MX2014008045A - Un herpesvirus koi recombinante y vacuna para la prevencion de una enfermedad causada por herpesvirus koi. - Google Patents

Un herpesvirus koi recombinante y vacuna para la prevencion de una enfermedad causada por herpesvirus koi.

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Abstract

La presente invención se refiere a un herpesvirus Koi recombinante (KHV), métodos para la producción de tal KHV, células que comprenden tal KHV y el uso de tal KHV como un vector y en vacunas para la prevención y/o tratamiento terapéutico de una enfermedad en los peces causada por herpesvirus Koi en carpas tal como Cyprinus Carpio Carpio o Cyprinus Carpio koi.

Description

UN HERPESVIRUS KOI RECOMBINANTE Y VACUNA PARA LA PREVENCIÓN DE UNA ENFERMEDAD CAUSADA POR HERPESVIRUS KOI MEMORIA DESCRIPTIVA La presente invención se refiere a un herpesvirus Koi recombinante (KHV), métodos para la producción de tal KHV, células que comprenden tal KHV y el uso de tal KHV como un vector y en las vacunas para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad en los peces causada por herpesvirus Koi en carpas tal como Cyprinus carpió carpió o Cyprinus carpió koi.
La carpa común (Cyprinus carpió carpió) es el pez más cultivado para el consumo humano, principalmente en Asia, Europa y el Medio Oriente. En contraste, la subespecie de Koi (Cyprinus carpió koi) es cultivada como un pez mascota para placer personal o competitivo mostrado especialmente en Japón, pero también en todo el mundo. Se detectó un virus causante de una enfermedad letal en la carpa común y carpa Koi, inicialmente llamado enfermedad del herpesvirus Koi (KHVD), en 1996 en el Reino Unido. El virus luego fue rápidamente identificado como la causa de la mortalidad masiva de la carpa Koi y carpa común en Israel, Estados Unidos y Alemania. Un cultivo intensivo de carpa común, muestras de Koi y en el comercio internacional han contribuido a la rápida difusión global de esta enfermedad altamente contagiosa y extremadamente virulenta. Desde su aparición, KHVD ha causado graves pérdidas económicas y financieras en la industria del cultivo de la carpa Koi y común en todo el mundo.
La caracterización inicial del virus demostró una estructura tipo herpes con una envoltura y un núcleo electrón-denso icosaédrico de 100-110 nm rodeado por una estructura tipo tegumento. El genoma del virus comprende ADN de doble cadena lineal (ADNds) de ~295 kb similar a los ciprínidos herpesvirus 1 (CyHV- ) pero más grande que los miembros Herpesviridae generalmente oscilan entre 125 y 240 kb de tamaño. La secuencia del genoma de KHV ha sido publicada muy recientemente (Aoki et al., J Virol, 81, pages 5058-5065 (2007)). El genoma de KHV contiene un número significativo de secuencias de ADN sin homología a cualquier otra secuencia virales conocida. Además, contiene secuencias de ADN altamente divergentes que codifican polipéptidos, que se asemejan a aquellas de varios virus de ADNds, herpesvirus, poxvirus, iridovirus y otros grandes virus de ADN.
Las características únicas de este virus han conducido a tres nomenclaturas diferentes: en primer lugar, herpesvirus Koi (KHV) según su manifestación morfológica; en segundo lugar, la carpa nefritis intersticial y virus de la necrosis branquial (CNGV) según sus efectos patogénicos de peces; y por último ciprínidos herpesvirus 3 (CyHV-3) según similitud del contenido génico con CyHV-1 y CyHV-2. La nomenclatura de este última ha sido apoyada además por la reciente secuenciación de la longitud completa del genoma viral. Sin embargo, en lo sucesivo se utilizará el nombre KHV.
KHV tiene un genoma de aproximadamente 295 kb que representa el mayor genoma identificado entre los miembros Herpesvirales. Aunque el primer aislamiento de KHV data de 1996, solamente poca información existe sobre el papel de los genes individuales en patogenesia de KHV y en la biología de la infección del hospedero natural.
Un KHV atenuado y su uso potencial como un candidato de vacuna se ha descrito en la Solicitud Internacional de Patente WO 2004/061093 A1. Sin embargo, este candidato de vacuna esconde un peligro potencial. La atenuación es la consecuencia de mutaciones al azar que se produjeron durante la replicación viral in vitro. En consecuencia, el carácter de la atenuación es desconocido y no se puede excluir la reversión a un fenotipo totalmente patógeno.
Investigación aplicada y fundamental en KHV requiere producción de virus recombinantes. Recientemente, la manipulación de los genomas de herpesvirus grande se convirtió en factible mediante el uso de vectores del cromosoma artificial bacteriano (BAC) (Messerle et al., Proc Nati Acad Sci U S A, 94, 14759-14763 (1997); Wagner et al., Trends Microbiol, 10, 318-324 (2002) and vide infra). Estos vectores permiten el mantenimiento y eficiente mutagénesis del genoma viral en Escherichia coli (E. coli) seguido por la reconstitución de los viriones de progenie de transfección del plásmido BAC en células eucariotas permisivas. Hasta la fecha, han sido propagados de forma exitosa los genomas de varios herpesvirus como clones BAC infecciosos, incluyendo citomegalovirus humano (HCMV) que representa el segundo mayor genoma del herpesvirus clonado como un BAC hasta la fecha (230 Kb) (Borst et al., J Virol, 73, 8320-8329 (1999)).
Recientemente, varios KHV recombinantes por primera vez se han construido usando la técnica del BAC; todos estos recombinantes se describen en la Solicitud de Patente PCT WO2009/027412. Esta solicitud de patente describe un método para hacer KHV recombinante con una deficiencia en uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste de ORF55: el gen de la timidina; ORF12: gen del receptor putativo de factor de necrosis tumoral (TNF); ORF 6: gen del receptor acoplado a la proteína G putativo (GPCR); ORF134: gen del homólogo interleucina 10 putativo; ORF140: gen putativo de timidilato quinasa, o combinaciones de los mismos. Dichos mutantes fueron utilizados como los virus de la vacuna viva atenuada.
Fue demostrado que algunos de estos mutantes eran seguros cuando se utilizaban en los peces específicos SPF de un cierto tamaño y edad. Sin embargo, en el campo, los cultivadores de peces están interesados en la vacunación temprana, es decir, cuando los peces son relativamente pequeños/jóvenes y donde existe una propagación relativamente grande en tamaño de los peces. Resultó que en tales condiciones las vacunas basadas sobre los virus mutantes de supresión tal como en la Solicitud de Patente Internacional WO2009/027412 en algunas situaciones no son lo suficientemente seguras: tales KHV recombinante son muy virulentos para su uso en peces jóvenes/pequeños. Esto significa que en la actualidad, todavía hay una falta de vacunas recombinantes atenuadas seguras y eficaces para el control de la enfermedad en situaciones de campo tales como el cultivo de peces.
Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos virus recombinantes KHV que pueden utilizarse para el desarrollo de vacunas atenuadas seguras y eficaces para controlar la infección de KHV en el campo.
Fue sorprendentemente encontrado ahora que un KHV recombinante en donde el marco de lectura abierta 57 (ORF57) es deficiente, muestra un fuertemente reducida o ninguna mortalidad en absoluto, incluso en carpas muy jóvenes/pequeñas infectadas con este herpesvirus recombinante y proporciona inmunidad contra herpesvirus Koi de tipo salvaje. Tal KHV recombinante así proporciona un virus de la vacuna atenuada segura y eficaz que puede ser utilizada convenientemente en carpas jóvenes y/o pequeñas. Este hallazgo es aún más sorprendente en vista del hecho de que ORF57 fue hasta ahora un gen esencial, sin que ningún virus vivo fuera factible. Por lo tanto, una primera modalidad de la presente invención se refiere a un herpesvirus Koi recombinante en donde ORF57 es deficiente, dando como resultado un KHV que se atenúa e induce una tasa de mortalidad del 40% o menos en la carpa, preferentemente Cyprínus carpió carpió o Cyprínus carpió koi, cuando se infectaba con dicho herpesvirus.
Como se utiliza en este documento, un ORF57 "deficiente" es un ORF57 que ya no es funcional, es decir, ya no es capaz de codificar una proteína funcional. Un ORF57 deficiente en este documento, resulta en un KHV que es atenuado al nivel que induce una tasa de mortalidad del 40% o menos en la carpa. Tal deficiencia puede obtenerse por ejemplo, por mutación como inserción o eliminación de uno o más nucleótidos en el gen que codifica la ORF57, o en su región promotora. Tal mutación por ejemplo, puede ser una mutación de cambio de marco en el 5' sitio de los genes, o una supresión de (parte de) la región promotora o (parte de) el propio gen.
