TWI484034B

TWI484034B - 重組錦鯉疱疹病毒（ｋｈｖ）及預防ｋｈｖ所引起疾病之疫苗

Info

Publication number: TWI484034B
Application number: TW101150791A
Authority: TW
Inventors: Alain Francis Claude Vanderplasschen
Original assignee: Univ Liege
Priority date: 2011-12-30
Filing date: 2012-12-28
Publication date: 2015-05-11
Also published as: CN104159609A; JP5982009B2; TW201333201A; MX361408B; JP2015503914A; IN2014CN04655A; US20170028057A1; RU2014131474A; UA119786C2; EP2797627B1; IL232902A0; MD4481B1; US20140348875A1; EP2797627A1; JP2018078903A; JP2016195593A; RS61261B1; PH12014501388A1; HUE053075T2; UA114719C2

Description

重組錦鯉疱疹病毒(KHV)及預防KHV所引起疾病之疫苗

本發明係關於重組錦鯉皰疹病毒(KHV)、產生該KHV之方法、包含該KHV之細胞以及該KHV作為載體及在用於預防及/或治療性處理由鯉魚(例如西鯉(Cyprinus carpio carpio )或錦鯉(Cyprinus carpio koi ))中之錦鯉皰疹病毒所引起魚疾病之疫苗中之用途。

鯉魚(西鯉)係主要在亞洲、歐洲及中東最廣泛養殖之供人類食用之魚。相比之下，錦鯉(Cyprinus carpio koi )亞種係尤其在日本乃至全世界作為用於個人樂趣或競爭性展覽之寵物魚來養殖。在鯉魚及錦鯉二者中引起致命性疾病(最初稱為錦鯉皰疹病毒疾病(KHVD))之病毒係於1996年在英國檢測到。然後，該病毒很快被確定為以色列、美國及德國之錦鯉及鯉魚大量死亡之病因。鯉魚之密集養殖、錦鯉展覽及國際貿易促進此高傳染性高毒性疾病在全球迅速蔓延。KHVD之出現已在世界錦鯉及鯉魚養殖業中造成了嚴重的財政及經濟損失。

該病毒之最初表徵展示具有套膜及由被膜狀結構包圍之100-110 nm之二十面體電子緻密核心之皰疹狀結構。該病毒之基因組包含約295 kb之線性雙鏈DNA(dsDNA)，其與鯉科皰疹病毒1(CyHV-1)類似，但大於皰疹病毒科成員之彼等大小通常在125 kb至240 kb範圍內者。最近，已公開KHV基因組之序列(Aoki等人，J Virol,81，第5058-5065頁 (2007))。KHV基因組含有大量與任何其他已知之病毒序列不同源之DNA序列。此外，其亦含有編碼多肽之高度相異之DNA序列，其與若干種dsDNA病毒(如皰疹病毒、痘病毒、利虹病毒及其他大型DNA病毒)之彼等DNA序列類似。

此病毒之獨特特徵已使其獲得三種不同名稱：第一，根據其形態表現命名為錦鯉皰疹病毒(KHV)；第二，根據其在魚中之致病效應命名為鯉魚間質性腎炎及鰓壞死病毒(CNGV)；且最後，根據與CyHV-1及與CyHV-2之基因內容相似度命名為鯉科皰疹病毒3(CyHV-3)。最近對全長病毒基因組之測序進一步支持後一名稱。然而，下文將使用名稱KHV。

KHV具有大約295 kb之基因組，其代表迄今為止在皰疹病毒目成員中鑑別之最大基因組。儘管KHV之首次分離可追溯至1996年，但關於個別基因在KHV致病機制中及在感染自然宿主之生物學中之作用僅獲得極少資訊。

減毒KHV及其作為疫苗候選株之潛在用途已闡述於國際專利申請案WO 2004/061093 A1中。然而，此疫苗候選株隱藏潛在危險。減毒係病毒在活體外複製期間發生之隨機突變之結果。因此，減毒之特徵未知，且其可能逆轉為完全致病表現型。

對KHV之應用及基礎研究需要產生重組病毒。最近，藉助使用細菌人工染色體(BAC)載體使大型皰疹病毒基因組之操作變得可行(Messerle等人，Proc Natl Acad Sci U S A, 94,14759-14763(1997)；Wagner等人，Trends Microbiol,10,318-324(2002)且見下文)。該等載體容許在大腸桿菌(Escherichia coli，E.coli)中維持病毒基因組及對其進行有效誘變，隨後藉由將BAC質粒轉染至允許性真核細胞中來重構子代病毒粒子。迄今為止，已成功繁殖若干種皰疹病毒之基因組作為感染性BAC純系，包括人類細胞巨大病毒(HCMV)，其代表迄今為止作為BAC選殖之第二大皰疹病毒基因組(230 Kb)(Borst等人，J Virol,73,8320-8329(1999))。

最近，已使用BAC技術首次構築若干種重組KHV；該等重組體皆闡述於PCT專利申請案WO2009/027412中。此專利申請案揭示製備在選自由以下組成之群之基因中之一或多者中缺陷之重組KHV病毒之方法：ORF55：胸苷激酶基因；ORF12：假定腫瘤壞死因子(TNF)受體基因；ORF16：假定G-蛋白偶聯受體(GPCR)基因；ORF134：假定介白素10同源基因；ORF140：假定胸苷酸激酶基因；或其組合。該等突變體用作減毒活疫苗病毒。

一些該等突變體在用於某一大小及年齡之特定SPF魚時顯示為安全的。然而，在現場，養魚場主對早期疫苗接種感興趣，即在魚相對較年幼/較小時及魚之大小仍有相對較大生長空間之情形下。結果證實，在該等條件下，如國際專利申請案WO2009/027412中所揭示之基於缺失突變體病毒之疫苗在一些情形下可能不夠安全：該重組KHV毒性過強而不能用於年幼/小魚。

此意味著當前仍缺乏安全且有效之減毒重組疫苗來控制現場情形中(例如養魚業中)之疾病。

本發明之目標係提供可用於研發安全且有效之減毒疫苗以在現場控制KHV感染之新穎重組KHV病毒。

現在驚奇地發現，開放讀碼框57(ORF57)缺陷之重組KHV即使在極年幼/極小之感染此皰疹病毒重組體之鯉魚中亦展示顯著減小之死亡率或完全沒有死亡，且提供抵抗野生型錦鯉皰疹病毒之免疫性。因此，此一重組KHV提供可適用於年幼及/或小鯉魚中之安全且有效之減毒疫苗病毒。

鑒於迄今為止業內仍認為ORF57係活病毒賴以生存之必需基因之事實，此發現甚至更加令人驚奇。

因此，本發明之第一實施例係關於ORF57缺陷之重組錦鯉皰疹病毒，從而產生減毒KHV，且其在鯉魚、較佳西鯉或錦鯉感染該皰疹病毒時誘發40%或更低死亡率。

本文所使用「缺陷型」ORF57係不再具有功能(即不再能夠編碼功能蛋白)之ORF57。本文所使用缺陷型ORF57產生減毒至在鯉魚中誘發40%或更低死亡率之程度之KHV。此一缺陷可藉由(例如)突變(例如在編碼ORF57之基因中或其啟動子區域中一或多個核苷酸之插入或缺失)來獲得。此一突變可係(例如)基因之5'位點之移碼突變或(部分)啟動子區域或(部分)基因本身之缺失。

