UA119786C2 - Рекомбінантний герпесвірус кої (khv) і вакцина для профілактики захворювання, що викликається khv - Google Patents

Рекомбінантний герпесвірус кої (khv) і вакцина для профілактики захворювання, що викликається khv Download PDF

Info

Publication number
UA119786C2
UA119786C2 UAA201702576A UAA201702576A UA119786C2 UA 119786 C2 UA119786 C2 UA 119786C2 UA A201702576 A UAA201702576 A UA A201702576A UA A201702576 A UAA201702576 A UA A201702576A UA 119786 C2 UA119786 C2 UA 119786C2
Authority
UA
Ukraine
Prior art keywords
knu
infection
recombinant
herpesvirus
vas
Prior art date
Application number
UAA201702576A
Other languages
English (en)
Inventor
Ален Франсіс Клод Вандерплассхен
Алэн Франсис Клод Вандэрплассхэн
Original Assignee
Гесваль С.А.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Гесваль С.А. filed Critical Гесваль С.А.
Publication of UA119786C2 publication Critical patent/UA119786C2/uk

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/245—Herpetoviridae, e.g. herpes simplex virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A61P31/22—Antivirals for DNA viruses for herpes viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5254—Virus avirulent or attenuated
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/55—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the host/recipient, e.g. newborn with maternal antibodies
    • A61K2039/552—Veterinary vaccine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16034—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/16043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16051—Methods of production or purification of viral material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/16011—Herpesviridae
    • C12N2710/16061—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2710/16062—Methods of inactivation or attenuation by genetic engineering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/20—Pseudochromosomes, minichrosomosomes
    • C12N2800/204—Pseudochromosomes, minichrosomosomes of bacterial origin, e.g. BAC

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Farming Of Fish And Shellfish (AREA)

Abstract

Винахід стосується живого атенуйованого рекомбінантного герпесвірусу кої (KHV), що містить геном, в якому відкрита рамка зчитування 56 (ORF56) частково або повністю делетована, і відкрита рамка зчитування 57 (ORF57) частково делетована так, що делеція не поширюється в область ORF57 від положення 100212 до положення 100261, і причому герпесвірус здатний до реплікації. Винахід також стосується застосування заявленого KHV як вектора і у вакцинах для профілактики і/або терапевтичного лікування у риби захворювання, що викликається герпесвірусом кої у коропа, такого як Сурrіnus саrpіо саrріо або Cyprinus carpio kоi.