Un ejemplo de la secuencia de ADN de ORF57 es la secuencia de ADN de ORF57 como se indica en el No de acceso Genbank NC_009127 donde el codón de inicio e interrupción de ORF57 se encuentran en la posición 99382 y 00803. Hace falta decir que la ubicación de ORF57 puede diferir en otras cepas KHV debido a la variación natural. Además, debido a la variación natural, puede haber pequeñas diferencias en la secuencia de ORF57 en una cepa KHV en comparación con otra cepa KHV. Por lo tanto, la ORF57 como se describe en este documento, es un marco de lectura abierto que tiene una identidad de secuencia de más del 80% con la secuencia de ADN de ORF57 como se indica en Genbank No. de acceso NC_009127.
La secuencia de nucleótidos de la región que comprende ORF56, 57 y 58, que abarca los nucleótidos 96630-101558 está representada en SEQ ID NO: 12. Véase también la figura 1.
Está claro que la manera más amplia de hacer un gen deficiente, es decir, la supresión del ORF57 todo resultará en ninguna producción de la proteína ORF57 en absoluto.
Desde un punto de vista práctico y desde un punto de vista de la seguridad, tal eliminación completa sería tomar un paso lógico. Sin embargo, como se indica a continuación en la figura 1 , una región promotora putativa está situada en la posición 100212-100261 que posiblemente podría estar implicada en la expresión del ORF58 adyacente. Por esta razón, una mutación en ORF57 no preferiblemente debe extenderse en esta región. Por lo tanto, se prefirió introducir mutaciones en ORF57 en la región de la izquierda de la posición 100212 o a la derecha de la posición 100261.
También se puede ver en la figura 1 que dos regiones promotoras putativas se encuentran en la posición respectivamente 99451-99500 y la posición 99794-99843 que posiblemente podrían estar implicadas en la expresión del ORF56 adyacente. Por lo tanto, es teóricamente posible que una eliminación en una región en ORF57 interfiera con la expresión de ORF56. En ese caso, podría ser que una KHV recombinante en donde ORF57 es deficiente según la invención meramente se comporte atenuado debido a una menor expresión de ORF56. Sin embargo se muestra en la sección de ejemplos que 1) ORF56 no es un gen esencial y 2) un ORF56 deficiente que no contribuye al carácter atenuado del KHV recombinante según la invención. En estos ejemplos se muestra que grandes supresiones pueden realizarse en ORF56 sin influir en la viabilidad del KHV recombinante y sin cambiar significativamente el carácter atenuado del KHV recombinante. Esto implica, entre otras cosas, que los sitios putativos del promotor ORF56 ubicados en ORF57 se puedan quitar sin problemas.
También se desprende de la figura 1 , que dos sitios putativos de promotor de ORF57 se encuentren en ORF56 en las posiciones 97075-97124 y 98712-98761. Por lo tanto, no se podía excluir que la supresión de una pequeña parte de ORF57, tales como ORF57 Del 1 proporcione una truncada pero aún funcional proteína codificada por ORF57. Para excluir esta posibilidad, una gran supresión doble de ORF56-ORF57 fue hecha como se describe en la sección de ejemplos que se extiende por la región de posición 97001-99750. Esta eliminación se comporta esencialmente igual a los mutantes ORF57 solos, como puede verse en la figura 5 en comparación con la figura 7. Por lo tanto, puede concluirse que la proteína codificada por ORF57 es no esencial para el virus.
La eliminación de sólo una pequeña parte de ORF57 es una posibilidad, incluso puede ser una posibilidad preferida por las razones expuestas más arriba, pero cuidado debe tenerse que la proteína truncada resultante no sea funcional. Si la persona calificada por cualquier motivo decide eliminar menos que el ORF57 completo, fácilmente sería capaz de verificar si el ORF57 se hace deficiente: un ORF57 no deficiente que conduce a un virus que tiene un nivel demasiado alto de virulencia, es decir, muy bajo nivel de atenuación.
Preferentemente, el KHV recombinante es además deficiente en uno o más genes virales que contribuyen a la virulencia pero no son esenciales para la replicación del virus. Por lo tanto, una forma preferida de esta modalidad se refiere a un herpesvirus Koi recombinante según la invención que es deficiente en al menos un gen adicional que contribuye a la virulencia, pero no es esencial para la replicación del virus.
Una forma más preferida de esta modalidad se refiere a un herpesvirus Koi recombinante según la invención que es deficiente en al menos un gen adicional que contribuye a la virulencia en donde dicho gen está seleccionado del grupo formado por el gen timidina quinasa; ORF12: gen del receptor putativo del factor de necrosis tumoral (TNF); ORF16: gen del receptor acoplado a la proteína G putativo (GPCR); ORF134: gen del homólogo interleucina 10 putativo; ORF140: gen putativo timidilato quinasa, o cualquier combinación de éstos.
En una forma aún más preferida de esta modalidad, el KHV recombinante es además deficiente en por lo menos el gen de timidina quinasa o el gen de timidilato quinasa putativo.
En otra forma aún más preferida de esta modalidad, el KHV recombinante según la presente invención es además deficiente en el gen de timidina quinasa y al menos un gen adicional que contribuye a la virulencia seleccionada del grupo formado por ORF12: gen del receptor putativo del factor de necrosis tumoral (TNF); ORF16: gen del receptor acoplado a la proteína G putativo (GPCR); ORF134: gen del homólogo interleucina 10 putativo; ORF140: gen putativo timidilato quinasa.
En una forma aún más preferida de esta modalidad, el KHV recombinante es además deficiente en por lo menos el gen de timidina quinasa y el gen de timidilato quinasa putativo.
En otra forma preferida de esta incorporación, el herpesvirus Koi recombinante según la presente invención está en una forma viva. Preferentemente, el herpesvirus Koi recombinante tiene la capacidad de reconstituir las partículas infecciosas, es decir; para replicar cuando se introducen en células eucariotas permisivas o peces individuales, preferiblemente en la carpa, más preferentemente en Cyprinus carpió, incluso más preferido en Cyprinus carpió carpió y/o Cyprinus carpió koi.
En una modalidad alternativa el KHV recombinante según la presente invención es además deficiente en uno o más genes virales que es/son esenciales para la replicación (y opcionalmente deficientes en uno o más genes virales que contribuyen a la virulencia pero es/son no esenciales para la replicación del virus), así proporcionando un herpesvirus Koi recombinante según la invención de una forma no replicativa. Por lo tanto, una modalidad alternativa se refiere a KHV recombinante según la presente invención en donde dicho herpesvirus es en una forma no replicativa. Una "forma no replicativa" significa que el herpesvirus Koi recombinante todavía tiene la capacidad de infectar células o individuos peces (por ejemplo, Cyprinus carpió, Cyprinus carpió carpió o Cyprinus carpió koi) pero no es capaz de replicar en la medida que el virus de progenie infectado está formado. Una cepa recombinante no replicativa es producida por la inactivación (por medio de técnicas conocidas como inserción, eliminación o mutación, por ejemplo mediante clonación de BAC) de un gen KHV que es esencial para la replicación.
Dicho virus eliminado es cultivado en una línea celular permisiva establemente expresando el gen eliminado (trans-complementación). Este enfoque es un enfoque bien conocido en la técnica. Entre otros, ha sido utilizado con éxito para herpesvirus diferentes tales como gH eliminados Suid Herpesvirus 1 (virus de Aujeszky) (Babic et al., 1996) y Herpesvirus 1 bovino (Schróder y Keil, 1999).
Cualquier gen que contribuye a la replicación puede hacerse deficiente con el fin de obtener un herpesvirus Koi recombinante no replicativo. En otras palabras, cualquier gen del cual la inactivación conduce a un herpesvirus Koi recombinante no replicativo, pueden suprimirse. Preferiblemente, un gen del KHV recombinante según la presente invención que se suprime con el fin de proporcionar una forma no replicativa del virus, se selecciona del grupo que consiste de: ORF25, ORF31 , ORF32, ORF34, ORF35, ORF42, ORF43, ORF45, ORF51 , ORF59, ORF60, ORF62, ORF65, ORF66, ORF68, ORF70, ORF72, ORF78, ORF81 , ORF84, ORF89, ORF90, ORF92, ORF95, ORF97, ORF99, ORF108, ORF115, ORF131, ORF132, ORF136, ORF137, ORF148 y ORF149.