ORF57之DNA序列之實例係如以基因庫登錄號NC_009127給出之ORF57之DNA序列，其中ORF57起始及終止密碼子位於位置99382及100803處。不言而喻，在其他KHV株中，ORF57之位置可由於自然變異而有所不同。另外，由於自然變異，一個KHV株中之ORF57序列在與另一KHV株相比時可存在微小差異。因此，如本文所述之ORF57係與如以基因庫登錄號NC_009127給出之ORF57之DNA序列具有高於80%之序列一致性之開放讀碼框。

該區域中包含ORF56、57及58且跨越核苷酸96630-101558之核苷酸序列示於SEQ ID NO：12中。亦參見圖1。

顯然，使基因缺陷之最廣泛方式(即使整個ORF57缺失)將完全不產生ORF57蛋白。

自實際觀點且自安全性觀點出發，此一完全缺失可係欲採取之合理步驟。然而，如根據圖1得出，假定啟動子區域位於位置100212-100261處，其可能參與毗鄰ORF58之表現。出於此原因，ORF57中之突變較佳應不延伸至此區域中。因此，較佳在ORF57中在位置100212左側或在位置100261右側之區域中引入突變。

自圖1亦可看出，兩個假定啟動子區域分別位於位置99451-99500及位置99794-99843處，其可能參與毗鄰ORF56之表現。因此，在ORF57中之區域中之缺失在理論上可能干擾ORF56之表現。在該情形下，本發明ORF57缺陷之重組KHV可由於ORF56之較低表現而僅表現減毒。然而，實例部分中展示，1)ORF56並非係必需基因，及2) 缺陷型ORF56無助於本發明重組KHV之減毒特徵。在該等實例中展示，可在ORF56中產生較大缺失而不影響重組KHV之活力且不顯著改變重組KHV之減毒特徵。此尤其暗示，可移除位於ORF57中之假定ORF56啟動子位點而不會造成問題。

根據圖1亦得出，ORF57之兩個假定啟動子位點位於ORF56中之位置97075-97124及98712-98761處。因此，不能排除，一小部分ORF57之缺失(例如在ORF57 Del 1中)提供截短但仍有功能之ORF57編碼之蛋白質。為排除此可能性，如實例部分中所述來產生跨越位置97001-99750之區域之較大ORF56-ORF57雙重缺失。此缺失之表現基本上等效於單一ORF57突變體，如圖5在與圖7比較時可見。因此可推斷出，ORF57編碼之蛋白質對於病毒並非必需。

僅缺失一小部分ORF57係一可能性，其由於上述原因甚至可係較佳可能性，但必須稍加注意所得截短蛋白無功能。若熟習此項技術者因任何原因而決定使少於完全之ORF57缺失，則其將能夠易於檢查是否使ORF57缺陷：非缺陷型ORF57將致使病毒具有過高毒力值，即過低減毒程度。

較佳地，重組KHV另外在一或多個有助於毒力但並非病毒複製必需之病毒基因中缺陷。

因此，此實施例之較佳形式係關於在至少一個有助於毒力但並非病毒複製必需之其他基因中缺陷之本發明重組錦鯉皰疹病毒。

此實施例之更佳形式係關於在至少一個有助於毒力之其他基因中缺陷之本發明重組錦鯉皰疹病毒，其中該基因係選自由以下組成之群：胸苷激酶基因；ORF12：假定腫瘤壞死因子(TNF)受體基因；ORF16：假定G-蛋白偶聯受體(GPCR)基因；ORF134：假定介白素10同源基因；ORF140：假定胸苷酸激酶基因；或其任何組合。

在此實施例之甚至更佳之形式中，重組KHV另外在至少胸苷激酶基因或假定胸苷酸激酶基因中缺陷。

在此實施例之另一甚至更佳之形式中，本發明重組KHV另外在胸苷激酶基因及至少一個選自由以下組成之群之有助於毒力之其他基因中缺陷：ORF12：假定腫瘤壞死因子(TNF)受體基因；ORF16：假定G-蛋白偶聯受體(GPCR)基因；ORF134：假定介白素10同源基因或ORF140：假定胸苷酸激酶基因。

在此實施例之另一甚至更佳之形式中，重組KHV另外在至少胸苷激酶基因及假定胸苷酸激酶基因中缺陷。

在此實施例之另一較佳形式中，本發明重組錦鯉皰疹病毒係呈活的形式。較佳地，重組錦鯉皰疹病毒能夠重構感染性粒子，即在引入允許性真核細胞或魚個體中、較佳鯉魚中、更佳野鯉(Cyprinus carpio )中、甚至更佳西鯉及/或錦鯉中時能複製。

在替代實施例中，本發明重組KHV另外在一或多個複製必需之病毒基因中缺陷(且視情況在一或多個有助於毒力但並非病毒複製必需之病毒基因中缺陷)，由此以非複製性形式提供本發明重組錦鯉皰疹病毒。

因此，替代實施例係關於該皰疹病毒呈非複製性形式之本發明重組KHV。

「非複製性形式」意指，重組錦鯉皰疹病毒仍能夠感染細胞或魚個體(例如野鯉、西鯉或錦鯉)，但不能夠複製擴增而形成感染性子代病毒。

非複製重組株係藉由使複製必需之KHV基因不活化(藉助諸如插入、缺失或突變等已知技術，例如使用BAC選殖)來產生。

在穩定地表現缺失基因(反式互補)之允許性細胞系上培養此一缺失病毒。

此方法係業內所熟知之方法。其已尤其成功地用於不同皰疹病毒，例如gH缺失之豬皰疹病毒(Suid Herpesvirus)1(奧葉茲基病毒(Aujeszky virus)，Babic等人，1996)及牛皰疹病毒1(Schröder及Keil,1999)。

可使任一有助於複製之基因缺陷以獲得非複製重組錦鯉皰疹病毒。換言之，任何若不活化則會產生非複製重組錦鯉皰疹病毒之基因皆可缺失。較佳地，本發明重組KHV中缺失以提供非複製性形式之病毒之基因係選自由以下組成之群：

ORF25、ORF31、ORF32、ORF34、ORF35、ORF42、ORF43、ORF45、ORF51、ORF59、ORF60、ORF62、ORF65、ORF66、ORF68、ORF70、ORF72、ORF78、ORF81、ORF84、ORF89、ORF9O、ORF92、ORF95、 ORF97、ORF99、ORF108、ORF115、ORF131、ORF132、ORF136、ORF137、ORF148及ORF149。