Description

Даний винахід стосується рекомбінантного герпесвірусу кої (КНУ), способу продукування такого КНУ, клітин, що містять такий КНУ, і застосування такого КНУ як вектора і у вакцинах для профілактики і/або терапевтичного лікування захворювання у риби, викликаного герпесвірусом кої у коропа, такого як Сургіпив сагріо сагріо або Сургіпив сагріо Кої.
Звичайний короп (Сургіпив5 сагріо сагріо) є найбільш широко культивованою для споживання людиною рибою, в основному в Азії, Європі і на Середньому Сході. На відміну від цього, підвиди кої (Сургіпих сагріо Кої) культивуються як домашня риба для естетичного задоволення або для змагальних виставок, особливо в Японії, а також і по всьому світу. Вірус, що спричиняє летальне захворювання як у звичайного, так і у коропа кої, спочатку названий герпесвірусне захворювання кої (КНМО), був детектований у 1996 в Великобританії. Потім вірус був швидко ідентифікований як причина масової загибелі кої і звичайного коропа в Ізраїлі, США і Німеччині.
Інтенсивне вирощування звичайного коропа, виставки кої і міжнародна торгівля призвели до швидкого глобального поширення цього високозаразного і надзвичайно вірулентного захворювання. Після виникнення КНМО викликав серйозні фінансові і економічні втрати для підприємств, що вирощують як кої, так і звичайного коропа по всьому світу.
Первинна характеризація вірусу продемонструвала подібну до герпесу структуру з оболонкою і ікосаедральною електронощільною серцевиною 100-110 нм, оточеною подібною до тегументу структурою. Геном вірусу містить лінійну дволанцюжкову ДНК (длднНК) з «295 т.п.о., подібну до ДНК герпесвірусу 1 сімейства коропових 1 (СунуУ-1), але більше ніж ДНК членів
Негрехмігідає, що звичайно варіюється від 125 до 240 т.п.о. за розміром. Послідовність геному
КНУ була зовсім нещодавно опублікована (Аокі еї аї., у Мігої, 81, раде5 5058-5065 (2007)). Геном
КНМ містить значну кількість послідовності ДНК без гомології з будь-якою іншою відомою вірусною послідовністю. Крім того, вона містить надзвичайно дивергентні послідовності ДНК, що кодують поліпептиди, які мають схожість з деякими длДНК вірусів, таких як герпесвірус, поксвірус, іридовірус і інші великі ДНК-віруси.
Унікальні характеристики цього вірусу привели до трьох різних номенклатур: по-перше, герпесвірус кої (КНМ) відповідно до його морфологічного вияву; по-друге, інтерстиціальний нефрит коропа і вірус некрозу зябер (СМОМ) відповідно до його патогенетичних ефектів у риби; і на закінчення, герпесвірус З сімейства коропових (СУНМ-3) згідно зі схожістю вмісту генів з
Ко) СунУу-1 ії з Сунму-2. Остання номенклатура була додатково підтверджена нещодавнім секвенуванням повної довжини вірусного геному. Однак надалі буде використана назва КНУ.
КНМ має геном приблизно 295 т.п.о., що представляє найбільший геном, коли-небудь ідентифікований серед членів Негрезміга(ез. Хоч перше виділення КНУ було здійснене в 1996 р., лише невелика кількість інформації доступна про роль окремих генів в патогенезі КНУ і в біології інфікування природного хазяїна.
Атенуйований КНМ і його потенційне застосування як вакцини-кандидата було описано в міжнародній заявці на патент УУО 2004/061093 А1. Однак ця вакцина-кандидат несе потенційну небезпеку. Атенуація являє собою послідовність випадкових мутацій, які відбулися під час вірусної реплікації іп міто. Отже, характер атенуації невідомий і не може бути виключене повернення до повністю патогенного фенотипу.
Для використання і фундаментального дослідження КНМ потрібне продукування рекомбінантного вірусу. Останнім часом маніпулювання великими герпесвірусними геномами стало можливим за допомогою використання векторів на основі штучної бактеріальної хромосоми (ВАС) (Меззетгіе евї а!., Ргос. Маї!. Асай. 5сі. ОБА, 94, 14759-14763 (1997); Мадпег єї а!., Ттепавз Містобіо!., 10, 318-324 (2002) див. нижче). Ці вектори дозволяють підтримання і ефективний мутагенез вірусного геному в Е5спПегіснпіа соїї (Е. соїї) з подальшим відтворенням віріонів потомства трансфекцією плазміди ВАС в пермісивні еукаріотичні клітини. До цього часу геноми деяких герпесвірусів були успішно розмножені у вигляді інфекційних ВАС-клонів, включаючи людський цитомегаловірус (НСМУ), який являє собою другий по величині герпесвірусний геном, клонований у вигляді ВАС до цього часу (230 т.п.о.) (Вогвї єї аї., у). Мігої., 73, 8320-8329 (1999)).
Останнім часом декілька рекомбінантних КНУ були уперше сконструйовані із застосуванням технології ВАС; ці рекомбінанти описані в заявці на патент згідно з РСТ МО 2009/027412. У цій заявці розкритий спосіб одержання рекомбінантних КНУ, що мають нестачу одного в одному або більше генах, вибраних з групи, що складається з ОВЕ55: гена тимідинкінази; ОВЕ12: передбачуваного гена рецептора фактора некрозу пухлин (ТМЕ); ОВЕ16: гена передбачуваного зв'язаного з (13-білюом рецептора (пРСВ); ОВЕ134: передбачуваного гена гомолога інтерлейкіну- 10; ОВЕ140: передбачуваного гена тимідилаткінази або їх комбінації. Такі мутанти застосовували у вигляді живого атенуйованого вакцинного вірусу.
Було продемонстровано, що деякі з таких мутантів були безпечними при застосуванні відносно конкретної 5РЕ риби певного розміру і віку. Однак в даній галузі виробники риби зацікавлені в ранній вакцинації, тобто коли риба є відносно молодою/маленькою і має місце відносно великий розкид риби за розміром. Виявилося, що в таких умовах вакцини на основі делеційних мутантних вірусів, як розкрито в міжнародній заявці на патент УМО 2009/027412, можуть в деяких ситуаціях не бути достатньо безпечними: такі рекомбінантні КНМ є надто вірулентними для застосування відносно молодої/маленької риби. Це означає, що на даний час все ще має місце нестача безпечних і ефективних атенуйованих рекомбінантних вакцин для контролю захворювання в такій галузі як вирощування риби.
Задачею даного винаходу є одержання нових рекомбінантних КНУ-вірусів, які можуть бути використані для розробки безпечних і ефективних атенуйованих вакцин для контролю інфекції
КНУ в даній галузі.
Несподівано було виявлено, що рекомбінантний КНУ, в якому відкрита рамка зчитування 57 (ОВЕ57) є неповноцінною, демонструє сильно знижену смертність або відсутність смертності взагалі, навіть у дуже молодого/ммаленького коропа, інфікованого цим герпесвірусним рекомбінантом, і надає імунітет до герпесвірусу кої дикого типу. Такий рекомбінантний КНУ, таким чином, надає безпечний і ефективний атенуйований вакцинний вірус, який може бути відповідно використаний відносно молодого і/або маленького коропа.
Це відкриття є навіть більш несподіваним з точки зору того факту, що ОВЕ57 до даного часу вважався обов'язковим, без якого не було б можливе життя вірусу.
Отже, перший варіант здійснення даного винаходу стосується рекомбінантного герпесвірусу кої, в якому ОВЕ57 є неповноцінним, що призводить в результаті до КНУ, який є атенуйованим і індукує рівень смертності 40 95 або менш у коропа, переважно Сургіпи5 сагріо сагріо або
Сургіпиз сагріо Кої, при інфікуванні вказаним герпесвірусом.
У використовуваному в даному описі значенні "неповноцінний" ОВЕ57 означає ОВЕ57, який більше не є функціональним, тобто більше не здатний до кодування функціонального білка.
Неповноцінний ОНЕ57 у використовуваному в даному описі значенні в результаті призводить до
КНУ, що є атенуйованим до рівня, який індукує рівень смертності 40 95 або менше у коропа.
Така неповноцінність може, наприклад, бути одержана мутацією, такою як вставка або делеція
Ко) одного або більше нуклеотидів в гені, що кодує ОВЕ57, або в його промоторній області. Така мутація може, наприклад, бути мутацією зі зсувом рамки в 5'-сайті гена або делецією (частини) промоторної області або (частини) самого гена.
Прикладом послідовності ДНК ОНЕ57 є послідовність ДНК ОВЕ57, як наведено в Сепрапк під номером доступу МС 009127, де стартовий кодон і стоп-кюдон ОНЕ57 розташовані в положенні 99382 і 100803. Абсолютно очевидно, що розташування ОНЕ57 може відрізнятися в інших КНУ-штамах через природну мінливість. Також через природну мінливість можуть мати місце невеликі відмінності в послідовності ОВЕ57 в одному КНУ-штамі при порівнянні з іншим
КНУ-штамом. Отже, ОВЕ57, як описано в даному документі, є відкритою рамкою зчитування, що має ідентичність послідовності більше ніж 8095 з послідовністю ДНК ОВЕ57, наведеною в
СепбрапкК під номером доступу МС 009127.
Нуклеотидна послідовність області, що містить ОНЕ56, 57 і 58, яка охоплює нуклеотиди 96630-101558, представлена в 5ЕО ІЮО МО: 12. Див. також фіг. 1.
Очевидно, що найбільш екстенсивний шлях створення неповноцінного гена, тобто делеція всього ОВЕ57, призведе в результаті до повної відсутності вироблення білка ОВЕ57.
З практичної точки зору і з точки зору безпеки логічно було б здійснити стадію такої повної делеції. Однак, як випливає з фіг. 1, передбачувана промоторна область розташована в положенні 100212-100261, яка, можливо, задіяна в експресії сусіднього ОНЕ58. Через цю причину мутація в ОНЕ57 переважно не повинна поширюватися на цю область. Таким чином, переважно вводити мутації в ОВЕ57 в область зліва від положення 100212 або справа від положення 100261.
Також на фіг. 1 видно, що дві передбачувані промоторні області розташовані відповідно в положенні 99451-99500 і положенні 99794-99843, які, можливо, можуть бути задіяні в експресії сусіднього ОВНЕ56. Отже, теоретично можливо, що делеція в області в ОНЕ57 перешкоджає експресії ОВЕ5б6. У цьому випадку можливо, що рекомбінантний КНУ, в якому ОВЕ57 є неповноцінним, відповідно до винаходу, просто виявляє себе атенуйованим внаслідок більш низької експресії ОВЕ56. Однак в розділі приклади показано, що 1) ОВЕ56 не є необхідним геном, їі 2) неповноцінний ОНЕ56 не додає внесок в атенуйований характер рекомбінантного
КНУ відповідно до винаходу. У цих прикладах показано, що великі делеції можуть бути внесені в ОВЕ56 без впливу на життєздатність рекомбінантного КНМУ і без значної зміни атенуйованого характеру рекомбінантного КНУ. Це в числі іншого має на увазі, що передбачувані промоторні сайти ОВЕ56, розташовані в ОВЕ57, можуть без проблем бути видалені.
Також з фіг. 1 випливає, що два передбачуваних промоторних сайти для ОВЕ57 розташовані в ОНЕ56 в положеннях 97075-97124 і 98712-98761. Отже, не можна виключати те, що делеція маленької частини ОВЕ57, такої як ОВЕ57 ОеєїІ, забезпечує укорочений, але все ще функціональний ОНЕ57-кодований білок. Для того, щоб виключити цю можливість, вносили велику подвійну делецію ОНЕ56-ОВЕ57, як описано в розділі приклади, яка охоплює область положень 97001-99750. Ця делеція виявляється по суті однаково з одиночними ОНВЕ57- мутантами, як можна побачити на фіг. 5 при порівнянні з фіг. 7. Отже, можна зробити висновок, що кодований ОВЕ57 білок не є необхідним для вірусу.
Делеція тільки маленької частини ОВЕ57 є можливою, вона навіть може бути переважною можливістю, внаслідок причин, наведених вище, але необхідно здійснити деяку обробку, щоб одержаний в результаті укорочений білок не був нефункціональним. Якщо фахівець в даній галузі через яку-небудь причину вирішить видалити менше, ніж повний ОВЕ57, він легко може бути здатний перевірити неповноцінність ОВЕ57: ОВЕ57, що не є неповноцінним, призведе до вірусу, що має дуже високий рівень вірулентності, тобто дуже низький рівень атенуації.
Переважно, рекомбінантний КНУ є додатково неповноцінним по одному або більше вірусних генах, які додають внесок у вірулентність, але не є необхідними для реплікації вірусу. Таким чином, переважна форма цього варіанта здійснення стосується рекомбінантного герпесвірусу кої, відповідно до винаходу, який є неповноцінним щонайменше по одному додатковому гену, який додає внесок у вірулентність, але не є необхідним для реплікації вірусу.
Більш переважна форма цього варіанта здійснення стосується рекомбінантного герпесвірусу кої відповідно до винаходу, який є неповноцінним щонайменше по одному додатковому гену, який додає внесок у вірулентність, де вказаний ген вибраний з групи, що складається з гена тимідинкінази; ОВЕ12: передбачуваного гена рецептора фактора некрозу пухлин (ТМЕ); ОВЕ16: передбачуваного гена зв'язаного з С-білком рецептора (0РСЕВ); ОВЕ134: передбачуваного гена сгомолога інтерлейкіну-10; ОВЕ140: передбачуваного гена тимідилаткінази або будь-якої їх комбінації.
У ще більш переважній формі цього варіанта здійснення рекомбінантний КНМ є додатково
Зо неповноцінним щонайменше по гену тимідинкінази або передбачуваному гену тимідилаткінази.
У іншій ще більш переважній формі цього варіанта здійснення рекомбінантний КНУ, відповідно до даного винаходу, є додатково неповноцінним по гену тимідинкінази і щонайменше по одному додатковому гену, який додає внесок у вірулентність, вибраному з групи, що складається з ОВЕ12: передбачуваного гена рецептора фактора некрозу пухлин (ТМЕ); ОВЕ16: передбачуваного гена зв'язаного з (3-білюом рецептора (пРСА); ОВЕ134: передбачуваного гена гомолога інтерлейкіну-10; або ОВЕ140: передбачуваного гена тимідилаткінази.
У ще більш переважній формі цього варіанта здійснення рекомбінантний КНМ є додатково неповноцінним щонайменше по гену тимідинкінази і передбачуваному гену тимідилаткінази.
У іншій переважній формі цього варіанта здійснення рекомбінантний герпесвірус кої, відповідно до винаходу, представлений в живій формі. Переважно, рекомбінантний герпесвірус кої має здатність відтворювати інфекційні частинки, тобто реплікуватися при введенні в пермісивні еукаріотичні клітини або індивідуумам риби, переважно коропу, більш переважно
Суріїпив5 сагріо, ще більш переважно Сургіпиз сагріо сагріо і/або Сургіпив сагріо Кої.
У альтернативному варіанті здійснення рекомбінантний КНУ, відповідно до винаходу, є додатково неповноцінним по одному або більше вірусних генах, які є необхідними для реплікації (і необов'язково неповноцінним по одному або більше вірусних генах, які додають внесок у вірулентність, але не є необхідними для реплікації вірусу), таким чином забезпечуючи рекомбінантний герпесвірус кої відповідно до винаходу в нереплікативній формі.
Таким чином, альтернативний варіант здійснення стосується рекомбінантного КНУ, відповідно до винаходу, де вказаний герпесвірус представлений в нереплікативній формі. "Нереплікативна форма" означає, що рекомбінантний герпесвірус кої все ще має здатність інфікувати клітини або індивідуумів риби (наприклад, Сургіпив сагріо, Сургіпив сагріо сагріо або
Сургіпиз сагріо Кої), але не здатний реплікуватися для поширення вірусного потомства.
Нереплікативний рекомбінантний штам виробляється інактивацією (за допомогою відомих технологій, таких як вставка, делеція або мутація, наприклад, із застосуванням клонування
ВАС) гена КНУ, який необхідний для реплікації.
Такий делетований вірус культивується в пермісивній клітинній лінії, стабільно експресуючій делетований ген (транскомплементація).
Цей підхід є добре відомим в даній галузі підходом. Крім іншого, він був успішно використаний для різних герпесвірусів, таких як цій пегревмігив 1 (вірус Ауєскі) з делетованим 9Н (Вабіс єї а!ї., 1996) і Воміпе Пегревмігив 1 (Зспгодег апа Кеїї, 1999).
