CN110452926B - 一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种展示CyHV‑2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用，ORF25在杆状病毒表面的展示通过将ORF25的胞外区与杆状病毒AcMNPV gp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，重组杆状病毒为载体表达的ORF25融合蛋白的氨基酸序列为SEQ IDNO:3。本发明以截短的CyHV‑2糖蛋白ORF25为抗原基因，构建重组杆状病毒，成功将ORF25展示在病毒表面。用该重组病毒转导鲫鱼细胞，ORF25在鲫鱼细胞表达并展示在细胞表面。以该重组病毒作为CyHV‑2疫苗对异育银鲫进行浸泡免疫，攻毒试验表明该重组杆状病毒免疫可以对CyHV‑2感染提供83.3％的相对保护率。

Description

一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于病毒载体疫苗技术领域，具体地说，涉及一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用。
背景技术
CyHV-2(鲤疱疹病毒2型)是感染异育银鲫引起疱疹病毒性造血器官坏死病的病原，春季和秋季是其致病的高发季节，死亡率可高达100％，近年来给我国的鲫鱼养殖业造成了严重的经济损失。CyHV-2是双链DNA病毒，基因组长达290kb，可编码150种蛋白，其中包括36种膜蛋白(Journal of virology 2013；87:2908-2922)。
疫苗免疫是控制病毒感染的重要手段。研究表明，针对CyHV-2的感染，灭活疫苗可以为异育银鲫提供71.4％的相对保护率(Fish&Shellfish Immunology 2016；49:344-350)。酵母表达系统表达纯化的CyHV-2的囊膜蛋白ORF25,ORF25C和ORF25D可以作为亚单位疫苗，为异育银鲫提供抵抗CyHV-2感染的保护性免疫(Fish&Shellfish Immunology 2015；47:1024-1031)。但是这些疫苗需要注射到鲫鱼体内，使用不够简便，保护率也不理想。
杆状病毒可以将外源蛋白通过gp64跨膜区展示在病毒颗粒表面、转导多种动物细胞并在转导细胞中表达所携带外源基因，还可以作为疫苗佐剂刺激动物免疫反应等特点，因此在动物疫苗的研究和生产领域有广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用，利用杆状病毒展示外源蛋白、对异育银鲫细胞具有转导能力的特点，构建了一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒，主要目的是为防控CyHV-2的感染提供一种简单、经济、高效的疫苗。
其具体技术方案为：
一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒，ORF25在杆状病毒表面的展示通过将ORF25的胞外区与杆状病毒AcMNPV gp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，以重组杆状病毒为载体表达的ORF25融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：a.制备CyHV-2编码的ORF25胞外区基因片段；b.将上述基因片段克隆到表达载体，使ORF25胞外区与AcMNPV gp64的跨膜区融合表达；c.将上述表达质粒与线性化的Bacmid共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。具体为：
步骤1、从感染CyHV-2的组织匀浆中提取总DNA作为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2为引物，扩增ORF25的胞外区基因片段。
步骤2、将获得的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切，克隆到pQBD表达载体，获得重组质粒pQBD-ORF25。
步骤3、用pQBD-ORF25和线性化的AcMNPV bacmid qBac-III共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒。继续扩增，获得高滴度重组病毒。
步骤4、将重组杆状病毒稀释至滴度为4×103TCID50/mL，将2cm大小的异育银鲫放入其中浸浴2小时进行免疫。
本发明所述展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒在防控CyHV-2的感染疫苗制备过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明获得的展示CyHV-2膜蛋白ORF25的重组杆状病毒无需注射，可以直接通过简单的浸浴方式为异育银鲫提供免疫保护，对CyHV-2感染的相对保护率优于已报道的疫苗免疫效果，说明本发明构建的重组杆状病毒可以为CyHV-2感染的防控提供一种免疫效果好而且使用方法简单、易操作的疫苗。
本分明将ORF25抗原展示在重组病毒表面，使其可以作为亚单位疫苗刺激B细胞产生抗体，也可以将ORF25基因转导到宿主细胞中表达，起到类似于DNA疫苗的效果。免疫后7天IL-11高于对照约3倍，免疫后15天IFNγ高于对照1.5倍。
附图说明
图1是本发明制备的重组杆状病毒的示意图；
图2是本发明纯化的重组杆状病毒表面展示CyHV-2ORF25融合蛋白的免疫印迹图；
图3是本发明的重组杆状病毒转导鲫鱼肾细胞并在其表面表达CyHV-2ORF25融合蛋白的流式细胞术检测结果；
图4是本发明的展示CyHV-2膜蛋白ORF25的重组杆状病毒浸泡免疫后，经CyHV-2攻毒，异育银鲫的存活率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
1、展示CyHV-2膜蛋白ORF25的重组杆状病毒的制备
从感染CyHV-2的组织匀浆中提取总DNA作为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，扩增ORF25的胞外区基因片段。