本發明重組錦鯉皰疹病毒較佳包含細菌人工染色體(BAC)載體序列。

自約十五年前以來，該等細菌人工染色體之使用一直顯著促進較大皰疹病毒基因組之操作。該等載體容許在大腸桿菌中維持病毒基因組及對其進行誘變，隨後藉由將BAC質粒轉染至允許性真核細胞中來重構子代病毒。在第一步驟中，藉由在經感染細胞中進行習用同源重組而將BAC載體之序列引入皰疹病毒基因組中。皰疹病毒之線性雙鏈DNA基因組在複製期間環化。此足以分離BAC突變體之環狀複製中間體且藉由DNA轉化而使其穿梭至大腸桿菌中。僅需要一次此穿梭即可建立系統。然後使皰疹病毒BAC在大腸桿菌中繁殖及突變。使均質純系皰疹病毒BAC DNA穿梭回至真核允許性細胞中以僅供病毒重構。由於不需要病毒功能，故病毒基因組在大腸桿菌中時保持休眠，從而在選殖時保持病毒功能存在。此對於活體外培養程序改變分離物之真正性質之病毒至關重要。

本文所使用術語「同源重組」指示，當兩種不同的同源核酸分子彼此相遇時發生交配，且生成新核酸組合。本文所使用術語「介導同源重組之序列」係指引起依賴特定重組蛋白之同源重組之序列，該特定重組蛋白催化、實施或輔助同源重組。此一重組蛋白較佳特異性地作用於「介導同源重組之序列」且不作用於其他序列。

BAC載體序列為業內所熟知，且業內經常闡述其在構築諸如皰疹病毒等重組病毒中之用途(Borst,E.M.、Hahn,G.、Koszinowski,U.H.及Messerle,M.(1999),J Virol 73,8320-9；Costes,B.、Fournier,G.、Michel,B.、Delforge,C.、Raj,V.S.、Dewals,B.、Gillet,L.、Drion,P.、Body,A.、Schynts,F.、Lieffrig,F.、Vanderplasschen,A.，2008.J Virol 82,4955-4964；Dewals,B.、Boudry,C.、Gillet,L.、Markine-Goriaynoff,N.、de Leval,L.、Haig,D.M.及Vanderplasschen,A.(2006),JGen Virol 87,509-17；Gillet,L.、Daix,V.、Donofrio,G.、Wagner,M.、Koszinowski,U.H.、China,B.、Ackermann,M.、Markine-Goriaynoff,N.及Vanderplasschen,A.(2005),J Gen Virol 86,907-17；Messerle,M.、Crnkovic,I.、Hammerschmidt,W.、Ziegler,H.及Koszinowski,U.H.(1997),Proc Natl Acad Sci U S A 94,14759-63；Warming,S.、Costantino,N.、Court,D.L.、Jenkins,N.A.及Copeland,N.G.(2005),Nucleic Acids Res 33,e36；Wagner,M.、Ruzsics,Z.及Koszinowski,U.H.(2002),Trends Microbiol 10,318-24)。

並非必須將BAC載體序列插入ORF57中。或者，可將其插入任何有助於毒力之其他病毒基因及/或任何對於病毒複製而言必需或不必需之其他病毒基因及/或任何基因間隔區中。

然而，在更佳形式中，重組錦鯉皰疹病毒包含插入ORF57中之BAC載體序列。該插入之優點在於，藉由將 BAC載體插入ORF57中，可同時使ORF57變缺陷，由此直接提供本發明重組KHV。

本發明重組KHV之實例係藉由將經修飾之側接loxP之BAC盒插入ORF55中及選殖KHV基因組來達成(見下文)。此插入產生在細菌中穩定地維持基因組且當轉染至允許性細胞中時能夠再生病毒粒子之BAC重組病毒。(關於BAC載體之細節參見：Costes,B.、Fournier,G.、Michel,B.、Delforge,C.、Raj,V.S.、Dewals,B.、Gillet,L.、Drion,P.、Body,A.、Schynts,F.、Lieffrig,F.、Vanderplasschen,A.，2008,J Virol 82,4955-4964，且關於技術細節見下文)。使用此載體在ORF57中引入缺失。

術語「BAC載體」係指使用大腸桿菌之F質粒來產生之質粒且係可在細菌(例如大腸桿菌及諸如此類)中穩定地維持且生長約300 kb或更大之較大DNA片段之載體。BAC載體至少含有對於BAC載體之複製而言必需之BAC載體序列。此一複製必需之區域之實例包括(但不限於)F質粒及其變體之複製起點。

本文所使用術語「BAC載體序列」係指包含對於BAC載體之功能而言必需之序列之序列。視情況，BAC載體序列可進一步包含「重組蛋白依賴性重組序列」及/或「選擇標記」。

即「重組蛋白依賴性重組序列」及/或「選擇標記」之細節係在(例如)上文所提及之文獻中及在WO 22009/027412中給出。

不論將BAC載體在基因組中插入何處，BAC載體序列較佳側接介導同源重組之序列(較佳loxP)。

另外，BAC載體序列較佳包含選擇標記(見下文)。在更佳形式中，選擇標記係藥物選擇標記(見下文)。

在另一較佳實施例中，該重組皰疹病毒之基因組係以質粒形式存在。此係藉由分離上文所提及包含BAC載體序列之重組錦鯉皰疹病毒之環狀形式並將其引入細菌細胞中來達成。如上所提及，將BAC(細菌人工染色體)載體序列插入一或多個有助於毒力或對於複製而言必需之病毒基因中對於本發明而言並非係必需的，只要藉由遺傳工程技術來使一或多個有助於毒力或複製必需之所提及基因缺陷即可。

因此，可將BAC載體序列插入病毒基因組之任一區域中，只要ORF57及較佳一或多個有助於毒力之其他病毒基因亦缺陷即可。

當然，可重複使用如上所述使用BAC載體介導之選殖技術：例如第一次用來使ORF57缺陷，且第二次用來使另一基因缺陷。

在其他應用中，BAC載體序列原則上可保持存於本發明重組KHV中而不造成問題。然而，對於本發明錦鯉皰疹病毒在(例如)疫苗中之用途而言，較佳將大部分BAC序列移除。例如，對於包含編碼選擇標記之基因之BAC序列之情形及另外甚至對於抗性基因之情形即係如此。該等基因於疫苗中之存在不僅被認為係非必需的且甚至被認為係不合意的。

因此，將較佳至少一部分(例如包含抗性基因或選擇標記之部分)或更佳大部分BAC載體序列自皰疹病毒基因組切除，藉此較佳在皰疹病毒基因組中之切除位點或先前插入位點處留下異源序列。更佳地，異源序列之大小少於200個核苷酸。切除係藉由將重組KHV引入表現Cre重組酶之允許性真核細胞中來達成，該Cre重組酶切除側接loxP之BAC載體序列。

因此，此實施例之較佳形式係關於本發明重組錦鯉皰疹病毒，其特徵在於自皰疹病毒基因組切除部分BAC載體序列，由此分別在皰疹病毒基因組中之切除位點或先前插入位點處留下異源序列。