Будь-який ген, який бере участь в реплікації, може бути зроблений неповноцінним для того, щоб одержати рекомбінантний герпесвірус кої, що не реплікується. Іншими словами, будь-який ген, інактивація якого веде до нереплікативного рекомбінантного герпесвірусу кої, може бути делетований. Переважно, ген рекомбінантного КНУ, відповідно до винаходу, який є делетованим для того, щоб забезпечити нереплікативну форму вірусу, вибраний з групи що складається з: ОВЕ25, ОВЕЗ31, ОВЕЗ2, ОВЕЗ34, ОВЕЗ35, ОВЕ42, ОВЕ43, ОВЕ45, ОВЕ51, ОВЕ59,
ОВЕб60, ОВЕ62, ОВЕ65, ОВЕ6б6, ОВЕ68, ОВЕ70, ОВЕ72, ОВЕ78, ОВЕ81, ОВЕ84, ОВЕ89, ОВЕ90,
ОВЕ92, ОВЕ95, ОВЕ97, ОВЕ99, ОВЕ108, ОВЕ115, ОВЕ131, ОВЕ132, ОВЕ136, ОВЕ137, ОВЕ148 і
ОВЕ149.
Рекомбінантний герпесвірус кої відповідно до винаходу переважно містить послідовність вектора штучної бактеріальної хромосоми (ВАС).
Приблизно півтора десятка років тому маніпулювання великими герпесвірусними геномами було значно полегшене за допомогою застосування таких бактеріальних штучних хромосом. Ці вектори дозволяють підтримання і мутагенез вірусного геному ЕзсПегіспіа сої з подальшим відтворенням віріонів потомства трансфекцією плазміди ВАС в пермісивні еукаріотичні клітини.
На першій стадії послідовності для вектора ВАС вводять в герпесвірусний геном загальноприйнятою гомологічною рекомбінацією в інфікованих клітинах. Лінійна дволанцюжкова
ДНК геному герпесвірусів циклізується під час реплікації. Цього достатньо для виділення реплікаційного інтермедіату ВАС-мутанта і перенесення його за допомогою ДНК-трансформації в Е. сої. Це човникове перенесення потрібне тільки один раз для стабілізації системи.
Герпесвірус ВАС потім репродукують і мутують в БЕ. соїї. Гомогенну ДНК клонованого герпесвірусу ВАС човниково переносять зворотно в еукаріотичні пермісивні клітини тільки для відтворення вірусу. Оскільки вірусні функції не є необхідними, вірусний геном залишається сплячим в Е. соїї, при цьому зберігаючи вірусні функції представленими під час клонування. Це є важливим для вірусів, коли процедури іп міго культивування міняють аутентичні властивості ізолятів.
Зо У використовуваному в даному описі значенні термін "гомологічна рекомбінація" означає, що, коли дві різні гомологічні молекули нуклеїнової кислоти зустрічають одна одну, відбувається кросовер і генерується нова комбінація нуклеїнової кислоти. У використовуваному в даному описі значенні термін "послідовність, опосередковуюча гомологічну рекомбінацію," стосується послідовності, що викликає гомологічну рекомбінацію, яка залежить від специфічного рекомбінаційного білка, який каталізує, здійснює і сприяє гомологічній рекомбінації. Такий рекомбінаційний білок переважно діє специфічно на "послідовність, опосередковуючу гомологічну рекомбінацію," і не впливає на інші послідовності.
Послідовності вектора ВАС добре відомі в даній галузі і їх використання в конструюванні рекомбінантних вірусів, таких як герпесвіруси, часто описувалося в даній галузі (Вогвї Е. М,
Нанп О., Ков5гіпомувКі ). Н. 5 Меззепе М. (1999), у. Мігої. 73, 8320-9; Совіез В., Еошгпієг Са., Місне
В., ОеМогае С, Ва)Ї М. 5., Оема5 В., Сійєї ЇЇ. Опйоп Р., Воду А., Зспупів Е., Гіейтід Р.,
Мапаегріаззснеп А., 2008. у. Мігої. 82, 4955-4964; Сема! В., Воцагу С, СШеї Г., Магкіпе-Согпаупой
М., де І ема! І.., Наїд 0. М. 8 Мапаегріаззспеп А. (2006), У. Сп. Мігої. 87, 509-17; Сіпек.., Оаїх М.,
Бопоїіо с1., Мадпег М., КовзгіпомеКі О. Н., Спіпа В., АсКептапп М., МаїКіпе-Согіаупой М. 8
Мапаегріаззснеп А. (2005), у). Сеп. Міго!. 86, 907-17; Меззепе М., СткКоміс І., Наттегвсптіаї М/., едіеєг Н. 4 КозвгіпомуєКкі ОО. Н. (1997), Ргос. Майї). Асай. сі. О5А, 94, 14759-63; Маптіпд 95.,
Совіапіїпо М.. Соц 0. І., УепКіпе М. А. а Сореїапа М. сх. (2005), Мисієїс. Асідх. Ве5. 33, еЗ3б6;
Мадпег М., Ниг5іс5 2. 5 Ковгіпому5Кі ). Н. (2002), Ттепав Містобіої. 10, 318-24).
Послідовність вектора ВАС не обов'язково повинна бути вставлена в ОРВЕ57.
Альтернативно, вона може бути вставлена в інший вірусний ген, який додає внесок у вірулентність, і/або будь-який інший вірусний ген, який є або не є необхідним для вірусної реплікації, і/або будь-яку міжгенну область.
Однак, в більш переважній формі, рекомбінантний герпесвірус кої містить послідовність
ВАС-вектора, яка вбудована в ОВЕ57. Така вставка має ту перевагу, що, за допомогою вбудовування вектора ВАС в ОВЕ57, ОВЕ57 при цьому стає неповноцінним, таким чином, безпосередньо забезпечуючи рекомбінантний КНУ відповідно до винаходу.
Приклад рекомбінантного КНМ відповідно до винаходу був виконаний за допомогою клонування геному КНУ інсерцією модифікованої іохР-фланкованої касети ВАС в ОВЕ55 (див. нижче). Ця вставка привела до ВАС-рекомбінантного вірусу, геном якого стабільно зберігався в бо бактеріях і був здатний генерувати віріони при трансфекції в пермісивні клітини (див. Совіє5 В.,
Еошгпієг Сї., Місне! В., Оемогде С, Ваї М. 5., Оемаї!5 В., СіПеї Г., Огіоп Р., Воду А., Зспупів Е.,
Пентд Е., Мапаегріаззспеп А., 2008, 9. Мігоі. 82, 4955-4964; для подробиць про ВАС-вектор, і див. нижче технічні подробиці). Цей вектор використовували для введення делеції в ОВЕ57.
Термін "вектор ВАС" стосується плазміди, продукованої з використанням Е-плазміди Е. соїЇ, і вектора, який може стабільно зберігатися і вирощувати фрагмент ДНК великого розміру приблизно 300 т.п.о. або більше в бактеріях, таких як Е. сої і ним подібні. Вектор ВАС містить щонайменше одну послідовність ВАС-вектора, необхідну для реплікації ВАС-вектора. Приклади такої області, необхідної для реплікації, містять, але не обмежені ними, точку початку реплікації
Е-плазміди і її варіанти.
У використовуваному в даному описі значенні термін "послідовність вектора ВАС" стосується послідовності, яка містить послідовність, необхідну для функції вектора ВАС.
Необов'язково, послідовність вектора ВАС може додатково містити "залежну від рекомбінаційного білка рекомбінантну послідовність" і/або "селектований маркер".
Подробиці "залежної від рекомбінаційного білка рекомбінантної послідовності" і/або "селектованого маркера" наведені, наприклад, в наведеній вище літературі і в МО 22009/027412.
Незалежно від місця, де вектор ВАС вбудований в геном, переважно, щоб послідовність вектора ВАС була фланкована послідовностями, опосередковуючими гомологічну рекомбінацію, переважно іохР. Також переважно послідовність вектора ВАС містить селектований маркер (див. нижче) У більш переважній формі селектований маркер є лікарським маркером (див. нижче). У іншому переважному варіанті здійснення геном вказаного рекомбінантного герпесвірусу представлений у формі плазміди. Це досягається виділенням циклічних форм вищезазначеного рекомбінантного герпесвірусу кої, що містить послідовність вектора ВАС, і введенням в бактеріальні клітини. Як згадано вище, для винаходу не є необхідним, щоб послідовність вектора ВАС (бактеріальна штучна хромосома) була вбудована в один або більше вірусних генів, які додають внесок у вірулентність або є необхідними для реплікації, за умови, що один або більше із згаданих генів, які сприяють вірулентності або є необхідними для реплікації, зроблені неповноцінними за допомогою технологій генетичної інженерії.
Зо Отже, послідовність вектора ВАС може бути вбудована в будь-яку область вірусного геному, за умови, що ОВЕ57 і переважно один або більше інших вірусних генів, які сприяють вірулентності, також є неповноцінними.
Без сумніву, опосередковані векторами ВАС технології клонування, як описано вище, можуть бути застосовані багато разів: наприклад, перший раз для того, щоб зробити ОВЕ57 неповноцінним, і другий раз для того, щоб зробити неповноцінним додатковий ген.
Послідовність вектора ВАС може в принципі без проблем залишатися представленою в рекомбінантному КНУ, відповідно до винаходу, в подальших застосуваннях. Однак, для застосування герпесвірусу кої відповідно до винаходу, наприклад у вакцині, переважно, щоб більша частина послідовності ВАС була видалена. Це має місце, наприклад, для ВАС- послідовностей, які містять гени, що кодують селектовані маркери, і навіть більшою мірою для генів стійкості. Наявність таких генів у вакцині вважається не тільки необов'язковою, але навіть небажаною.
Таким чином, переважно щонайменше одну частину (наприклад, частину, яка містить ген стійкості або селектований маркер) або більш переважно більшу частину послідовності вектора
ВАС вирізають з геному герпесвірусу, тим самим переважно залишаючи гетерологічну послідовність в сайті вирізання або в колишньому сайті вставки в геномі герпесвірусу. Більш переважно, гетерологічна послідовність має розмір менше ніж 200 нуклеотидів. Вирізання виконується введенням рекомбінантного КНМ в пермісивну еукаріотичну клітину, експресуючу рекомбіназу Сте, яка вирізає ІохР-фланковану послідовність ВАС-вектора.
Отже, переважна форма цього варіанта здійснення стосується рекомбінантного герпесвірусу кої відповідно до винаходу, який характеризується тим, що частина послідовності вектора ВАС вирізається з геному герпесвірусу, тим самим залишаючи гетерологічну послідовність в сайті вирізання або в колишньому сайті вставки, відповідно, в геномі герпесвірусу.
Ї в більш переважній формі цього варіанта здійснення частина послідовності ВАС-вектора, яку вирізають з геному герпесвірусу, містить щонайменше один ген, що кодує селектований маркер і/або ген стійкості.
Також можливо видаляти повністю послідовність касети ВАС-гомологічною рекомбінацією в еукаріотичних клітинах із застосуванням фрагмента ДНК дикого типу вірусного геному, що бо охоплює сайт вставки касети ВАС (наприклад, ОВЕ55, що кодують ТК). Селекція вірусних бляшок, які більше не експресують ЕСЕР (що кодується ВАС-касетою), дозволяє селекцію рекомбінантів, які мають обернений сайт ВАС-вставки відносно послідовності дикого типу.
Рекомбінантний герпесвірус кої, відповідно до даного винаходу, в будь-якій формі, клон ВАС
КНУ ї вищезазначена конструкція КНУ, де щонайменше частина послідовності вектора ВАС вирізана з геному герпесвірусу, можуть бути застосовані для додаткового маніпулювання, включаючи, наприклад, технології генетичної інженерії для того, щоб зробити геном неповноцінним в додаткових специфічних генах. Неповноцінність таких додаткових генів може бути аналогічно одержана із застосуванням технології ВАС, як вже вказано вище.
Хоч рекомбінантний КНУ відповідно до винаходу може бути використаний як вакцина сам по собі (див. нижче), просто для того, щоб захистити рибу, більш конкретно коропа, ще більш конкретно Сургіпив5 сагріо сагріо або Сургіпив сагріо Кої, від захворювання КНУ, він також може бути ефективно використаний як вірус-носій для гетерологічного (тобто не з КНУ) фрагмента
ДНК. У цьому випадку переважні характеристики рекомбінантного КНУ, відповідно до винаходу, будуть повністю використані і на доповнення вірус, наприклад, набуде додаткових властивостей, таких як маркерні властивості, додаткові імунізуючі властивості або властивості ад'юванту. "Маркерні властивості" в цьому значенні означає, що фрагмент гетерологічної ДНК дозволяє напряму або опосередковано встановлювати відмінності між інфекцією польовим вірусом або інфекцією вакцинним вірусом. Прямий шлях для встановлення відмінності між інфекцією польовим вірусом їі інфекцією вакцинним вірусом, наприклад, включає ПЛР із застосуванням праймерів, які специфічно реагують з гетерологічним (тобто не з КНУ) фрагментом ДНК в рекомбінантному КНМ відповідно до винаходу і не реагують з ДНК польового вірусу КНУ.
Непрямий шлях встановлення відмінності між інфекцією польовим вірусом і інфекцією вакцинним вірусом буде, наприклад, включати імунологічну реакцію із застосуванням антитіла, яке специфічно реагує з імуногенним білком, що кодується гетерологічним (тобто не з КНУ) фрагментом ДНК в рекомбінантному КНМ відповідно до винаходу, і не реагує ні з яким білком польового вірусу КНУ.
Таким чином, інший варіант здійснення даного винаходу стосується рекомбінантного КНМ відповідно до винаходу, який містить гетерологічний ДНК-фрагмент, наприклад гетерологічний
Зо ген.
Переважно, такий гетерологічний фрагмент ДНК є гетерологічним геном, який кодує імуногенний білок іншого вірусу або мікроорганізму, що є патогенним для риби, більш конкретно коропа, ще більш конкретно Сургіпив сагріо сагріо або Сургіпи5 сагріо Кої. Більш переважно, гетерологічний ген є Сї глікопротеїном рабдовірусу, що викликає весняну віремію коропа. Такі конструкції при застосуванні у вакцині будуть не тільки захищати коропа від КНУ, але також від весняної віремії коропа.
Придатні промотори для експресії гетерологічних генів в еукаріотичних клітинах широко відомі в даній галузі. Прикладом придатного промотору для експресії гетерологічного гена, наприклад С глікопротеїну рабдовірусу, що викликає весняну віремію коропа, є промотор НСММУ
ІЕ.
Даний винахід додатково стосується способу продукування інфекційних частинок рекомбінантного герпесвірусу кої (КНУ), який включає стадії: (а) введення рекомбінантного КНМ відповідно до винаходу або рекомбінантної ДНК КНУ, що містить геном рекомбінантного КНУ, відповідно до винаходу, в пермісивні еукаріотичні клітини, і (5) культивування клітини-хазяїна для продукування рекомбінантного герпесвірусу кої (КНУ).
Через їх атенуйований характер вищезазначені рекомбінантні герпесвіруси кої відповідно до винаходу і їх ДНК є дуже придатними для імунізації риби, переважно індивідуумів Сургіпиб сагріо сагріо або Сургіпив сагріо Кої, ін'єкцією або бальнеотерапією, або перорально.
Отже, ще один варіант здійснення даного винаходу стосується рекомбінантного герпесвірусу кої відповідно до винаходу і/або ДНК КНУ, що містять геном рекомбінантного герпесвірусу кої, відповідно до винаходу, для застосування в профілактиці і/або терапевтичному лікуванні захворювання у риби, викликаного герпесвірусом кої (КНУ).
Профілактичне застосування являє собою застосування, яке спрямоване на запобігання інфекції або щонайменше клінічним виявам захворювань.
Терапевтичне застосування являє собою застосування вказаного КНМ або ДНК КНУ відносно риби, яка вже має захворювання, що викликається КНУ.
Ще один варіант здійснення даного винаходу стосується рекомбінантного герпесвірусу кої, відповідно до винаходу і/або ДНК КНУ, що містять геном рекомбінантного герпесвірусу кої, відповідно до винаходу, для застосування у вакцині для профілактики і/або терапевтичного бо лікування у риби захворювання, що викликається герпесвірусом кої (КНУ).
Ще один варіант здійснення даного винаходу стосується вакцини для профілактики і/або терапевтичного лікування у риби захворювання, що викликається герпесвірусом кої (КНУ), яка відрізняється тим, що вказана вакцина містить рекомбінантний герпесвірус кої, відповідно до винаходу і/або ДНК КНУ, що містять геном рекомбінантного герпесвірусу кої, відповідно до винаходу, і фармацевтично прийнятний носій.
Ще один варіант здійснення даного винаходу стосується вакцини для профілактики і/або терапевтичного лікування у риби захворювання, що викликається рабдовірусом, який викликає весняну віремію коропів, причому ця вакцина містить рекомбінантний КНМ відповідно до винаходу, який несе ген, що кодує С глікопротеїн вказаного рабдовірусу, який викликає весняну віремію коропів, або послідовність ДНК, що містить геном вказаного рекомбінантного КНУ, і фармацевтично прийнятний носій.
