺伝子;ORF1
34:推定インターロイキン10ホモログ遺伝子;ORF140:推定チミジル酸キナー
ゼ遺伝子またはそれらの組み合せから成る群より選択される、一または複数の遺伝子にお
いて一つの欠損を有する組換えKHVを作製する方法を開示している。このような変異株
は、生弱毒化ワクチンウイルスとして使用された。
体はPCTの特許出願WO2009/027412にすべて記載されている。この特許出
願は、ORF55:チミジンキナーゼ遺伝子;ORF12:推定腫瘍壊死因子(TNF)
受容体遺伝子;ORF16:推定Gタンパク質共役受容体(GPCR)遺伝子;ORF1
34:推定インターロイキン10ホモログ遺伝子;ORF140:推定チミジル酸キナー
ゼ遺伝子またはそれらの組み合せから成る群より選択される、一または複数の遺伝子にお
いて一つの欠損を有する組換えKHVを作製する方法を開示している。このような変異株
は、生弱毒化ワクチンウイルスとして使用された。
これらの変異株のいくつかは、一定サイズおよび年齢の特定病原体除去魚(speci
fic SPF fish)において使用されたときに、安全であることが示された。し
かし現地の養殖業者は、早期の、換言すれば魚が比較的に若く/小さくてしかも魚のサイ
ズにかなり大きな幅が存在するときのワクチン接種に関心がある。このような条件におい
て、国際特許出願WO2009/027412に開示されたような欠失変異ウイルス株に
基づくワクチンは、いくつかの状況において十分には安全ではないかもしれないことが、
つまりこのような組換えKHVが若い/小さい魚での使用にとってあまりにも病原性が高
いことが分かった。
fic SPF fish)において使用されたときに、安全であることが示された。し
かし現地の養殖業者は、早期の、換言すれば魚が比較的に若く/小さくてしかも魚のサイ
ズにかなり大きな幅が存在するときのワクチン接種に関心がある。このような条件におい
て、国際特許出願WO2009/027412に開示されたような欠失変異ウイルス株に
基づくワクチンは、いくつかの状況において十分には安全ではないかもしれないことが、
つまりこのような組換えKHVが若い/小さい魚での使用にとってあまりにも病原性が高
いことが分かった。
このことは現在、養魚業等の現地における疾患の制御のための安全かつ有効な弱毒化組
換えワクチンが、未だに欠けていることを意味する。
換えワクチンが、未だに欠けていることを意味する。
現場においてKHV感染を制御するための安全かつ有効な弱毒化ワクチンの開発のため
に使用し得る、新規組換えKHVウイルスを提供することが、本発明の目的である。
に使用し得る、新規組換えKHVウイルスを提供することが、本発明の目的である。
驚くべきことに、オープンリーディングフレーム57(ORF57)が欠損した組換え
KHVは、このヘルペスウイルス組換え体により感染した非常に若く/小さいコイにおい
てさえ、非常に減少した死亡率を示すかまたは全く死亡率を示さず、しかも野生株コイヘ
ルペスウイルスに対する免疫を与えることが見出された。このような組換えKHVは、従
って若くおよび/または小さいコイにおいて適切に使用し得る安全でかつ有効な弱毒化ワ
クチンウイルスを提供する。
KHVは、このヘルペスウイルス組換え体により感染した非常に若く/小さいコイにおい
てさえ、非常に減少した死亡率を示すかまたは全く死亡率を示さず、しかも野生株コイヘ
ルペスウイルスに対する免疫を与えることが見出された。このような組換えKHVは、従
って若くおよび/または小さいコイにおいて適切に使用し得る安全でかつ有効な弱毒化ワ
クチンウイルスを提供する。
この発見は、ORF57がいままではそれが無ければ生きたウイルスが存在できない必
須遺伝子であると考えられた事実を考慮すると、なお一層驚くべきことである。
須遺伝子であると考えられた事実を考慮すると、なお一層驚くべきことである。
従って本発明の第一の実施形態は、ORF57が欠損している組換えコイヘルペスウイ
ルスであって、好ましくはマゴイ(Cyprinus carpio carpio)ま
たはニシキゴイ(Cyprinus carpio koi)といったコイに感染させた
際に、40%以下の致死率を誘導する弱毒化KHVをもたらす、組換えコイヘルペスウイ
ルスに関する。
ルスであって、好ましくはマゴイ(Cyprinus carpio carpio)ま
たはニシキゴイ(Cyprinus carpio koi)といったコイに感染させた
際に、40%以下の致死率を誘導する弱毒化KHVをもたらす、組換えコイヘルペスウイ
ルスに関する。
本明細書で用いる場合、「欠損した(deficient)」ORF57とは、もはや
機能的でない、すなわちもはや機能的なタンパク質をコードすることのできないORF5
7である。本明細書で用いる欠損したORF57(deficient ORF57)は
、コイにおいて40%以下の致死率を誘発するレベルまで弱毒化されたKHVをもたらす
。このような欠損(deficiency)は、例えばORF57をコードする遺伝子内
またはそのプロモーター領域内における一または複数のヌクレオチドの挿入または欠失(
deletion)によって獲得し得る。この様な変異は、例えば遺伝子の5’部位での
フレームシフト変異、またはプロモーター領域(の一部)または遺伝子自身(の一部)の
欠失であり得る。
機能的でない、すなわちもはや機能的なタンパク質をコードすることのできないORF5
7である。本明細書で用いる欠損したORF57(deficient ORF57)は
、コイにおいて40%以下の致死率を誘発するレベルまで弱毒化されたKHVをもたらす
。このような欠損(deficiency)は、例えばORF57をコードする遺伝子内
またはそのプロモーター領域内における一または複数のヌクレオチドの挿入または欠失(
deletion)によって獲得し得る。この様な変異は、例えば遺伝子の5’部位での
フレームシフト変異、またはプロモーター領域(の一部)または遺伝子自身(の一部)の
欠失であり得る。
ORF57のDNA塩基配列の一例は、ORF開始および終止コドンが99382位お
よび100803位に位置するGenbank受入番号NC_009127で与えられる
、ORF57のDNA塩基配列である。ORF57の位置が、他のKHV株において自然
変異のために異なり得ることは言うまでもない。また自然変異のために、他のKHV株と
比較したときにあるKHV株におけるORF57の配列にわずかな差異があり得る。従っ
て本明細書記載のORF57は、Genbank受入番号NC_009127で与えられ
るORF57のDNA塩基配列と80%以上の配列相同性を有するオープンリーディング
フレームである。
よび100803位に位置するGenbank受入番号NC_009127で与えられる
、ORF57のDNA塩基配列である。ORF57の位置が、他のKHV株において自然
変異のために異なり得ることは言うまでもない。また自然変異のために、他のKHV株と
比較したときにあるKHV株におけるORF57の配列にわずかな差異があり得る。従っ
て本明細書記載のORF57は、Genbank受入番号NC_009127で与えられ
るORF57のDNA塩基配列と80%以上の配列相同性を有するオープンリーディング
フレームである。
ヌクレオチド96630‐101558にわたるORF56、57および58を含む領
域のヌクレオチド配列を、配列番号12に示す。図1も参照されたい。
域のヌクレオチド配列を、配列番号12に示す。図1も参照されたい。
遺伝子を欠損させる最も広範な方法、すなわちORF57全体を欠失させることにより
、ORF57タンパク質の産生が完全に失われることは明らかである。
、ORF57タンパク質の産生が完全に失われることは明らかである。
実用上の見地からおよび安全性の観点からこのような全欠失は、取るべき論理的な手段
であるだろう。しかしながら図1の通り、隣接したORF58の発現に関与するかもしれ
ない推定プロモーター領域が、100210位‐100261位に位置している。この理
由により、ORF57における変異は、好ましくはこの領域に及ぶべきではない。従って
ORF57における変異は、100212位の左側または100261位の右側に導入す
ることが好ましい。
であるだろう。しかしながら図1の通り、隣接したORF58の発現に関与するかもしれ
ない推定プロモーター領域が、100210位‐100261位に位置している。この理
由により、ORF57における変異は、好ましくはこの領域に及ぶべきではない。従って
ORF57における変異は、100212位の左側または100261位の右側に導入す
ることが好ましい。
また図1より、隣接したORF56の発現に関与するかもしれない二つの推定プロモー
ター領域が、それぞれ99451位‐99500位および99794位‐99843位に
位置していることも見て取れる。従って、ORF57内の領域の欠失が、ORF56の発
現を妨げることも理論的に可能である。その場合、本発明によりORF57が欠損してい
る組換えKHVが、単にORF56の発現低下の結果として弱毒化された性質を示すとい
うことがあり得る。しかしながら実施例のセクションにおいて、1)ORF56は必須遺
伝子ではないこと、および2)ORF56の欠損は本発明の組換えKHVの弱毒化の性質
に寄与しないことが示されている。これらの実施例において、組換えKHVの生存能力に
影響することなく、しかも組換えKHVの弱毒化特性を顕著に変えることなく、ORF5
6内において広範囲の欠失が成され得ることが示されている。これは、とりわけORF5
7に位置する推定ORF56プロモーター部位を問題なく除去し得ることを暗示している
。
ター領域が、それぞれ99451位‐99500位および99794位‐99843位に
位置していることも見て取れる。従って、ORF57内の領域の欠失が、ORF56の発
現を妨げることも理論的に可能である。その場合、本発明によりORF57が欠損してい
る組換えKHVが、単にORF56の発現低下の結果として弱毒化された性質を示すとい
うことがあり得る。しかしながら実施例のセクションにおいて、1)ORF56は必須遺
伝子ではないこと、および2)ORF56の欠損は本発明の組換えKHVの弱毒化の性質
に寄与しないことが示されている。これらの実施例において、組換えKHVの生存能力に
影響することなく、しかも組換えKHVの弱毒化特性を顕著に変えることなく、ORF5
6内において広範囲の欠失が成され得ることが示されている。これは、とりわけORF5
7に位置する推定ORF56プロモーター部位を問題なく除去し得ることを暗示している
。
また図1から判断すると、ORF57の二つの推定プロモーターは、ORF56内の9
7075位‐97124位および98712位‐98761位に位置している。従ってO
RF57の小部分の欠失、例えばORF57 Del1等が不完全ながら、なお機能的な
ORF57にコードされたタンパク質を提供することを排除し得なかった。この可能性を
排除するために実施例のセクションにおいて記載する通り、97001位‐99750位
の領域にわたる広範囲のORF56‐ORF57二重欠失を行った。図7と比較した時に
図5に示される通りこの欠失は、本質的に単一のORF57変異株と同等の性質を示す。
従ってORF57にコードされたタンパク質は、ウイルスにとって必須でないと結論づけ
られる。
7075位‐97124位および98712位‐98761位に位置している。従ってO
RF57の小部分の欠失、例えばORF57 Del1等が不完全ながら、なお機能的な
ORF57にコードされたタンパク質を提供することを排除し得なかった。この可能性を
排除するために実施例のセクションにおいて記載する通り、97001位‐99750位
の領域にわたる広範囲のORF56‐ORF57二重欠失を行った。図7と比較した時に
図5に示される通りこの欠失は、本質的に単一のORF57変異株と同等の性質を示す。
従ってORF57にコードされたタンパク質は、ウイルスにとって必須でないと結論づけ
られる。
ORF57の小部分の欠失は可能性があり、上述の理由により好ましい可能性さえあり
得るが、しかし生じた不完全なタンパク質が非機能的であることに留意しなければならな
い。当業者がいかなる理由であれ全ORF57未満を欠失することにするならば、ORF
57が欠損されたかどうかを容易に検査することができるだろう。なぜならば、欠損のな
いORF57は、過度に高レベルの病原性、すなわち過度に低レベルの弱毒化を有するウ
イルスをもたらすからである。
得るが、しかし生じた不完全なタンパク質が非機能的であることに留意しなければならな
い。当業者がいかなる理由であれ全ORF57未満を欠失することにするならば、ORF
57が欠損されたかどうかを容易に検査することができるだろう。なぜならば、欠損のな
いORF57は、過度に高レベルの病原性、すなわち過度に低レベルの弱毒化を有するウ
イルスをもたらすからである。
好ましくは、組換えKHVは、ウイルスの病原性に寄与するが複製に必須でない一また
は複数のウイルス遺伝子においてさらに欠損している。
は複数のウイルス遺伝子においてさらに欠損している。
従ってこの実施形態の好ましい形態は、ウイルスの病原性に寄与するがしかし複製にと
って必須でない少なくとも一つの追加の遺伝子において欠損している、本発明の組換えコ
イヘルペスウイルスに関する。
って必須でない少なくとも一つの追加の遺伝子において欠損している、本発明の組換えコ