Preferiblemente un herpesvirus Koi recombinante según la presente invención consta de una secuencia de vector de cromosoma artificial bacteriano (BAC). Desde hace aproximadamente una década y media, la manipulación de los genomas de herpesvirus grandes ha sido facilitada enormemente por el uso de dichos cromosomas artificiales bacterianos. Estos vectores permiten el mantenimiento y la mutagénesis del genoma viral en Escheríchia coli, seguido de reconstitución de los viriones de progenie por la transfección del plásmido BAC en células eucariotas permisivas. En un primer paso, se introducen las secuencias para el vector BAC en el genoma de herpesvirus por recombinación homologa convencional en las células infectadas. El genoma de ADN de doble cadena lineal de herpesvirus circula durante la replicación. Es suficiente aislar el intermedio de replicación circular del mutante BAC y su traslado por la transformación de ADN en E. coli. Este traslado es necesario solamente una vez para establecer el sistema. El herpesvirus BAC se propaga y muta en E. coli. El herpesvirus homogéneo, clonal BAC ADN es trasladado de regreso en células eucariotas permisivas solamente para la reconstitución del virus. Como funciones virales no son necesarias, el genoma del virus permanece dormido mientras está en E. coli, preservando las funciones virales presentes en el momento de la clonación. Esto es importante para los virus donde los procedimientos de cultivo in vitro cambian las propiedades auténticas de los aislados.
Como se utiliza en este documento, el término "recombinación homologa" indica que cuando dos moléculas diferentes de ácidos nucleicos homólogos diferentes, ocurre un cruce, y se genera una nueva combinación de ácidos nucleicos. Como se utiliza en este documento, el término "secuencia de mediar la recombinación homologa" se refiere a una secuencia que causa la recombinación homologa que es dependiente de una proteína de recombinación específica, que es catalizada, llevando a cabo o asistiendo en la recombinación homologa. Tal proteína de recombinación preferentemente actúa específicamente sobre una "secuencia de mediación de la recombinación homologa" y no actúa en otras secuencias.
Las secuencias de vector BAC son bien sabidas en la técnica y su uso en la construcción de virus recombinantes como herpesvirus con frecuencia se ha descrito en la técnica (Borst, E. M., Hahn, G., Koszinowski, U. H. & Messerle, M. (1999), J Virol 73, 8320-9. Costes, B., Fournier, G., Michel, B., Delforge, C, Raj, V.S., Dewals, B., Gillet, L, Drion, P., Body, A., Schynts, F., Lieffrig, F., Vanderplasschen, A., 2008. J Virol 82, 4955-4964. Dewals, B., Boudry, C, Gillet, L, Markine-Goriaynoff, N., de Leval, L., Haig, D. M. & Vanderplasschen, A. (2006), J Gen Virol 87, 509-17. Gillet, L, Daix, V., Donofrio, G., Wagner, M., Koszinowski, U. H., China, B., Ackermann, M., Markine-Goriaynoff, N. & Vanderplasschen, A. (2005), J Gen Virol 86, 907-17. Messerle, M.( Crnkovic, I., Hammerschmidt, W., Ziegler, H. & Koszinowski, U. H. (1997), Proc Nati Acad Sci U S A 94, 14759-63. Warming, S., Costantino, N., Court, D. L, Jenkins, N. A. & Copeland, N. G. (2005), Nucleic Acids Res 33, e36. Wagner, M., Ruzsics, Z. & Koszinowski, U. H. (2002), Trends Microbiol 10, 318-24).
La secuencia del vector BAC no necesariamente necesita ser insertada en ORF57. Alternativamente puede ser insertada en cualquier otro gen viral que contribuye a la virulencia y/o cualquier otro gen viral que es o no es esencial para la replicación viral y/o cualquier región intergénica.
Sin embargo, en una forma más preferida, el herpesvirus Koi recombinante consta de una secuencia de vectores BAC que se inserta en ORF57. Dicha inserción tiene la ventaja que al insertando el vector BAC en ORF57, ORF57 se convierte al mismo tiempo deficiente, proporcionando así directamente un KHV recombinante según la invención.
Un ejemplo de un KHV recombinante según la presente invención se logró mediante la clonación del genoma KHV mediante la inserción de un cartucho de BAC flanqueado loxP modificado en ORF55 (vide infra). Esta inserción condujo a un virus recombinante BAC cuyo genoma se mantuvo estable en bacterias y fue capaz de regenerar los viriones cuando se transfectó en células permisivas. (Véase: Costes, B., Fournier, G., Michel, B., Delforge, C, Raj, V.S., Dewals, B., Gillet, L, Drion, P., Body, A., Schynts, F., Lieffrig, F., Vanderplasschen, A., 2008, J Virol 82, 4955-4964 para detalles del BAC-vector, y vide infra para detalles técnicos). Este vector se utiliza para introducir una supresión en ORF57.
El término "vector BAC" se refiere a un plásmido que se produce utilizando el plásmido F de E. coli y un vector que puede mantenerse estable y desarrollar un fragmento de ADN de gran tamaño, de unos 300 kb o más en las bacterias, tal como E. coli y similares. El vector BAC contiene al menos una secuencia de vectores BAC esencial para la replicación del vector BAC. Ejemplos de una región esencial para la replicación incluyen, pero no se limitan a, el origen de la replicación del plásmido F y sus variantes.
Como se utiliza en este documento, el término "Secuencia de vector BAC" se refiere a una secuencia que comprende una secuencia esencial para la función de un vector BAC. Opcionalmente, la secuencia de vector BAC además puede abarcar una "secuencia recombinante dependiente de la proteína de recombinación" y/o un "marcador seleccionable".
Los por menores, en esencia, de "secuencia recombinante dependiente de la proteína de recombinación" y/o un "marcador seleccionable" se dan por ejemplo en la literatura anteriormente mencionadas y en WO 22009/027412.
Sin importar el lugar donde el vector BAC se inserta en el genoma, es preferible que la secuencia de vector BAC esté flanqueada por secuencias que median la recombinación homologa, preferiblemente loxP. La secuencia de vector BAC comprende también, preferiblemente un marcador seleccionable (vide infra). En una forma más preferida, el marcador seleccionable es un marcador seleccionable de fármaco (vide infra). En otra modalidad recomendada el genoma de dicho herpesvirus recombinantes está presente en forma de un plásmido. Esto se logra aislando las formas circulares de los herpesvirus Koi recombinantes mencionados que comprenden una secuencia de vectores BAC e introducción en las células bacterianas. Como se mencionó anteriormente, no es esencial para la invención que la secuencia del vector BAC (cromosoma artificial bacteriano) se introduzca en uno o más de los genes virales que contribuyen a la virulencia o son necesarias para la replicación, siempre y cuando uno o más de los mencionados genes que contribuyen a la virulencia o son necesarios para la replicación estén hechos deficientes por técnicas de ingeniería genética. Por lo tanto, la secuencia del vector BAC puede insertarse en cualquier región del genoma del virus, siempre que ORF57 y preferiblemente uno o más genes virales diferentes que contribuyen a la virulencia también sean deficientes. Por supuesto, el uso de técnicas de clonación mediadas por el BAC vector como se describió anteriormente puede utilizarse en varias ocasiones: por ejemplo, una primera vez para hacer ORF57 deficiente y una segunda vez para hacer un gen adicional deficiente.
La secuencia del vector BAC puede en principio permanecer presente en un KHV recombinante según la invención en otras aplicaciones sin problemas. Sin embargo, para el uso de un herpesvirus Koi según la invención en por ejemplo una vacuna, es preferible que la mayoría de las secuencias de BAC se remuevan. Esto es por ejemplo el caso de las secuencias de BAC que comprenden los genes que codifican los marcadores seleccionares y más aún para los genes de resistencia. La presencia de dichos genes en una vacuna no sólo se considera innecesaria, sino incluso indeseable.
Por lo tanto, preferentemente al menos una parte (por ejemplo una parte que se compone de un gen de resistencia o un marcador seleccionable) o más preferiblemente la mayor parte de la secuencia de vector BAC es suprimida desde el genoma de herpesvirus, preferiblemente de tal modo dejando tras de sí una secuencia heteróloga en el sitio de división o inserción anterior en el genoma del herpesvirus. Más preferentemente, la secuencia heterologa tiene un tamaño de menos de 200 nucleótidos. La supresión se logra por la introducción del KHV recombinante en una célula eucariota permisiva expresando el Cre recombinasa que suprime la secuencia de vector BAC de flanqueo loxP.
Por lo tanto, una forma preferida de esta modalidad se refiere a un herpesvirus Koi recombinante según la invención, caracterizado en que parte de la secuencia de vector BAC es suprimida desde el genoma herpesvirus dejando así una secuencia heterologa en el sitio de la supresión o sitio de inserción anterior, respectivamente, en el genoma de herpesvirus.
Y en una forma más preferida de esta modalidad, la parte de la secuencia del vector BAC que es suprimida desde el genoma del herpesvirus comprende al menos un gen que codifica un marcador seleccionare y/o un gen de resistencia.