且在此實施例之更佳形式中，自皰疹病毒基因組切除之部分BAC載體序列包含至少一個編碼選擇標記之基因及/或抗性基因。

亦可藉由在真核細胞中使用野生型病毒基因組中涵蓋BAC盒之插入位點(例如編碼TK之ORF55)之DNA片段進行同源重組，來完全移除BAC盒序列。選擇不再表現EGFP(由BAC盒編碼)之病毒斑，即可選出已將BAC插入位點恢復成野生型序列之重組體。

可使用呈任一形式之本發明重組錦鯉皰疹病毒、KHVBAC純系及上文所提及自皰疹病毒基因組切除至少部分BAC載體序列之KHV構築體來實施包括(例如)遺傳工程技術在內之進一步操作，以在其他特定基因中造成基因組缺陷。此等其他基因之缺陷同樣可使用如上文已闡述之BAC技術來獲得。

儘管本發明重組KHV可原樣用於疫苗目的(參見下文)以僅為了預防魚、更特定而言鯉魚、甚至更特定而言西鯉或錦鯉罹患KHV疾病，但其亦可有效地用作異源(即非KHV)DNA片段之載體病毒。在該情形下，可充分使用本發明重組KHV之有利特徵，且此外該病毒將獲得(例如)其他性質，例如標記性質、其他免疫性質或輔助性質。

此時「標記性質」意指異源DNA片段容許直接或間接辨別野外病毒感染或疫苗病毒感染。

辨別野外病毒感染與疫苗病毒感染之直接方式包括(例如)使用會與本發明重組KHV中之異源(即非KHV)DNA片段特異性反應但不與KHV野外病毒之DNA反應之引子進行PCR反應。

辨別野外病毒感染與疫苗病毒感染之間接方式包括(例如)使用會與由本發明重組KHV中之異源(即非KHV)DNA片段編碼之免疫原性蛋白特異性反應但不與KHV野外病毒之任何蛋白質反應之抗體進行免疫反應。

因此，本發明之另一實施例係關於包含異源DNA片段(例如異源基因)之本發明重組KHV。

較佳地，此一異源DNA片段係編碼對魚、更特定而言鯉魚、甚至更特定而言西鯉或錦鯉致病之另一病毒或微生物之免疫原性蛋白之異源基因。

更佳地，異源基因係引起鯉魚春季病毒血症之棒狀病毒之G醣蛋白。此一構築體在用於疫苗中時將不僅保護鯉魚抵抗KHV且亦抵抗鯉魚春季病毒血症。

用於在真核細胞中表現異源基因之適宜啟動子已為業內廣泛所知。用於表現異源基因(例如引起鯉魚春季病毒血症之棒狀病毒之G醣蛋白)之適宜啟動子之實例係HCMV IE啟動子。

本發明進一步提供產生重組錦鯉皰疹病毒(KHV)之感染性粒子之方法，其中該方法包含以下步驟：(a)將本發明重組KHV或包含本發明重組KHV之基因組之重組KHV DNA引入允許性真核細胞中；及(b)培養宿主細胞以產生重組錦鯉皰疹病毒(KHV)。

由於其減毒特徵，上文所提及之本發明重組錦鯉皰疹病毒及其DNA極適於藉由注射或浴療或經口來對魚、較佳西鯉或錦鯉個體進行免疫。

因此，本發明之再一實施例提供本發明重組錦鯉皰疹病毒及/或包含本發明重組錦鯉皰疹病毒之基因組之KHV DNA，其用於預防及/或治療性處理由錦鯉皰疹病毒(KHV)引起之魚疾病。

預防性用途係旨在預防感染或至少疾病之臨床表現之用途。

治療性用途係該KHV或KHV DNA在已患有KHV所引起魚疾病中之用途。

因此，本發明之又一實施例提供本發明重組錦鯉皰疹病毒及/或包含本發明重組錦鯉皰疹病毒之基因組之KHV DNA，其用於預防及/或治療性處理由錦鯉皰疹病毒(KHV)引起之魚疾病之疫苗中。

本發明之再一實施例提供預防及/或治療性處理由錦鯉皰疹病毒(KHV)引起之魚疾病之疫苗，其特徵在於該疫苗包含本發明重組錦鯉皰疹病毒及/或包含本發明重組錦鯉皰疹病毒之基因組之KHV DNA及醫藥上可接受之載劑。

本發明之又一實施例提供預防及/或治療性處理由引起鯉魚春季病毒血症之棒狀病毒引起之魚疾病之疫苗，該疫苗包含攜載編碼引起鯉魚春季病毒血症之該棒狀病毒之G醣蛋白之基因之本發明重組KHV或包含該重組KHV之基因組之DNA序列及醫藥上可接受之載劑。

本文所使用術語「疫苗」係指能夠預防及/或治療性處理宿主之特定疾病之組合物。此一疫苗可產生預防性或治療性免疫性。

醫藥上可接受之載劑可如水或緩衝劑一般簡單。醫藥上可接受之載劑亦可包含穩定劑。其亦可包含佐劑，或其本身可係佐劑。

通常，對於注射或藉助將魚浸泡於水中來遞送而言，將疫苗製備為液體溶液、乳液或懸浮液。例如，可製備液體乳液或可乳化濃縮物以將其添加至容納魚之水池或水浴中。亦可製備適於在投與之前溶解於或懸浮於液體媒劑中或與固體食物混合之固體(例如粉末)形式。疫苗可係用無菌稀釋劑重構之呈即用形式之凍乾培養物。例如，可在0.9%鹽水中(視情況作為包裝疫苗產品之一部分來提供)重構凍乾細胞。可注射疫苗之較佳調配物係乳液。可將液體或重構形式之疫苗稀釋於少量水(例如1體積至100體積)中，之後將其添加至注射筆(pen)、池或浴中。

在此實施例之一個較佳形式中，包含重組KHV株之疫苗製劑係呈乾燥形式，例如呈凍乾粉末形式、呈經壓縮丸粒或錠劑形式等等。

在此實施例之另一形式中，該病毒可呈組織培養液形式。可將該培養液儲存在環境條件下、較佳儲存在-70℃下、最佳以含有甘油之溶液形式儲存。在一具體實例中，組織培養液含有20%甘油。

可藉由多種方法將本發明中所揭示之重組KHV株轉化成乾燥形式。尤佳乾燥形式係藉助凍乾。在乾燥(例如凍乾程序)之前，可將各種成份添加至介質(例如防腐劑、抗氧化劑或還原劑、各種賦形劑等等)中。亦可在乾燥步驟之後亦將該等賦形劑添加至乾燥(例如凍乾)之活性減弱之病毒中。