イヘルペスウイルスに関する。
この実施形態のより好ましい形態は、病原性に寄与する少なくとも一つの追加の遺伝子
において欠損している本発明の組換えコイヘルペスウイルスに関し、ここで前記遺伝子は
、チミジンキナーゼ遺伝子;ORF12:推定腫瘍壊死因子(TNF)受容体遺伝子;O
RF16:推定Gタンパク質共役受容体(GPCR)遺伝子;ORF134:推定インタ
ーロイキン10ホモログ遺伝子;ORF140:推定チミジル酸キナーゼ遺伝子またはそ
れらの任意の組み合せから成る群より選択される。
において欠損している本発明の組換えコイヘルペスウイルスに関し、ここで前記遺伝子は
、チミジンキナーゼ遺伝子;ORF12:推定腫瘍壊死因子(TNF)受容体遺伝子;O
RF16:推定Gタンパク質共役受容体(GPCR)遺伝子;ORF134:推定インタ
ーロイキン10ホモログ遺伝子;ORF140:推定チミジル酸キナーゼ遺伝子またはそ
れらの任意の組み合せから成る群より選択される。
この実施形態のさらにより好ましい形態において、組換えKHVは、少なくともチミジ
ンキナーゼ遺伝子または推定チミジル酸キナーゼ遺伝子においてさらに欠損している。
ンキナーゼ遺伝子または推定チミジル酸キナーゼ遺伝子においてさらに欠損している。
この実施形態の他のさらにより好ましい形態において、本発明の組換えKHVは、チミ
ジンキナーゼ遺伝子が欠損しているとともに、ORF12:推定腫瘍壊死因子(TNF)
受容体遺伝子;ORF16:推定Gタンパク質共役受容体(GPCR)遺伝子;ORF1
34:推定インターロイキン10ホモログ遺伝子またはORF140:推定チミジル酸キ
ナーゼ遺伝子から成る群より選択される、病原性に寄与する少なくとも一つのさらなる遺
伝子においてさらに欠損している。
ジンキナーゼ遺伝子が欠損しているとともに、ORF12:推定腫瘍壊死因子(TNF)
受容体遺伝子;ORF16:推定Gタンパク質共役受容体(GPCR)遺伝子;ORF1
34:推定インターロイキン10ホモログ遺伝子またはORF140:推定チミジル酸キ
ナーゼ遺伝子から成る群より選択される、病原性に寄与する少なくとも一つのさらなる遺
伝子においてさらに欠損している。
この実施形態の一層さらにより好ましい形態において、組換えKHVは、少なくともチ
ミジンキナーゼ遺伝子および推定チミジル酸キナーゼ遺伝子においてさらに欠損している
。
ミジンキナーゼ遺伝子および推定チミジル酸キナーゼ遺伝子においてさらに欠損している
。
この実施形態の他の好ましい形態において、本発明の組換えコイヘルペスウイルスは生
きた形態である。好ましくは、組換えコイヘルペスウイルスは、感染性粒子を再構成する
能力を有する。すなわち、許容真核細胞または魚個体、好ましくはコイ、より好ましくは
コイ(Cyprinus carpio)、さらにより好ましくはマゴイ(Cyprin
us carpio carpio)および/またはニシキゴイ(Cyprinus c
arpio koi)に導入されたときに、複製する能力を有する。
きた形態である。好ましくは、組換えコイヘルペスウイルスは、感染性粒子を再構成する
能力を有する。すなわち、許容真核細胞または魚個体、好ましくはコイ、より好ましくは
コイ(Cyprinus carpio)、さらにより好ましくはマゴイ(Cyprin
us carpio carpio)および/またはニシキゴイ(Cyprinus c
arpio koi)に導入されたときに、複製する能力を有する。
別の実施形態において本発明の組換えKHVは、複製にとって必須である一または複数
のウイルス遺伝子においてさらに欠損しており(およびウイルスの病原性に寄与するがし
かし複製にとって必須ではない一または複数のウイルス遺伝子において欠損していてもよ
い)、従って本発明の組換えコイヘルペスウイルスを非複製型で提供する。
のウイルス遺伝子においてさらに欠損しており(およびウイルスの病原性に寄与するがし
かし複製にとって必須ではない一または複数のウイルス遺伝子において欠損していてもよ
い)、従って本発明の組換えコイヘルペスウイルスを非複製型で提供する。
従って代わりの実施形態は、前記ヘルペスウイルスが非複製型である本発明の組換えK
HVに関する。
HVに関する。
「非複製型」とは、組換えコイヘルペスウイルスが、なお細胞または魚個体(例えば、
コイ(Cyprinus carpio)、マゴイ(Cyprinus carpio
carpio)またはニシキゴイ(Cyprinus carpio koi)に感染す
る能力を有するが、しかし感染性の子孫ウイルスが形成される程度までには複製すること
ができないことを意味する。
コイ(Cyprinus carpio)、マゴイ(Cyprinus carpio
carpio)またはニシキゴイ(Cyprinus carpio koi)に感染す
る能力を有するが、しかし感染性の子孫ウイルスが形成される程度までには複製すること
ができないことを意味する。
非複製型組換え株は、複製にとって必須であるKHV遺伝子の不活化によって(例えば
、BACクローニングを使用して、挿入、欠失または変異等の既知の技術によって)作製
される。
、BACクローニングを使用して、挿入、欠失または変異等の既知の技術によって)作製
される。
このような欠失ウイルスは、欠失遺伝子を安定して発現する許容細胞株上で培養される
(トランス相補)。
(トランス相補)。
この研究方法は、当該分野において良く知られた研究方法である。それは、とりわけg
H欠損ブタヘルペスウイルス1型(Aujeszkyウイルス)(Babicら、199
6)およびウシヘルペスウイルス1型(SchroederおよびKeil、1999)
等の種々のヘルペスウイルスに対して成功裡に使用されてきた。
H欠損ブタヘルペスウイルス1型(Aujeszkyウイルス)(Babicら、199
6)およびウシヘルペスウイルス1型(SchroederおよびKeil、1999)
等の種々のヘルペスウイルスに対して成功裡に使用されてきた。
複製に寄与するいかなる遺伝子も、非複製型組換えコイヘルペスウイルスを得るために
欠損させ得る。言い換えれば、不活化させることにより、非複製型組換えコイヘルペスウ
イルスをもたらすいかなる遺伝子も欠損させ得る。好ましくは、ウイルスの非複製形態を
提供するために欠損される本発明の組換えKHVの遺伝子は、ORF25、ORF31、
ORF32、ORF34、ORF35、ORF42、ORF43、ORF45、ORF5
1、ORF59、ORF60、ORF62、ORF65、ORF66、ORF68、OR
F70、ORF72、ORF78、ORF81、ORF84、ORF89、ORF90、
ORF92、ORF95、ORF97、ORF99、ORF108、ORF115、OR
F131、ORF132、ORF136、ORF137、ORF148およびORF14
9から成る群より選択される。
欠損させ得る。言い換えれば、不活化させることにより、非複製型組換えコイヘルペスウ
イルスをもたらすいかなる遺伝子も欠損させ得る。好ましくは、ウイルスの非複製形態を
提供するために欠損される本発明の組換えKHVの遺伝子は、ORF25、ORF31、
ORF32、ORF34、ORF35、ORF42、ORF43、ORF45、ORF5
1、ORF59、ORF60、ORF62、ORF65、ORF66、ORF68、OR
F70、ORF72、ORF78、ORF81、ORF84、ORF89、ORF90、
ORF92、ORF95、ORF97、ORF99、ORF108、ORF115、OR
F131、ORF132、ORF136、ORF137、ORF148およびORF14
9から成る群より選択される。
本発明の組換えコイヘルペスウイルスは、好ましくは細菌人工染色体(BAC)ベクタ
ー配列を含む。
ー配列を含む。
約15年以前から巨大ヘルペスウイルスのゲノム操作は、このような細菌人工染色体の
使用によって促進されてきた。これらのベクターは、大腸菌(Escherichia
coli)でのウイルスゲノムの維持および変異誘発、その後に続く許容真核細胞へのB
ACプラスミドの遺伝子導入による子孫ビリオンの再構成を可能とする。第一段階で、B
ACベクターの配列が従来の相同組換えによって感染細胞中でヘルペスウイルスゲノムに
導入される。ヘルペスウイルスの直鎖状2本鎖DNAゲノムは、複製中に環状化する。そ
れは、BAC変異型の環状の複製中間体を単離するために、およびE.coliへのDN
A形質転換によってそれを往復させるために十分である。この往復は、系を確立するため
に一度だけ必要とされる。ヘルペスウイルスBACは、それからE.coli中で増殖さ
れて変異される。同種のクローンヘルペスウイルスBAC DNAは、ウイルス再構成の
ためだけに真核許容細胞に戻される。ウイルスの機能は要求されないのでウイルスゲノム
は、E.coli中では休眠したままであり、クローニングの際に提示していたウイルス
機能を保存している。このことは、インビトロでの培養方法によって単離株のもともとの
特性が変化してしまうようなウイルスにとって重要である。
使用によって促進されてきた。これらのベクターは、大腸菌(Escherichia
coli)でのウイルスゲノムの維持および変異誘発、その後に続く許容真核細胞へのB
ACプラスミドの遺伝子導入による子孫ビリオンの再構成を可能とする。第一段階で、B
ACベクターの配列が従来の相同組換えによって感染細胞中でヘルペスウイルスゲノムに
導入される。ヘルペスウイルスの直鎖状2本鎖DNAゲノムは、複製中に環状化する。そ
れは、BAC変異型の環状の複製中間体を単離するために、およびE.coliへのDN
A形質転換によってそれを往復させるために十分である。この往復は、系を確立するため
に一度だけ必要とされる。ヘルペスウイルスBACは、それからE.coli中で増殖さ
れて変異される。同種のクローンヘルペスウイルスBAC DNAは、ウイルス再構成の
ためだけに真核許容細胞に戻される。ウイルスの機能は要求されないのでウイルスゲノム
は、E.coli中では休眠したままであり、クローニングの際に提示していたウイルス
機能を保存している。このことは、インビトロでの培養方法によって単離株のもともとの
特性が変化してしまうようなウイルスにとって重要である。
本明細書で用いる場合、用語「相同組換え」とは、二つの異なる相同核酸分子が遭遇す
るときに、交差が起こり新しい核酸の組合せが生じることを表す。本明細書で用いる場合
、用語「配列介在性相同組換え」とは、相同組換えにおいて触媒し、実行しまたは補助し
ている特異的組換えタンパク質に依存する相同組換えを引き起こす配列を表す。このよう
な組換えタンパク質は、好ましくは特異的に「配列介在性相同組み換え」に作用し他の配
列には作用しない。
るときに、交差が起こり新しい核酸の組合せが生じることを表す。本明細書で用いる場合
、用語「配列介在性相同組換え」とは、相同組換えにおいて触媒し、実行しまたは補助し
ている特異的組換えタンパク質に依存する相同組換えを引き起こす配列を表す。このよう
な組換えタンパク質は、好ましくは特異的に「配列介在性相同組み換え」に作用し他の配
列には作用しない。
BACベクター配列は、当該分野においてよく知られており、ヘルペスウイルス等の組
換えウイルスの構築におけるその使用がしばしば当該分野において記載されている(Bo
rst、E.M.、Hahn、G.、Koszinowski、U.H.& Messe
rle、M.(1999)、J Virol 73、8320‐9.Costes、B.
、Fournier、G.、Michel、B.、Delforge、D.、Raj、V
.S.、Dewals、B.、Gillet、L.、Drion、P.、Body、A.
、Schynts、F.、Lieffrig、F.、Vanderplasschen、
A.、2008.J Virol 82、4955‐4964.Dewals、B.、B
oudry、C.、Gillet、L.、Markine‐Goriaynoff、N.
、de Leval、L.、Haig、D.M.& Vanderplasschen、
A.(2006)、J Gen Virol 87、509‐17.Gillet、L.
、Daix、V.、Donofrio、G.、Wagner、M.、Koszinows
ki、U.H.、China、B.、Ackermann、M.、Markine‐Go
riaynoff、N.& Vanderplasschen、A.(2005)、J
Gen Virol 86、907‐17.Messerle、M.、Crnkovic
、I.、Hammerschmidt、W.、Ziegler、H.& Koszino
wski、U.H.(1997)、Proc Natl Acad Sci USA 9
4、14759‐63.Warming、S.、Costantino、N.、Cour
t、D.L.、Jenkins、N.A.& Copeland、N.G.(2005)
、Nucleic Acids Res 33、e36.Wagner、M.、Ruzs
ics、Z.& Koszinowski、U.H.(2002)、Trends Mi
crobiol 10、318‐24)。
換えウイルスの構築におけるその使用がしばしば当該分野において記載されている(Bo
rst、E.M.、Hahn、G.、Koszinowski、U.H.& Messe
rle、M.(1999)、J Virol 73、8320‐9.Costes、B.