También es posible eliminar completamente la secuencia del cartucho BAC por recombinación homologa en células eucarióticas utilizando un fragmento de ADN del genoma viral tipo salvaje que abarca el sitio de inserción del cartucho BAC (por ejemplo, ORF55 codificación TK). La selección de placas virales que ya no expresan más EGFP (codificada por el cartucho BAC) permite la selección de recombinantes que han revertido el sitio de inserción del BAC a la secuencia de tipo salvaje.
El herpesvirus Koi recombinante según la invención presente en cualquier forma, el clon BAC KHV y el constructo KHV antes mencionado donde por lo menos parte de la secuencia del vector BAC es suprimida del genoma del herpesvirus puede ser usado para la manipulación adicional que implica por ejemplo técnicas de ingeniería genética para hacer el genoma deficiente en otros genes específicos. La deficiencia de dichos genes además igualmente puede obtenerse usando la técnica de BAC, como ya se ha dicho anteriormente.
Aunque un KHV recombinante según la invención puede utilizarse con fines de vacuna como tal (véase abajo), simplemente para evitar que el pez, más específicamente, la carpa, Cyprinus carpió carpió o Cyprínus carpió koi, de enfermedad KHV incluso más específicamente, también pueda ser eficientemente utilizado como virus portador para el fragmento de ADN heterólogo (es decir, no KHV). En ese caso, las características ventajosas del KHV recombinante según la invención se utilizaría completamente y además el virus por ejemplo ganaría propiedades adicionales como propiedades del marcador, propiedades inmunitarias adicionales o propiedades de adyuvante. "Propiedades de marcador" en este sentido significa que el fragmento de ADN heterólogo permite, directa o indirectamente, discriminar entre la infección del virus de campo o infección del virus de la vacuna. Una manera directa para discriminar entre la infección del virus de campo y la infección del virus de la vacuna por ejemplo implicaría una reacción de PCR utilizando cebadores que reaccionan específicamente con un fragmento de ADN heterólogo (es decir, no-KHV) en un KHV recombinante según la invención y no con el ADN de un virus de campo KHV. Una manera indirecta de discriminar entre la infección del virus de campo y la infección del virus de la vacuna, por ejemplo implicaría una reacción inmunológica usando un anticuerpo que reacciona específicamente con una proteína inmunogénica codificada por un fragmento de ADN heterólogo (es decir, no-KHV) en un KHV recombinante según la invención y con ninguna proteína de un virus de campo KHV.
Por lo tanto, otra modalidad de la presente invención se refiere a un KHV recombinante según la invención que consta de un fragmento de ADN heterólogo, por ejemplo un gen heterólogo.
Preferiblemente, tal fragmento de ADN heterólogo es un gen heterólogo que codifica una proteína inmunogénica de otro virus o microorganismo que es patógeno de peces, más específicamente, carpa, aún más específicamente Cyprinus carpió carpió o Cyprinus carpió koi.
Más preferentemente, el gen heterólogo es la glicoproteína G del rabdovirus que causa viremia primaveral de la carpa. Tal construcción, cuando se utiliza una vacuna, no sólo protegerá la carpa contra KHV sino también contra la viremia primaveral de la carpa. Los promotores adecuados para la expresión de genes heterólogos en células eucariotas son ampliamente conocidos en la técnica. Un ejemplo de un promotor adecuado para la expresión de un gen heterólogo, por ejemplo la glicoproteína G del rabdovirus que causa viremia primaveral de la carpa es el promotor de HCMV IE.
La presente invención además proporciona un método para la producción de partículas infecciosas de herpesvirus Koi (KHV) recombinante, en donde dicho método comprende los pasos de (a) introducir un KHV recombinante según la invención o un ADN KHV recombinante que comprende el genoma de un KHV recombinante según la invención en las células eucariotas permisivas; y (b) cultivar la célula hospedera para producir herpesvirus Koi recombinante (KHV) Debido a su carácter atenuado, los herpesvirus Koi recombinantes antes mencionados según la invención y su ADN son muy convenientes para la inmunización del pez, preferiblemente individuos Cyprínus carpió carpió o Cyprínus carpió koi por inyección o balneación o por vía oral.
Por lo tanto, todavía otra modalidad de la invención presente proporciona un herpesvirus Koi recombinante según la invención y/o un ADN KHV que comprende el genoma de los herpesvirus Koi recombinante según la invención para su uso en la prevención y/o tratamiento terapéutico de una enfermedad en los peces causada por herpesvirus Koi (KHV).
El uso preventivo es un uso que apunta a prevenir la infección, o manifestaciones menos clínicas de la enfermedad. El uso terapéutico es un uso de dicho KHV o KHV ADN en peces que ya sufren de la enfermedad causada por KHV.
Nuevamente, todavía otra modalidad de la invención presente proporciona un herpesvirus Koi recombinante según la invención y/o un ADN KHV que comprende el genoma de los herpesvirus Koi recombinantes según la invención para su uso en una vacuna para la prevención y/o tratamiento terapéutico de una enfermedad en los peces causada por herpesvirus Koi (KHV).
Todavía otra modalidad de la invención presente proporciona una vacuna para la prevención y/o el tratamiento terapéutico de una enfermedad en los peces causados por herpesvirus Koi (KHV), caracterizada en que dicha vacuna comprende un herpesvirus Koi recombinante según la invención y/o un ADN KHV que comprende el genoma de los herpesvirus Koi recombinantes según la invención y un portador farmacéuticamente aceptable.
Otra vez otra modalidad de la invención presente proporciona una vacuna para la prevención y/o tratamiento de una enfermedad en los peces causada por un rabdovirus causando viremia primaveral de la carpa, vacuna la cual comprende un KHV recombinante según la invención llevando el gen que codifica la glicoproteína G de dicho rabdovirus causando viremia primaveral de la carpa o una secuencia de ADN que comprende el genoma de dicho KHV recombinante y un portador farmacéuticamente aceptable.
Como se utiliza en este documento, el término "vacuna" se refiere a una composición capaz de prevención y/o el tratamiento terapéutico de un hospedero a una determinada enfermedad. Tal vacuna puede producir inmunidad profiláctica o terapéutica.
El portador farmacéuticamente aceptable puede ser tan simple como el agua o un regulador de pH. El portador farmacéuticamente aceptable también puede componerse de estabilizadores. También puede constar de un adyuvante o en sí mismo puede ser un adyuvante.
Por lo general, las vacunas se preparan como soluciones líquidas, emulsiones o suspensiones para inyección o la entrega a través de la inmersión del pez en el agua. Por ejemplo, se puede preparar una emulsión líquida o concentrado emulsionable para ser añadido a un tanque de agua o baño donde se tienen a los peces. También se pueden preparar formas sólidas (por ejemplo polvo) convenientes para la disolución o suspensión en vehículos líquidos o para mezclarse con alimentos sólidos, antes de la administración. La vacuna puede ser un cultivo liofilizada en una forma lista para usarse para la reconstitución con un diluyente estéril. Por ejemplo, las células liofilizadas pueden ser reconstituidas en solución salina al 0.9% (opcionalmente proporcionada como parte del producto envasado de vacuna).
Una formulación preferida de la vacuna inyectable es una emulsión. Las formas líquidas o reconstituidas de la vacuna pueden diluirse en un pequeño volumen de agua (por ejemplo volúmenes de 1 a 100) antes de la adición a una pluma, depósito o baño.
En una forma preferida de esta modalidad, la preparación de la vacuna que comprende la cepa recombinante de KHV está en forma seca, por ejemplo en forma de polvo, liofilizada, en forma de pellas o tabletas comprimidas, etc.
En otra forma de esta modalidad, dicho virus puede estar en forma de un fluido de cultivo de tejido. Dicho fluido puede ser almacenado en el ambiente, preferiblemente a -70°C, más preferentemente como una solución que contiene glicerol. En un ejemplo concreto, el fluido de cultivo de tejido contiene 20% de glicerol.
La cepa recombinante de KHV descrita en la presente invención podrá ser convertida en una forma seca por un número de métodos. Una forma particularmente preferida de secado es a través de liofilización. Antes del secado, por ejemplo, procedimiento de liofilización, una variedad de ingredientes pueden agregarse al medio como preservativos, anti-oxidantes o agentes reductores, una variedad de excipientes, etc. Dichos excipientes pueden también añadirse al virus atenuado activo seco, por ejemplo, liofilizado también después del paso de secado.
Cuando el KHV recombinante según la invención se utiliza como un componente de la vacuna para la administración oral (por ejemplo, mediante inmersión o balneación), generalmente será necesario para la administración de un adyuvante. Si sin embargo la preparación de la vacuna se inyecta directamente en el pez, el uso de un adyuvante es opcional. Si el KHV recombinante según la invención está en una forma no replicativa, puede preferirse la adición de estimulantes inmunes.