當使用本發明重組KHV作為疫苗組份用於經口投與(例如藉助浸漬或浴療)時，通常不需要投與佐劑。

然而，若將疫苗製劑直接注射至魚中，則可視情況使用佐劑。若本發明重組KHV係呈非複製性形式，則添加免疫刺激劑可較佳。

一般而言，為增強免疫反應，製劑可包括各種佐劑、細胞介素或其他免疫刺激劑，尤其係在意欲注射製劑之情形下。

佐劑係以非特異方式增強宿主之免疫反應之免疫刺激性物質。佐劑可係親水性佐劑(例如，氫氧化鋁或磷酸鋁)或疏水性佐劑(例如基於礦物油之佐劑)。可將佐劑(例如胞壁醯二肽、抗生物素蛋白、氫氧化鋁、磷酸鋁、油、油乳液、皂素、硫酸葡聚糖、葡聚糖、細胞介素、嵌段共聚物、免疫刺激性寡核苷酸及業內已知之其他佐劑)與本發明重組KHV混合。養魚業中之常用佐劑之實例係胞壁醯二肽、脂多糖、若干種葡聚糖及聚糖及Carbopol®(一種均聚物)。適宜佐劑係(例如)油包水(w/o)乳液、o/w乳液及w/o/w雙重乳液。適用於w/o乳液中之油佐劑係(例如)礦物油或可代謝油。礦物油係(例如)Bayol®、Marcol®及Drakeol®；可代謝油係(例如)植物油(例如花生油及大豆油)或動物油(例如魚油鯊烷及鯊烯)。或者，可有利地使用如EP 382,271中所闡述之維生素E(生育酚)增溶劑。極適宜o/w乳液係(例如)自5-50% w/w水相及95-50% w/w油佐劑開始來獲得，更佳使用20-50% w/w水相及80-50% w/w油佐劑。所添加佐劑之量取決於佐劑本身之性質，且關於該等量之資訊係由製造商提供。

在較佳實施例中，本發明疫苗另外包含穩定劑。可將穩定劑添加至本發明疫苗中以(例如)防止其降解，延長儲存期限或改良冷凍-乾燥效率。有用之穩定劑尤其係SPGA(Bovarnik等人，1950，J.Bacteriology，第59卷，第509頁)；脫脂乳；明膠；牛血清白蛋白；碳水化合物，例如山梨醇、甘露醇、海藻糖、澱粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖、乳糖；蛋白質，例如白蛋白或酪蛋白或其降解產物；及緩衝劑，例如鹼金屬磷酸鹽。

可添加諸如新黴素及鏈黴素等抗生素以防止潛在細菌生長。

此外，疫苗可包含一或多種適宜表面活性化合物或乳化劑，例如Span ®或Tween®。疫苗亦可包含所謂的「媒劑」。媒劑係本發明KHV病毒(呈病毒粒子形式或呈DNA形式)可附著而不與之共價結合之化合物。該等媒劑尤其係生物微膠囊、微褐藻酸鹽、脂質體及大分子溶膠(macrosol)，其皆已為業內所知。此一媒劑之特殊形式係免疫刺激複合物(Iscom)。不言而喻，將其他穩定劑、載劑、稀釋劑、乳液及諸如此類與本發明疫苗混合亦在本發明之範圍內。該等添加劑闡述於(例如)諸如以下等眾所周知之手冊中：「Remington：the science and practice of pharmacy」(2000,Lippincot,USA,ISBN：683306472)及：「Veterinary vaccinology」(P.Pastoret等人編輯，1997,Elsevier,A msterdam,ISBN：0444819681)。

重組KHV當以其乾燥形式用於疫苗中時可進一步包括重構液，較佳為無菌水、鹽水或生理溶液。其亦可含有少量來自製造過程之殘餘材料，例如細胞蛋白、DNA、RNA等等。儘管該等材料本身並非添加劑，但其仍可存於疫苗調配物中。

可將疫苗個別地經口(例如藉助進食或藉由強迫式經口投與)或藉由注射(例如經由肌內或腹膜內途徑)投與魚。

或者，可藉由噴灑、溶解及/或浸泡疫苗來將疫苗同時投與含於水體中之整個魚群。該等方法可用於對所有種類之魚(例如，食用魚及觀賞魚)且在各種環境(例如池塘、水族館、自然棲所及淡水水庫)中進行疫苗接種。

本發明之另一態樣係關於包含本發明重組KHV之DNA疫苗。

就包含本發明重組KHV之基因組之意義而言，本發明DNA疫苗與包含本發明重組KHV之疫苗基本上並無不同。

其可使用(例如)無針型注射器(例如GeneGun®)藉助真皮內施加來容易地投與。此投與方式將DNA直接遞送至欲進行疫苗接種之動物之細胞中。本發明重組KHV DNA於本發明醫藥組合物(如下所述)中之較佳量係在介於10 pg與1000 μg之間之範圍內。較佳地，使用介於0.1 μg與100 μg之間之範圍內之量。或者，可將魚浸泡於包含(例如)介於10 pg/ml與1000 μg/ml之間之欲投與DNA之溶液中。所有該等投與技術及途徑皆為業內所熟知。

較佳地，本發明疫苗係以適於注射或適於浸泡疫苗接種之形式(例如懸浮液、溶液、分散液、乳液及諸如此類)來調配。

向靶標有機體施加本發明疫苗之給藥方案可施加單一劑量或多個劑量，該等劑量可同時或依序以與劑量及調配物相容之方式且以此一將免疫有效之量來給予。熟習此項技術者可熟練藉由以下來確定治療是否「免疫有效」：例如，向經疫苗接種之動物投與實驗性攻毒感染，且接下來測定靶標動物之疾病之臨床體徵、血清學參數，或量測病原體之再分離。

構成基於本發明之重組KHV或重組KHV DNA之本發明疫苗之「醫藥有效量」者取決於期望效應及靶標有機體。一般從業者可熟練確定有效量。上文已闡述了包含於本發明醫藥組合物中之本發明重組KHV DNA之較佳量。

包含本發明重組KHV病毒株之活疫苗之較佳量表示為(例如)溶菌斑形成單位(pfu)。例如，對於活病毒載體而言，可有利地使用介於1溶菌斑形成單位(pfu)/動物劑量與10¹⁰ 溶菌斑形成單位/動物劑量之間之劑量範圍；較佳介於10² pfu/劑量與10⁶ pfu/劑量之間之範圍。

可應用許多投與方式，其皆為業內所知。較佳經由注射(肌內或腹膜內途徑)、浸泡、浸漬或經口將本發明疫苗投與魚。可依照標準疫苗接種實踐來最佳化投與方案。

若疫苗包含本發明重組KHV之非複製性形式，則劑量將表示為欲投與之非複製性病毒粒子之數目。則劑量通常將稍高於所投與之活病毒粒子，此乃因在被免疫系統移除之前活病毒粒子會在靶標動物中複製至某一程度。對於基於非複製性病毒粒子之疫苗而言，在約10⁴ 個粒子至10⁹ 個粒子範圍內之病毒粒子量通常將係適宜的。