、Fournier、G.、Michel、B.、Delforge、D.、Raj、V
.S.、Dewals、B.、Gillet、L.、Drion、P.、Body、A.
、Schynts、F.、Lieffrig、F.、Vanderplasschen、
A.、2008.J Virol 82、4955‐4964.Dewals、B.、B
oudry、C.、Gillet、L.、Markine‐Goriaynoff、N.
、de Leval、L.、Haig、D.M.& Vanderplasschen、
A.(2006)、J Gen Virol 87、509‐17.Gillet、L.
、Daix、V.、Donofrio、G.、Wagner、M.、Koszinows
ki、U.H.、China、B.、Ackermann、M.、Markine‐Go
riaynoff、N.& Vanderplasschen、A.(2005)、J
Gen Virol 86、907‐17.Messerle、M.、Crnkovic
、I.、Hammerschmidt、W.、Ziegler、H.& Koszino
wski、U.H.(1997)、Proc Natl Acad Sci USA 9
4、14759‐63.Warming、S.、Costantino、N.、Cour
t、D.L.、Jenkins、N.A.& Copeland、N.G.(2005)
、Nucleic Acids Res 33、e36.Wagner、M.、Ruzs
ics、Z.& Koszinowski、U.H.(2002)、Trends Mi
crobiol 10、318‐24)。
BACベクター配列は、必ずしもORF57に挿入される必要はない。その代りにそれ
は、病原性に寄与するいかなる他のウイルス遺伝子、および/またはウイルス複製にとっ
て必須のまたは必須でないいかなる他のウイルス遺伝子、および/またはいかなる遺伝子
間領域にも挿入され得る。
は、病原性に寄与するいかなる他のウイルス遺伝子、および/またはウイルス複製にとっ
て必須のまたは必須でないいかなる他のウイルス遺伝子、および/またはいかなる遺伝子
間領域にも挿入され得る。
しかしながらより好ましい形態において組換えコイヘルペスウイルスは、ORF57に
挿入されたBACベクター配列を含む。このような挿入は、BACベクターをORF57
に挿入することによって、同時にORF57に欠損が生じ、従って直接的に本発明の組換
えKHVを提供するという利点を有する。
挿入されたBACベクター配列を含む。このような挿入は、BACベクターをORF57
に挿入することによって、同時にORF57に欠損が生じ、従って直接的に本発明の組換
えKHVを提供するという利点を有する。
本発明の組換えKHVの例は、ORF55への改変loxP隣接BACカセットの挿入
によるKHVゲノムのクローニングによって達成された(下記を参照されたい)。この挿
入は、許容細胞に遺伝子導入されたときに、そのゲノムが細菌中で安定して維持され、ビ
リオンを再生できるBAC組換えウイルスをもたらした(BACベクターの詳細について
は、Costes、B.、Fournier、G.、Michel、B.、Delfor
ge、C.、Raj、V.S.、Dewals、B.、Gillet、L.、Drion
、P.、Body、A.、Schynts、F.、Lieffrig、F.、Vande
rplasschen、A.、2008、J Virol 82、4955‐4964を
、および技術的詳細については下記を参照されたい)。このベクターは、ORF57にお
ける欠失(deletion)を導入するために使用した。
によるKHVゲノムのクローニングによって達成された(下記を参照されたい)。この挿
入は、許容細胞に遺伝子導入されたときに、そのゲノムが細菌中で安定して維持され、ビ
リオンを再生できるBAC組換えウイルスをもたらした(BACベクターの詳細について
は、Costes、B.、Fournier、G.、Michel、B.、Delfor
ge、C.、Raj、V.S.、Dewals、B.、Gillet、L.、Drion
、P.、Body、A.、Schynts、F.、Lieffrig、F.、Vande
rplasschen、A.、2008、J Virol 82、4955‐4964を
、および技術的詳細については下記を参照されたい)。このベクターは、ORF57にお
ける欠失(deletion)を導入するために使用した。
用語「BACベクター」とは、E.coliのFプラスミドを使用して作製されるプラ
スミドであって、しかもE.coli等の細菌において約300kb以上の巨大サイズの
DNA断片を安定して維持し増殖することのできるベクターを表す。BACベクターは、
少なくともBACベクターの複製にとって必須なBACベクター配列を含有する。このよ
うな複製にとって必須な領域の例には、限定されるものではないが、Fプラスミドの複製
起点およびその変異型が含まれる。
スミドであって、しかもE.coli等の細菌において約300kb以上の巨大サイズの
DNA断片を安定して維持し増殖することのできるベクターを表す。BACベクターは、
少なくともBACベクターの複製にとって必須なBACベクター配列を含有する。このよ
うな複製にとって必須な領域の例には、限定されるものではないが、Fプラスミドの複製
起点およびその変異型が含まれる。
本明細書で用いる場合、用語「BACベクター配列」とは、BACベクターの機能にと
って必須な配列を含む配列を表す。BACベクター配列は、「組換えタンパク質依存性組
換え配列」および/または「選択マーカー」をさらに含んでいてもよい。
って必須な配列を含む配列を表す。BACベクター配列は、「組換えタンパク質依存性組
換え配列」および/または「選択マーカー」をさらに含んでいてもよい。
すなわち「組換えタンパク質依存性組換え配列」および/または「選択マーカー」の詳
細は、例えば上述の文献、およびWO22009/027412に記載されている。
細は、例えば上述の文献、およびWO22009/027412に記載されている。
BACベクターがゲノムに挿入される位置に関わらず、好ましくは、BACベクター配
列は相同組換えを媒介する配列、好ましくはloxPによって隣接されている。またBA
Cベクター配列は、好ましくは選択マーカーを含む(下記を参照されたい)。より好まし
い形態において選択マーカーは、薬剤選択マーカーである(下記を参照されたい)。
列は相同組換えを媒介する配列、好ましくはloxPによって隣接されている。またBA
Cベクター配列は、好ましくは選択マーカーを含む(下記を参照されたい)。より好まし
い形態において選択マーカーは、薬剤選択マーカーである(下記を参照されたい)。
他の好ましい形態において、前記組換えヘルペスウイルスのゲノムはプラスミド形態で
存在する。これは上記のBACベクター配列を含む組換えコイヘルペスウイルスの環状型
を単離することおよび細菌細胞への導入によって達成される。上記の通り、病原性に寄与
するまたは複製にとって必要である一または複数の上記の遺伝子が遺伝子工学技術によっ
て欠損されているかぎり、BAC(細菌人工染色体)ベクター配列を、病原性に寄与する
または複製にとって必要である一または複数のウイルス遺伝子に挿入することは、本発明
にとって必須ではない。
存在する。これは上記のBACベクター配列を含む組換えコイヘルペスウイルスの環状型
を単離することおよび細菌細胞への導入によって達成される。上記の通り、病原性に寄与
するまたは複製にとって必要である一または複数の上記の遺伝子が遺伝子工学技術によっ
て欠損されているかぎり、BAC(細菌人工染色体)ベクター配列を、病原性に寄与する
または複製にとって必要である一または複数のウイルス遺伝子に挿入することは、本発明
にとって必須ではない。
従って、ORF57および好ましくは病原性に寄与する一または複数のウイルス遺伝子
も欠損しているかぎり、BACベクター配列はウイルスゲノムのいかなる領域に挿入され
てもよい。
も欠損しているかぎり、BACベクター配列はウイルスゲノムのいかなる領域に挿入され
てもよい。
もちろん、上記のBACベクター介在性クローニング技術の利用は、例えば最初はOR
F57を欠損させるために、そして再度追加の遺伝子を欠損させるために繰り返して使用
され得る。
F57を欠損させるために、そして再度追加の遺伝子を欠損させるために繰り返して使用
され得る。
BACベクター配列は、原則としてさらなる使用においても、本発明の組換えKHV中
に問題なく存在し得る。しかしながら、例えばワクチンにおける本発明のコイヘルペスウ
イルスの使用のためには、BAC配列の大部分は除去されることが好ましい。これは、例
えば選択マーカーをコードする遺伝子およびさらには耐性遺伝子を含むBAC配列の場合
である。ワクチンにおけるこのような遺伝子の存在は、不要であると考えられるだけでな
く、望ましくさえない。
に問題なく存在し得る。しかしながら、例えばワクチンにおける本発明のコイヘルペスウ
イルスの使用のためには、BAC配列の大部分は除去されることが好ましい。これは、例
えば選択マーカーをコードする遺伝子およびさらには耐性遺伝子を含むBAC配列の場合
である。ワクチンにおけるこのような遺伝子の存在は、不要であると考えられるだけでな
く、望ましくさえない。
従って好ましくはBACベクター配列の少なくとも一部(例えば、耐性遺伝子または選
択マーカーを含む一部)、またはより好ましくは大部分がヘルペスウイルスゲノムから切
除され、それによってヘルペスウイルスゲノムにおける切除部位または前挿入部位に異種
配列を置き去りにする。より好ましくは、異種配列は200ヌクレオチド未満のサイズを
有する。切除は、loxP隣接BACベクター配列を切除するCreリコンビナーゼを発
現する許容真核細胞への組換えKHVの導入によって達成される。
択マーカーを含む一部)、またはより好ましくは大部分がヘルペスウイルスゲノムから切
除され、それによってヘルペスウイルスゲノムにおける切除部位または前挿入部位に異種
配列を置き去りにする。より好ましくは、異種配列は200ヌクレオチド未満のサイズを
有する。切除は、loxP隣接BACベクター配列を切除するCreリコンビナーゼを発
現する許容真核細胞への組換えKHVの導入によって達成される。
従ってこの実施形態の好ましい形態は、BACベクター配列の一部がヘルペスウイルス
ゲノムから切除され、それによってヘルペスウイルスゲノムの切除部位または前挿入部位
のそれぞれに異種配列を置き去りにすることを特徴とする、本発明の組換えコイヘルペス
ウイルスに関する。
ゲノムから切除され、それによってヘルペスウイルスゲノムの切除部位または前挿入部位
のそれぞれに異種配列を置き去りにすることを特徴とする、本発明の組換えコイヘルペス
ウイルスに関する。
そしてこの実施形態のより好ましい形態において、ヘルペスウイルスゲノムから切除さ
れるBACベクター配列の一部は、選択マーカーおよび/または耐性遺伝子をコードする
少なくとも一つの遺伝子を含む。
れるBACベクター配列の一部は、選択マーカーおよび/または耐性遺伝子をコードする
少なくとも一つの遺伝子を含む。
またBACカセットの挿入部位を含む野生型ウイルスゲノムのDNA断片(例えば、T
KをコードするORF55)を使用する真核細胞中における相同組換えによって、全BA
Cカセット配列を除去することも可能である。EGFP(BACカセットによりコードさ
れている)を発現しないウイルスプラークを選択することにより、BAC挿入サイトが野
生型配列に復帰した組換え体を選択することが可能となる。
KをコードするORF55)を使用する真核細胞中における相同組換えによって、全BA
Cカセット配列を除去することも可能である。EGFP(BACカセットによりコードさ
れている)を発現しないウイルスプラークを選択することにより、BAC挿入サイトが野
生型配列に復帰した組換え体を選択することが可能となる。
本発明の組換えコイヘルペスウイルスは、KHV BACクローン、およびBACベク
ター配列の少なくとも一部がヘルペスウイルスゲノムから切除されている上記のKHV構
築物のどちらの形態でも、さらに特定の遺伝子に欠損のあるゲノムを作製するために、さ
らなる操作、例えば遺伝子工学技術が関与する操作のために使用し得る。このようなさら
なる遺伝子の欠損は、既に上記した通り、同様にBAC技術を使用して獲得し得る。
ター配列の少なくとも一部がヘルペスウイルスゲノムから切除されている上記のKHV構
築物のどちらの形態でも、さらに特定の遺伝子に欠損のあるゲノムを作製するために、さ
らなる操作、例えば遺伝子工学技術が関与する操作のために使用し得る。このようなさら
なる遺伝子の欠損は、既に上記した通り、同様にBAC技術を使用して獲得し得る。
本発明の組換えKHVは、魚、より具体的にはコイ、さらにより具体的にはマゴイ(C
yprinus carpio carpio)またはニシキゴイ(Cyprinus
carpio koi)を単にKHV疾患から予防するための、ワクチン用途に使用し得
るばかりでなく、異種(すなわち非KHV)DNA断片の担体ウイルス(carrier
virus)としても効率的に使用され得る。その場合、本発明の組換えKHVの有利
な特性が完全に利用し得るであろうし、さらにウイルスは、例えばマーカー特性、さらな
る免疫特性またはアジュバント特性等のさらなる特性を獲得するであろう。
yprinus carpio carpio)またはニシキゴイ(Cyprinus
carpio koi)を単にKHV疾患から予防するための、ワクチン用途に使用し得
るばかりでなく、異種(すなわち非KHV)DNA断片の担体ウイルス(carrier
virus)としても効率的に使用され得る。その場合、本発明の組換えKHVの有利
な特性が完全に利用し得るであろうし、さらにウイルスは、例えばマーカー特性、さらな
る免疫特性またはアジュバント特性等のさらなる特性を獲得するであろう。
この点において「マーカー特性」とは、直接的または間接的に異種DNA断片が、野生
ウイルス(field virus)感染とワクチンウイルス感染の違いを識別するのを
可能にすることを意味する。
ウイルス(field virus)感染とワクチンウイルス感染の違いを識別するのを
可能にすることを意味する。
野生ウイルス感染とワクチンウイルス感染の違いを識別する直接的な方法は、例えば、
本発明の組換えKHV中の異種(すなわち非KHV)DNA断片と特異的に反応し、KH
V野生ウイルスのDNAとは反応しないプライマーを使用するPCR法(PCR‐rea
ction)を含むであろう。
本発明の組換えKHV中の異種(すなわち非KHV)DNA断片と特異的に反応し、KH
V野生ウイルスのDNAとは反応しないプライマーを使用するPCR法(PCR‐rea
ction)を含むであろう。
野生ウイルス感染とワクチンウイルス感染の違いを識別する間接的な方法は、例えば、
本発明の組換えKHV中の異種(すなわち非KHV)DNA断片によってコードされた免
疫原性タンパク質と特異的に反応し、しかもKHV野生ウイルスのいかなるタンパク質と
も反応しない抗体を使用する免疫反応を含むであろう。