En general, con el fin de potenciar la respuesta inmune, la preparación puede incluir una variedad de adyuvantes, citoquinas u otros estimulantes inmunes, particularmente en el caso de preparaciones que están destinadas para la inyección. Un adyuvante es una sustancia inmunoestimulante que impulsa la inmunorespuesta del hospedero de forma no específica. El adyuvante puede ser adyuvante hidrofílico, por ejemplo, hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio o adyuvante hidrofóbico, por ejemplo adyuvantes a base de aceite mineral. Adyuvantes como muramil dipéptidos, avidina, hidróxido de aluminio, fosfato de aluminio, aceites, emulsiones de aceite, saponinas, sulfato de dextrano, glucanos, citoquinas, copolímeros de bloque, oligonucleótidos inmunoestimulantes y otros conocidos en la técnica pueden ser mezclados con el KHV recombinante según la invención. Los ejemplos de los adyuvantes utilizados con frecuencia en el cultivo de peces son muramil dipéptidos, lipopolisacáridos, varios glucanos y glicanos y Carbopol® (un homopolímero). Convenientes adyuvantes son, por ejemplo, emulsiones agua en aceite (w/o), emulsiones o/w y emulsiones dobles w/o/w. Adyuvantes de aceite adecuados para su uso en emulsiones w/o son por ejemplo aceites minerales o aceites metabolizables. Aceites minerales son, por ejemplo Bayol®, Marcol®; y Drakeol®; aceites metabolizables son, por ejemplo, aceites vegetales, como el aceite de maní y aceite de soya, o aceites animales como el escualeno y escualano de aceites de pescado. Alternativamente un solubilizado de vitamina E (tocoferol) como se describe en EP 382,271 puede utilizarse ventajosamente. Emulsiones o/w muy convenientes por ejemplo se obtienen a partir de la fase del agua w/w 5-50% y adyuvante de aceite w/w 95-50%, más preferiblemente fase de agua w/w 20-50% y adyuvante de aceite w/w 80-50% se utilizan. La cantidad de adyuvante añadido depende de la naturaleza de los propios adyuvantes y la información con respecto a tales cantidades proporcionadas por el fabricante.
En una modalidad preferida la vacuna según la invención comprende además un estabilizador. Un estabilizador puede agregarse a una vacuna según la invención por ejemplo para protegerla de la degradación, para aumentar la vida útil, o para mejorar la eficiencia de liofilización. Los estabilizadores útiles son, entre otros, SPGA (Bovarnik et al., 1950, J. Bacteriology, vol. 59, p. 509), leche desnatada, gelatina, albúmina de suero bovino, hidratos de carbono por ejemplo, sorbitol, manitol, trehalosa, almidón, sacarosa, dextrano o glucosa, lactosas, proteínas como albúmina o caseína o productos de degradación de los mismos y reguladores de pH, tales como fosfatos de metal alcalino.
Para evitar que el potencial de crecimiento de los gérmenes pueden añadirse antibióticos como estreptomicina y neomicina.
Además, la vacuna puede abarcar uno o más compuestos tensoactivos adecuados o emulsionantes, por ejemplo Span® o Tween®. La vacuna también puede abarcar el denominado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al que se adhiere el virus KHV (ya sea en forma de una partícula de virus o en forma de ADN) según la invención se adhiere, sin ser covalentemente unido a él. Estos vehículos son, entre otros, bio-microcápsulas, micro-alginatos, liposomas y macrosoles, conocidos en la técnica. Una forma especial de tal vehículo es un Iscom. Hace falta decir que el mezclado de otros estabilizadores, portadores, diluyentes, emulsiones, y lo similar a las vacunas según la invención están dentro del ámbito de la invención. Dichos aditivos por ejemplo se describen en manuales bien conocidos tales como: "Remington: the science and practice of pharmacy" (2000, Lippincot, USA, ISBN: 683306472), y: "Veterinary vaccinology" (P. Pastoret et al. ed., 1997, Elsevier, Amsterdam, ISBN: 0444819681).
El KHV recombinante cuando se utiliza en su forma seca en una vacuna además puede incluir un fluido de reconstitución, agua preferentemente estéril, solución salina o fisiológica. También puede contener pequeñas cantidades de materiales residuales de los procedimientos de fabricación tales como proteínas de células, ADN, ARN, etc. Mientras que estos materiales no sean aditivos propiamente, sin embargo pueden estar presentes en la formulación de la vacuna.
La vacuna puede ser administrada a los peces individualmente-oralmente, por ejemplo a través de su alimentación o por administración oral forzada o por inyección (por ejemplo por la vía intramuscular o intraperitoneal).
Alternativamente la vacuna puede ser administrada simultáneamente a la población de peces entera contenida en un cuerpo de agua por aspersión, disolución y/o sumergiendo la vacuna. Estos métodos son útiles para la vacunación de todas las clases de peces, por ejemplo, alimentos y peces ornamentales y en varios ambientes tales como estanques, acuarios, hábitat natural y reservónos de agua dulce.
Otro aspecto de la invención se refiere a una vacuna de ADN que comprende el KHV recombinante según la invención.
Las vacunas de ADN según la invención básicamente no difieren de las vacunas que comprenden el KHV recombinante según la invención, en el sentido que forman el genoma de un KHV recombinante según la invención. Fácilmente pueden ser administradas a través de aplicación intradérmica por ejemplo, usando un inyector sin aguja como un GeneGun®. Esta forma de administración entrega el ADN directamente en las células del animal a ser vacunado. Una cantidad preferida de un ADN KHV recombinante según la invención, en una composición farmacéutica según la invención (tal como se indica a continuación) está en el intervalo entre 10 pg y 1000 \ÍQ. Preferiblemente, se utilizan cantidades en el intervalo entre 0.1 y 100 pg. Alternativamente, los peces pueden ser sumergidos en soluciones que comprenden por ejemplo entre 10 pg y 1000 Mg/ml del ADN para ser administradas. Todas estas técnicas y vías de administración son bien sabidas en la técnica.
Preferentemente la vacuna según la invención está formulada en una forma adecuada para la inyección o para la vacunación de inmersión, como una suspensión, solución, emulsión, dispersión y similares.
El esquema de dosificación para la aplicación de una vacuna según la invención al organismo objetivo puede ser la aplicación de dosis únicas o múltiples, que pueden ser dadas a la vez o consecutivamente, de manera compatible con la dosificación y la formulación y en tal cantidad que sea inmunológicamente eficaz. Está dentro de la capacidad de la persona calificada determinar si un tratamiento es "inmunológicamente efectivo", por ejemplo al administrar una infección experimental desafiante a los animales vacunados y luego determinar los signos clínicos de los animales objetivo de la enfermedad, los parámetros serológicos, o mediante la medición del reaislamiento del patógeno.
Lo que constituye una "cantidad farmacéuticamente eficaz" para una vacuna según la invención que se basa en un KHV recombinante o un DNA KHV recombinante según la invención, es dependiente sobre el efecto deseado y el organismo objetivo. La determinación de la cantidad efectiva está dentro de las habilidades del médico de rutina. Una cantidad preferida de un ADN KHV recombinante según la invención, integrada en una composición farmacéutica según la invención, se ha descrito anteriormente.
Una cantidad preferida de una vacuna viva que comprende la cepa del virus KHV recombinante según la invención se expresa por ejemplo como unidades formadoras de placa (pfu). Por ejemplo para un vector viral vivo en un intervalo de dosis entre 1 y 1010 unidades formadoras de placa (pfu) por dosis de animal ventajosamente puede ser utilizada; preferiblemente un intervalo entre 102 y 106 pfu/dosis. Muchas formas de administración pueden ser aplicadas, todas conocidas en la técnica. Las vacunas según la invención se administran preferentemente a los peces vía inyección (intramuscular o por vía intraperitoneal), inmersión, sumergimiento o per os. El protocolo para la administración puede optimizarse conforme a las prácticas estándar de vacunación.
Si una vacuna comprende una forma no replicativa del KHV recombinante según la invención, la dosis se expresaría como el número de partículas no replicativas del virus que se administrará. Entonces la dosis generalmente sería algo mayor en comparación con la administración de las partículas del virus vivo, ya que las partículas del virus vivo replican en cierta medida en el animal objetivo, antes de que se eliminen por el sistema inmune. Para las vacunas sobre la base de las partículas del virus no replicativo, una cantidad de partículas del virus en el intervalo de aproximadamente 104 a 109 partículas generalmente sería conveniente.
Preferentemente la vacuna se administra mediante inmersión, especialmente cuando un KHV recombinante vivo según la invención se utiliza. Esto es especialmente eficaz en el caso de la utilización de las vacunas en el ajuste de la agricultura comercial acua-cultivo.