較佳地，尤其當使用本發明之活重組KHV時，經由浸泡來投與疫苗。此在將該等疫苗用於商業水產養殖業環境中之情形下尤其有效。

實例：

a)細胞及病毒 在含有4.5 g/l葡萄糖(D-葡萄糖一水合物，Merck)及10%胎牛血清(FCS)之最低必需培養基(MEM,Invitrogen)中培養野鯉腦細胞(CCB)(Neukirch等人，1999)。在含5% CO₂ 之潮濕氣氛中在25C下培養細胞。自死於KHV(CER Marloie，比利時)之魚之腎臟分離CyHV-3FL株。

b)CyHV-3 BAC質粒 使用CyHV-3 FL BAC質粒作為親代質粒以產生CyHV-3重組體。此質粒已廣泛闡述於Costes等人(2008)及國際專利申請案WO 2009/027412中。CyHV-3 FL BAC質粒係CyHV-3 FL株基因組之感染性細菌人工染色體(BAC)純系。在此質粒中，將側接loxP 之BAC盒插入CyHV-3 TK基因座(ORF55)中。

c)在細菌中使用galK陽性選擇產生ORF 57 CyHV-3 FL BAC重組質粒 如前所述在細菌中使用galK陽性選擇產生兩種在ORF57基因座中具有缺失(參見圖1中之ORF57 Del 1及ORF57 Del 2)之CyHV-3 FL BAC重組質粒(Warming等人，2005)(圖2)。重組片段係由側接50 bp序列之半乳糖激酶(galK)基因(1231 bp)組成，該等50 bp序列與CyHV-3基因組中側接欲缺失序列(圖1)之區域同源。

該等片段係藉由PCR使用pgalK載體作為模板來產生。使用以下引子來擴增(引子序列參見表1)：對於產生ORF57 Del 1缺失而言：使用引子ORF57 Del1 fw及ORF57 Del1 rev，產生ORF57 Del 1-galK擴增子；對於產生ORF57 Del 2缺失而言：使用引子ORF57 Del2 fw及ORF57 Del2 rev，產生ORF57 Del 2-galK擴增子。純化擴增產物(QIAquick凝膠提取套組)。接下來，用50 ng之上述PCR產物對含有CyHV-3 FL BAC質粒之電穿孔勝任之SW102細胞進行電穿孔。將經電穿孔細胞平鋪於補充有20%半乳糖及氯黴素(17 μg/ml)之固體M63基本培養基上以選擇於其中發生同源重組之細菌。最後，將所獲得菌落劃線至如在別處闡述之MacConkey指示板上以證實galK陽性純系之產生。擴增並純化重組BAC分子(QIAGEN大型構築體套組)，並使用組合之限制性內切酶-南方墨點(Southern blot)方法、PCR及測序來控制其分子結構。

^* 引子代表與CyHV-3基因組(加下劃線之序列)且與galK 表現盒同源之序列.

d)自ORF 57 CyHV-3 FL BAC重組質粒重構感染性病毒 將CyHV-3 BAC質粒轉染(Lipofectamine Plus,Invitrogen)至允許性CCB中。為產生源自BAC質粒之具有野生型TK基因座之病毒株，將CyHV-3 BAC質粒與pGEMT-TK載體(分子比率1：75)一起共轉染於CCB細胞中。轉染後七天，挑選EGFP表現(BAC盒編碼EGFP表現盒)呈陰性之病毒斑並藉由連續三輪溶菌斑純化來富集。同樣，為自病毒基因組重構BAC盒經切除之病毒粒子，將BAC質粒與編碼與核定位信號融合之Cre重組酶之pEFIN3-NLS-Cre載體(Costes等人；2008 JVI，分子比率：1：70)一起共轉染於CCB細胞中。

e)在細菌中使用galK陽性選擇產生ORF 56 CyHV-3 FL BAC重組質粒 如前所述在細菌中使用galK陽性選擇來產生兩種在ORF56基因座中缺失(參見圖1中之ORF56 Del 1及ORF56 Del 2)之CyHV-3 FL BAC重組質粒(Warming等人，2005)(圖3)。重組片段係由側接50 bp序列之半乳糖激酶(galK)基因(1231 bp)組成，該等50 bp序列與CyHV-3基因組中側接欲缺失序列(圖1)之區域同源。該等片段係藉由PCR使用pgalK載體作為模板來產生。使用以下引子來擴增(引子序列參見表2)：對於產生ORF56 Del 1缺失而言：使用引子ORF56 Del1 fw及ORF56 Del1 rev，產生ORF56 Del 1-galK擴增子；對於產生ORF56 Del 2缺失而言：使用引子ORF56 Del2 fw及ORF56 Del2 rev，產生ORF56 Del 2- galK擴增子。純化擴增產物(QIAquick凝膠提取套組)。接下來，用50 ng之上述PCR產物對含有CyHV-3 FL BAC質粒之電穿孔勝任之SW102細胞進行電穿孔。將經電穿孔細胞平鋪於補充有20%半乳糖及氯黴素(17 μg/ml)之固體M63基本培養基上以選擇於其中發生同源重組之細菌。最後，將所獲得菌落劃線至如在別處闡述之MacConkey指示板上以證實galK陽性純系之產生。擴增並純化重組BAC分子(QIAGEN大型構築體套組)，並使用組合之限制性內切酶-南方墨點方法、PCR及測序來控制其分子結構。

^* 引子代表與CyHV-3基因組(加下劃線之序列)且與galK表現盒同源之序列。

f)自ORF 56 CyHV-3 FL BAC重組質粒重構感染性病毒 將CyHV-3 BAC質粒轉染(Lipofectamine Plus,Invitrogen)至允許性CCB中。為產生源自BAC質粒之具有野生型TK基因座之病毒株，將CyHV-3 BAC質粒與pGEMT-TK載體(分子比率1：75)一起共轉染於CCB細胞中。轉染後七天，挑選EGFP表現(BAC盒編碼EGFP表現盒)呈陰性之病毒斑並藉由連續三輪溶菌斑純化來富集。同樣，為自病毒基因組重構BAC盒經切除之病毒粒子，將BAC質粒與編碼與核定位信號融合之Cre重組酶之pEFIN3-NLS-Cre載體(Costes等人；2008 JVI，分子比率：1：70)一起共轉染於CCB細胞中。

g)在細菌中使用galK陽性及陰性選擇產生ORF56-57 CyHV-3 FL BAC重組質粒 如前所述在細菌中使用galK陽性及陰性選擇來產生在ORF56及ORF57基因座中缺失(圖1)之CyHV-3 FL BAC重組質粒(Warming等人，2005)(圖4)。第一重組過程(galK陽性選擇)欲藉由半乳糖激酶(galK)基因(1231 bp)來代替ORF56及ORF57之經鑑別序列。重組片段係由側接50 bp序列之galK基因組成，該等50 bp序列與CyHV-3基因組中側接欲缺失序列(圖1)之區域(ORF56-57 Del galK，圖4)同源。此片段係藉由PCR使用引子ORF56-ORF57 Del fw及ORF56-ORF57 Del rev(表3)及作為模板之pgalK載體來產生。純化擴增產物(QIAquick凝膠提取套組)。接下來，用50 ng之上述PCR產物對含有CyHV-3 FL BAC質粒之電穿孔勝任之SW102細胞進行電穿孔。將經電