本発明の組換えKHV中の異種(すなわち非KHV)DNA断片によってコードされた免
疫原性タンパク質と特異的に反応し、しかもKHV野生ウイルスのいかなるタンパク質と
も反応しない抗体を使用する免疫反応を含むであろう。
従って本発明の他の実施形態は、異種DNA断片、例えば異種遺伝子を含む本発明の組
換えKHVに関する。
換えKHVに関する。
好ましくは、このような異種DNA断片は、魚、より具体的にはコイ、さらにより具体
的にはマゴイ(Cyprinus carpio carpio)またはニシキゴイ(C
yprinus carpio koi)に対して病原性のある、別のウイルスまたは微
生物の免疫原性タンパク質をコードする異種遺伝子である。より好ましくは、異種遺伝子
は、コイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルス(rhabdovirus)の糖タ
ンパク質G遺伝子である。このような構築物は、ワクチンに使用されたとき、KHVに対
してのみならずコイ春ウイルス血症に対してもコイを保護し得る。
的にはマゴイ(Cyprinus carpio carpio)またはニシキゴイ(C
yprinus carpio koi)に対して病原性のある、別のウイルスまたは微
生物の免疫原性タンパク質をコードする異種遺伝子である。より好ましくは、異種遺伝子
は、コイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルス(rhabdovirus)の糖タ
ンパク質G遺伝子である。このような構築物は、ワクチンに使用されたとき、KHVに対
してのみならずコイ春ウイルス血症に対してもコイを保護し得る。
真核細胞における異種遺伝子の発現のために適したプロモーターは、当該技術分野にお
いて広範に知られている。異種遺伝子、例えばコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウ
イルスの糖タンパク質G遺伝子の発現にとって適したプロモーターの一例は、HCMV(
ヒトサイトメガロウイルス)IEプロモーターである。
いて広範に知られている。異種遺伝子、例えばコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウ
イルスの糖タンパク質G遺伝子の発現にとって適したプロモーターの一例は、HCMV(
ヒトサイトメガロウイルス)IEプロモーターである。
本発明はさらに、組換えコイヘルペスウイルス(KHV)の感染性粒子の作製の方法を
提供し、ここで前記方法は、
(a)本発明の組換えKHV、または本発明の組換えKHVのゲノムを含む組換えKHV
DNAを、許容真核細胞に導入する段階;および
(b)組換えコイヘルペスウイルス(KHV)を作製するために宿主細胞を培養する段階
を含む。
提供し、ここで前記方法は、
(a)本発明の組換えKHV、または本発明の組換えKHVのゲノムを含む組換えKHV
DNAを、許容真核細胞に導入する段階;および
(b)組換えコイヘルペスウイルス(KHV)を作製するために宿主細胞を培養する段階
を含む。
上記の本発明の組換えコイヘルペスウイルスおよびそのDNAは弱毒化された特性を有
するため、注射または薬浴または経口による魚、好ましくはマゴイ(Cyprinus
carpio carpio)またはニシキゴイ(Cyprinus carpio k
oi)個体の免疫化に非常に適している。
するため、注射または薬浴または経口による魚、好ましくはマゴイ(Cyprinus
carpio carpio)またはニシキゴイ(Cyprinus carpio k
oi)個体の免疫化に非常に適している。
従って本発明のさらなる他の実施形態は、コイヘルペスウイルス(KHV)により引き
起こされる魚の疾患の予防処置および/または治療処置における使用のための、本発明の
組換えコイヘルペスウイルス、および/または本発明の組換えコイヘルペスウイルスのゲ
ノムを含む、KHV DNAを提供する。
起こされる魚の疾患の予防処置および/または治療処置における使用のための、本発明の
組換えコイヘルペスウイルス、および/または本発明の組換えコイヘルペスウイルスのゲ
ノムを含む、KHV DNAを提供する。
予防的使用とは、感染または少なくとも疾患の臨床症状を防ぐことを目的とする使用で
ある。
ある。
治療的使用とは、KHVによって引き起こされる疾患に既に罹患している魚における前
記KHVまたはKHV DNAの使用である。
記KHVまたはKHV DNAの使用である。
また本発明の他の実施形態は、コイヘルペスウイルス(KHV)により引き起こされる
魚の疾患の予防処置および/または治療処置のためのワクチンにおける使用のための、本
発明の組換えコイヘルペスウイルス、および/または本発明の組換えコイヘルペスウイル
スのゲノムを含むKHV DNAを提供する。
魚の疾患の予防処置および/または治療処置のためのワクチンにおける使用のための、本
発明の組換えコイヘルペスウイルス、および/または本発明の組換えコイヘルペスウイル
スのゲノムを含むKHV DNAを提供する。
さらに本発明の他の実施形態は、コイヘルペスウイルス(KHV)により引き起こされ
る魚の疾患の予防処理および/または治療処置のためのワクチンであって、本発明の組換
えコイヘルペスウイルスおよび/または本発明の組換えコイヘルペスウイルスのゲノムを
含むKHV DNA、並びに薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とするワクチンを
提供する。
る魚の疾患の予防処理および/または治療処置のためのワクチンであって、本発明の組換
えコイヘルペスウイルスおよび/または本発明の組換えコイヘルペスウイルスのゲノムを
含むKHV DNA、並びに薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とするワクチンを
提供する。
また本発明の他の実施形態は、コイ春ウイルス血症の原因となるラブドウイルスにより
引き起こされる魚の疾患の予防処置および/または治療処置のためのワクチンであって、
コイ春ウイルス血症の原因となる前記ラブドウイルスの糖タンパク質Gをコードする遺伝
子を保有する本発明の組換えKHV、または前記KHVのゲノムを含むDNA配列、およ
び薬学的に許容可能な担体を含むワクチンを提供する。
引き起こされる魚の疾患の予防処置および/または治療処置のためのワクチンであって、
コイ春ウイルス血症の原因となる前記ラブドウイルスの糖タンパク質Gをコードする遺伝
子を保有する本発明の組換えKHV、または前記KHVのゲノムを含むDNA配列、およ
び薬学的に許容可能な担体を含むワクチンを提供する。
本明細書で用いる場合、用語「ワクチン」とは、特定の疾患に対し宿主の予防処置およ
び/または治療処置ができる組成物を表す。このようなワクチンは、予防的免疫または治
療的免疫を引き起こし得る。
び/または治療処置ができる組成物を表す。このようなワクチンは、予防的免疫または治
療的免疫を引き起こし得る。
薬学的に許容可能な担体は、水または緩衝液のように単純であり得る。薬学的に許容可
能な担体は、また安定剤を含んでもよい。それは、またアジュバントを含んでもよいし、
またはそれ自体がアジュバントでもあり得る。
能な担体は、また安定剤を含んでもよい。それは、またアジュバントを含んでもよいし、
またはそれ自体がアジュバントでもあり得る。
典型的にワクチンは、注射または水中での魚の浸漬による送達のための液体溶液、エマ
ルジョンまたは懸濁液として調製される。例えば、魚が入った貯水槽または浴槽に添加す
るために、液体エマルジョンまたは乳剤を調製し得る。また、投与前に、液体ビヒクルへ
の溶解または懸濁に適した、または固形食との混合に適した固形(例えば、粉体)形態を
調製してもよい。ワクチンは、滅菌希釈液による再構成によって即時使用可能となる凍結
乾燥培養液であり得る。例えば凍結乾燥細胞は、0.9%生理食塩水(任意に、包装した
ワクチン製品の一部として提供される)で再構成され得る。注射可能なワクチンの好まし
い剤形はエマルジョンである。液体または再構成形態のワクチンは、囲い、水槽または浴
槽(pen,tank or bath)への添加の前に少量(例えば、1ないし100
容量)の水で希釈され得る。
ルジョンまたは懸濁液として調製される。例えば、魚が入った貯水槽または浴槽に添加す
るために、液体エマルジョンまたは乳剤を調製し得る。また、投与前に、液体ビヒクルへ
の溶解または懸濁に適した、または固形食との混合に適した固形(例えば、粉体)形態を
調製してもよい。ワクチンは、滅菌希釈液による再構成によって即時使用可能となる凍結
乾燥培養液であり得る。例えば凍結乾燥細胞は、0.9%生理食塩水(任意に、包装した
ワクチン製品の一部として提供される)で再構成され得る。注射可能なワクチンの好まし
い剤形はエマルジョンである。液体または再構成形態のワクチンは、囲い、水槽または浴
槽(pen,tank or bath)への添加の前に少量(例えば、1ないし100
容量)の水で希釈され得る。
この実施形態の好ましい一形態において、組換えKHV株を含むワクチン製剤は、例え
ば粉体、凍結乾燥体、圧縮ペレットまたは錠剤等の乾燥形態である。
ば粉体、凍結乾燥体、圧縮ペレットまたは錠剤等の乾燥形態である。
この実施形態の他の形態において、前記ウイルスは組織培養液の形態であり得る。前記
液体は、好ましくは−70℃の雰囲気下、最も好ましくはグリセリンを含有する液体とし
て保存し得る。一具体例において、該組織培養液は20%グリセリンを含有する。
液体は、好ましくは−70℃の雰囲気下、最も好ましくはグリセリンを含有する液体とし
て保存し得る。一具体例において、該組織培養液は20%グリセリンを含有する。
本発明において開示する組換えKHV株は、いくつかの方法によって乾燥形態に変換し
得る。特に好ましい乾燥形態は凍結乾燥によるものである。乾燥、例えば凍結乾燥処置に
先立って、様々の原料、例えば保存料、抗酸化剤または還元剤、種々の賦形剤等を培養液
に添加し得る。このような賦形剤は、乾燥、例えば凍結乾燥した活性弱毒化ウイルスに乾
燥段階後にも添加し得る。
得る。特に好ましい乾燥形態は凍結乾燥によるものである。乾燥、例えば凍結乾燥処置に
先立って、様々の原料、例えば保存料、抗酸化剤または還元剤、種々の賦形剤等を培養液
に添加し得る。このような賦形剤は、乾燥、例えば凍結乾燥した活性弱毒化ウイルスに乾
燥段階後にも添加し得る。
本発明の組換えKHVが経口投与(例えば、浸漬または薬浴)のためのワクチン成分と
して使用されるときは、通常アジュバントの投与の必要はないはずである。
して使用されるときは、通常アジュバントの投与の必要はないはずである。
しかしながらもしワクチン製剤が魚に直接注射されるならば、アジュバントを使用して
もよい。もし本発明の組換えKHVが非複製型であるならば、免疫賦活剤の添加が好まし
いかもしれない。
もよい。もし本発明の組換えKHVが非複製型であるならば、免疫賦活剤の添加が好まし
いかもしれない。
一般的に製剤は、免疫応答を強化するために、特に注射用の製剤の場合には様々なアジ
ュバント、サイトカインまたは他の免疫賦活剤を含んでよい。
ュバント、サイトカインまたは他の免疫賦活剤を含んでよい。
アジュバントは、宿主の免疫応答を非特異的な方法で強化する免疫賦活物質である。ア
ジュバントは、親水性アジュバント、例えば水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニ
ウム、または疎水性アジュバント、例えばミネラルオイルを含むアジュバントであり得る
。ムラミルジペプチド、アビジン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、オイル、
オイルエマルジョン、サポニン、デキストラン硫酸、グルカン、サイトカイン、ブロック
共重合体、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび当該分野で知られたその他のアジュバント
は、本発明の組換えKHVと混合し得る。養殖業において頻繁に使用されるアジュバント
の例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖類、数種のグルカンおよびグルカンおよびCar
bopol(登録商標)(ホモポリマー)である。適したアジュバントは、例えば油中水
(w/o)エマルジョン、o/wエマルジョンおよびw/o/w二重エマルジョンである
。w/oエマルジョンにおける使用に適したオイルアジュバントは、例えばミネラルオイ
ルまたは代謝可能なオイルである。ミネラルオイルは、例えばBayol(登録商標)、
Marcol(登録商標)およびDrakeol(登録商標)であり;代謝可能なオイル
は、例えばピーナッツ油および大豆油等の植物油、または魚油スクアランおよびスクアレ
ン等の動物油である。あるいは、EP382,271に記載の通り、ビタミンE(トコフ
ェロール)可溶化物も有利に使用し得る。非常に適したo/wエマルジョンは、例えば、
5〜50%w/w水相と95〜50%w/wオイルアジュバントから出発して得られるが
、より好ましくは20〜50%w/w水相と80〜50%w/wオイルアジュバントが使
用される。アジュバントの添加量は、アジュバントそれ自体の性質、および製造者によっ
て提供される当該量に関する情報に依存する。
ジュバントは、親水性アジュバント、例えば水酸化アルミニウムもしくはリン酸アルミニ
ウム、または疎水性アジュバント、例えばミネラルオイルを含むアジュバントであり得る
。ムラミルジペプチド、アビジン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、オイル、
オイルエマルジョン、サポニン、デキストラン硫酸、グルカン、サイトカイン、ブロック
共重合体、免疫賦活オリゴヌクレオチドおよび当該分野で知られたその他のアジュバント
は、本発明の組換えKHVと混合し得る。養殖業において頻繁に使用されるアジュバント
の例は、ムラミルジペプチド、リポ多糖類、数種のグルカンおよびグルカンおよびCar
bopol(登録商標)(ホモポリマー)である。適したアジュバントは、例えば油中水
(w/o)エマルジョン、o/wエマルジョンおよびw/o/w二重エマルジョンである
。w/oエマルジョンにおける使用に適したオイルアジュバントは、例えばミネラルオイ
ルまたは代謝可能なオイルである。ミネラルオイルは、例えばBayol(登録商標)、
Marcol(登録商標)およびDrakeol(登録商標)であり;代謝可能なオイル
は、例えばピーナッツ油および大豆油等の植物油、または魚油スクアランおよびスクアレ
ン等の動物油である。あるいは、EP382,271に記載の通り、ビタミンE(トコフ
ェロール)可溶化物も有利に使用し得る。非常に適したo/wエマルジョンは、例えば、
5〜50%w/w水相と95〜50%w/wオイルアジュバントから出発して得られるが
、より好ましくは20〜50%w/w水相と80〜50%w/wオイルアジュバントが使