У використовуваному в даному описі значенні термін "вакцина" стосується композиції, здатної до профілактики і/або терапевтичного лікування хазяїна від конкретного захворювання.
Така вакцина може продукувати профілактичну або терапевтичну стійкість.
Фармацевтично прийнятний носій може бути простою водою або буфером. Фармацевтично прийнятний носій може також містити стабілізатори. Він може також містити ад'ювант або може сам бути ад'ювантом.
Звичайно вакцини готують у вигляді рідких розчинів, емульсій або суспензій для ін'єкції або доставки за допомогою занурення риби у воду. Наприклад, рідка емульсія або емульгований концентрат можуть бути приготовані для того, щоб додати їх в резервуар з водою або ванну, де міститься риба. Тверді (наприклад, порошок) форми, придатні для розчинення, або суспензії в рідких основах або для змішування з твердою їжею перед введенням також можуть бути приготовані. Вакцина може бути ліофілізованою культурою в готовій до використання формі для відтворення зі стерильним розріджувачем. Наприклад, ліофілізовані клітини можуть бути відтворені в 0,9 95 сольовому розчині (необов'язково наданому у вигляді частини упакованого вакцинного продукту). Переважною рецептурою ін'єктованої вакцини є емульсія. Рідкі або відтворені форми вакцини можуть бути розбавлені в маленькому об'ємі води (наприклад, від 1 до 100 об'ємів) перед введенням в шприц, резервуар або ванну.
У одній переважній формі цього варіанта здійснення препарат вакцини, що містить
Зо рекомбінантний КНУ-штам, представлений в сухій формі, наприклад в порошкоподібній формі, ліофілізованій формі, у формі пресованої пластинки або у формі таблетки і т. д.
У іншій формі цього варіанта здійснення вказаний вірус може бути у формі культурального тканинного текучого середовища. Вказане текуче середовище може зберігатися в навколишніх умовах, переважно при -70 "С, найбільш переважно у вигляді розчину, що містить гліцерин. У одному конкретному прикладі тканинне культуральне текуче середовище містить 2090 гліцерину.
Рекомбінантний КНУ-штам, розкритий у винаході, може бути перетворений в суху форму рядом способів. Особливо переважною формою висушування є ліофілізація. Перед висушуванням, наприклад процедурою ліофілізації, різноманітні інгредієнти можуть бути додані в середовище, такі як консерванти, антиоксиданти або відновні агенти, різноманітні допоміжні речовини і т. д. Такі допоміжні речовини також можуть бути додані до сухого, наприклад, ліофілізованого вірусу з атенуйованою активністю також після стадії висушування.
Коли рекомбінантний КНМ відповідно до винаходу використовують як компонент вакцини для перорального введення (наприклад, за допомогою занурення або бальнеотерапії), звичайно не буде необхідності введення ад'юванту.
Якщо, однак, препарат вакцини ін'єктують напряму в організм риби, застосування ад'юванту є необов'язковим. Якщо рекомбінантний КНУ відповідно до винаходу має нерепліковану форму, то додавання імуностимуляторів може бути переважним.
Загалом, для того, щоб посилити імунну відповідь, препарат може містити різноманітні ад'юванти, цитокіни або інші імуностимулятори, особливо у випадку, якщо препарати призначені для ін'єкції.
Ад'ювант являє собою імуностимулюючу речовину, що посилює імунну відповідь хазяїна неспецифічним чином. Ад'ювант може бути гідрофільним ад'ювантом, наприклад гідроксидом алюмінію або ортофосфатом алюмінію, або гідрофобним ад'ювантом, наприклад ад'ювантами на основі мінерального масла. Ад'юванти, такі як мурамілдипептид, авідин, гідроксид алюмінію, ортофосфат алюмінію, масла, масляні емульсії, сапоніни, декстрансульфат, глюкани, цитокіни, блок-співполімери, імуностимулюючі олігонуклеотиди і інші відомі в даній галузі, можуть бути змішані з рекомбінантним КНМ відповідно до винаходу. Прикладами ад'ювантів, що часто застосовуються у вирощуванні риби, є мурамілдипептиди, ліпополісахариди, деякі глюкани і 60 глікани ії КарбополФ (гомополімер). Придатними ад'ювантами є, наприклад, вода в масляних
(в/м) емульсіях, м/в емульсії і в/м/в подвійні емульсії. Масляними ад'ювантами, придатними для застосування у в/м емульсії, є наприклад, мінеральні масла або метаболізовані масла.
Мінеральні масла являють собою, наприклад, Ваус!іФ, Магсо!Ф і ОгаКео!Ф; метаболізовані масла являють собою, наприклад, рослинні олії, такі як арахісова олія і соєва олія, або тваринні масла, такі як риб'ячі масла, сквалан і сквален. Альтернативно, солюбілізат вітаміну Е (токоферол), як описано в ЕР 382271, може бути переважно застосований. Особливо придатні м/в емульсії, наприклад, можуть бути одержані, починаючи від 5-50 95 мас/мас, водної фази і 95-50 95 мас/мас, масляного ад'юванту, більш переважно застосовується 20-50 95 мас/мас, водної фази і 80-50 95 мас/мас, масляного ад'юванту. Кількість доданого ад'юванту залежить від природи самого ад'юванту і інформації відносно таких кількостей, наданої виробником.
У переважному варіанті здійснення вакцина відповідно до винаходу додатково містить стабілізатор. Стабілізатор може бути доданий до вакцини, відповідно до винаходу, наприклад, для захисту від руйнування, для збільшення терміну зберігання або для поліпшення ефективності заморожуванням-висушуванням. Придатними стабілізаторами є, в числі інших, 5РОИаА (Воматік еї аї., 1950, 9. Васієгіоіоду, мої. 59, р. 509), сепароване молоко, желатин, бичачий сироватковий альбумін, вуглеводи, наприклад сорбіт, маніт, трегалоза, крохмаль, сахароза, декстран або глюкоза, лактози, білки, такі як альбумін або казеїн, або продукти їх руйнування, і буфери, такі як фосфати лужних металів.
Антибіотики, такі як неоміцин і стрептоміцин, можуть бути додані для запобігання потенційному росту мікроорганізмів.
На доповнення, вакцина може містити одну або більше придатних поверхнево-активних сполук або емульгаторів, наприклад брапФ або ТмеєепФ. Вакцина може також містити так званий "носій". Носій являє собою сполуку, до якої КНУ-вірус (або у формі вірусної частинки, або у формі ДНК) відповідно до винаходу приєднується, не зв'язуючись з нею ковалентно.
Такими основами в числі іншого є біомікрокапсули, мікроальгінати, ліпосоми і макрозолі, відомі в даній галузі. Спеціальною формою такого носія є Іском. Абсолютно очевидно, що домішування інших стабілізаторів, носіїв, розріджувачів, емульсій і подібного до вакцин, відповідно до винаходу, також входить в обсяг даного винаходу. Такі добавки, наприклад, описані в добре відомому керівництві, такому як: "Нетіпдіоп: Ше зсіепсе ап ргасіїсе ої
Зо рпаптасу" (2000, І ірріпсої, ОБА, ІЗВМ: 683306472), і "Меїегіпагу массіпоіоду" (Равіогеї Р. еї аї., 1997, ЕІземієгї, Атвівгдат, ІЗВМ: 0444819681).
Рекомбінантний КНМ при застосуванні в його сухій формі у вакцині може додатково містити текуче середовище відтворення, переважно стерильну воду, сольовий розчин або фізіологічний розчин. Він також може включати невеликі кількості залишкових матеріалів з процесу виробництва, таких як клітинні білки, ДНК, РНК і т. д. Хоч ці матеріали не є добавками самі по собі, вони можуть, проте, бути представлені в складі вакцини.
Вакцина може бути введена рибі індивідуально перорально, наприклад з кормом або за допомогою примусового перорального введення, або за допомогою ін'єкції (наприклад, через внутрішньом'язовий або внутрішньоочеревинний шлях).
Альтернативно, вакцина може бути введена одночасно всій популяції риби, що міститься у водному об'ємі, розпиленням, розчиненням і/або імерсією вакцини. Ці способи застосовні для вакцинації всіх типів риби, наприклад харчова і декоративна риби, і в різноманітних умовах навколишнього середовища, таких як ставки, акваріуми, природне середовище мешкання і резервуари зі свіжою водою.
Додатковий варіант винаходу стосується ДНК-вакцини, що містить рекомбінантний. КНУ відповідно до винаходу.
ДНК-вакцини відповідно до винаходу по суті не відрізняються від вакцин, що містять рекомбінантний КНМ відповідно до винаходу, в тому розумінні, що вони містять геном рекомбінантного КНУ відповідно до винаходу.
Вони легко можуть бути введені за допомогою внутрішньошкірного введення, наприклад, із застосуванням безголкового впорскування, такого як ЧепесбипФ). Цей шлях введення доставляє
ДНК напряму в клітини тварини, яка повинна бути вакцинована. Переважна кількість рекомбінантної ДНК КНУ відповідно до винаходу в фармацевтичній композиції відповідно до винаходу (як наведено нижче) знаходиться в діапазоні між 10 пг ії 1000 мкг. Переважно застосовуються кількості в діапазоні між 0,1 і 100 мкг. Альтернативно, риба може бути занурена в розчини, що містять наприклад, між 10 пг і 1000 мкг/мл ДНК, яка повинна бути введена. Всі ці технології і шляхи введення добре відомі в даній галузі.
Переважно, вакцину, відповідно до винаходу, складають у формі, придатній для вакцинації ін'єкцією або імерсією, такої як суспензія, розчин, дисперсія, емульсія і тому подібне.
Схема дозування для введення вакцини відповідно до винаходу в цільовий організм може бути внесенням одиничної або множинних доз, які можуть бути введені в один і той же час або послідовно чином, сумісним з дозуванням і рецептурою, і в такій кількості, яка буде імунологічно ефективною. У компетенції фахівця в даній галузі визначення того, чи є лікування "імунологічно ефективним", наприклад, введенням випробувальної стимулюючої інфекції вакцинованим тваринам і подальшим визначенням у цільових тварин клінічних ознак захворювання, серологічних параметрів або вимірюванням повторного виділення патогену.
Те, що складає "фармацевтично ефективну кількість" для вакцини відповідно до винаходу, яка основана на рекомбінантному КНМ або рекомбінантній ДНК КНУ відповідно до винаходу, залежить від необхідного ефекту і від цільового організму. Визначення ефективної кількості є базовою навичкою рядового фахівця. Переважна кількість рекомбінантної ДНК КНУ, відповідно до винаходу, що міститься в фармацевтичній композиції відповідно до винаходу, була описана вище.
Переважна кількість живої вакцини, що містить штам рекомбінантного КНУ-вірусу, відповідно до винаходу, виражена, наприклад, у вигляді бляшкоутворюючих одиниць (БУО).
Наприклад, для живого вірусного вектора діапазон доз між 1 і 109 бляшкоутворюючих одиниць (БУС) з розрахунку на дозу на тварину може бути переважно застосований; переважно діапазон між 102 і 105 БУО/дозу. Багато, які шляхи введення можуть бути застосовані, всі з яких відомі в даній галузі. Вакцини, відповідно до винаходу, переважно вводяться рибі за допомогою ін'єкції (внутрішньом'язовий або внутрішньоочеревинний шлях), імерсії, занурення або перорально.
Протокол для введення може бути оптимізований згідно зі стандартною практикою вакцинації.
Якщо вакцина містить нереплікативну форму рекомбінантного КНУ, відповідно до винаходу, доза буде виражена у вигляді кількості частинок нереплікативного вірусу, яка повинна бути введена. Тоді доза звичайно буде трохи вище, ніж при введенні частинок живого вірусу, через те, що частинки живого вірусу реплікуються деякою мірою в цільовій тварині, перед тим як вони видаляються імунною системою. Для вакцин на основі частинок нереплікативного вірусу кількість частинок вірусу в діапазоні приблизно від 107 до 109 частинок звичайно буде придатною.
Переважно, вакцина вводиться за допомогою імерсії, особливо, коли застосовують живий рекомбінантний КНУ, відповідно до винаходу. Це є особливо ефективним у випадку застосування таких вакцин в установці для промислового вирощування у воді.
Опис креслень
Фіг. 1: схематичне представлення області геному СуНМУ-3, що охоплює ОВЕ57. Вказані координати АТО і стоп-кодонів кожного ОНВЕ (відповідно до номера доступу в Сепрапк
МО 009127). Представлені координати передбачуваних промоторів (Р), ідентифікованих аналізами комп'ютерної симуляції в або близько до ОВЕ56б і ОВЕ57. Число після букви Р ідентифікує ВЕ під контролем ідентифікованої промоторної послідовності. Зверху представлені вибрані послідовності, які повинні бути делетовані для того, щоб зробити ОНЕ56 або ОВЕ57 недіючими. Вказані координати делецій.
Фіг. 2, 3: схема послідовності стадій, виконаних для продукування рекомбінантних плазмід
НІ ВАС даїК, делетованих по ОВЕ57 (фіг. 2) або ОВЕЗ56 (фіг. 3), і для демонстрації відтворення інфекційного вірусу з продукованих плазмід. Області ОВЕ57 або ОВЕ56, як ідентифіковано на фігурі 1, були заміщені експресійною касетою даїК із застосуванням гомологічної рекомбінації в
Е. соїї. Для відтворення інфекційного вірусу з локусом тимідинкінази (ТК) дикого типу (ревертантні штами РІ ВАС), рекомбінантні плазміди котрансфікували в пермісивні клітини ССВ з плазмідою РОЕМТ-ТК. Для відтворення інфекційного вірусу з укороченою формою ТК (усічені штами Р. ВАС), рекомбінантні плазміди трансфікували в клітини ССВ, експресуючі рекомбіназу
Сте.
Фіг. 4: схема послідовності стадій, виконаних для продукування рекомбінантних плазмід Бі.
БО ВАС, делетованих по ОВЕ57 і ОВЕ56 (ОВЕ56-57), і для демонстрації відтворення інфекційного вірусу з продукованих плазмід. Область ОНЕ56-57, як ідентифіковано на фіг. 1, заміняли експресійною касетою даїК із застосуванням гомологічної рекомбінації в Е. соїї. Експресійну касету даІК потім видаляли гомологічною рекомбінацією з синтетичною послідовністю ДНК, що відповідає областям геному КНУ, фланкуючим експресійну касету даіїК (ОВЕ56-57 касета ЮОеї).
Для відтворення інфекційного вірусу з локусом тимідинкінази (ТК) дикого типу (ревертантні штами РІ ВАС) рекомбінантну плазміду котрансфікували в пермісивні клітини ССВ з плазмідою раєЕМТ-ТК. Для відтворення інфекційного вірусу з укороченою формою ТК (усічені штами РІ.
ВАС), рекомбінантну плазміду трансфікували в клітини ССВ, експресуючі рекомбіназу Сте.
Фіг. 5: тести безпеки (А-О) і вакцинації/стимуляції (Е-Сб) рекомбінантів ОВЕ57 з однієї бо делецією. Безпеку РІ ВАС, усіченого по ОВЕ57 Ое!/1-даїК (А), і РІ ВАС, усіченого по ОВЕ57
Реїі2-даІК (В), штамів тестували, як описано в прикладах (Тести безпеки), на звичайному коропі (віком 7 місяців, середня маса 3,74 г, п-20). Усічений штам РІ ВАС (С) і імітуючу інфекцію (0) застосовували як позитивний і негативний контролі, відповідно. Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем 0 як вихідною точкою. Через шість тижнів після інфекції рекомбінантами ОВЕ57 з одиночною делецією (Е і Е), рибу стимулювали, як описано в прикладах (вакцинація/стимуляція). Імітовано інфікованих риб застосовували як контролі (С). Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем 42 як вихідною точкою.
Фіг. 6: безпека рекомбінантів ОВЕ56 з одиночною делецією.
Безпеку РІ ВАС, усічених по ОНЕБ56б Ое!1-даїК (А), і РІ ВАС, усічених по ОВЕБ56 Оев!12-даї!к (В), штамів тестували, як описано в прикладах (Тести безпеки), на звичайному коропі (вік 7 місяців, середня маса 3,74 г, п-20). Усічений штам БІ ВАС (С) і імітуючу інфекцію (0) застосовували як позитивний і негативний контролі, відповідно. Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем 0 як вихідною точкою.
Фіг. 7: тести безпеки (А-С) і вакцинації/стимуляції (0-5) штаму РІ. з усіченою ВАС ОВЕ56-57 реї. Безпеку штаму РІ з усіченою ВАС ОВЕ56-57 Ов! (В) тестували, як описано в прикладах (Тести безпеки), на звичайному коропі (вік 7 місяців, середня маса 4,41 г, п-30). Штам КІ з усіченою ВАС (А) і імітуючу інфекцію (С) застосовували як позитивний і негативний контролі, відповідно. Імітуючу інфекцію виконували на дубльованих групах. Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем 0 як вихідною точкою.