穿孔細胞平鋪於補充有20%半乳糖及氯黴素(17 μg/ml)之固體M63基本培養基上以選擇於其中發生同源重組之細菌。最後，將所獲得菌落劃線至如在別處闡述之MacConkey指示板上以證實galK陽性純系之產生。擴增並純化重組BAC分子(QIAGEN大型構築體套組)，並使用組合之限制性內切酶-南方墨點方法、PCR及測序來控制其分子結構。第二重組過程(galK陰性選擇)欲自FL BAC ORF56-57 Del galK質粒移除galK盒。使用合成之499 bp DNA片段(ORF56-57 Del盒，見下文)來達成此目標。其係由與CyHV-3基因組中側接欲缺失序列之區域同源之序列組成：位於galK基因上游之250 bp(坐標96751至9700，基因庫登錄號NC_009127)及位於galK基因下游之249 bp(坐標99751至100000，其中鹼基99760缺失，基因庫登錄號NC_009127)。用50 ng之上述PCR產物對含有FL BAC ORF56-57 Del galK質粒之電穿孔勝任之SW102細胞進行電穿孔。將經電穿孔細胞平鋪於補充有2-去氧-半乳糖之固體基本培養基上以選擇於其中發生同源重組之細菌(galK消化2-去氧-半乳糖產生有毒產物)。擴增並純化重組BAC分子(QIAGEN大型構築體套組)，並使用組合之限制性內切酶-南方墨點方法、PCR及測序來控制其分子結構。

ORF56-57 Del盒： 5'-tttgtcaaccagtcctccagggtcggtttggcgctggcctccttgcccttggtcacggcgatggcagacgccacaatcctcgcgacgggttccgtcagagcagagttcttaaacatttcgacgcctcctccgacggtgaaccactctgaccaattcaggtcggagggccacgctgcctgtgcatcatcgtctgcacagcgtccctcgacagccccagcccgcacagcagtccgccactcttccctgttgagtgcacgactcgtcaagatcaagctgcttgagcgcgtcgtgtacgggttcatgatggccctgcagaaggcgctgcgcattcagaagcagggctgcaggatggtggggctcgaggacccggagaaggtggaggatatgaagaactttgtgctgcacaagggcttcaaccaccactacgccttctgcgatcaccactggcagcactgggccctgggccgctccttcgagggcgagctgcccgacgtggtgg-3'

h)自ORF56 -57 CyHV-3 FL BAC重組質粒重構感染性病毒 將CyHV-3 BAC質粒轉染(Lipofectamine Plus,Invitrogen)至允許性CCB中。為產生源自BAC質粒之具有野生型TK基因座之病毒株，將CyHV-3 BAC質粒與pGEMT-TK載體(分子比率1：75)一起共轉染於CCB細胞中。轉染後七天，挑選EGFP表現(BAC盒編碼EGFP表現盒)呈陰性之病毒斑並藉由連續三輪溶菌斑純化來富集。同樣，為自病毒基因組重構BAC盒經切除之病毒粒子，將BAC質粒與編碼與核定位信號融合之Cre重組酶之pEFIN3-NLS-Cre載體(Costes等人；2008 JVI，分子比率：1：70)一起共轉染於CCB細胞中。

i)安全性測試

使鯉魚在60升池中及24℃下適應10天。在含有4 PFU/ml、40 PFU/ml或400 PFU/ml之欲測試KHV株之水中將鯉魚(生物量為50g魚/l)浸泡2 h。將對照組(模擬感染)浸泡於已添加等體積培養基之水中。在培育階段結束時，使魚返回至更大池中。在接種之前滴定病毒接種物且在接種之後進行返滴以確保各組之間之劑量相等。每日檢查魚之KHV疾病之臨床體徵，並移除死魚。

j)疫苗接種/攻毒

使鯉魚在60升池中及24C下適應10天。對於疫苗接種而言，在含有4 PFU/ml、40 PFU/ml或400 PFU/ml之欲測試KHV株之水中將鯉魚(生物量為50g魚/l)浸泡2 h。在培育階段結束時，使魚返回至更大池中。在疫苗接種後3週或6週，藉由將魚與感染後立即釋放於經疫苗接種之魚之池中之幼稚魚共同飼養來用毒性KHV加以攻毒。藉由於含有300 PFU/ml之毒性親代FL株之水中浸泡2 h對該等魚進行接種。將兩條經感染魚添加至每一含有經疫苗接種之魚之池中。

k)安全性及攻毒結果

如實例(安全性測試)中所闡述測試BAC經切除之FL ORF57 Del 1 galK株(圖5A)及BAC經切除之FL ORF57 Del 2 galK株(圖5B)對鯉魚(7個月齡，平均重量為3.74 g，n=20)之安全性。分別使用BAC經切除之FL株(圖5C)及模擬感染(圖5D)作為陽性及陰性對照。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將第0天作為參考值。感染ORF57單一缺失之重組體後六週(圖5E及F)，如實例(疫苗接種/攻毒)中所闡述來攻毒魚。使用經模擬感染之魚作為對照(圖5G)。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將第42天作為參考值。

自圖5A及圖5B明瞭，本發明之ORF57缺失突變體即使在施加至小魚時亦係安全的。

自圖5E及圖5F亦可明瞭，本發明之KHV ORF57缺失突變體尤其在以40 pfu/ml或更高之劑量投與時極適宜作為有效疫苗。

如實例(安全性測試)中所闡述測試BAC經切除之FL ORF56 Del 1 galK株(圖6A)及BAC經切除之FL ORF56 Del 2 galK株(圖6B)對鯉魚(7個月齡，平均重量為3.74 g，n=20)之安全性。分別使用BAC經切除之FL株(圖6C)及模擬感染(圖6D)作為陽性及陰性對照。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將第0天作為參考值。

如自圖6A及圖6B可明瞭，ORF56缺失突變體展示與對照野生型病毒大致相當之毒力(將組A及組B與組C進行比較)。

如在圖7及圖8中可看出，在ORF57及ORF56二者中攜載缺失之KHV展示與攜載單一ORF57缺失之KHV相當之安全性及效能特徵。

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圖1： 涵蓋ORF57之CyHV-3基因組區域之示意圖。指示每一ORF之ATG及終止密碼子之坐標(根據基因庫登錄號NC_009127)。呈現藉由電腦(in silico)分析鑑別之ORF56及ORF57內或其附近之假定啟動子(P)之坐標。在字母P後之數字鑑別在經鑑別啟動子序列之控制下之ORF。所選擇欲缺失以使ORF56及/或ORF57無效之序列示於頂部。指示缺失之坐標。

圖2、3： 經實施以產生缺失ORF57(圖2)或ORF56(圖3)之FL BAC galK重組質粒且展示自所產生質粒重構感染性病毒之階段流程圖。在大腸桿菌中使用同源重組來用galK表現盒代替如圖1中所鑑別之ORF57或ORF56之區域。為重構具有野生型胸苷激酶(TK)基因座(FL BAC反突變株)之感染性病毒，將重組質粒與pGEMT-TK質粒共轉染於允許性CCB細胞中。為重構具有截短形式之TK之感染性病毒(BAC經切除之FL株)，將重組質粒轉染於表現Cre重組酶之CCB細胞中。