用される。アジュバントの添加量は、アジュバントそれ自体の性質、および製造者によっ
て提供される当該量に関する情報に依存する。
好ましい実施形態において本発明のワクチンは、安定剤をさらに含む。安定剤は、例え
ば分解から保護するため、保存性を高めるため、または凍結乾燥効率を改善するために本
発明のワクチンに添加され得る。有用な安定剤は、とりわけSPGA(Bovarnik
ら、1950、J.Bacteriology、vol.59、p.509)、脱脂乳、
ゼラチン、ウシ血清アルブミン、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デ
ンプン、ショ糖、デキストランまたはグルコース、乳糖等の炭水化物、アルブミンもしく
はカゼインまたはその分解物等のタンパク質、およびアルカリ金属リン酸塩等の緩衝液で
ある。
ば分解から保護するため、保存性を高めるため、または凍結乾燥効率を改善するために本
発明のワクチンに添加され得る。有用な安定剤は、とりわけSPGA(Bovarnik
ら、1950、J.Bacteriology、vol.59、p.509)、脱脂乳、
ゼラチン、ウシ血清アルブミン、例えばソルビトール、マンニトール、トレハロース、デ
ンプン、ショ糖、デキストランまたはグルコース、乳糖等の炭水化物、アルブミンもしく
はカゼインまたはその分解物等のタンパク質、およびアルカリ金属リン酸塩等の緩衝液で
ある。
ネオマイシンおよびストレプトマイシン等の抗生物質を、潜在的な細菌増殖を防ぐため
に添加し得る。
に添加し得る。
さらにワクチンは、一または複数の適した界面活性化合物または乳化剤、例えばSpa
n(登録商標)またはTween(登録商標)を含み得る。ワクチンは、またいわゆる「
ビヒクル(vehicle)」も含み得る。ビヒクルとは、本発明のKHVウイルス(ウ
イルス粒子形態かそれともDNA形態)が、それに共有結合することなくそれに付着する
化合物である。このようなビヒクルは、とりわけバイオ‐マイクロカプセル、マイクロ‐
アルギン酸、リポソームおよびmacrosolsであり、当該技術分野においてすべて
知られている。このようなビヒクルの特別の形態がイスコムである。言うまでもないこと
であるが、本発明のワクチンに他の安定剤、担体、希釈剤、エマルジョン、その他を混合
することもまた本発明の範囲内である。このような添加物は、例えば「レミントン薬学の
科学と実践(Remington:the science and practice
of pharmacy)」(2000、Lippincot、USA、ISBN:6
83306472)、および「獣医ワクチン学(Veterinary vaccino
logy)」(P.Pastoretら、編、1997、Elsevier、Amste
rdam、ISBN:0444819681)等の良く知られた参考書に記載されている
。
n(登録商標)またはTween(登録商標)を含み得る。ワクチンは、またいわゆる「
ビヒクル(vehicle)」も含み得る。ビヒクルとは、本発明のKHVウイルス(ウ
イルス粒子形態かそれともDNA形態)が、それに共有結合することなくそれに付着する
化合物である。このようなビヒクルは、とりわけバイオ‐マイクロカプセル、マイクロ‐
アルギン酸、リポソームおよびmacrosolsであり、当該技術分野においてすべて
知られている。このようなビヒクルの特別の形態がイスコムである。言うまでもないこと
であるが、本発明のワクチンに他の安定剤、担体、希釈剤、エマルジョン、その他を混合
することもまた本発明の範囲内である。このような添加物は、例えば「レミントン薬学の
科学と実践(Remington:the science and practice
of pharmacy)」(2000、Lippincot、USA、ISBN:6
83306472)、および「獣医ワクチン学(Veterinary vaccino
logy)」(P.Pastoretら、編、1997、Elsevier、Amste
rdam、ISBN:0444819681)等の良く知られた参考書に記載されている
。
組換えKHVは、ワクチンにおいてその乾燥形態で使用されるとき、さらに再構成液体
、好ましくは滅菌水、生理食塩水または生理溶液を含み得る。それは、また細胞のタンパ
ク質、DNA、RNA等の製造工程由来の少量の残留物も含有し得る。これらの物質はそ
れ自体添加物ではないものの、それにもかかわらずワクチン製剤に存在し得る。
、好ましくは滅菌水、生理食塩水または生理溶液を含み得る。それは、また細胞のタンパ
ク質、DNA、RNA等の製造工程由来の少量の残留物も含有し得る。これらの物質はそ
れ自体添加物ではないものの、それにもかかわらずワクチン製剤に存在し得る。
ワクチンは、経口的に、例えば飼料によりまたは強制経口投与により、または注射によ
り(例えば、筋肉内または腹腔内経路により)魚に対し個別に投与し得る。
り(例えば、筋肉内または腹腔内経路により)魚に対し個別に投与し得る。
あるいはワクチンは、水中に入れられた魚全体の個体群にスプレーし、溶解しおよび/
または浸漬することによって一斉に投与し得る。これらの方法は、全ての種類の魚、例え
ば食用魚および鑑賞用魚等のワクチン接種にとって、および様々な環境、例えば池、水族
館、自生地および淡水貯留池等におけるワクチン接種にとって有用である。
または浸漬することによって一斉に投与し得る。これらの方法は、全ての種類の魚、例え
ば食用魚および鑑賞用魚等のワクチン接種にとって、および様々な環境、例えば池、水族
館、自生地および淡水貯留池等におけるワクチン接種にとって有用である。
本発明のさらなる態様は、本発明の組換えKHVを含むDNAワクチンに関する。
本発明のDNAワクチンは、どちらも本発明の組換えKHVのゲノムを含むという意味
で、本発明の組換えKHVを含むワクチンと基本的に異ならない。
で、本発明の組換えKHVを含むワクチンと基本的に異ならない。
それらは、例えばGeneGun(登録商標)等の無針注射器を使用する皮内施用によ
り容易に投与し得る。この投与方法は、DNAをワクチン接種される動物の細胞に直接送
達する。本発明の医薬組成物(以下に概説)における本発明の組換えKHV DNAの好
ましい量は、10pgと1000μgの範囲内にある。好ましくは、0.1と100μg
の範囲内の量が使用される。あるいは魚は、例えば10pgと1000μg/mlの範囲
内の投与されるべきDNAを含む溶液に浸漬され得る。すべてのこれらの投与技術および
投与経路は、当該技術分野で良く知られている。
り容易に投与し得る。この投与方法は、DNAをワクチン接種される動物の細胞に直接送
達する。本発明の医薬組成物(以下に概説)における本発明の組換えKHV DNAの好
ましい量は、10pgと1000μgの範囲内にある。好ましくは、0.1と100μg
の範囲内の量が使用される。あるいは魚は、例えば10pgと1000μg/mlの範囲
内の投与されるべきDNAを含む溶液に浸漬され得る。すべてのこれらの投与技術および
投与経路は、当該技術分野で良く知られている。
好ましくは、本発明のワクチンは、例えば懸濁液、溶液、分散液、エマルジョン、その
他の、注射または浸漬ワクチン接種に適した形態に製剤化される。
他の、注射または浸漬ワクチン接種に適した形態に製剤化される。
標的生物に対する本発明ワクチン施用のための投与計画は、単回投与または複数回投与
の施用が可能であり、投与量および製剤に適合する仕方で、および免疫学的に有効であろ
う量で、同時にまたは逐次的に投与され得る。処置が「免疫学的に有効」であるか否かを
決定することは、当業者の能力で十分可能であり、例えばワクチン接種された動物に実験
的な攻撃感染を投与し、そして次に標的動物の臨床症状、血清パラメータを検討すること
によって、または病原体の再分離を評価する。
の施用が可能であり、投与量および製剤に適合する仕方で、および免疫学的に有効であろ
う量で、同時にまたは逐次的に投与され得る。処置が「免疫学的に有効」であるか否かを
決定することは、当業者の能力で十分可能であり、例えばワクチン接種された動物に実験
的な攻撃感染を投与し、そして次に標的動物の臨床症状、血清パラメータを検討すること
によって、または病原体の再分離を評価する。
本発明の組換えKHVまたは組換えKHV DNAに基づく本発明のワクチンに対して
、何が、「医薬的有効量」を構成するかは、所望の効果および標的生物に依存する。有効
量の決定は、専門家の通常の技術で十分可能である。本発明の医薬組成物中に含まれる、
本発明の組換えKHV DNAの好ましい量については、上述した。
、何が、「医薬的有効量」を構成するかは、所望の効果および標的生物に依存する。有効
量の決定は、専門家の通常の技術で十分可能である。本発明の医薬組成物中に含まれる、
本発明の組換えKHV DNAの好ましい量については、上述した。
本発明の組換えKHVウイルス株を含む生ワクチンの好ましい量は、例えばプラーク形
成単位(pfu)として表される。例えば生ウイルスベクターにとって、動物当たり1な
いし1010プラーク形成単位(pfu)内の用量範囲が有利に使用し得る;好ましくは
102ないし106pfu/用量である。
成単位(pfu)として表される。例えば生ウイルスベクターにとって、動物当たり1な
いし1010プラーク形成単位(pfu)内の用量範囲が有利に使用し得る;好ましくは
102ないし106pfu/用量である。
多数の投与方法が施用できて、すべてが当該技術分野で知られている。本発明のワクチ
ンは、好ましくは注射(筋肉内または腹腔内経由)、浸漬、薬浴または経口によって魚に
投与される。投与のためのプロトコールは、標準的ワクチン接種技法に従って最適化し得
る。
ンは、好ましくは注射(筋肉内または腹腔内経由)、浸漬、薬浴または経口によって魚に
投与される。投与のためのプロトコールは、標準的ワクチン接種技法に従って最適化し得
る。
もしワクチンが本発明の組換えKHVの非複製型を含むならば、用量は投与される非複
製型ウイルス粒子の数として表されるであろう。さらに生ウイルス粒子の投与と比較した
とき、該用量は通常いくぶん高めであるだろうが、それは、生ウイルス粒子は、免疫系に
よって除去される前に標的動物において一定範囲まで複製するからである。非複製型ウイ
ルス粒子に基づくワクチンにとって、約104ないし109粒子の範囲のウイルス粒子量
が通常は適しているであろう。
製型ウイルス粒子の数として表されるであろう。さらに生ウイルス粒子の投与と比較した
とき、該用量は通常いくぶん高めであるだろうが、それは、生ウイルス粒子は、免疫系に
よって除去される前に標的動物において一定範囲まで複製するからである。非複製型ウイ
ルス粒子に基づくワクチンにとって、約104ないし109粒子の範囲のウイルス粒子量
が通常は適しているであろう。
ワクチンは、特に本発明の生組換えKHVが使用されるとき、好ましくは浸漬によって
投与される。これは、このようなワクチンを商業的養殖業において使用する場合に特に効
果的である。
投与される。これは、このようなワクチンを商業的養殖業において使用する場合に特に効
果的である。
FL BAC切除ORF56 Del 1 galK(A)株およびFL BAC切除
ORF56 Del 2 galK(B)株を、実施例(安全性試験)に記載した通りマ
ゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL BAC切除株(
C)およびモック感染(D)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き
残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
ORF56単一欠損組換え体の安全性。
ORF56 Del 2 galK(B)株を、実施例(安全性試験)に記載した通りマ
ゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL BAC切除株(
C)およびモック感染(D)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き
残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56 Del 1 galK(A)株およびFL BAC切除
ORF56 Del 2 galK(B)株を、実施例(安全性試験)に記載した通りマ
ゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL BAC切除株(
C)およびモック感染(D)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き
残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
ORF56単一欠損組換え体の安全性。
ORF56 Del 2 galK(B)株を、実施例(安全性試験)に記載した通りマ
ゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL BAC切除株(
C)およびモック感染(D)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き
残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56 Del 1 galK(A)株およびFL BAC切除
ORF56 Del 2 galK(B)株を、実施例(安全性試験)に記載した通りマ
ゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL BAC切除株(
C)およびモック感染(D)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き
残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
ORF56単一欠損組換え体の安全性。
ORF56 Del 2 galK(B)株を、実施例(安全性試験)に記載した通りマ
ゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL BAC切除株(
C)およびモック感染(D)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き
残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56 Del 1 galK(A)株およびFL BAC切除
ORF56 Del 2 galK(B)株を、実施例(安全性試験)に記載した通りマ
ゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL BAC切除株(
C)およびモック感染(D)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き