Тести вакцинації/стимуляції (О0-(35). Риб (п-15), вакцинованих штамом РІ з усіченою ВАС
ОВЕБ56-57 Овєї, стимулювали КНУ РЇ -штамом через З тижні (0) або 6 тижнів (Е) після вакцинації, як описано в прикладах (вакцинація/стимуляція). Дубльовані групи імітовано інфікованих риб застосовували як контролі (Е і С). Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем стимуляції як вихідною точкою.
Фіг. 8: тести безпеки (А-С) і вакцинації/стимуляції (0-5) штаму РІЇ з ревертантною ВАС
ОВЕБ56-57 Оєї. Безпеку штаму Р. з ревертантною ВАС ОВЕ56-57 Ов! (В) тестували, як описано в прикладах (Тести безпеки), на звичайному коропі (вік 7 місяців, середня маса 3,74 г, п-30). РІ.
ВАС-ревертантний штам (А) і імітуючу інфекцію (С) застосовували як позитивний і негативний
Зо контролі, відповідно. Імітуючу інфекцію виконували на дубльованих групах. Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем 0 як вихідною точкою.
Тести вакцинації/стимуляції (0-2). Риб (п-15), вакцинованих штамом РІ з ревертантною
ВАС ОВЕ56-57 Оєї, стимулювали Рі-штамом КНМ через З тижні (0) або 6 тижнів (Е) після вакцинації як описано в прикладах (вакцинація/стимуляція). Дубльовані групи імітовано інфікованої риби застосовували як контролі (Е і С). Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем стимуляції як вихідною точкою.
Приклади а. Клітини і віруси. Клітини мозку Сургіпив5 сагріо (ССВ) (Мешкігсий еї аї., 1999) культивували в мінімальному підтримуючому середовищі (МЕМ, Іпмйтодеп), що містить 4,5 г/л глюкози (моногідрат Ю-глюкози, МегекК) і 10 95 фетальної телячої сироватки (ЕС5). Клітини культивували при 25 "С у вологій атмосфері, що містить 5 95 СО». Штам РІ Суну-3 виділяли з нирки риби, яка померла від КНМ (СЕВ Магіоіє, ВеїІдіит). р. Плазміда ВАС Суну-3. Плазміду ВАС РІ Сунум-3 застосовували як батьківську плазміду для продукування рекомбінантів СУНУ-3. Ця плазміда була детально описана в Созіє5 вї аї. (2008) і в міжнародній заявці на патент УУО 2009/027412. Плазміда ВАС РІ Сунум-3 являє собою клон інфекційної штучної бактеріальної хромосоми (ВАС) геному штаму РІ СунНу-3. У цій плазміді іохР-фланкована ВАС-касета вбудована в ТК-локус СУНМ-З (ОВЕ55). с. Продукування рекомбінантних плазмід ГІ ВАС ОВЕ57 СунНу-3 із застосуванням даїК- позитивної селекції в бактеріях. Дві рекомбінантні плазміди ГІ ВАС Суну-3 з делецією в локусі
ОВЕ57 (див. ОВЕ57 Ое11 і ОВЕ57 Оеї2 на фіг. 1) продукували із застосуванням даїЇК-позитивної селекції в бактеріях, як описано раніше (У/аптіпа еї аї., 2005) (фіг. 2). Рекомбінаційний фрагмент складався з гена галактокінази (дак) (1231 п.о.), фланкованого послідовностями з 50 п.о., гомологічними областям геному СунНм-3, фланкуючим послідовність, яка повинна бути делетована (фіг. 1).
Ці фрагменти продукували за допомогою ПЛР, застосовуючи вектор радаїЇК як матрицю. Для ампліфікації застосовували наступні праймери (див. таблицю 1, послідовність праймера): для продукування делеції ОВЕ57 Оеє!1: праймери ОВЕ57 ОвїІйм ії ОВЕ57 ОеїПем, що приводять до амплікона ОВЕ57 Ое!11-даІК; для продукування делеції ОВЕ57 Оєі2: праймери ОВЕ57 Оеі2Ім і
ОВЕ57 ОевіІ2гєм, що приводять до амплікона ОВЕ57 Оє!І2-даіК. Продукт ампліфікації очищали бо (ОіАдиіскК Се! Ехігасіюп Кі). Потім електрокомпетентні клітини 5МУ102, що містять плазміду РІ.
ВАС Суну-3, електропорували з 50 нг продуктів ПЛР, описаних вище. Електропоровані клітини висівали на чашки на тверде мінімальне середовище Мб63, доповнене 2095 галактозою і хлорамфеніколом (17 мкг/мл), для відбору бактерій, в яких відбулася гомологічна рекомбінація.
На закінчення, одержані колонії висівали штрихом на індикаторні планшети МакКонкі, як описано в іншому місці, для підтвердження продукування даЇК-позитивних клонів. Рекомбінантні молекули ВАС ампліфікували і очищали (ОІАСЕМ Іагде-Сопвігисі Кі), і їх молекулярну структуру контролювали із застосуванням комбінованого підходу рестрикційна ендонуклеаза- саузерн-блотинг, ПЛР і секвенування.
Таблиця 1
Олігонуклеотиди, застосовувані для ампліфікації ПЛР
Координати підкресленої - й й послідовності відповідно до
Праймер Послідовність номера доступу в Сепрапк.
МС 009127 есе е ее васеве постатесевААсОсССТ
ОВЕ57 ОеїЇй ох чити ж ужрчич уч суучеричичня | 17 по. 99551-99599
САССОССТОСБАОСТССС
ГОТТОАСААТТААТСАТС
ОСА
МОСТСАТСАТСТОСОИССО
ОВЕ57 Овіїгтеу ЕСАТССАСИСОСССТТО | 71по. 99743-99694 юеСсАсАспсАвАОастТТсСА
ССАСТОТОСТОСТОСТТ-У ню шиншили 5
СТТСААССАССАСТАСОС
ОВЕ57 Оеідім чну ри щ прон 74 п.о. 99894-99943 сптєтасаАтеАСеСсТо
ТОАСААТТААТСАТСОСЄ
САУ
Таблиця 1 (продовження)
Координати підкресленої - й й послідовності відповідно до
Праймер Послідовність номера доступу в Сепрапк.
МС 009127 і «. ствдоса га гпИлЛАСОос мтесАтТеАдОсотОастасСеСт
ОВЕ57 Оеї2гем І. ктетосттстееАА т 74 п.о. 100161-100112 сАТСТастттОасСАбАОасє
САССАСТОТОСТОСТСС
ТТ-У "Праймери представляють послідовності, гомологічні СунНм-З-геному (підкреслені послідовності) і експресійній касеті даїК. а. Відтворення інфекційного вірусу з рекомбінантної плазміди Р ВАС ОВЕ57 Сунм-3.
Плазміди ВАС Сунм-3 трансфікували (І іроїесіатіпе Ріи5, Іпийтодеп) в пермісивні ССВ. Для продукування плазміди ВАС одержані штами з локусом ТК дикого типу, плазміди ВАС Сунм-3 котрансфікували в клітини ССВ разом з вектором раєМТ-ТК (молекулярне співвідношення 1:75). Через сім днів після трансфекції вірусні бляшки, негативні відносно ЕСЕР-експресії (ВАС- касета кодує ЕСіЕР-експресійну касету), відбирали і збагачували трьома послідовними раундами очищення бляшок. Подібним чином для відтворення віріонів з усіченою ВАС-касетою з вірусного геному, плазміди ВАС котрансфікували в клітини ССВ разом з вектором рЕРБІМЗ-
МІ 5-Сте, що кодує рекомбіназу Сте, злиту з сигналом ядерної локалізації (Совіе5 вї а!.; 2008 МІ) (молекулярне співвідношення: 1:70). е. Продукування рекомбінантних плазмід ОВЕ5б6 СунНмМ-3 РІ ВАС із застосуванням даїкК- позитивної селекції в бактеріях. Дві рекомбінантні плазміди ГІ ВАС Суну-3 з делецією в локусі
ОВЕ56 (див. ОНЕБ6 Оеї! ії ОВЕБ56 Ое!2 на фіг. 1) продукували із застосуванням адаї К- позитивної селекції в бактеріях, як описано раніше (У/аппіпо сеї аї., 2005) (фіг. 3). Рекомбінаційний фрагмент складався з гена галактокінази (дак) (1231 п.о.), фланкованого послідовностями з 50 п.о., гомологічними області, фланкуючій послідовність геному СУНУ-3, яка повинна бути делетована (фіг. 1). Ці фрагменти продукували за допомогою ПЛР із застосуванням вектора рдаїК як матриці. Застосовували наступні праймери для ампліфікації (див. таблицю 2 для послідовності праймера): для продукування делеції ОНЕБ56 ОеєїІ: праймери ОНЕБ56 ОеїІйи Її ОВЕ56 Оеїгем, що приводять до амплікона ОНЕ5б6 ОеєїІ-даіїК; для продукування делеції ОВЕ5б Оеєі2: праймери
ОВЕБ5б ОєІ2лм і ОВЕ5б ОвєіІ2гєм, що приводять до амплікона ОВЕ5б Оеї2-даіК. Продукт ампліфікації очищали (ОІАдиціск Сіеї Ехігасіюп Кі). Потім електрокомпетентні клітини 5М/У102, що містять плазміду СУНМ-3 РІ ВАС, електропорували з 50 нг продуктів ПЛР, описаних вище.
Електропоровані клітини висівали на чашки на тверде мінімальне середовище Мб3, доповнене 20956 галактозою і хлорамфеніколом (17 нг/мл), для відбору бактерій, в яких відбулася гомологічна рекомбінація. На закінчення, одержані колонії висівали штрихом на індикаторні планшети МакКонкі, як описано в іншому місці, для підтвердження продукування даїк-
Зо позитивних клонів. Рекомбінантні молекули ВАС ампліфікували і очищали (ОІАСЕМ І агде-
Сопвігисі КІВ, і їх молекулярну структуру контролювали із застосуванням комбінованого підходу рестрикційна ендонуклеаза-саузерн-блотинг, ПЛР і секвенування.
Таблиця 2
Олігонуклеотиди, застосовувані для ампліфікації ПЛР
Координати підкресленої - й соя послідовності відповідно до
Праймер Послідовність П.О. номера доступу в Сепрапк.
МО 009127 ій
ТеДОСАТСОСДОСТСАССА
ОсСтТТОАОасСтТІСТСССОсСАТ
ОВЕ56 ОеїТ й | | 74 п.о. 97475-97524
СТАСТОВСОССАСССТОТТ
Асад ттавтомТеЧось
З
СООСОДОСТОАТТТСОСТС
ОНЕБ5Б6 ей геу АТОАОСАЛАТССЛІТОСО | опо. 98361-98312 вессААсАОоСАОсТСАОс
АСТОТССТОСТеСтТТ-У нІ?"нІТЯ ІИИОВВВМВЛОВОВЛВВВИМОТО НЯ зАтеасОогТАсСОоТесОоСсИг
ЗСОССАСТТОЛССТТССТС
ОВЕ56 Оеідім пупицанцнр ані адтьстутюци 74 п.о. 97275-97324
АсСОТСеСССаТСАССТОТІ
ЗАСААТТААТСАТСИОИОСА-
ХОСАСАССАТСАССАТСТ.
ОВЕ56 Овідгеу ЗІСССАТОТСТОСССЛАСО | топо. 98561-98512 п АСАССОСТОАСТСАОСАС аТосСтастТостт-3: "Праймери представляють послідовності, гомологічні геному СуНмМ-3 (підкреслені послідовності) і експресійній касеті даїК.
І. Відтворення інфекційного вірусу з рекомбінантної плазміди ОНЕ56 СУуУНУ-3 РІ. ВАС.
Плазміди СУНУ-3 ВАС трансфікували (І іроїесіатіпе Ріи5, Іпийгодеп) в пермісивні ССВ. Для продукування одержаних з плазміди ВАС-штамів з локусом ТК дикого типу плазміди ВАС Сунм-
З котрансфікували в клітини ССВ разом з вектором раєМТ-ТК (молекулярне співвідношення 1:75). Через сім днів після трансфекції вірусні бляшки, негативні по ЕСЕР-експресії (ВАС-касета кодує ЕСЕ; -експресійну касету), відбирали і збагачували трьома послідовними раундами очищення бляшок. Подібним чином, для відтворення віріонів з усіченою ВАС-касетою з вірусного геному, плазміди ВАС котрансфікували в клітини ССВ разом з вектором РЕРІМЗ3-МІ 5-
Сте, що кодує рекомбіназу Сте, злиту з сигналом ядерної локалізації (Сов5іев5 еї аі!.; 2008 УМІ) (молекулярне співвідношення: 1:70). 9. Продукування рекомбінантних плазмід ОВЕ56-57 Сунм-3 РІ ВАС із застосуванням даїк- позитивної і негативної селекції в бактеріях. Рекомбінантні плазміди Р ВАС Суну-3 з делецією в локусах ОВЕ56 і ОВЕ57 (фіг. 1) продукували із застосуванням даЇК-позитивної і негативної селекції в бактеріях, як описано раніше (У/агтіпа еї а!., 2005) (фіг. 43. Перший рекомбінаційоний процес (даіК-позитивна селекція) здійснювали для заміщення ідентифікованої послідовності
ОВЕ56 і ОВЕ57 геном галактокінази (даїК) (1231 п.о.). Рекомбінаційний фрагмент складався з гена даїК, фланкованого послідовностями з 50 п.о., гомологічними області геному СуУНУ-3, фланкуючої послідовності, яка повинна бути делетована (фіг. 1) (ОВЕ56-57 ЮОе!-даїК, фіг. 4).
Цей фрагмент продукували за допомогою ПЛР із застосуванням праймерів ОВЕ56-ОВЕ57 Ов! і ОВЕ56-ОВЕ57 Овігем (Таблиця 3) і вектора рдаїК як матриці. Продукт ампліфікації очищали (ОСіАдиіскК Се! Ехігасіоп КіЮ. Потім електрокомпетентні клітини 5МУ102, що містять плазміду
СунУ-3 РІ ВАС, електропорували з 50 нг продукту ПЛР, описаного вище. Електропоровані клітини висівали на чашки на тверде мінімальне середовище Мб3, доповнене 20 95 галактозою і хлорамфеніколом (17 мкг/мл), для відбору бактерій, в яких відбулася гомологічна рекомбінація.
На закінчення, одержані колонії висівали штрихом на індикаторні планшети МакКонкі, як описано в іншому місці, для підтвердження продукування даІК-позитивних клонів. Рекомбінантні молекули ВАС ампліфікували і очищали (ОІАСЕМ Іагде-Конструкція Кі), і їх молекулярну структуру контролювали із застосуванням комбінованого підходу рестрикційна ендонуклеаза- саузерн-блотинг, ПЛР і секвенування. Другий рекомбінаційний процес (даІК-негативна селекція) виконували для видалення даЇК-касети з плазміди Р ВАС ОВЕ56-57 Юе!-даІК. Застосовували синтетичний фрагмент ДНК з 499 п.о. (ОВЕ56-57 касета Оеєї, див. нижче) для досягнення цієї мети. Він складається з послідовності, гомологічної області геному СунНм-3, фланкуючої послідовності, яка повинна бути делетована: 250 п.о. (координати з 96751 по 9700, номер доступу в Сепрапк МС 009127) перед геном адаїК і 249 п.о. (координати з 99751 по 100000 з делецією основи 99760, номер доступу в Сепрапк МС 009127) опісля гена даїК.
Електрокомпетентні клітини 5МУУ102, що містять плазміду Р ВАС ОВЕ56-57 ОЮеї!-даїК, електропорували з 50 нг продукту ПЛР, описаного вище. Електропоровані клітини висівали на чашки на тверде мінімальне середовище, доповнене 2-деоксигалактозою, для відбору бактерій, в яких відбулася гомологічна рекомбінація (розщеплення 2-деоксигалактози даіїК продукує токсичні продукти). Рекомбінантні молекули ВАС ампліфікували і очищали (О1ІАСЕМ І агде-
Сопвігисі КІВ, і їх молекулярну структуру контролювали із застосуванням комбінованого підходу рестрикційна ендонуклеаза-саузерн-блотинг, ПЛР і секвенування. Касета ОВЕ56-57 Ові!: в. шоксавссацієстюсадочієвашавсасюдссісснессподісасозсваюдсадасоассавсвассісоє засоаонесцісадаасацаднеснавасашсдасоссюєсіссвасоавовассасістассвацсву сво свдоассасаююссювесавасцевсасвасасссюцчасадососвосссвсасвосацієчесасюсноссї сідчацідсасовсісцієвадаісаавсіснавосасаієіівасваансаювіадсссасвозадососіса сансвозачесзаавосюсатвавіюацосісваддчасосоаваававоудааооаваюзвацчавстаюсіюва савчачснсвассассвсівсоасснодевзаєассасюасадсаодосссювдассосюсноезвовасавос юесерасоіваща
Таблиця З
Олігонуклеотиди, застосовувані для ампліфікації ПЛР
Координати підкресленої - й й послідовності відповідно до
Праймер Послідовність номера доступу в Сепрапк.
МО 009127 ех пеССТОСАСАвССССАОсСС ре ЕУСАСАОСАСТСОССАСТСТ | топо. 96951-97000
ТССТОТТОАТСАССАСТОТС сТОСТеСТтІУ
І
ДАСССОТАСАСОАСОСОСТО
- | А паСАОСТТСАТСТІСАСИаА
ОНЕББОНЕБ Ананас яннтМкон! тд по, 99800-99751 соте ТОСАСССТОТТОАСА
АТТААТС АТСОСОСА-У ." "Праймери представляють послідовності, гомологічні геному СуНмМ-3 (підкреслені послідовності) і експресійній касеті даїК. п. Відтворення інфекційного вірусу з рекомбінантної плазміди ОВЕ56-57 Сунм-3 РІ ВАС.
Плазміди ВАС Сунм-3 трансфікували (І іроїесіатіпе Ріи5, Іпийтодеп) в пермісивні ССВ. Для продукування плазміди ВАС, одержаної зі штаму з локусом ТК дикого типу, плазміди ВАС Сунм-
З котрансфікували в клітини ССВ разом з вектором раєМТ-ТК (молекулярне співвідношення 1:75). Через сім днів після трансфекції вірусні бляшки, негативні по ЕСЕР-експресії (ВАС-касета кодує ЕСЕ; -експресійну касету), відбирали і збагачували трьома послідовними раундами очищення бляшок. Подібним чином, для відтворення віріонів, з усіченою ВАС-касетою з вірусного геному, плазміди ВАС котрансфікували в клітини ССВ разом з вектором рРЕРІМЗ3-МІ 5-
Сте, що кодує рекомбіназу Сте, злиту з сигналом ядерної локалізації (Сов5іев5 еї аі!.; 2008 УМІ) (молекулярне співвідношення: 1:70). і. Тести безпеки
Звичайних коропів акліматизували в бО-літрових резервуарах при 24 "С протягом 10 днів.
Коропів (біомаса 50 г риби/л) занурювали на 2 год. у воду, що містить 4, 40 або 400 БУО/мл
КНМ-штаму, який повинен бути тестований. Контрольну групу (імітаційно інфіковану) занурювали у воду, в яку додавали рівний об'єм культурального середовища. Наприкінці інкубаційного періоду риб повертали в більший резервуар. Вірусні інокуляти титрували перед інокулюванням і зворотно титрували після інокулювання для забезпечення того, щоб дози були еквівалентними між групами. Риб перевіряли щодня на клінічні ознаки захворювання КНМ і мертвих риб видаляли. . Вакцинація/стимуляція
Звичайних коропів акліматизували в бО-літрових резервуарах при 24 "С протягом 10 днів.