Leyendas de las figuras Figura 1 : Representación esquemática de la región del genoma CyHV-3 que abarca ORF57. Las coordenadas de ATG y codones de interrupción de cada ORF (según Genbank No. de acceso NC_009127) son indicadas. Se presentan las coordenadas de promotores putativos (P) identificados por análisis in silico dentro o cerca de ORF56 y ORF57. El número después de la letra P identifica el ORF bajo control de la secuencia del promotor identificada. Las secuencias seleccionadas se eliminarán con el fin de invalidar ORF56 y/o ORF57 están representadas en la parte superior. Se indican las coordenadas de las eliminaciones.
Figura 2 y 3: Diagrama de flujo de etapas realizadas para producir plásmidos recombinantes de BAC FL galK suprimidos para ORF57 (figura 2) o ORF56 (figura 3) y para demostrar la reconstitución del virus infeccioso de los plásmidos producidos. Las regiones de ORF57 o ORF56, como se identifica en la figura 1 , fueron reemplazadas por un cartucho de expresión galK mediante recombinación homologa en E. coli. Para reconstituir el virus infeccioso con un locus de timidina quinasa tipo salvaje (TK) (cepas revertientes FL BAC), los plásmidos recombinantes fueron co-transfectados en células CCB permisivas con el plásmido pGEMT-TK. Para reconstituir el virus infeccioso con una forma truncada de TK (cepas BAC FL cortadas), los plásmidos recombinantes fueron transfectados en células CCB expresando Cre recombinasa.
Figura 4: Diagrama de flujo de etapas realizadas para producir plásmidos recombinantes de BAC FL suprimidos para ORF57 y ORF56 (ORF56-57), y para demostrar la reconstitución del virus infeccioso de los plásmidos producidos. La región de ORF57, como se identifica en la figura 1 , fue reemplazada por un cartucho de expresión galK mediante recombinación homologa en E. coli. El cartucho de expresión galK entonces fue removido por recombinación homologa con una secuencia de ADN sintética correspondiente a regiones del genoma KHV flanqueando el cartucho de expresión galK (cartucho ORF56-57 Del). Para reconstituir el virus infeccioso con un locus de timidina quinasa tipo salvaje (TK) (cepas revertientes FL BAC), el plásmido recombinante fue co-transfectado en células CCB permisivas con el plásmido pGEMT-TK. Para reconstituir el virus infeccioso con una forma truncada de TK (cepas BAC FL cortadas), el plásmido recombinante fue transfectado en células CCB expresando Cre recombinasa.
Figuras 5A-5G: Pruebas de seguridad (figuras 5A-5D) y vacunación/desafío (figuras 5E-5G) de recombinantes suprimidos sencillos ORF57. La seguridad de las cepas BAC FL suprimida galK ORF57 Del 1 (A) y el BAC FL suprimido Del ORF57 2 galK (figura 5B) fue probada como se describe en los ejemplos (pruebas de seguridad) en la carpa común (7 meses de edad, es decir peso de 3.74 g, n = 20). La cepa BAC FL cortada (figura 5C) y la infección simulada (figura 5D) fueron utilizadas como controles positivos y negativos, respectivamente. Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según los días pos-infección tomando el día 0 como referencia. La infección después de seis semanas con los recombinantes suprimidos sencillos ORF57 (figura 5E y 5F), los peces fueron desafiados como se indica en los ejemplos (vacunación/desafío). Los peces infectados de manera simulada fueron utilizados como controles (figura 5G). Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según los días pos-infección tomando el día 42 como referencia.
Figuras 6A-6D: seguridad de recombinantes suprimidos sencillos ORF56. La seguridad de las cepas BAC FL suprimida galK ORF56 Del 1 (figura 6A) y la cepa BAC FL suprimida ORF56 Del 2 galK (figura 6B) fue probada como se describe en los ejemplos (pruebas de seguridad) en la carpa común (7 meses de edad, es decir peso de 3.74 g, n = 20). La cepa BAC FL cortada (figura 6C) y la infección simulada (figura 6D) fueron utilizadas como controles positivos y negativos, respectivamente. Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según los días pos-infección tomando el día 0 como referencia.
Figuras 7A-7G: pruebas de seguridad (figuras 7A-7C) y de vacunación/desafío (figuras 7D-7G) de la cepa BAC FL suprimida ORF56-57 Del. La seguridad de la cepa BAC FL suprimida Del ORF56-57 (figura 7B) fue probada como se describe en los ejemplos (pruebas de seguridad) en la carpa común (7 meses de edad, es decir peso de 4.41 g, n = 30). La cepa BAC FL suprimida (figura 7A) y la infección simulada (figura 7C) fueron utilizadas como controles positivos y negativos, respectivamente. La infección simulada fue realizada en grupos duplicados. Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según los días pos-infección tomando el día 0 como referencia. Pruebas de vacunación/desafío (figuras 7D-7G). Peces (n = 15) vacunados con la cepa BAC FL suprimida ORF56-57 Del fueron desafiados con la cepa KHV FL en 3 semanas (figura 7D) o 6 semanas (figura 7F) tras la vacunación como se describe en los ejemplos (vacunación/desafío). Los grupos duplicados de peces infectados de forma simulada fueron utilizados como controles (figuras 7E y 7G). . Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según días pos-infección tomando el día del desafío como referencia.
Figuras 8A-8G: pruebas de seguridad (figuras 8A-8C) y de vacunación/desafío (figuras 8D-8G) de la cepa BAC FL revertiente ORF56-57 Del. La seguridad de la cepa BAC FL revertiente Del ORF56-57 (figura 8B) fue probada como se describe en los ejemplos (pruebas de seguridad) en la carpa común (7 meses de edad, es decir peso de 3.74 g, n = 30). La cepa BAC FL revertiente (figura 8A) y la infección simulada (figura 8C) fueron utilizadas como controles positivos y negativos, respectivamente. La infección simulada fue realizada en grupos duplicados. Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según los días pos-infección tomando el día 0 como referencia. Pruebas de vacunación/desafío (figuras 8D-8G). Peces (n = 15) vacunados con la cepa BAC FL revertiente ORF56-57 Del fueron desafiados con la cepa KHV FL en 3 semanas (figura 8D) o 6 semanas (figura 8F) tras la vacunación como se describe en los ejemplos (vacunación/desafío). Los grupos duplicados de peces infectados de forma simulada fueron utilizados como controles (figuras 8E y 8G). Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según días pos-infección tomando el día del desafío como referencia.
EJEMPLOS a) Células y virus Células del cerebro Cyprinus carpió (CCB) (Neukirch et al., 1999) fueron cultivadas en medio esencial mínimo (MEM, Invitrogen) que contiene 4.5 g/l glucosa (D-Glucosa monohidrato, Merck) y 10% de suero fetal de ternero (FCS). Las células fueron cultivadas a 25°C en una atmósfera húmeda que contiene 5% de C02. La cepa FL CyHV-3 fue aislada desde el riñon de un pez que murió de KHV (CER Marloie, Bélgica). b) Plásmido BAC CvHV-3 El plásmido CyHV-3 FL BAC fue utilizado como plásmido parental para producir recombinantes CyHV-3. Este plásmido se ha descrito extensivamente en Costes et al (2008) y en la solicitud de patente internacional WO 2009/027412. El plásmido CyHV-3 FL BAC es un clon del cromosoma artificial bacteriano infeccioso (BAC) del genoma de la cepa FL CyHV-3. En este plásmido, el cartucho de BAC flanqueado loxP se inserta en el locus CyHV-3 TK (ORF55). c) Producción de plásmidos recombinantes ORF 57 CyHV-3 FL BAC usando selección positiva galK en bacterias Dos plásmidos recombinantes BAC FL CyHV-3 con la supresión en el locus ORF57 (véase ORF57 Del 1 y ORF57 Del 2 en la figura 1) fueron producidos usando una selección positiva galK en bacterias como se describió anteriormente (Warming et al., 2005) (figura 2). El fragmento de recombinación consistió en un gen de galactoquinasa (galK) (1231 bp) flanqueado por secuencias homologas 50 bpa a las regiones del genoma de CyHV-3 flanqueando la secuencia a ser suprimida (figura 1).