圖4：說明製造 缺失ORF57及ORF56(ORF56-57)之FL BAC重組質粒且展示自所產生質粒重構感染性病毒之階段流程圖。採用在大腸桿菌中之同源重組法，使用galK表現盒置換如圖1中所鑑別之ORF56-57之區域。然後，藉由與對應於側接galK表現盒(ORF56-57 Del盒)之KHV基因組區域之合成DNA序列之同源重組法來移除galK表現盒。為重構具有野生型胸苷激酶(TK)基因座之感染性病毒(FL BAC反突變株)，將重組質粒與pGEMT-TK質粒共轉染於允許性CCB細胞中。為重構具有截短形式之TK之感染性病毒(BAC經切除之FL株)，將重組質粒轉染於表現Cre重組酶之CCB細胞中。

圖5： ORF57單一缺失重組體之安全性(A-D)及疫苗接種/攻毒(E-G)測試。如實例(安全性測試)中所闡述，測試BAC經切除之FL ORF57 Del 1 galK株(A)及BAC經切除之FL ORF57 Del 2 galK株(B)對鯉魚(7個月齡，平均重量為3.74g，n=20)之安全性。分別使用BAC經切除之FL株(C)及模擬感染(D)作為陽性及陰性對照。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將第0天作為參考值。感染ORF57單一缺失之重組體(E：BAC經切除之FL ORF57 Del 1 galK株及F：BAC經切除之FL ORF57 Del 2 galK株)後六週，如實例(疫苗接種/攻毒)中所闡述來攻毒魚。使用經模擬感染之魚作為對照(G)。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將第42天作為參考值。

圖6： ORF56單一缺失之重組體之安全性。

如實例(安全性測試)中所闡述來測試BAC經切除之FL ORF56 Del 1 galK株(A)及BAC經切除之FL ORF56 Del 2 galK株(B)之對鯉魚(7個月齡，平均重量為3.74 g，n=20)安全性。分別使用BAC經切除之FL株(C)及模擬感染(D)作為陽性及陰性對照。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將第0天作為參考值。

圖7： BAC經切除之FL ORF56-57 Del株之安全性(A-C)及疫苗接種/攻毒(D-G)測試。如實例(安全性測試)中所闡述來測試BAC經切除之FL ORF56-57 Del株(B)對鯉魚(7個月齡，平均重量為4.41 g，n=30)之安全性。分別使用BAC經切除之FL株(A)及模擬感染(C)作為陽性及陰性對照。於重複組中進行模擬感染。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將第0天作為參考值。

疫苗接種/攻毒(D-G)測試。在如實例(疫苗接種/攻毒)中所闡述在疫苗接種後3週(D)或6週(F)用KHV FL株攻毒經BAC經切除之FL ORF56-57 Del株疫苗接種之魚(n=15)。使用重複組之經模擬感染之魚作為對照(E及G)。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將攻毒當天作為參考值。

圖8： FL BAC反突變ORF56-57 Del株之安全性(A-C)及疫苗接種/攻毒(D-G)測試。如實例(安全性測試)中所闡述來測試FL BAC反突變ORF56-57 Del株(B)對鯉魚(7個月齡，平均重量為3.74 g，n=30)之安全性。分別使用FL BAC反突變株(A)及模擬感染(C)作為陽性及陰性對照。於重複組中進行模擬感染。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將第0天作為參考值。疫苗接種/攻毒(D-G)測試。在如實例(疫苗接種/攻毒)中所闡述進行疫苗接種後3週(D)或6週(F)用KHV FL株攻毒經FL BAC反突變ORF56-57 Del株疫苗接種之魚(n=15)。使用重複組之經模擬感染之魚作為對照(E及G)。根據感染後之天數來表示存活鯉魚之百分比，將攻毒當天作為參考值。

<110> 比利時列日大學

<120> 重組錦鯉疱疹病毒(KHV)及預防KHV所引起疾病之疫苗

<130> 23186 FF

<140> 101150791

<141> 2012-12-28

<150> 11196171.0

<151> 2011-12-30

<160> 12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 77

<212> DNA

<213> 錦鯉皰疹病毒

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<211> 4929

<212> DNA

<213> 錦鯉皰疹病毒

<400> 12

Claims

一種活的重組錦鯉皰疹病毒(KHV)，其中開放讀碼框57(ORF57)缺陷，從而產生活的重組減毒之KHV。
如請求項1之活的重組錦鯉皰疹病毒，其中其在至少一個有助於毒力但並非複製必需之其他基因中缺陷，該至少一個其他基因係選自由以下組成之群：胸苷激酶基因、ORF12：假定腫瘤壞死因子(TNF)受體基因、ORF16：假定G-蛋白偶聯受體(GPCR)基因、ORF134：假定介白素10同源基因、及ORF140：假定胸苷酸激酶基因。
如請求項1或2之活的重組錦鯉皰疹病毒，其包含BAC(細菌人工染色體)載體序列。
如請求項3之活的重組錦鯉皰疹病毒，其中自該皰疹病毒基因組切除該BAC載體序列，由此分別在該皰疹病毒基因組中之切除位點或先前插入位點處留下異源DNA片段。
如請求項1或2之活的重組錦鯉皰疹病毒，其中其進一步包含異源DNA片段。
如請求項5之活的重組錦鯉皰疹病毒，其中該異源基因係編碼引起鯉魚春季病毒血症之棒狀病毒之G醣蛋白之基因。
如請求項1或2之活的重組錦鯉皰疹病毒，其用作異源DNA片段之載體。
一種細胞，其包含如請求項1至6中任一項之活的重組錦鯉皰疹病毒。
一種產生重組錦鯉皰疹病毒(KHV)之感染性粒子之方法，其中該方法包括以下步驟：(a)將如請求項1至6中任一項之活的重組KHV或包含如請求項1至6中任一項之重組錦鯉皰疹病毒之基因組之重組KHV DNA引入允許性真核細胞中；及(b)培養該細胞，產生重組錦鯉皰疹病毒(KHV)。
如請求項1或2之活的重組錦鯉皰疹病毒及/或包含如請求項1至6中任一項之重組錦鯉皰疹病毒之基因組之重組KHV DNA，其用於預防及/或治療性處理由錦鯉皰疹病毒(KHV)引起之魚疾病之疫苗中。
一種疫苗，其用於預防及/或治療性處理由錦鯉皰疹病毒(KHV)引起之魚疾病，其中該疫苗包含如請求項1至6中任一項之活的重組錦鯉皰疹病毒及/或包含如請求項1至6中任一項之重組錦鯉皰疹病毒之基因組之重組KHV DNA，及醫藥上可接受之載劑。
一種疫苗，其用於預防及/或治療性處理由引起鯉魚春季病毒血症之棒狀病毒引起之魚疾病，其中該疫苗包含如請求項6之活的重組錦鯉皰疹病毒及/或包含如請求項6之重組錦鯉皰疹病毒之基因組之重組KHV DNA，及醫藥上可接受之載劑。