Для вакцинації коропів (біомаса 50 г риби/л) занурювали на 2 год. у воду, що містить 4,40 або 400 БУО/мл КНУ-штаму, який повинен бути тестований. Наприкінці інкубаційного періоду рибу повертали в більший резервуар. Через З тижні або 6 тижнів після вакцинації риб стимулювали вірулентним КНМ витримуванням спільно з рибами, інфікованими безпосередньо перед їх випусканням в резервуар з вакцинованою рибою. Цих риб інокулювали імерсією у воду, що містить 300 БУО/мл вірулентного батьківського штаму РГ., протягом 2 год. Двох інфікованих риб випускали в кожний резервуар, що містить вакциновану рибу.
К. Результати безпеки і стимуляції
Безпеку штамів РІ ВАС, усіченого по ОВЕ57 ЮОе!1-даїК (фіг. 5 А), і РІ ВАС, усіченого по
ОВЕ57 Ое!ї2-даїК (фіг. 58), тестували, як описано в прикладах (Тести безпеки), на звичайному коропі (вік 7 місяців, середня маса 3,74 г, п-20). Усічений штам РІ ВАС (фіг. 5С) і імітуючу інфекцію (фіг. 50) застосовували як позитивний і негативний контролі, відповідно. Кількості процентів коропів, що вижили, виражали відповідно до днів після інфекції з днем 0 як вихідною точкою. Через шість тижнів після інфекції рекомбінантами ОВЕ57 з одиночною делецією (фіг. 5Е і ЕР) риб стимулювали, як описано в прикладах (вакцинація/стимуляція). Імітовано інфікованих риб застосовували як контролі (фіг. 52). Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем 42 як вихідною точкою.
З фіг. 5А і В очевидно, що делеційний мутант ОВЕ57, відповідно до винаходу, є безпечним, навіть при застосуванні відносно маленьких риб.
Також очевидно з фіг. 5Е і Е, що делеційний мутант КНМ ОВЕ57, відповідно до винаходу, є дуже придатним як ефективна вакцина, особливо при введенні в дозі 40 БУО/мл або вище.
Безпеку РІ ВАС, усіченого по ОВЕБ56 Оеї!1-даїК (фіг. бА), і ГІ ВАС, усіченого по ОВРБб Оев!12- заїК (фіг. 68), штамів тестували, як описано в прикладах (Тести безпеки), на звичайному коропі (вік 7 місяців, середня маса 3,74 г, п-20). Штам Р. з усіченою ВАС (фіг. 6С) і імітуючу інфекцію (фіг. 60) застосовували як позитивний і негативний контролі, відповідно. Кількості процентів коропів, що вижили, виражені відповідно до днів після інфекції з днем 0 як вихідною точкою. Як очевидно з фіг. бА і В, делеційні мутанти ОВЕ56 демонструють вірулентність, яка приблизно порівнянна з вірулентністю вірусу дикого типу (Порівняння панелей А і В з панеллю С).
Як видно з фіг. 7 і 8, КНУ, що несе делецію в обох ОВЕ57 і ОВЕ56, демонструє безпеку і профіль ефективності, порівнянні з КНУ, що несе одиночну делецію ОВЕ57.
Посилання
Аокі Т., Нігопо І., Китокажа К., Гикида Н., Манагу В., ЕІдаг А., Оамізоп А. у., УМайтек т. В.,
Вегсомієї Н. 4 Неайск А. Р. (2007). Сепоте 5едиеєпсе5з ої їШгеє Кої Пегревміги5 івоїаїе5 гергезепіїпд Ше ехрапаїпд аізіібшіоп ої ап етегдіпу дізеа5е ІНгеайепіпд Кої апа соттоп сагр мопаміде. у. Міо. 81, 5058-65.
Вабіс М., КІпрр В.С., МаКозснеу В., Кагоєг А., РГатапа А., Менепієїег Т. С, 1996. Сіусоргоївїп
Зо ОН ої рзецйдогабієз мігив із еззепійа! ог репеїгайноп апа ргорадаїйноп іп сеїЇ сийиге апа іп Те пегу/бив5 вубвівт ої тісе. Пе уошгтпаї ої депегаї мігоїоду 77 (РІ 9), 2277-2285.
Вогзі Е. М., Напп ас., КозвгіпожеКкі ШО. Н. а Меззепйе М. (1999). Сіопіпд ої Ше Ппитап суютеадаїоміги5 (НСМУ) депоте аз ап іп'есійїои5 Брасієтіа! апіїсіа! спготозоте іп ЕзсНепісніа соїї: а пем/ арргоасі ог сопвігисіп ої НСМУ тиіапів. .). Мігої. 73, 8320-9.
Совіев В., Рошгпієг С., Місне! В., Оеногде С, На) М.5., Оємаїв В., СіПеї ї., Огіоп Р., Воду А.,
Зепупів Р., Пейгід Р., Мапаегріаззспеп А., 2008. Сіопіпд ої Ше Кої пПегревміги5 депоте ав ап іптесіїоив5 Басієгіа! апіїсіа! спготозоте детопвігаїез паї аівгирійп ої Пе ІПутіаіпе Кіпазе Іосив5 іпдисез рапіа! анепиайоп іп Сургіпив сагріо Кої. У. Міко!. 82, 4955-4964.
Ремаїв В., Воцагу С, СіШеї Г.., Магкіпе-Согіаупої М., де І ема! Г., Наїд 0. М. 5 Мапаегріаззспеп
А. (2006). Сіопіпд ої Ше депоте ої АїІсеіарпіпе Пегревміги5 1 ав ап іпієсіби5 апа раїйодепіс
Бастетіа! апітісіа! спготозоте. У). Сеп. Міго!. 87, 509-17. сеї І.., Оаїх М., бопоїтіо С., Мадпег М., Ков52іпомувКкі ). Н., Спіпа В., АсКеппапп М., МаїКіпе-
Согіаупоїї М. б Мапаегріаззсенеп А. (2005). ОємеІортепі ої роміпе Негрезмігив 4 ав ап ехргеввіоп месіог ивіпу Басіеїгіаї! апіїісіаІ спготозоте сіопіпд. у). Сеп. Мігої. 86, 907-17.
Неагіск В. Р., Сай О., Мип 5. С, МСдомеї! Т. 5., Майгек Т. В., КеПеу а. О., Аакізоп М. А. (2005). Іпшаї! ізоїайоп апа сНагасієгігайоп ої а Пегрев-їїКе міги5 (КНУ) пот Кої апа соттоп сагр.
Виїї. Різп. Ве. Адеп. Зирріетенпі 2, 1-7.
Поцге М., різпоп А. в Койег М. (2006). СНагасієгігайоп ої а помеї! мігив сацйвіпу а Іеїна! дізвазе іп сагр апа Кої. Місгобіо!. Мої. Віої. Нем. 70, 147-56.
БО МаїКіпе-Согіаупой М., СіПеї І., Кагізеп 0. А., Нааїт І., Міппег Е., Равіогеї Р. Р., Еикида М. 85
Мапаегріаззспеп, А. (2004). Тне соге 2 Бреїа-1,6-М- асеїуЇдіисозатіпуйгапеотегазе-М епсодей ру роміпе Пегребміги5 4 ів пої евзепіа! їог міги5 геріїсайоп дезріїє сопітіршіпду ю розі-мапзіайопа! тоаіїісайопв ої зігисішга! ргоїєїпв5. У. (зеп. Мікої. 85, 355-67.
Меззетпле М., СткКоміс І., Наттегвсптіаї МУ., 2івдієг Н. 4 Коз5гіпомувКі ). Н. (1997). Сіопіпу апа тшиїадепевів ої а Ппегрезміги5 депоте ав ап іптесійїбив Басівгіа! апійсіаї спготовоте. Ргос. Маї).
Асад. 5сі. ОБА, 94, 14759-63.
Могдап НА. МУ., Сапієйо 9. Її. 5 МеоеОеєптой С. Н. (1990). Тгапетесіоп ої спіскеп етргуо
Тіргоріавів м/п Магек 5 дізеазе міги5 ОМА. Аміап. Рів. 34, 3345-51.
Меишкігсп М., ВойсНег К., Виппа)гаки! 5. (1999). Івоїайоп ої а міги5 їот Кої м/йй апцегей дійв.
ВиїІ. Єшиг. Ав. Рівп. Раїйої. 19, 221-224.
Вопеп А., РегеЇрего А., Абгатом/ї» У., Ншогап М., Тіптап 5., Веі|егапо І., Бієїпі: М. в Копег
М. (2003). Епісіепі массіпе адаїіпві Ше мігпив5 сайвзіпу а Іеїна! дівєазе іп сийштей Сургіпив сагріо.
Массіпе, 21, 4677-84. зЗепгодег С, Кеї сх. М., 1999. Воміпе пегревзмігив 1 гедціге5 діусоргоївїп Н ог іпіесіїміу апа дігесі зргєадіпд апа діусоргоїєїп5 9Н(М/450) апа 98 ог діусоргоївіп О-іпаерепаепі се!їІ-їо-сеї вргеад. Те доштаї ої депегаї мігоїоду 80 (РІ 1), 57-61.
Ммадпег М., Вигвіс5 2. б Коб5гіпомеКі ШО. Н. (2002). Негребвміги5 депеїїс5 паз соте ої аде.
Тгепаз Місгобіо!. 10, 318-24.
МУагдеп С, Тапа О0., пи Н., 2011. Негрезмігиз ВАСзв: разі, ргезепі, апа їшиге. доштаї ої
Біотеадісіпе « Біотесппоіоду, 2011, 124595.
Маттіпад 5., Совіапіїпо М.. Соц 0. Г.., УепКіпв М. А. 5 Сореїапа М. ах. (2005). 5ітріє апа підну ейісіепі ВАС гесотрбріпеетгіпа изіпа даїК зеїІесійоп. Мисівїс. Асіа5. Нев. 33, еЗб.
р - спини сеК т ВУХ
СПИСОК ПОСНІЛОВНСиМ. качьнах Зх флюгюі хе ніше Т.З шк
АД ПІЛАТ ШО ДЕ:
КОшои тихше ів ФМІММІ МУ АТО Куна ж ФЖДЛТИфИА сі3УУє: Гука пре мита каш икКОоМмиІвАНтТКИиХ ГЕКПЕСсвІВвУуЄ КІ сЕКУЮ ТТ ВАКЦИНА, КЛ ПЕОСФУНАКшИКИ «делоту вмер ММ юВеєті т шо
ПАХИСЕЕИАЛНИЯ, ЩО ВЕКЛИКАЄТЬСЯ КНУ
Ко «ри;
Ве ее КЕ кое НЯ «АК М дл шви тту луки су ЗО
АТОМ о шаЩштк Ап оижаОВ ло чжійх У «ВІ тя ВН
ХУ ЖІ ФАТА
«В Бетритвсевтвтює ост - доц ;
АНТИ 4 кон і ВН НИ в и А ща спиною чУсчатасає шен вча шафок оВ саке штрих щи
НН че пот щит поло 27 ях У и чх
БУ Я хЕК щи Кк хх жюрі КК дя ту «ак я ск свисов скоб суее сашссвоемо ссспідесехх воазсновОс спсаушното во еколо нння п С тло дека мн жим 3
Уа чртю Ста м чек У ех сих жі КИиК т пеЖртуастваіюус млі «атнухМ З лез кв няно во Ка о ее и КК иа п а о і Но р а ла НОЯ ем спкептечеек свсваслссчих бславосвсжа совок пса шк их бо пк ук та
Миша лора ху
ВЖЕ АЮ во ко зи чи поч. сли ьья ТИ
СЯ: ДЕ
Я ря ху ттрутр вк руютию мок «Же ІВуЛЕ ЦЯ ММА Ж сг
ЦІЮ ху самок и Кия рю итерихні М сири кум ку фути фу ми Кл Кох утих ери мох шт жест е тонам масі рищ сплІрміуаана: ЗепскеУкища сраки 5рчр) и и ча
МЕТАЛОМ с їй ж кячх -х хек Ух ах шапки же х«Чіся ПАК «іх ЄСвилчоєвігрює киї
Ма «ЕІ КУ «ап ох пута їжи ати УКВ иа В рих уИДе М ку 0 питну Кри мити рижики пу ЛЕ клю 2 юна сота сусп Кат су ЯК «лоти иа ши Зх мк пакт му та еп о ФА 14 «Ел 5 кр ях «м БУ кю ту те
ЕМ «ВЖИ по на
СОБНКУ я зако оно щи К
Кая у сх ІЗЯ уст фол елух иа Студ цІМОМІМ фр Ж ме уитИМих удІВЕИУ МОМ там оку В КК, сно
ІАЕ ВЕК мидркА ОДНО ра хлІЦ НИХ НИК ОК МН КІ Ко пи ек рр Кт
ХУ КК М, я
ОреНКнЯ Ще
ОКА 7
Коен т
МАС ХУ ху ткя студе
ХА АД яр кн схемі на а поки
ЖАХ БОШ ВА ую Ки нень -к лю Ві твоюк ис ск Ж тки ижи вжи зихІМИТ Є ожоКе УМ фо ж в ми еф кава ЕВ стеж и І ЩІ
ААУ И ДЕ ри Х КВК пес ЯНВ ро БАж ли їхе. жи ЧА НУ
ТЛО хх «их ТО шу ціїш шиіи? ДАНЕ
НИК дю тузі ик пед
ЕМ 0 люЄДМИИю ВИХ «ау Я так я кожи ікмд Кркдиеукв п НН НН г чЧиФдсасшиесна певна ожила списати звспшщесшчисеЗе ло шомпох щх жен аа Ех
СТЕ ХО НЕ
«побу З
ШО Е
Уч уж и
БК» КЕ «мана вик «кій ВЕК
ОК НН АННУ АНЯ
АЙ Мем сваюує сх кох т «У Шш
МУ НА першим перочшмамлани жан ух Хм яа Сила щ-т уки че
АН вроз ння МО
МІК ех їй
КАМИ п мое тд
ЗАЖЮ МТ Ж
«и ДЕК шкі гер рухову
ЧЕМ ДЕН ЖЕ ад - анна звисає ди даєчна ми ш пани ту доро Моя ци сири піхов щи и оф тож ря
ПИКА ЛЕДИ ЖИ ТДМУ КЕТІ КОЮ Во ОД БЛІя серии Кеш ТІ запивати вид зе
ЕК а иа Зчаса ня ку т сша КХ ре зх о о ск тр жа ХМ кл леді р ех ок «вії гГерцесвідУує КОЇ ее т я МИХ ОА нн и В КН НН НН пол
КОЖНІ Кук ІВ ФрІКОСМХу помах. ши ХарИмНИт: рути щі ях бситукозумтьхі узи Метки ф жи смужки Моезахкі Корж ціх сви в слух ЦО вику я
ОЕМ ОЕМ И ЗВ БІТ ХВО ФВ ОМ ДВК шкі пліви их рр смс сирі пси фев ІВ жит еИ потерти УК рин С яУПІМУКАЦІКа Мр чеа дае люовихх мені шу ЧНІ КОДИ щІМі бажта ик ут у ди С уефсихІм Вимк СсМуйлутисею м ежеими Уест ук ІЖиИюИх ШОСЕ ІхрХдК ту г паесатсяисою пориви анеи ЧЕСЕЗаМшра салом сова оцю уюсх ща п м р ні п и и пи в п и о р нн тре
МАК МЕ я За МЕНТВт В ШМД ил ОВО вареник ше КО докт єго оду пре ривки Я ма у домо сизаіх вим сви пікети ТЕ
ЗІ смів полк щшикиво спаси тес Кп устих лУЙ ї Кже гу З КУ З вашнку З х МЕ З Я КК У ен ни в и Ви и В НН НН ат жену лавок ене споакасоазео ваше ктетов сфор сус Се пн нн вн нн в В НВ Ко хх
МІФККХАТНТУИТИХ. САМОТИ ЛУНА МКИХ ОСЛІУЖУТ І ВКИВХЕ лим хе МеВ шу сбЗисхкиси ЯКИМИ Би
НУ
«Ам їх хм, я «Ів азу хр мк их «кі КІ
В я А НН
Ук УМ кепшлссеіфлут их тОКИХ Ах стати х авазпаваась лита ка Ззасщивлет пад икди Еш дУва й
ПОУАІЕХЛЮЦАУТХ. БЕ Юа ЧИЮ ВХ ЖАХУ МКМ. КОВИХ р што Ссашавкєнтя гени дини Кіа птлаоеми БЕК ху
МИКОЛІ ТИщи КОМІ МКК ВВА МОСК АСИСТ Тит ХУ пит и щи ук ко пуск у пір ферум ВК зах
ШЕ ЦКИМАК вх иХ шКЯ К ИМ МЖК ККУ МЕ п пів Еко фогумут рик Дутка еф фо дит КЕ их бах
ОЗ щикнаа о Яцек є хм пошосщисеча диалашише Сак ши спе жену почи и дих смт и мх речи ця зл
СИБІТЧЕВС КИТИ ТКУ ипсА М Я па оно аж НАУ оф фесту сутки укуси МК жито унеУ в жид КК екв их ср чІшсвисавси зкесслсасая Фокс сосни дпепсвоашиа зало ше дово и омели М текти Мастила улир і ти си их и Доу
МОМ мес шеа оц Кс попки сне же тупу вид риє енд люту удав секти ДЕК МК дих ПОТ затих миши и ше шееКм смачна шошшеиМсЕ ОК их еп уви их Ким вими муч ууиже и КІВІ В дов В кіш ше нку Ме тд
ЕМО ВЕМААХІВАІЬМ Хати рокта МПрП. на
Ух риорочежур суди ки фих еф схов Копте ии етов га икиие дих и аа ОАЕ ЕК АХ, Калашник ЕК шт ИН КК Во
Іжа Кия ода ОК віЖу Ки се етШжиИІИЙ УБУТКУ ІЖ Оу сухі ах ЖИВ да их, що
Екран ов Ва кНМ Мих МОМ сечі її ан и он В В В НИ тус ши мраетияІ ютера оледесем срок таи сш осету сошки Ти сіхух учив жии вих Кф их нин и и пр а п п в Укр ит чини тат
ЧАсмеНА Косова бета спитати стале Бета ТЕМ
СЮ КИ В Кг у пулу тим сус пе уж умо их УЖ У и их ясир Ки ази а ноо шу песик тнилй втилмекиаа сер нУуталс пваслесоосо зпсшопеена песо, БУЕчЯЗи сус ков еЮ сухе і АВ МК ЖК зими походив суне вх мож ко пл
ОМЕЛИ М ЛОЯСЮ усатеререр ла чт яму шли Ул лома водити писано реа хумукар єї сив ех се Коко в тич ці вки поту пре ди даси мех само уана сито ст лу тних вес М ее ки рити уж цуе ен НК ННЯ дом
ЕМ ЗОМ снвЦа холст пе МоМх мосвоситх шодо Ким ках жу стаю их ім озут скунию схкр до ватри кт тя шик доме и у ія ож уж ня Ух сс стасе зкшлачишей знос кесо чашок класи всвВ Соловки їИпнЕ кдд Ку пе КУТОВУ кт Я т, т лодгу
З ЦММ ие ху ом КТК ОМА МЛ МАТ: МІ СХ пс доатицих тку КОАКТКХ х
З сдиаслетоакт Зоасксзвех скачзсвошях Бекиводнай Запас пола РЕНО
Фо скс птесвассфисо срасодисзе сасчасхскче блоевссае ково Ке що свісвочиши попе час совет блусвовосв сон ссая каша звасссевм ссоевиащие стос кнчша ффетооассти пла леютит мшстонкю Лео
Чинсцюєесво чсбосзсвчє Гозфуашио зеоекансосе Кезсеоєвє совок Ват пт с аа ще псом Єр сонеиє Коса ПЕК ТК лілдилонуєицв лес сплечнІняв апоштаваєе Філе ю Бо мКа хай діло вомаенх сксонравосе впвІФчешавІ пощезеео Божа усу ів пока свис опис ьсх ЕщшВОПеКсТ фам щфосациОМк коро ВО зиеютцисле сеиолочива сходинки ооо шоссе Усю НУТИ ло аспсдоєтита сешеспоссе сети дешева кке сопесесксв осо хв папакшеаси золоссацо поза зочацек оса після Кос їжа зочаестичеис восочачеек сезисссаЗе зош доузчасакоу всех іа зе Фах сзЯх чафрчаса свпочзсаеу восссчедаЯ ехо іх строчок фхетутивичиктуи Кучурів их по ИеЕ меру три тутов иу пи
ДЕЛІ КІЬ Ма куюіи МАМА ДК пМна БФ ЗСУ МУ чвисахксевму пепашчахц щем забава парна щискекчене А сивим саевосен шоломи зеошеповою апоапохня возах хЕЖИ свистцасето семи сувою омлет зиск васх спстмахоикх МИ
Кози сити, шия нити оч м. пи ой. вх пкт ик с и кфихтічуг дотик при їх дилюют Ле
КЕ ТИ кори ЕДЕМ ит хв Ма МКМ КИ МЕ У ЧА шулмнлиМмоюм ВІЯМИ СМя. сихкшнтлетра сещасокно есооюта маш КН серопдяозеня осо песо Фев пес сеох шепіт а девзсвунсоє сосвадяиє ЗЕ сза Чдвососевнем комою Меп кН спалахи кт Перо Фуслляаиие ЕІ паси у ПО чЧчевесассназа птспоенощас свое кою стос пепсин поставу ІЗ своя засос засос песо бодекоще шко МВ зцзоатчвеа стилпоавакт косЗаветсс сиЗЄзекаас зпацевахає зеопаславоа ра
Чкпассссоуав заоч свквх поссоскоча сок аосде печити пава Іво пВЦІДясАхХ Фрлувке ною восзмме Коток зо сооваа ее ий
Вста о вясечегнее зоплапютови поет пЕва заоч о ПОБУ хво цпвасодоно сезпасазосв блозповсдя судо све сбоаовосзоу коор Во
Пт дК сим ер, шо шпон сеепекови бас юю борошна ек жу специ дечал дуга ласпасю коса шсепесшкови забзсссовся се овЕ ша помринаєиня сек еру пак снма своем поета іо часта що иксванев сСоавоеколє позцазеане засво: Єоезочахчо ЗВО зпфлрониних пезскосоев сеспаовносх дос ВЕчисЗееє Сорт ЗЕ сеедезцчоака пазавкаковз хана ие праху тає кв мех КЕ пЕКсКоВМХ свлометв жона кмую ск еєсх КоУМ Кл пеню ЗЕ сансвснаюу Зссванову пло ством таривоєекев сус Я кам х масло видано окоч вслопчтксоча золешснех «есе висмлуюуво ан платцпововаю Симон ааавсшим зво хицих вас. жона е їйди лом цувк Хв юВщде или осокою зкзевекосх оса цо че числпслсгза док олавкце предок певним сб боса НИго Як сс щос пойсводеосо Мосс сазацосезе Засебосле аскстееемх ЗЕ схлрпаусннає. сиздуратови сирим аєих «пою зорове бевакщцс че ТИ «вешесиис соте бокиоласав сзасласакс дапассчвом водах Зо ладу вести мезо сах Фарма спомин поро ЗО півосдншеся мадевасяя мезссдаснє сеусадасцає сиовасвищи зе исяє ВО звик сан чеше сан песо менє схоємлинам соц захо шпишнтююко Фирма я фодаєепеиує чиє песо себцожаєои а шпевичещш ссоптзоє є сивисознитоа поисдзвила чола алла авмса ЗІ павсчоссави засповшспа чаоссаваке скфавУВкшкОо зисанесве Совссашиав яму павезоашімну вписати чаші кекс еас реле Коша аж зезасечкще вазах ваеасикцає сова сршшеакок сект 35о ссовсявстия впаяиукио порою зколуєюає соснова Кия 35 сеспадтецсл сонне семою сифослоас алеля генах я сисваслох азс воср зиску позов сопесешия сус за смс «имааи ж спосвпизое зостався засос УМО
Фора сепуовсов вососовака ЗЧсасдсвВо опо ссоя доста ичее ЗБ
ПМД ОХТКаХ ЄВ БИТИ ФЕСТ АКЯУ сином ВК З стшесстасо соченоюсзу Зусзсе аеро кими анаклтаютноо тав сало заск чиста бщшеменеасив савани есе попи чи садах слані вими наа пайсвасоту усе ствх ТВ з ясел сома ВМО ее Фета мою Бус зи
КО зд