残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重4.41g、n=30)に対し実施した。FL BAC切除株(A)およびモック感染(C)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
ORF56 Del 2 galK(B)株を、実施例(安全性試験)に記載した通りマ
ゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL BAC切除株(
C)およびモック感染(D)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。生き
残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重4.41g、n=30)に対し実施した。FL BAC切除株(A)およびモック感染(C)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重4.41g、n=30)に対し実施した。FL BAC切除株(A)およびモック感染(C)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重4.41g、n=30)に対し実施した。FL BAC切除株(A)およびモック感染(C)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重4.41g、n=30)に対し実施した。FL BAC切除株(A)およびモック感染(C)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重4.41g、n=30)に対し実施した。FL BAC切除株(A)およびモック感染(C)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC切除ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重4.41g、n=30)に対し実施した。FL BAC切除株(A)およびモック感染(C)は、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は、二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC切除ORF56‐57 Del
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=30)に対し試験した。FL BAC復帰変異株(A)およびモック感染(C)を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載
した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻撃感
染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残ったコイ
の割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 D
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=30)に対し試験した。FL BAC復帰変異株(A)およびモック感染(C)を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 D
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=30)に対し試験した。FL BAC復帰変異株(A)およびモック感染(C)を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 D
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=30)に対し試験した。FL BAC復帰変異株(A)およびモック感染(C)を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 D
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=30)に対し試験した。FL BAC復帰変異株(A)およびモック感染(C)を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 D
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=30)に対し試験した。FL BAC復帰変異株(A)およびモック感染(C)を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 D
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株の安全性(A〜C)およびワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 Del株(B)の安全性を、実施例(安全性試験)に記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=30)に対し試験した。FL BAC復帰変異株(A)およびモック感染(C)を、それぞれ正の対照および負の対照として使用した。モック感染は二重の群に対し実施した。生き残ったコイの割合は、第0日を基準として感染後の日数に従って表す。
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
ワクチン接種/攻撃感染(D〜G)試験。FL BAC復帰変異ORF56‐57 D
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
el株によりワクチン接種した魚(n=15)を、実施例(ワクチン接種/攻撃感染)に
記載した通りワクチン接種後第3週(D)または第6週(F)にKHV FL株により攻
撃感染した。モック感染魚の二重の群を対照(EおよびG)として使用した。生き残った
コイの割合を、攻撃感染の日を基準として感染後の日数に従って表す。
[実施例]
a)細胞およびウイルス
コイ(Cyprinus carpio)脳細胞(CCB)(Neukirch ら、
1999)を、グルコース(D‐グルコース一水和、Merck)4.5g/lおよび1
0%ウシ胎児血清を含有する最小必須培地(MEM、Invitrogen)で培養した
。細胞は5%CO2を含有する多湿雰囲気中25℃で培養した。CyHV‐3 FL株は
、KHVで死亡した魚の腎臓から単離された(CER Marloie、Belgium
)。
a)細胞およびウイルス
コイ(Cyprinus carpio)脳細胞(CCB)(Neukirch ら、
1999)を、グルコース(D‐グルコース一水和、Merck)4.5g/lおよび1
0%ウシ胎児血清を含有する最小必須培地(MEM、Invitrogen)で培養した
。細胞は5%CO2を含有する多湿雰囲気中25℃で培養した。CyHV‐3 FL株は
、KHVで死亡した魚の腎臓から単離された(CER Marloie、Belgium
)。
b)CyHV‐3 BACプラスミド
CyHV‐3組換え体を作製するために親プラスミドとしてCyHV‐3 FL BA
Cプラスミドを使用した。このプラスミドは、Costesら(2008)および国際特
許出願WO 2009/027412において広範に記載されている。CyHV‐3 F
L BACプラスミドは、CyHV‐3 FL株ゲノムの感染性細菌人工染色体(BAC
)クローンである。このプラスミドにおいて、loxP‐隣接BACカセットがCyHV
‐3 TK遺伝子座(ORF55)に挿入される。
CyHV‐3組換え体を作製するために親プラスミドとしてCyHV‐3 FL BA
Cプラスミドを使用した。このプラスミドは、Costesら(2008)および国際特
許出願WO 2009/027412において広範に記載されている。CyHV‐3 F
L BACプラスミドは、CyHV‐3 FL株ゲノムの感染性細菌人工染色体(BAC
)クローンである。このプラスミドにおいて、loxP‐隣接BACカセットがCyHV
‐3 TK遺伝子座(ORF55)に挿入される。
c)細菌におけるgalKポジティブ選択を使用するORF57 CyHV‐3 FL
BAC組換えプラスミドの作製
ORF57遺伝子座(図1のORF57 Del 1およびORF57 Del 2を
参照されたい)に欠失を有する二つのCyHV‐3 FL BAC組換えプラスミドを、
以前に記載された通り(Warmingら、2005)細菌においてgalKポジティブ
選択を使用して作製した(図2)。組換え断片は、欠失される配列に隣接するCyHV‐
3ゲノム領域と相同な50bpの隣接配列を有するガラクトキナーゼ(galK)遺伝子
(1231bp)から構成されていた(図1)。
BAC組換えプラスミドの作製
ORF57遺伝子座(図1のORF57 Del 1およびORF57 Del 2を
参照されたい)に欠失を有する二つのCyHV‐3 FL BAC組換えプラスミドを、
以前に記載された通り(Warmingら、2005)細菌においてgalKポジティブ
選択を使用して作製した(図2)。組換え断片は、欠失される配列に隣接するCyHV‐
3ゲノム領域と相同な50bpの隣接配列を有するガラクトキナーゼ(galK)遺伝子
(1231bp)から構成されていた(図1)。
これらの断片は、pgalKベクターを鋳型として使用してPCRによって作製した。
増幅のために次のプライマーを使用した(プライマー配列に対しては表1を参照されたい
):ORF57 Del 1欠損の作製用:ORF57 Del 1‐galKアンプリ
コンをもたらす、プライマーORF57 Del1 fwおよびORF57 Del1
rev;ORF57 Del 2欠損の作製用:ORF57 Del 2‐galKアン
プリコンをもたらすプライマーORF57 Del2 fwおよびORF57 Del2
rev。増幅産物は精製した(QIAquick Gel Extraction K
it)。次にCyHV‐3 FL BACプラスミドを含有するエレクトロコンピテント
SW102セルを上記PCR産物50ngにより電気穿孔した。相同組換えが起きた細菌
を選択するために、電気穿孔した細胞を20%ガラクトースおよびクロラムフェニコール
(17μg/ml)を添加した固形M63最小培地に播種した。最後に、得られたコロニ
ーを、galK陽性クローンの作製を確認するために他に記載した通りマッコンキー指標
寒天培地に画線した。組換えBAC分子は、増幅し精製し(QIAGEN Large‐
Construct Kit)、その分子構造は制限酵素‐サザンブロットの複合法、P
CRおよび配列決定を使用して管理した。
増幅のために次のプライマーを使用した(プライマー配列に対しては表1を参照されたい
):ORF57 Del 1欠損の作製用:ORF57 Del 1‐galKアンプリ
コンをもたらす、プライマーORF57 Del1 fwおよびORF57 Del1
rev;ORF57 Del 2欠損の作製用:ORF57 Del 2‐galKアン
プリコンをもたらすプライマーORF57 Del2 fwおよびORF57 Del2
rev。増幅産物は精製した(QIAquick Gel Extraction K
it)。次にCyHV‐3 FL BACプラスミドを含有するエレクトロコンピテント
SW102セルを上記PCR産物50ngにより電気穿孔した。相同組換えが起きた細菌
を選択するために、電気穿孔した細胞を20%ガラクトースおよびクロラムフェニコール
(17μg/ml)を添加した固形M63最小培地に播種した。最後に、得られたコロニ
ーを、galK陽性クローンの作製を確認するために他に記載した通りマッコンキー指標
寒天培地に画線した。組換えBAC分子は、増幅し精製し(QIAGEN Large‐
Construct Kit)、その分子構造は制限酵素‐サザンブロットの複合法、P
CRおよび配列決定を使用して管理した。
d)ORF 57 CyHV‐3 FL BAC組換えプラスミドからの感染性ウイルス
の再構成
CyHV‐3 BACプラスミドを許容CCBに遺伝子導入した(Lipofecta
mine Plus、Invitrogen)。野生型TK遺伝子座を有する菌株に由来
するBACプラスミドを作製するために、CyHV‐3 BACプラスミドをpGEMT
‐TKベクターと共にCCB細胞に同時遺伝子導入した(分子比1:75)。遺伝子導入
後第7日に、EGFP発現(BACカセットはEGFP発現カセットをコードする)陰性
のウイルスプラークを釣菌し、3回連続のプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウイ
ルスゲノムからBACカセットを切除したビリオンを再構成するために、BACプラスミ
ドを、核局在シグナルに融合したCreリコンビナーゼをコードするpEFIN3‐NL
S‐Creベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(Costesら;200
8 JVI)(分子比:1:70)。
の再構成
CyHV‐3 BACプラスミドを許容CCBに遺伝子導入した(Lipofecta
mine Plus、Invitrogen)。野生型TK遺伝子座を有する菌株に由来
するBACプラスミドを作製するために、CyHV‐3 BACプラスミドをpGEMT
‐TKベクターと共にCCB細胞に同時遺伝子導入した(分子比1:75)。遺伝子導入
後第7日に、EGFP発現(BACカセットはEGFP発現カセットをコードする)陰性
のウイルスプラークを釣菌し、3回連続のプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウイ
ルスゲノムからBACカセットを切除したビリオンを再構成するために、BACプラスミ
ドを、核局在シグナルに融合したCreリコンビナーゼをコードするpEFIN3‐NL
S‐Creベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(Costesら;200
8 JVI)(分子比:1:70)。
e)細菌におけるgalKポジティブ選択を使用するORF 56 CyHV‐3 FL
BAC組換えプラスミドの作製
以前に記載された通り(Warmingら、2005)(図3)、細菌におけるgal
Kポジティブ選択を使用して、ORF56遺伝子座に欠失を有する二つのCyHV‐3
FL BAC組換えプラスミド(図1のORF56 Del 1およびORF56Del
2を参照されたい)を作製した。組換え断片は、欠失される配列に隣接するCyHV‐
3領域に相同な50bpの隣接配列を有するガラクトキナーゼ(galK)遺伝子(12
31bp)から構成されていた(図1)。これらの断片は、pgalKベクターを鋳型と
して使用するPCRによって作製した。増幅のために次のプライマーを使用した(プライ
マー配列に対しては表2を参照されたい):ORF56Del 1欠損の作製用:ORF