Estos fragmentos fueron producidos por PCR usando el vector pgalK como plantilla. Los siguientes cebadores fueron utilizados para la amplificación (véase el cuadro 1 para la secuencia del cebador): para la producción de la supresión Del ORF57 1 : cartillas ORF57 Dell fw y ORF57 DeM rev conduce al amplicón ORF57 Del 1-galK; para la producción de la supresión ORF57 del2: plantillas ORF57 Del2 fw y ORF57 Del2 rev llevando al amplicón ORF57 Del 2-galK. El producto de amplificación se purificó (Kit de extracción QIAquick Gel). A continuación, células SW102 electrocompetentes que contienen el plásmido CyHV-3 FL BAC fueron electroporadas con 50 ng de los productos de PCR descritos anteriormente. Las células electroporadas fueron colocadas en placas en mínimo medio sólido M63 suplementado con 20% de galactosa y cloranfenicol (17 pg/ml) para seleccionar las bacterias donde la recombinación homologa ocurrió. Finalmente, las colonias obtenidas fueron sembradas sobre placas indicadoras MacConkey como se describe en otro lugar para confirmar la producción de clones positivos galK. Las moléculas recombinantes de BAC fueron amplificadas y purificadas (Kit grande-constructo QIAGEN), y su estructura molecular fue controlada mediante un enfoque combinado endonucleasa de restricción-Southern blot, PCR y secuenciación.
CUADRO 1 Oliqonucleótidos usados para la amplificación PCR * Los cebadores representan secuencias homólogas al genoma CyHV-3 (secuencias subrayadas) y al cartucho de expresión galK. d) Reconstitución del virus infeccioso del plásmido recombinante ORF 57 CvHV-3 FL BAC Los plásmidos CyHV-3 BAC fueron transfectados (Lipofectamine Plus, Invitrogen) en CCB permisiva. Para producir cepas derivadas de plásmido BAC con un locus TK de tipo salvaje, los plásmidos CyHV-3 BAC fueron co-transfectados en células CCB junto con el vector pGEMT-TK (relación molecular 1 :75). Siete días posteriores a la transfección, placas virales negativas para la expresión de EGFP (el cartucho BAC codifica un cartucho de expresión de EGFP) fueron elegidas y enriquecidas por tres rondas sucesivas de la purificación de la placa. Similarmente, para reconstituir los viriones con cartucho suprimido BAC del genoma viral, los plásmidos BAC fueron co-transfectados en células CCB junto con el vector pEFIN3-NLS-Cre de codificación de Cre recombinasa fusionada en una señal de localización nuclear (Costes et al; 2008 IMV) (relación molecular: 1 :70). e) Producción de plásmidos recombinantes ORF 56 CvHV-3 FL BAC usando selección positiva galK en bacterias Dos plásmidos recombinantes BAC FL CyHV-3 con la supresión en el locus ORF56 (véase ORF56 Del 2 y ORF56 Del 2 en la figura 1) fueron producidos usando una selección positiva galK en bacterias como se describió anteriormente (Warming et al., 2005) (figura 3). El fragmento de recombinación consistió en un gen de galactoquinasa (galK) (1231 bp) flanqueado por secuencias homólogas 50 bpa a las regiones del genoma de CyHV-3 flanqueando la secuencia a ser suprimida (figura 1). Estos fragmentos fueron producidos por PCR usando el vector pgalK como plantilla. Los siguientes cebadores fueron utilizados para la amplificación (véase el cuadro 2 para la secuencia del cebador): para la producción de la supresión ORF56 Del 1 : cebadores ORF56 DeM fw y ORF56 Dell rev conduce al amplicón ORF56 Del 1-galK; para la producción de la supresión ORF56 Del 2: cebadores ORF56 Del2 fw y ORF56 Del2 rev llevando al amplicón ORF56 Del 2-galK. El producto de amplificación se purificó (Kit de extracción QIAquick Gel). A continuación, células SW102 electrocompetentes que contienen el plásmido CyHV-3 FL BAC fueron electroporadas con 50 ng de los productos de PCR descritos anteriormente. Las células electroporadas fueron colocadas en placas en mínimo medio sólido M63 suplementado con 20% de galactosa y cloranfenicol (17 pg/ml) para seleccionar las bacterias donde la recombinación homóloga ocurrió. Finalmente, las colonias obtenidas fueron sembradas sobre placas indicadoras MacConkey como se describe en otro lugar para confirmar la producción de clones positivos galK. Las moléculas recombinantes de BAC fueron amplificadas y purificadas (Kit QIAGEN grande-Construct), y su estructura molecular fue controlada mediante un enfoque combinado endonucleasa de restricción-Southern blot, PCR y secuenciación.
CUADRO 2 Oligonucleótidos usados para la amplificación PCR * Los cebadores representan secuencias homólogas al genoma CyHV-3 (secuencias subrayadas) y al cartucho de expresión galK.
F) Reconstitución del virus infeccioso del plásmido recombinante ORF 56 CvHV-3 FL BAC Los plásmidos CyHV-3 BAC fueron transfectados (Lipofectamine Plus, Invitrogen) en CCB permisiva. Para producir cepas derivadas de plásmido BAC con un locus TK de tipo salvaje, los plásmidos CyHV-3 BAC fueron co-transfectados en células CCB junto con el vector pGEMT-TK (relación molecular 1 :75). Siete días posteriores a la transfección, placas virales negativas para la expresión de EGFP (el cartucho BAC codifica un cartucho de expresión de EGFP) fueron elegidas y enriquecidas por tres rondas sucesivas de la purificación de la placa. Similarmente, para reconstituir los viriones con cartucho suprimido BAC del genoma viral, los plásmidos BAC fueron co-transfectados en células CCB junto con el vector pEFIN3-NLS-Cre de codificación de Cre recombinasa fusionada en una señal de localización nuclear (Costes et al; 2008 IMV) (relación molecular: 1 :70). g) Producción de plásmidos recombinantes ORF56- 57 CvHV-3 FL BAC usando selección positiva v negativa galK en bacterias Plásmidos recombinantes BAC FL CyHV-3 con la supresión en el locus ORF56 y ORF57 (figura 1) fueron producidos usando una selección positiva y negativa galK en bacterias como se describió anteriormente (Warming et al., 2005) (figura 4). El primer procedimiento de recombinación (selección positiva galK) fue reemplazar la secuencia identificada de ORF56 y ORF57 por el gen de galactoquinasa (galK) (1231 bp). El fragmento de recombinación consistió del gen galK flanqueado por secuencias homologas 50bp a las regiones del genoma CyHV-3 flanqueando la secuencia se suprimirá (Fig. 1) (ORF56-57 Del galK, figura 4). Este fragmento fue producido por PCR usando los cebadores ORF56-ORF57 Del fw y ORF56-ORF57 Del rev (cuadro 3) y el vector de pgalK como la plantilla. El producto de amplificación se purificó (Kit de extracción QIAquick Gel). A continuación, células SW102 electrocompetentes que contienen el plásmido CyHV-3 FL BAC fueron electroporadas con 50 ng del producto de PCR descrito anteriormente. Las células electroporadas fueron colocadas en placas en mínimo medio sólido M63 suplementado con 20% de galactosa y cloranfenicol (17 pg/ml) para seleccionar las bacterias donde la recombinación homologa ocurrió. Finalmente, las colonias obtenidas fueron sembradas sobre placas indicadoras MacConkey como se describe en otro lugar para confirmar la producción de clones positivos galK. Las moléculas recombinantes de BAC fueron amplificadas y purificadas (Kit grande-constructo QIAGEN), y su estructura molecular fue controlada mediante un enfoque combinado endonucleasa de restricción-Southern blot, PCR y secuenciación. El segundo procedimiento de recombinación (selección negativa galK) fue remover el cartucho galK del plásmido FL ORF56 BAC-57 Del galK. Un fragmento de ADN sintético de 499 bp (cartucho ORF56-57 Del, vide infra) se utilizó para alcanzar esta meta. Se compone de secuencias homologas a las regiones del genoma CyHV-3 flanqueando la secuencia a ser suprimida: 250 bp (de coordenadas 96751 a 9700, Genbank No. de acceso NC_009127) aguas arriba del gen galK y 249 bp (de coordenadas 99751 a 100000 con supresión de base 99760, Genbank No. de acceso NC_009 27) aguas abajo en el gen galK. Las células SW102 electrocompetentes que contienen el plásmido FL BAC ORF56-57 Del galK fueron electroporadas con 50 ng del producto de PCR descrito anteriormente. Las células electroporadas fueron colocadas en placas en medio mínimo sólido suplementado con 2-desoxi-galactosa para seleccionar las bacterias en donde la recombinación homologa ocurre (digestión de 2-desoxi-galactosa por galK producen productos tóxicos). Las moléculas recombinantes de BAC fueron amplificadas y purificadas (Kit QIAGEN grande-Construct), y su estructura molecular fue controlada mediante un enfoque combinado endonucleasa de restricción-Southern blot, PCR y secuenciación.