Claims (12)

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Живий атенуйований рекомбінантний герпесвірус кої (КНУ,, що містить геном, в якому відкрита рамка зчитування 56 (ОКЕ56) частково або повністю делетована, і відкрита рамка зчитування 57 (ОКЕ57) частково делетована так, що делеція не поширюється в область ОКЕ57 від положення 100212 до положення 100261, причому герпесвірус здатний до реплікації.
2. Герпесвірус за п. 1, який відрізняється тим, що він додатково містить послідовність вектора бактеріальної штучної хромосоми (ВАС).
3. Герпесвірус за п. 2, який відрізняється тим, що послідовність вектора ВАС вирізана з геному герпесвірусу, внаслідок чого збережений гетерологічний фрагмент ДНК в сайті вирізання в геномі герпесвірусу.
4. Герпесвірус за п. 1, який відрізняється тим, що він додатково містить щонайменше одну мутацію у щонайменше одному додатковому гені, який сприяє вірулентності, але не є суттєвим для реплікації.
5. Герпесвірус за п. 4, який відрізняється тим, що щонайменше один додатковий ген вибраний з групи, що складається з гена тимідинкінази, ОКЕ12: передбачуваного гена рецептора фактора некрозу пухлин (ТМЕ), ОКЕ16: передбачуваного гена зв'язаного з (з-білюком рецептора (СРСК), ОМЕ134: передбачуваного гена гомолога інтерлейкіну-10, і ОКЕ140: передбачуваного гена тимідилаткінази.
6. Герпесвірус за п. 1, який відрізняється тим, що він додатково містить гетерологічний фрагмент ДНК.
7. Вектор, який містить рекомбінантний герпесвірус кої (КНУ) за п. 1.
8. Виділена клітина, яка містить рекомбінантний герпесвірус кої (КНУ) за п. 1.
9. Вакцина, яка містить живий рекомбінантний герпесвірус кої за п. 1; або рекомбінантну ДНК герпервірусу кої що містить геном живого рекомбінантного вірусу кої.
10. Вакцина за п. 9, яка відрізняється тим, що вона додатково містить фармацевтично прийнятний носій.
11. Спосіб профілактики і/або терапевтичного лікування у риби захворювання, що викликається герпесвірусом кої (КНУ), який включає введення вакцини за п. 10.
12. Імуногенна композиція, яка містить фармацевтично прийнятний носій і живий рекомбінантний герпесвірус кої за п. 1. Тавіна делевія ОКА? ОБ ОМ ОвЕовнЗ че не Кок Що «Злі Роооосоооооооооо ооо со ТОВ Ве Шин я Ї г вжноні З я рев о ке На. ее и 1. пива зх - ші Цей я Фари с) синий сту сх міри хУєими ВЕУ ЗВУ муху де ї Я ЕВ Вико В ІНК ЮВЕМИ СМЖК МОЖ Б вк А ков щем ток 1
Яне. і
Трамефекія в клітимЕ СВ, єкспресуючі Пав із рекзаминкау те Цітям РІ. з Еезвналогічна усіченом БАС : « Бакохннизція Н і капетою САУ Кегранспекцюх я й Н Н Пеі-ік клин ЦЕтаз КІ. ВАС з і Пениміая ЖІ. ВАЄ сш нАвавнтм од Венертанхнин Н апзміаа ВЕ ВАС пн - Н ОВЕУ і 1-К ска? сна зааіК Н т нн Нітам Ж. ВАЄ З і х - - ша Уусіченов 1 Бомоленічна Кунефевців в каб ЄСВ, оке5? пня зва т рекаміміх х ккеуреуунут деки нах ле й Р хасетою СОНЕТ зго пдвовюютіх в кий У рек Ко ранвсвцік в КМ ета КЕ, ВАС З шля У тив асвожьт тк г я Плазніля сапіпгинсосіиноюв МеВертавтною това ОНКБ? Пе зда «ВЕБ Ох зак пон Штам її, ВЗС а нан усізенак "Транефекція в клітнни ОБУ се тамк ССВ, скопресуююиі рекомщназу сте Бактерія Кукарієв вені мликння
Фіг. 2 Трансфенція в клейка ССВ, гксирекукичі ке рекомііналу Се й но те ня Штям Бі. з
С. м а у є й .-- Гомелогізна усіченою ВАС : рокохііняція з Н кастрою ОБР Кіа я Й ще м. Н | Се і-вніх кдізвня Штам М. НАС я Н шив я вот ТЕ реве татвою. І Пипіміяи БЕ НАС ти ОВК Ве ізаїк, Н ОККО ЇВ Оу вх й В . і Нітим КІ. ВАЄ» Ку Й длактахАтЧАНАЧА НААН АААи Ве Хеіченов Н І саме чна Кронефевнів вокийхі СС, ТЕ Зв ід Н рекомеіванів з екетарехсуєтх рем ту Се х касет ОКО Жетранодккнія в клітною Мбтам КВАС з «гер анНКк ссвкровмутк ревертажуваю Плазміда реннннннннтннннннтннк о ОНА Б Пе) зак т. ВАЄ ОБЕЖе рак сті Штам КЕ. ВАЄ у ддннтннннччннннтяч усічення Транефекнія я кліпний ОККО ІІ рак ССВ, гкспресуюі рекомаіначу Ске Бактерів Еукарівтнені клітини
Фк. З
Вхарьефенійй в клітини ССВ в есЕКТТУХ й - Плазміде свв ваЕМТК Шекам Кі. х тя вас шк укічевою ВАЄ Гажохетічна Е і пекиміюція З Я ранкфекця з илітени і кассктою СБЕЗЬ-5І ! АСВ, ввелркнхувуч Є те вик. | прекомійняну ве Штам КТ. ВАС . пи - сейчас Пазніль КІ, НАС у ФВЕБН-тІ бі днк Газова ц Ккзронотекийх в клігнни І й Пи шен М Ніхам КЕ ВАЄ З 1 рекомбінація з дов крав й й ТО кдовтема рення ВеВерзавчтвен 7 оврУбя? ра | ОВЕБЬУ пе Пивлаіда І Трвнефекція в ТИДЕЗбА? беї Миття как С, експросуючі Ще м ї рекоміфназу Сте Штам Б ВАС» Ту ллинтитнитнттнитите тет ст осеєвк угічене СЕ 5Б-я7 Пн Бактерів Еукапіотичн: клітини
Фіг. 4 Цітам БЕ ВАС з усіченою ОКУ е1-еаК она А й до Ще : їв ож 4 ЕОМ Я НК | : СЕ за БУСИМІ : Ж о ж БУС М : НУ : : й - ЯК ВУСИМи : : Ж ла Н г : її 5 2 ії 25 Кл За 35 : і Дкіз після інфекції : Штаж КЕ, ВАЄ з усіченою ОК его ! ОО вена вав вва ев ав в нньих, І де В ! во А БУСика : ЩЕ - : Я в БОНН. Б зв сн НК БУ СМ : з Ї їх Бу хо 4 га 235 : ї Днів після иврекції й
Фіг. БА, 5
Штам з усіченою БЕ. ВАЄ рою жа а м Ки Те М сдрове ух о - и НД БУМ: ще е й х і ж т : Ого : га : г 5 мо 15 265 303 : : | Дю після інфе 000000: ізітаційне нвіхований ї щюЮ Фводорювовасововагерогоьконовосово р . ЩО Бо : «Е ск ЕМітаніВ Н ЩЕ : оо : за Й : б 5 мої 72500030 0035 : Я Анів після інфекції :
Фіг. Бо, БО
Мевам КТ, ВАС з усізеною СКК? пе -ваіК ТО) вважав йжиажннювнажача жжея тик Е : й ее кооієтьчієтннснї : : х : Не о вк й нс у : : я т У : ЩІ го Схимуляшя Фо дні дню ююнісь сьо : СА нвамом ЙО КНУ Я БУС : не т БУСИча : ! і се БУ СТея : ! а : : КУ «4 зи 57 2 5 72 т ві : й Аеів ібеле івфекцї й Зам КІ. НАС З усіченою СКУ? Печі й ії ПЕК ВЕЖІ В юю о КК мояжя Е : з я- ВО а | : сх я ев : щи ніна БУЄУМІ : і Стамухиція що :
в. дами; го ЖНУ не БУСММа : ОООж : і пен ВУ СИКОЮ й : І : : се: У ДИ У У МИСУ З У ПИ У З Р ЗУ й й Дав після інфекнії :
Фіг. БЕ, БЕ Інітаційноа гнфріковивий : ІХЖЕ кквннеоочконя, (; . не М, до Ще : 8 з х 1 : Е чо Стимеулвщя м о. хатамом В КНУ --- ЗМітанія І ск о : : о й зеднасквває І : явоято Вж ят 62 Б, 073 0077 Б; : Анів післи інфекнії зкззаним штамам
Фіг. БО
Штам БЕ. ВАЄ: з усіченою ОК ЕВО ТІВ 40 пееедвевфооеосоговов, А : : х зро : ! Ж ва | вуду тт кожні клани вл я є ї -- БЖОлня : В і І : Е і с -О БУС : що ; : ЩЕ х - Я ОО БУСИМя . і щ щі Зою патчі татттввтялкакоя : в й « з 15 за лк зи їх й соісеемлнмо ото НВ се фе : Штям КІ. НАС з усіченою СНЕ5е Овіденнік Ми ух в дова пн і щ І увпкатюттююьккя в |! ч -- БУС Н рун : а 000 -явюм Е з 0 БУ Слал іо) : : о Зк Не СТЕ: НИ МЕ НЕ : : шо АДиїв єв феї й
Фіг. вА, 68
Нам БЕ з усіченою ВАЄ Н т снннй БУСМма с Е : з ге Шона --40 БУМ ія М -- БУМ. Е р "в, ! кій ня 94 : ще х у х 5 ке у бе : Зоо : в І п 5 3000035 30002503 0035 : : Двів після інфеквії : Ічікаційно нфікопаннй о 30ю овоговововововадовосовоововозвай о : дю : їж Я вк : НЕ ча : : г «о --імітзнія : с ж : шк : й 5 ово ом вою ов і : Днів песли інфекції :
Фіг. 6С, 60
Ма КЕ, з усіченоїю ВАЄ і аж щі : КК та ід в у їй г ще Б ва М і На сей ВУС Й іш "ри сеча
: . ЗО БУЄ Я жк ! ї я З ПОЛ тю БУСМЬх фидтжженяяя ва : З 4 іп Тв я 2х ха І і Днів після йидеквії НЕгам КВАС з усічевою Сан Ме ее ї ТОВ з ов вві в В-во В-во ! : Б зв й Ще - БУдми ! Ж ж -- 50 БУМ І зе се Ю БУСМЧА Н а г х за в ха Ї Дів після інфекції !
Фіг. тА, В Імітвитвно інфікований фати кавиЖьььи и ВАМИ ЖААВ ВААС Ж ВСАА ЯТЬ Ж ЛВС Між вс ь з я АСЬСА Вкь вьСА ь ЖАСь зн ьсь ль ль аква льні, і пох с ! ш і щі Н вве вевоеваевеваовова і Ії БІ - ав І Оу міхаціяї ГУ -їк Ку ся Імітиція З І зв є й 3 16 Ії з Аевів ніслн гефежії
Фіг. С там БЕ БАС з хегченою КЕКВ Кн рптетттттоетттттеттотоотот ет оетит іпе15 : В І ТОЮ. кеанйнв в вані ве внідаен ж й. зб ніжок бе ків дн ве ЖК нені сонні ків ніж іде; ! і т що : Б хо ав : В во : - збо Стимуляція щи ; ! най ще Я КА ік г Зал : Е ха мс Р. КН З КУ о ма Н щ м БУМ дар ! ії ж вУСИМИ Н ТЕ ле КК їв ЕН 4 хі те : І Дін після інфекції і Імітаційне ііифбікований пі; Е ! ЖЕНЕ заененеенене вве, ; Бе ях -- міці і ' Що овк о Стимуляція ї х яттіаггазня З х пзамом КНУ : йо у І шк х х х Е г кн кнаєна єння скснаємаю : М! зо 354 зм «8 ї Днів після інфекції :
Фіг. 70 Е
Штам ГІ, ВАС з усічення СНУ Б-К Ве ! пх15 Кк гай евсвварнавоавовжеаня коток ЯМ ою Мох жом. Моз Н ою секожкев ються нои фосжесю всеж Ї 8 св к Р Ва З о- І ве Я. І З -яа БУснмя щ 40 бчимузяцій я Ж ЩО пмуляя Що - 5 о ЕМОУМА з зптимоч БЕ КНУ КО и ЕМСУми НІ і я 47 22 А І Гхук 23 т Дін після інфекції Імітаційно інфікований пе 15 Є Ж ТК нене енЕн мене ! яко М іч ї І во шо Що "зве, І ще се ЕМіка ція В. Во Й везе БО сеімітаців й СХ Е Стижкляці і; і їж тн Кляція сте, ! ЕН їй пітимом БЕ. КНУ х шк і 4: я 32 ах ВІ із 72 У Е й ; ! і Днів зіеля інфекції !
Фіг. 7Е, С
Ревертхитикі нта БІ. ВАЄ пеЗо і : -Я БУМ А 1 вевевдвк се 30 БУОАНЯ Ві у озва 00 со300БУСУМЯ я. | Ше во як чи "вебовсвтоєввню Е охо й 8 х НО їх шо Мох Анів після інфекції Ніхам КЗ. ВАЄ з резертаттвою СКЕБА-5У Пре 30 В ЯН оба б-р б --а- 4-4 Фо 4-х Ж Ко БО8ОО00неня БУОум па й БУЄМмчх і
Е. ско БУС во щі й КО т іп Іх за Днів після інфекції
Фіг. ВА, В Тмісаційно сиенковакні пе Со ШО : що 5 ВО Е Маші ! ; міх Е 5 я й 2 10 Із ме Днів після інфекції
Фіг. С
МШетам КО ВАЄ з ревертатвою СКК ІхЯ пхї5 ІВ) : І І БО ніна БУСИМИ Й | я БУСИЧя : а зе сну дяц сне БУМ ї ка і івтамом БІ. КНУ т Бусума ! і а ! ! кіш: кН и НЕ я НИ Днів після інфекції імітавішно інфікований
ЕЕ. ; НХІ вевавовевовой,, о імітнція 1 ; Ж Ко) Ї «-Яжітннція З бю щ ! й 4а Стимуляція І ЗА : (Ж 00 втамом БІ. КНУ ї 8 : ат Іововевовавввввє скоееен не: не т ше: ВИШ т НИ У ВИТ вів після інфекції !
Фіг. 80, Е
Штам Б ВАЄ з превертажачню СК яв? Те. п: 15 ТЕ ! М шо йо дювоєєювоюювеєосювоєюю я Н те б жк Н БМ с | нена БУСИМИ вк твімуля ція сус Н : 40 дутмем КС КНУ - ЕХО що 20 її тю БУЄ ї Го 33 Я? 5 Інше См 7 т І Анів після інфекції Е Іміталійвео дковання п-515 с ' б вававвававтья ши ! й ВЕСТ і ще - сен«ТВЕТИВЕЯ 1 ї зо Ку пок ПАтКація Х й Фо сСчименнців ! я виамом БІ. КНУ | ї- ' хз й і о у вх в ЗЕ ок Квт : Двів після інфекції !
Фіг. 85, о
UAA201702576A 2011-12-30 2012-12-20 Рекомбінантний герпесвірус кої (khv) і вакцина для профілактики захворювання, що викликається khv UA119786C2 (uk)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
EP11196171 2011-12-30