56 De1 1‐galKアンプリコンをもたらすプライマーORF56 Del1
fwおよびORF56 Del1 rev;ORF56Del 2欠損の作製用:ORF
56 Del 2‐galKアンプリコンをもたらすプライマーORF56 Del2
fwおよびORF56 Del2 rev。増幅産物は精製した(QIAquick
Gel Extraction Kit)。次にCyHV‐3 FL BACプラスミド
を含有するエレクトロコンピテントSW102セルを、上記PCR産物50ngにより電
気穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔した細胞を20%ガラ
クトースおよびクロラムフェニコール(17μg/ml)を添加した固形M63最小培地
に播種した。最後に、得られたコロニーを、galK陽性クローンの作製を確認するため
に他に記載した通りマッコンキー指標寒天培地に画線した。組換えBAC分子は増幅し精
製して(QIAGEN Large‐Construct Kit)、その分子構造は制
限酵素‐サザンブロットの複合法、PCRおよび配列決定を使用して管理した。
BAC組換えプラスミドの作製
以前に記載された通り(Warmingら、2005)(図3)、細菌におけるgal
Kポジティブ選択を使用して、ORF56遺伝子座に欠失を有する二つのCyHV‐3
FL BAC組換えプラスミド(図1のORF56 Del 1およびORF56Del
2を参照されたい)を作製した。組換え断片は、欠失される配列に隣接するCyHV‐
3領域に相同な50bpの隣接配列を有するガラクトキナーゼ(galK)遺伝子(12
31bp)から構成されていた(図1)。これらの断片は、pgalKベクターを鋳型と
して使用するPCRによって作製した。増幅のために次のプライマーを使用した(プライ
マー配列に対しては表2を参照されたい):ORF56Del 1欠損の作製用:ORF
56 De1 1‐galKアンプリコンをもたらすプライマーORF56 Del1
fwおよびORF56 Del1 rev;ORF56Del 2欠損の作製用:ORF
56 Del 2‐galKアンプリコンをもたらすプライマーORF56 Del2
fwおよびORF56 Del2 rev。増幅産物は精製した(QIAquick
Gel Extraction Kit)。次にCyHV‐3 FL BACプラスミド
を含有するエレクトロコンピテントSW102セルを、上記PCR産物50ngにより電
気穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔した細胞を20%ガラ
クトースおよびクロラムフェニコール(17μg/ml)を添加した固形M63最小培地
に播種した。最後に、得られたコロニーを、galK陽性クローンの作製を確認するため
に他に記載した通りマッコンキー指標寒天培地に画線した。組換えBAC分子は増幅し精
製して(QIAGEN Large‐Construct Kit)、その分子構造は制
限酵素‐サザンブロットの複合法、PCRおよび配列決定を使用して管理した。
f)ORF 56 CyHV‐3 FL BAC組換えプラスミドからの感染性ウイルス
の再構成
CyHV‐3 BACプラスミドを許容CCBに遺伝子導入した(Lipofecta
mine Plus、Invitrogen)。野生型TK遺伝子座を有する菌株由来の
BACプラスミド作成するために、CyHV‐3 BACプラスミドをpGEMT‐TK
ベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(分子比1:75)。遺伝子導入後第
7日に、EGFP発現(BACカセットはEGFP発現カセットをコードする)陰性のウ
イルスプラークを釣菌し、3回連続するプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウイル
スゲノムからBACカセットを切除したビリオンを再構成するために、BACプラスミド
を核局在シグナルに融合したCreリコンビナーゼをコードするpEFIN3‐NLS‐
Creベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(Costesら;2008
JVI)(分子比:1:70)。
の再構成
CyHV‐3 BACプラスミドを許容CCBに遺伝子導入した(Lipofecta
mine Plus、Invitrogen)。野生型TK遺伝子座を有する菌株由来の
BACプラスミド作成するために、CyHV‐3 BACプラスミドをpGEMT‐TK
ベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(分子比1:75)。遺伝子導入後第
7日に、EGFP発現(BACカセットはEGFP発現カセットをコードする)陰性のウ
イルスプラークを釣菌し、3回連続するプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウイル
スゲノムからBACカセットを切除したビリオンを再構成するために、BACプラスミド
を核局在シグナルに融合したCreリコンビナーゼをコードするpEFIN3‐NLS‐
Creベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(Costesら;2008
JVI)(分子比:1:70)。
g)細菌におけるgalKポジティブおよびネガティブ選択を使用するORF56‐57
CyHV‐3 FL BAC組換えプラスミドの作製
ORF56およびORF57遺伝子座に欠失を有するCyHV‐3 FL BAC組換
えプラスミドは(図1)、以前に記載された通り(Warmingら、2005)(図4
)細菌におけるgalKポジティブおよびネガティブ選択を使用して作製した。第一の組
換え過程(galKポジティブ選択)は、ORF56およびORF57の特定された配列
をガラクトキナーゼ(galK)遺伝子(1231bp)によって置換することであった
。組換え断片は、欠失される配列に隣接するCyHV‐3ゲノム領域に相同な50bpの
隣接配列を有するgalK遺伝子から構成されていた(図1)(ORF56‐57 De
l galK、図4)。この断片は、プライマーORF56‐ORF57 Del fw
およびORF56‐ORF57 Del rev(表3)および鋳型としてpgalKベ
クターを使用してPCRによって作製した。増幅産物は精製した(QIAquick G
el Extraction Kit)。次にCyHV‐3 FL BACプラスミドを
含有するエレクトロコンピテントSW102セルを、上記PCR産物50ngにより電気
穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔した細胞を20%ガラク
トースおよびクロラムフェニコール(17μg/ml)を添加した固形M63最小培地に
播種した。最後に、得られたコロニーを、galK陽性クローンの作製を確認するために
、他に記載した通りマッコンキー指標寒天培地に画線した。組換えBAC分子は増幅し精
製して(QIAGEN Large‐Construct Kit)、その分子構造は制
限酵素‐サザンブロットの複合法、PCRおよび配列決定を使用して管理した。第二の組
換え過程(galKネガティブ選択)は、FL BAC ORF56‐57 Del g
alKプラスミドからgalKカセットを除去することであった。この目的を達成するた
めに、499bpの合成DNA断片(ORF56‐57 Del カセット、下記を参照
されたい)を使用した。それは、欠失される配列に隣接するCyHV‐3ゲノム領域に相
同な配列:galK遺伝子の上流の250bp(Genbank受付番号NC_0091
27の座標96751位から9700位)およびgalK遺伝子の下流の249bp(G
enbank受付番号NC_009127の99760位の塩基が欠失した座標9975
1位から1000000位)から構成される。FL BAC ORF56‐57 Del
galKプラスミドを含有するエレクトロコンピテントSW102セルを上記PCR産
物50ngにより電気穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔し
た細胞を2‐デオキシガラクトースを添加した固形最小培地に播種した(galKによる
2‐デオキシガラクトースの消化により毒性物質が生じる)。組換えBAC分子は増幅し
精製して(QIAGEN Large‐Construct Kit)、その分子構造は
制限酵素‐サザンブロットの複合法、PCRおよび配列決定を使用して管理した。
CyHV‐3 FL BAC組換えプラスミドの作製
ORF56およびORF57遺伝子座に欠失を有するCyHV‐3 FL BAC組換
えプラスミドは(図1)、以前に記載された通り(Warmingら、2005)(図4
)細菌におけるgalKポジティブおよびネガティブ選択を使用して作製した。第一の組
換え過程(galKポジティブ選択)は、ORF56およびORF57の特定された配列
をガラクトキナーゼ(galK)遺伝子(1231bp)によって置換することであった
。組換え断片は、欠失される配列に隣接するCyHV‐3ゲノム領域に相同な50bpの
隣接配列を有するgalK遺伝子から構成されていた(図1)(ORF56‐57 De
l galK、図4)。この断片は、プライマーORF56‐ORF57 Del fw
およびORF56‐ORF57 Del rev(表3)および鋳型としてpgalKベ
クターを使用してPCRによって作製した。増幅産物は精製した(QIAquick G
el Extraction Kit)。次にCyHV‐3 FL BACプラスミドを
含有するエレクトロコンピテントSW102セルを、上記PCR産物50ngにより電気
穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔した細胞を20%ガラク
トースおよびクロラムフェニコール(17μg/ml)を添加した固形M63最小培地に
播種した。最後に、得られたコロニーを、galK陽性クローンの作製を確認するために
、他に記載した通りマッコンキー指標寒天培地に画線した。組換えBAC分子は増幅し精
製して(QIAGEN Large‐Construct Kit)、その分子構造は制
限酵素‐サザンブロットの複合法、PCRおよび配列決定を使用して管理した。第二の組
換え過程(galKネガティブ選択)は、FL BAC ORF56‐57 Del g
alKプラスミドからgalKカセットを除去することであった。この目的を達成するた
めに、499bpの合成DNA断片(ORF56‐57 Del カセット、下記を参照
されたい)を使用した。それは、欠失される配列に隣接するCyHV‐3ゲノム領域に相
同な配列:galK遺伝子の上流の250bp(Genbank受付番号NC_0091
27の座標96751位から9700位)およびgalK遺伝子の下流の249bp(G
enbank受付番号NC_009127の99760位の塩基が欠失した座標9975
1位から1000000位)から構成される。FL BAC ORF56‐57 Del
galKプラスミドを含有するエレクトロコンピテントSW102セルを上記PCR産
物50ngにより電気穿孔した。相同組換えが起きた細菌を選択するために、電気穿孔し
た細胞を2‐デオキシガラクトースを添加した固形最小培地に播種した(galKによる
2‐デオキシガラクトースの消化により毒性物質が生じる)。組換えBAC分子は増幅し
精製して(QIAGEN Large‐Construct Kit)、その分子構造は
制限酵素‐サザンブロットの複合法、PCRおよび配列決定を使用して管理した。
ORF56‐57 Delカセット:
5‘‐
tttgtcaaccagtcctccagggtcggtttggcgctggcct
ccttgcccttggtcacggcgatggcagacgccacaatcct
cgcgacgggttccgtcagagcagagttcttaaacatttcg
acgcctcctccgacggtgaaccactctgaccaattcaggt
cggagggccacgtctgcctgtgcatcatcgtctgcacagc
gtccctcgacagccccagcccgcacagcagtcgccactct
tccctgttgagtgcacgactcgtcaagatcaagctgcttg
agcgcgtcgtgtacgggttcatgatggccctgcagaaggc
gctgcgcattcagaagcagggctgcaggatggtggggctc
gaggacccggagaaggtggaggatatgaagaactttgtgc
tgcacaagggcttcaaccaccactacgccttctgcgatca
ccactggcagcactgggccctgggccgctccttcgagggc
gagctgcccgacgtggtgg‐3‘
5‘‐
tttgtcaaccagtcctccagggtcggtttggcgctggcct
ccttgcccttggtcacggcgatggcagacgccacaatcct
cgcgacgggttccgtcagagcagagttcttaaacatttcg
acgcctcctccgacggtgaaccactctgaccaattcaggt
cggagggccacgtctgcctgtgcatcatcgtctgcacagc
gtccctcgacagccccagcccgcacagcagtcgccactct
tccctgttgagtgcacgactcgtcaagatcaagctgcttg
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gctgcgcattcagaagcagggctgcaggatggtggggctc
gaggacccggagaaggtggaggatatgaagaactttgtgc
tgcacaagggcttcaaccaccactacgccttctgcgatca
ccactggcagcactgggccctgggccgctccttcgagggc
gagctgcccgacgtggtgg‐3‘
h)ORF56‐57 CyHV‐3 FL BAC組換えプラスミドからの感染性ウイ
ルスの再構成
CyHV‐3 BACプラスミドを許容CCBに遺伝子導入した(Lipofecta
mine Plus、Invitrogen)。野生型TK遺伝子座を有する菌株に由来
するBACプラスミドを作製するために、CyHV‐3 BACプラスミドをpGEMT
‐TKベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(分子比1:75)。遺伝子導
入後第7日に、EGFP発現(BACカセットはEGFP発現カセットをコードする)陰
性のウイルスプラークを釣菌し、3回連続のプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウ
イルスゲノムからBACカセットを切除したビリオンを再構成するために、BACプラス