Cartucho ORF56-57 Del: 5'- tttgtcaaccagtcctccagggtcggtttggcgctggcctccttgcccttggtcacggcgatggcagacgccac aatcctcgcgacgggttccgtcagagcagagttcttaaacatttcgacgcctcctccgacggtgaaccactct gaccaattcaggtcggagggccacgtctgcctgtgcatcatcgtctgcacagcgtccctcgacagccccagc ccgcacagcagtcgccactcttccctgttgagtgcacgactcgtcaagatcaagctgcttgagcgcgtcgtgt acgggttcatgatggccctgcagaaggcgctgcgcattcagaagcagggctgcaggatggtggggctcga ggacccggagaaggtggaggatatgaagaactttgtgctgcacaagggcttcaaccaccactacgccttct gcgatcaccactggcagcactgggccctgggccgctccttcgagggcgagctgcccgacgtggtgg-3' CUADRO 3 Oligonucleótidos usados para la amplificación PCR * Los cebadores representan secuencias homologas al genoma CyHV-3 (secuencias subrayadas) y al cartucho de expresión galK. h) Reconstitución del virus infeccioso del plásmido recombinante ORF 56-57 CvHV-3 FL BAC Los plásmidos CyHV-3 BAC fueron transfectados (Lipofectamine Plus, Invitrogen) en CCB permisiva. Para producir cepas derivadas de plásmido BAC con un locus TK de tipo salvaje, los plásmidos CyHV-3 BAC fueron co-transfectados en células CCB junto con el vector pGEMT-TK (relación molecular 1 :75). Siete días posteriores a la transfección, placas virales negativas para la expresión de EGFP (el cartucho BAC codifica un cartucho de expresión de EGFP) fueron elegidas y enriquecidas por tres rondas sucesivas de la purificación de la placa. Similarmente, para reconstituir los viriones con cartucho suprimido BAC del genoma viral, los plásmidos BAC fueron co-transfectados en células CCB junto con el vector pEFIN3-NLS-Cre de codificación de Cre recombinasa fusionada en una señal de localización nuclear (Costes et al; 2008 IMV) (relación molecular: 1 :70). i) Pruebas de seguridad Las carpas comunes fueron calcinadas en tanques de 60 litros a 24°C durante 10 días. Las carpas (biomasa de 50g de pez/l) se sumergieron durante 2 horas en agua que contiene 4, 40 ó 400 PFU/ml de la cepa KHV a ser probadas. El grupo control (infectado de forma simulada) fue sumergido en el agua donde se ha agregado un volumen igual de medio de cultivo. Al final del período de incubación, los peces fueron devueltos al tanque más grande. El inoculo viral fue titulado antes de la inoculación y contra-titulado después de la inoculación para asegurar que las dosis fueran equivalentes entre los grupos. Los peces fueron examinados diariamente para los signos clínicos de enfermedad KHV y peces muertos fueron removidos.
¡) Vacunación/desafío Las carpas comunes fueron climatizadas en tanques de 60 litros a 24°C durante 10 días. Para la vacunación, las carpas (biomasa de 50 g de pez/l) se sumergieron durante 2 horas en agua que contiene 4, 40 ó 400 PFU/ml de la cepa KHV a ser probada. Al final del período de incubación, los peces fueron devueltos al tanque más grande. En 3 semanas o 6 semanas pos-vacunación, los peces fueron desafiados con KHV virulento por convivencia con peces sin tratamiento previo infectados antes de su liberación en el tanque de peces vacunados. Estos peces fueron inoculados por inmersión en agua que contiene 300 PFU/ml de la cepa virulenta de FL parental durante 2 horas. Se agregaron dos peces infectados a cada tanque que contiene peces vacunados. k) Resultados de seguridad y desafío La seguridad de las cepas BAC FL suprimida galK ORF57 Del 1 (figura 5A) y BAC FL suprimida Del ORF57 2 galK (figura 5B) fue probada como se describe en los ejemplos (pruebas de seguridad) en la carpa común (7 meses de edad, peso medio de 3.74 g, n = 20). La cepa BAC FL cortada (figura 5C) y la infección simulada (figura 5D) fueron utilizadas como controles positivos y negativos, respectivamente. Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según los días pos-infección tomando el día 0 como la referencia. La pos-infección después de seis semanas con los recombinantes suprimidos sencillos ORF57 (figuras 5E y 5F), los peces fueron desafiados como se indica en los ejemplos (vacunación/desafío). Los peces infectados de manera simulada fueron utilizados como controles (figura 5G). Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según los días posinfección tomando el día 42 como referencia. Es claro de las figuras 5A y 5B que una supresión de ORF57 muíante de acuerdo a la invención es segura, cuando se aplica a pequeños peces. También resulta evidente a partir de las figuras 5E y 5F que un mutante de supresión KHV ORF57 según la invención es muy conveniente como una vacuna eficaz, especialmente cuando se administra en una dosis de 40 pfu/ml o superior.
La seguridad de las cepas BAC FL suprimidas galK ORF56 Del 1 (figura 6A) y la cepa BAC FL suprimida ORF56 Del 2 galK (figura 6B) fue probada como se describe en los ejemplos (pruebas de seguridad) en la carpa común (7 meses de edad, peso medio de 3.74 g, n = 20). La cepa BAC FL cortada (figura 6C) y la infección simulada (figura 6D) fueron utilizadas como controles positivos y negativos, respectivamente. Los porcentajes de la carpa sobreviviente se expresaron según los días pos-infección tomando el día 0 como referencia. Como será claro a partir de las figuras 6A y 6B, los mutantes de supresión de ORF56 muestran una virulencia que es comparable aproximadamente con la del virus de tipo salvaje de control (comparar las figuras 6A y 6B con la figura 6C).
Como puede verse en las figuras 7A-7G y 8A-8G, un KHV que lleva una supresión en ORF57 y en ORF56 muestra un perfil de seguridad y eficacia que es comparable al del KHV llevando una sola supresión ORF57.
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Claims (14)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un herpesvirus Koi (KHV) recombinante vivo en donde el marco de lectura abierto 57 (ORF57) es deficiente, lo que resulta en un KHV que es atenuado.
2. El herpesvirus Koi recombinante vivo de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque es deficiente en al menos un gen adicional que contribuye a la virulencia, pero no es esencial para la replicación.
3. El herpesvirus Koi recombinante vivo de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado además porque dicho al menos un gen adicional es seleccionado del grupo formado por el gen de timidina quinasa, ORF12: gen del receptor putativo del factor de necrosis tumoral (TNF); ORF16: gen del receptor acoplado a la proteína G putativo (GPCR); ORF134: gen del homólogo ¡nterleucina 10 putativo; ORF140: gen putativo de timidilato quinasa.
4. El herpesvirus Koi recombinante vivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque comprende una secuencia de vector BAC (cromosoma artificial bacteriano).
5. El herpesvirus Koi recombinante vivo de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado además porque la secuencia de vector BAC es suprimida desde el genoma de herpesvirus dejando así un fragmento de ADN heterólogo en el sitio de supresión o sitio de inserción anterior, respectivamente, en el genoma de herpesvirus.
6. El herpesvirus Koi recombinante vivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque comprende un fragmento de ADN heterólogo.
7. El herpesvirus Koi recombinante vivo de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque el gen heterólogo es un gen que codifica la glicoproteína G del rabdovirus causando viremia primaveral de la carpa.
8. El herpesvirus Koi recombinante vivo de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usarse como un vector para un fragmento de ADN heterólogo.
9. Una célula que comprende el herpesvirus Koi recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8.
10. Un método para la producción de partículas infecciosas de herpesvirus Koi (KHV) recombinante, en donde dicho método comprende los pasos de (a) introducir un KHV recombinante vivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 o un ADN KHV recombinante que comprende el genoma de un herpesvirus Koi recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en células eucariotas permisivas; y (b) cultivar dicha célula para producir el herpesvirus Koi recombinante (KHV).
11. Un herpesvirus Koi recombinante vivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y/o un ADN KHV recombinante que comprende el genoma de los herpesvirus Koi recombinantes de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, para usarse en la prevención y/o tratamiento terapéutico de una enfermedad en los peces causada por herpesvirus Koi (KHV).
12. Una vacuna para la prevención y/o el tratamiento terapéutico de una enfermedad en los peces causada por herpesvirus Koi (KHV), caracterizada porque dicha vacuna comprende un herpesvirus Koi recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y/o un ADN KHV recombinante que comprende el genoma del herpesvirus Koi recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
13. Una vacuna para la prevención y/o el tratamiento terapéutico de una enfermedad en los peces causada por rabdovirus causando viremia primaveral de la carpa, caracterizada porque dicha vacuna comprende un herpesvirus Koi recombinante vivo de la reivindicación 7 y/o un ADN KHV recombinante que comprende el genoma del herpesvirus Koi recombinante de la reivindicación 7 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. El uso de un herpesvirus Koi recombinante vivo de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y/o un ADN KHV recombinante que comprende el genoma de un herpesvirus Koi recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la elaboración de una vacuna para la prevención y/o tratamiento terapéutico de una enfermedad en los peces causada por herpesvirus Ko¡ (KHV).
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