Publications (1)

Publication Number Publication Date
UA119786C2 true UA119786C2 (uk) 2019-08-12

Family

ID=47429841

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201408626A UA114719C2 (uk) 2011-12-30 2012-12-20 Рекомбінантний герпесвірус кої (khv) і вакцина для профілактики захворювання, що викликається khv
UAA201702576A UA119786C2 (uk) 2011-12-30 2012-12-20 Рекомбінантний герпесвірус кої (khv) і вакцина для профілактики захворювання, що викликається khv

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
UAA201408626A UA114719C2 (uk) 2011-12-30 2012-12-20 Рекомбінантний герпесвірус кої (khv) і вакцина для профілактики захворювання, що викликається khv

Country Status (18)

Country Link
US (2) US20140348875A1 (uk)
EP (1) EP2797627B1 (uk)
JP (3) JP5982009B2 (uk)
CN (1) CN104159609B (uk)
BR (1) BR112014016117A2 (uk)
HU (1) HUE053075T2 (uk)
IL (1) IL232902A0 (uk)
IN (1) IN2014CN04655A (uk)
MD (1) MD4481C1 (uk)
MX (1) MX361408B (uk)
PH (1) PH12014501388A1 (uk)
PL (1) PL2797627T3 (uk)
RS (1) RS61261B1 (uk)
RU (1) RU2662768C2 (uk)
SG (1) SG11201403066TA (uk)
TW (1) TWI484034B (uk)
UA (2) UA114719C2 (uk)
WO (1) WO2013098214A1 (uk)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RS61261B1 (sr) * 2011-12-30 2021-01-29 Gesval S A Rekombinantni koi herpesvirus (khv) i vakcina za prevenciju bolesti prouzrokovane khv
US11174468B2 (en) * 2016-04-08 2021-11-16 William Marsh Rice University Galactose utilization
RU2736472C2 (ru) * 2016-11-18 2020-11-17 Общество с ограниченной ответственностью "ЭКСИФАРМ" Химерный белок, синтетическая днк, кодирующая указанный белок, экспрессионный вектор, штамм-продуцент синтетической днк и способ получения плазмидной днк
CN112321685B (zh) * 2018-11-05 2022-02-18 深圳技术大学 用于鱼类预防或治疗CyHV-2感染的试剂及其应用
EP3662929A1 (en) * 2018-12-07 2020-06-10 IDT Biologika GmbH A recombinant koi herpesvirus (khv) and a diva vaccine for preventing and/or treating a disease caused by khv
CN110101854B (zh) * 2019-05-14 2022-08-02 四川农业大学 一种鲤疱疹病毒ⅲ型疫苗及其制备方法
CN110468111B (zh) * 2019-08-07 2022-06-17 西北农林科技大学 一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN110452926B (zh) * 2019-08-07 2022-06-17 西北农林科技大学 一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用
CN113679832A (zh) * 2021-05-24 2021-11-23 苏州大学 一种利用冷冻干燥制备杆状病毒载鲤疱疹病毒ii型dna疫苗的方法
CN115960903B (zh) * 2022-12-23 2023-09-08 中国水产科学研究院淡水渔业研究中心 一种抑制CyHV-2病毒增殖的反义RNA组、重组载体和纳米粒递送系统及应用

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0382271B1 (en) 1989-02-04 1994-12-21 Akzo Nobel N.V. Tocols as adjuvant in vaccine
DE19733364A1 (de) 1997-08-01 1999-02-04 Koszinowski Ulrich H Prof Verfahren zur Klonierung eines großen Virusgenoms
IL153775A0 (en) 2003-01-01 2003-07-31 Yissum Res Dev Co Immunizing fish against viral infection
JP2007223913A (ja) * 2006-02-21 2007-09-06 Kyoritsu Seiyaku Kk コイヘルペスウイルス病ワクチン
CN101495636B (zh) * 2006-04-13 2012-12-05 国立大学法人东京海洋大学 锦鲤疱疹病毒（khv）病用dna疫苗
WO2009027412A1 (en) 2007-08-28 2009-03-05 Universite De Liege A recombinant koi herpesvirus (khv) or cyprinid herpesvirus 3 (cyhv-3) and a vaccine for the prevention of a disease caused by khv/cyhv-3 in cyprinus carpio carpio or cyprinus carpio koi
DE102007041332A1 (de) * 2007-08-31 2009-03-05 Siemens Ag Transferchuck zur Übertragung, insbesondere von Wafern
RS61261B1 (sr) * 2011-12-30 2021-01-29 Gesval S A Rekombinantni koi herpesvirus (khv) i vakcina za prevenciju bolesti prouzrokovane khv

Also Published As

Publication number Publication date
TWI484034B (zh) 2015-05-11
MD20120127A2 (en) 2013-07-31
IN2014CN04655A (uk) 2015-09-18
US20140348875A1 (en) 2014-11-27
MX2014008045A (es) 2014-10-24
PL2797627T3 (pl) 2021-06-28
RS61261B1 (sr) 2021-01-29
TW201333201A (zh) 2013-08-16
WO2013098214A1 (en) 2013-07-04
UA114719C2 (uk) 2017-07-25
JP2015503914A (ja) 2015-02-05
RU2662768C2 (ru) 2018-07-31
RU2014131474A (ru) 2016-02-20
JP2018078903A (ja) 2018-05-24
US9931396B2 (en) 2018-04-03
PH12014501388A1 (en) 2014-09-22
JP2016195593A (ja) 2016-11-24
CN104159609A (zh) 2014-11-19
EP2797627B1 (en) 2020-10-07
MD4481B1 (ro) 2017-05-31
MX361408B (es) 2018-12-04
IL232902A0 (en) 2014-07-31
MD4481C1 (ro) 2017-12-31
HUE053075T2 (hu) 2021-06-28
SG11201403066TA (en) 2014-10-30
US20170028057A1 (en) 2017-02-02
EP2797627A1 (en) 2014-11-05
CN104159609B (zh) 2018-05-22
JP5982009B2 (ja) 2016-08-31
BR112014016117A2 (pt) 2018-09-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
UA119786C2 (uk) Рекомбінантний герпесвірус кої (khv) і вакцина для профілактики захворювання, що викликається khv
JP6845266B2 (ja) 多価組換型鳥ヘルペスウイルス及び鳥類を免疫化するためのワクチン
CN100540051C (zh) 用于接种新生儿的改良的安卡拉痘苗病毒
HU230576B1 (hu) Kiméra fertőző DNS-klónok, kiméra sertés cirkovírusok, és alkalmazásuk
US20220389391A1 (en) F-genotype mumps virus attenuated strain and construction method therefor and application thereof
MXPA04011194A (es) Virus de viruela recombinantes que expresan los genes homologos introducidos dentro del genoma viral de la viruela.
KR102157911B1 (ko) 마이코플라스마 히오뉴모니아를 형질전환하기 위한 벡터, 형질전환된 ｍ. 히오뉴모니아 균주, 및 그것의 용도
EA012182B1 (ru) Электропорация микобактерии и сверхэкспрессия антигенов микобактерий
JP2010536394A (ja) マゴイ（シプリヌス・カルピオ・カルピオ）又はニシキゴイ（シプリヌス・カルピオ・コイ）においてＫＨＶ／ＣｙＨＶ−３により引き起こされる疾患の予防のための組み換えコイヘルペスウイルス（ＫＨＶ）又はコイ科ヘルペスウイルス３（ＣｙＨＶ−３）及びワクチン
US11707515B2 (en) Modified Brucella vaccine strain for the treatment of brucellosis
CN109310750B (zh) 编码传染性喉气管炎病毒和传染性法氏囊病病毒抗原的重组非致病性马立克氏病病毒构建体
TW201812005A (zh) 新穎之魚類病原病毒
US8623381B2 (en) Viral strains derived from the vaccinia virus Lister VACV-107 and uses thereof
JP2001186874A (ja) サルモネラワクチン
Williams et al. A recombinant bovine herpesvirus-4 vectored vaccine delivered via intranasal nebulization elicits viral neutralizing antibody titers in cattle
Glazenburg et al. In vivo recombination of pseudorabies virus strains in mice
EP2031065A1 (en) A recombinant koi herpesvirus (KHV) or Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV-3) and a vaccine for the prevention of a disease caused by KHV/CyHV-3 in Cyprinus carpio carpio or Cyprinus carpio koi
WO2011077143A1 (en) Transformation of commensal neisseria
Wang et al. Construction, identification, and immunogenic assessments of an HSV-1 mutant vaccine with a UL18 deletion
TWI602918B (zh) 含病毒載體之抗ｐｒｒｓ重組疫苗
Preston et al. In vivo and in vitro studies on temperature-sensitive mutants of swine vesicular disease virus
Shchelkunov et al. Vaccinia Virus
Rubino Creation and characterization of VZV recombinant strain ORF7Δ in a novel RFP-ORF23 fusion BAC construct