ミドを核局在シグナルと融合したCreリコンビナーゼをコードするpEFIN3‐NL
S‐Creベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(Costesら;200
8 JVI)(分子比:1:70)。
ルスの再構成
CyHV‐3 BACプラスミドを許容CCBに遺伝子導入した(Lipofecta
mine Plus、Invitrogen)。野生型TK遺伝子座を有する菌株に由来
するBACプラスミドを作製するために、CyHV‐3 BACプラスミドをpGEMT
‐TKベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(分子比1:75)。遺伝子導
入後第7日に、EGFP発現(BACカセットはEGFP発現カセットをコードする)陰
性のウイルスプラークを釣菌し、3回連続のプラーク精製によって濃縮した。同様に、ウ
イルスゲノムからBACカセットを切除したビリオンを再構成するために、BACプラス
ミドを核局在シグナルと融合したCreリコンビナーゼをコードするpEFIN3‐NL
S‐Creベクターと一緒にCCB細胞に同時遺伝子導入した(Costesら;200
8 JVI)(分子比:1:70)。
i)安全性試験
マゴイを、60リットルの水槽中、24℃で10日間順化させた。コイ(リットル当た
りコイ50gの生物体量)を、試験するKHV株の4、40または400PFU/mlを
含有する水に2時間浸漬した。対照群(モック感染)は、等量の培地を添加した水に浸漬
した。インキュベーション期間の終わりに、魚を大きな水槽に戻した。ウイルス接種菌液
は、投与量が群間で同等であることを保証するために、接種前に滴定し接種後に逆滴定し
た。KHV疾患の臨床症状について、魚を毎日検査し死亡した魚は除去した。
マゴイを、60リットルの水槽中、24℃で10日間順化させた。コイ(リットル当た
りコイ50gの生物体量)を、試験するKHV株の4、40または400PFU/mlを
含有する水に2時間浸漬した。対照群(モック感染)は、等量の培地を添加した水に浸漬
した。インキュベーション期間の終わりに、魚を大きな水槽に戻した。ウイルス接種菌液
は、投与量が群間で同等であることを保証するために、接種前に滴定し接種後に逆滴定し
た。KHV疾患の臨床症状について、魚を毎日検査し死亡した魚は除去した。
j)ワクチン接種/攻撃感染
マゴイを、60リットルの水槽中、24℃で10日間順化させた。ワクチン接種のため
にコイ(リットル当たり魚50gの生物体量)を、試験するKHV株の4、40または4
00PFU/mlを含有する水に2時間浸漬した。インキュベーション期間の終わりに、
魚を大きな水槽に戻した。ワクチン接種後の第3週または第6週に、ワクチン接種した魚
の入った水槽に放流する直前に感染させた無感作の魚と共棲させることによって、これら
の魚を病原性KHVにより攻撃感染した。追加された魚は、病原性の親FL株の300P
FU/mlを含有する水中に2時間浸漬して接種された。二匹の感染魚を、ワクチン接種
した魚を含有する各水槽に添加した。
マゴイを、60リットルの水槽中、24℃で10日間順化させた。ワクチン接種のため
にコイ(リットル当たり魚50gの生物体量)を、試験するKHV株の4、40または4
00PFU/mlを含有する水に2時間浸漬した。インキュベーション期間の終わりに、
魚を大きな水槽に戻した。ワクチン接種後の第3週または第6週に、ワクチン接種した魚
の入った水槽に放流する直前に感染させた無感作の魚と共棲させることによって、これら
の魚を病原性KHVにより攻撃感染した。追加された魚は、病原性の親FL株の300P
FU/mlを含有する水中に2時間浸漬して接種された。二匹の感染魚を、ワクチン接種
した魚を含有する各水槽に添加した。
k)安全性および攻撃感染の結果
FL BAC切除ORF57 Del 1 galK(図5A)およびFL BAC切
除ORF57 Del 2 galK(図5B)株の安全性を、実施例(安全性試験)に
記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL
BAC切除株(図5C)およびモック感染(図5D)は、それぞれ正の対照および負の対
照として使用した。生き残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って
表す。ORF57単一欠損組換え体(図5EおよびF)による感染後第6週に、魚を実施
例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載した通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照
(図5G)として使用した。生き残ったコイの割合は、第42日を基準として感染後の日
数に従って表した。
FL BAC切除ORF57 Del 1 galK(図5A)およびFL BAC切
除ORF57 Del 2 galK(図5B)株の安全性を、実施例(安全性試験)に
記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL
BAC切除株(図5C)およびモック感染(図5D)は、それぞれ正の対照および負の対
照として使用した。生き残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って
表す。ORF57単一欠損組換え体(図5EおよびF)による感染後第6週に、魚を実施
例(ワクチン接種/攻撃感染)に記載した通り攻撃感染した。モック感染した魚は、対照
(図5G)として使用した。生き残ったコイの割合は、第42日を基準として感染後の日
数に従って表した。
図5AおよびBから本発明のORF57欠損変異株は、小さい魚に使用されたときでさ
え安全であることが明らかである。
え安全であることが明らかである。
また図5EおよびFから、本発明のKHV ORF57欠損変異株は、特に40pfu
/ml以上の用量で投与されたときに、効果的なワクチンとして非常に適していることも
明らかとなる。
/ml以上の用量で投与されたときに、効果的なワクチンとして非常に適していることも
明らかとなる。
FL BAC切除ORF56 Del 1 galK(図6A)およびFL BAC切
除ORF56 Del 2 galK(図6B)株の安全性を、実施例(安全性試験)に
記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL
BAC切除株(図6C)およびモック感染(図6D)を、それぞれ正の対照および負の対
照として使用した。生き残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って
表す。図6AおよびBから明らかな通り、ORF56欠損変異株は、対照の野生型ウイル
スにほぼ匹敵する病原性を示す(パネルAおよびBをパネルCと比較されたい)。
除ORF56 Del 2 galK(図6B)株の安全性を、実施例(安全性試験)に
記載した通りマゴイ(7月齢、平均体重3.74g、n=20)に対し試験した。FL
BAC切除株(図6C)およびモック感染(図6D)を、それぞれ正の対照および負の対
照として使用した。生き残ったコイの割合を、第0日を基準として感染後の日数に従って
表す。図6AおよびBから明らかな通り、ORF56欠損変異株は、対照の野生型ウイル
スにほぼ匹敵する病原性を示す(パネルAおよびBをパネルCと比較されたい)。
図7および8から分かる通り、ORF57およびORF56の双方に欠失を保有するK
HVは、単一のORF57欠失を保有するKHVのそれと匹敵する安全性および効力特性
を示す。
HVは、単一のORF57欠失を保有するKHVのそれと匹敵する安全性および効力特性
を示す。
Claims (15)
- オープンリーディングフレーム57(ORF57)が欠損していることにより、弱毒化
しているKHVをもたらす、組換えコイヘルペスウイルス(KHV)。 - 病原性に寄与するが複製にとって必須ではない少なくとも一つの追加の遺伝子が欠損し
ていることを特徴とする、請求項1の組換えコイヘルペスウイルス。 - 前記の少なくとも一つの追加の遺伝子がチミジンキナーゼ遺伝子、ORF12:推定腫
瘍壊死因子(TNF)受容体遺伝子、ORF16:推定Gタンパク質共役受容体(GPC
R)遺伝子、ORF134:推定インターロイキン10ホモログ遺伝子およびORF14
0:推定チミジル酸キナーゼ遺伝子から成る群より選択されることを特徴とする、請求項
2の組換えコイヘルペスウイルス。 - 前記のヘルペスウイルスが生の形態であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか
一項の組換えコイヘルペスウイルス。 - 前記のヘルペスウイルスが非複製型であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか
一項の組換えコイヘルペスウイルス。 - BAC(細菌人工染色体)ベクター配列を含む、請求項1〜5のいずれか一項の組換え
コイヘルペスウイルス。 - 該BACベクター配列がヘルペスウイルスから切除され、それによってヘルペスウイル
スゲノム内の切除部位または前挿入部位にそれぞれ異種DNA断片がとり残されているこ
とを特徴とする、請求項6の組換えコイヘルペスウイルス。 - 異種DNA断片をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項の組換え
コイヘルペスウイルス。 - 該異種遺伝子がコイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスの糖タンパク質Gをコ
ードする遺伝子であることを特徴とする、請求項8の組換えコイヘルペスウイルス。 - 異種DNA断片用ベクターとしての使用のための、請求項1〜9のいずれか一項の組換
えコイヘルペスウイルス。 - 請求項1〜10のいずれか一項の組換えコイヘルペスウイルスを含む細胞。
- 組換えコイヘルペスウイルス(KHV)の感染性粒子の作製方法であって、ここで
(a)請求項1〜9のいずれか一項の組換えKHVまたは請求項1〜9のいずれか一項の
組換えコイヘルペスウイルスのゲノムを含む組換えKHV DNAを許容真核細胞に導入
する段階;および
(b)組換えコイヘルペスウイルス(KHV)を作製するために前記細胞を培養する段階
を含む前記方法。 - コイヘルペスウイルス(KHV)によって引き起こされる魚の疾患の予防処置および/
または治療処置用のワクチンにおける使用のための、請求項1〜9のいずれか一項の組換
えコイヘルペスウイルスおよび/または請求項1〜9のいずれか一項の組換えコイヘルペ
スウイルスのゲノムを含む組換えKHV DNA。 - コイヘルペスウイルス(KHV)によって引き起こされる魚の疾患の予防処置および/
または治療処置用のワクチンであって、請求項1〜9のいずれか一項の組換えコイヘルペ
スウイルスおよび/または請求項1〜9のいずれか一項の組換えコイヘルペスウイルスの
ゲノムを含む組換えKHV DNA、および薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴と
する前記ワクチン。 - コイ春ウイルス血症を引き起こすラブドウイルスによって引き起こされる魚の疾患の予
防処置および/または治療処置用のワクチンであって、請求項9の組換えコイヘルペスウ
イルスおよび/または請求項9の組換えコイヘルペスウイルスのゲノムを含む組換えKH
V DNA、および薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする前記ワクチン。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110101854A (zh) * | 2019-05-14 | 2019-08-09 | 四川农业大学 | 一种鲤疱疹病毒ⅲ型疫苗及其制备方法 |
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2662768C2 (ru) * | 2011-12-30 | 2018-07-31 | Гесвал с.а. | Рекомбинантный герпесвирус кои (khv) и вакцина для профилактики заболевания, вызываемого khv |
US11174468B2 (en) * | 2016-04-08 | 2021-11-16 | William Marsh Rice University | Galactose utilization |
RU2736472C2 (ru) * | 2016-11-18 | 2020-11-17 | Общество с ограниченной ответственностью "ЭКСИФАРМ" | Химерный белок, синтетическая днк, кодирующая указанный белок, экспрессионный вектор, штамм-продуцент синтетической днк и способ получения плазмидной днк |
CN112279897B (zh) * | 2018-11-05 | 2021-12-28 | 深圳技术大学 | 一种预防或治疗鱼类感染CyHV-2的试剂及应用 |
EP3662929A1 (en) * | 2018-12-07 | 2020-06-10 | IDT Biologika GmbH | A recombinant koi herpesvirus (khv) and a diva vaccine for preventing and/or treating a disease caused by khv |
CN110468111B (zh) * | 2019-08-07 | 2022-06-17 | 西北农林科技大学 | 一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用 |
CN110452926B (zh) * | 2019-08-07 | 2022-06-17 | 西北农林科技大学 | 一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用 |
CN113679832A (zh) * | 2021-05-24 | 2021-11-23 | 苏州大学 | 一种利用冷冻干燥制备杆状病毒载鲤疱疹病毒ii型dna疫苗的方法 |
CN115960903B (zh) * | 2022-12-23 | 2023-09-08 | 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 | 一种抑制CyHV-2病毒增殖的反义RNA组、重组载体和纳米粒递送系统及应用 |
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