将获得的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切，克隆到pQBD表达载体，获得重组质粒pQBD-ORF25。用pQBD-ORF25和线性化的AcMNPV bacmid qBac-III共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒。获得重组杆状病毒命名为rAcMNPV-ORF25(重组杆状病毒携带ORF25融合蛋白基因的示意图见附图1)。以该重组杆状病毒为载体表达的ORF25融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2、重组杆状病毒的纯化和表面展示蛋白的检测
P0代rAcMNPV-ORF25病毒扩增至P1代病毒，以0.5MOI感染Sf9细胞，感染后第四天收集培养液上清。培养液上清加到有1ml 20％蔗糖垫的离心管中，100000×g离心2h，沉淀部分用SDS上样缓冲液溶解，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，用抗体进行免疫印迹检测(附图2)。结果表明，CyHV-2膜蛋白ORF25展示在杆状病毒表面。
3、重组杆状病毒转导鲫鱼肾细胞并在鲫鱼细胞表面表达CyHV-2膜蛋白ORF25
将上述重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25加到体外培养的鲫鱼肾细胞单层，以100MOI转导，28℃孵育4h后换新鲜培养基，继续培养2天后收集细胞。用不表达ORF25的杆状病毒作为对照病毒同样处理鲫鱼肾细胞作为对照细胞。细胞不经穿透处理，直接用抗ORF25融合蛋白的抗体和FITC标记的二抗孵育，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度(附图3)。比较后发现rAcMNPV-ORF25处理的鲫鱼肾细胞表面的荧光强度明显高于rAcMNPV处理的细胞，说明重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25能有效转导鲫鱼肾细胞并在其细胞表面表达ORF25。
4、重组杆状病毒免疫异育银鲫及其对CyHV-2攻毒的保护力检测
将重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25稀释到5L水中(稀释后的杆状病毒滴度为4×
103TCID50/mL)，将35条异育银鲫放入其中浸浴2小时。以相同滴度的重组杆状病毒rAcMNPV-GFP作为对照杆状病毒处理免疫对照组，模拟免疫组(Mock)用相同体积的PBS处理。免疫后47天，每条鱼腹腔注射50μl CyHV-2病毒进行攻毒。攻毒后30天内，每天记录鱼死亡的数量，绘制异育银鲫的生存率曲线(附图4)。
根据公式：RPS＝(1-免疫组死亡率/模拟免疫组死亡率)×100％，计算重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25免疫后异育银鲫的相对存活率达83.3％。
本发明的创新思路：本发明构建的重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25，不仅在感染昆虫细胞包装产生杆状病毒颗粒的过程中能将CyHV-2的膜蛋白ORF25展示在重组杆状病毒表面，而且该重组杆状病毒能有效转导鲫鱼细胞，在鲫鱼细胞表达其基因组携带的ORF25融合蛋白基因并将该融合蛋白展示在细胞膜上。用重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25对异育银鲫进行简单的浸泡免疫，就可有效地刺激鱼产生针对CyHV-2感染的免疫保护反应。
现有文献报道的CyHV-2的疫苗免疫都采用注射的方式，难以进行大规模的免疫。本发明所述的重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25的疫苗免疫方法简单、易操作，便于鲫鱼的大规模免疫。从免疫效果上来看，免疫后异育银鲫的相对存活率高于文献道的CyHV-2灭活疫苗(Fish&Shellfish Immunology 2016；49:344-350)和酵母来源的ORF25亚单位疫苗(Fish&Shellfish Immunology 2015；47：1024-1031)。
总的说来，本发明构建的重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25具有转导鲫鱼细胞能力，也具有在杆状病毒表面及转导细胞表面展示CyHV-2抗原ORF25的能力，用本发明所述的重组杆状病毒对异育银鲫进行浸泡免疫，可以对CyHV-2的感染提供高效的保护。由此说明采用上述实施例1的方法可以获取一种用于防控CyHV-2感染的重组杆状病毒载体疫苗。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgatgacga caagggatcc aatacaacaa caaccaccac tac 43
<210> 2
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acatgaccaa acatgaattc cgtgagggtg ggagacgtat c 41
<210> 3
<211> 613
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His
1 5 10 15
Ser Ala Phe Ala Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser
20 25 30
Asn Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Arg Ala Thr Thr Thr Val
35 40 45
Gly Gly Asn Leu Thr Thr Thr Thr Gly Ala Phe Pro Ile Asn Ser Leu
50 55 60
Val Tyr Thr Val Asp Tyr Lys Thr Ser Lys Tyr Cys Ala Val Asn Gly
65 70 75 80
Leu Pro Tyr Glu Ile Lys Ala Thr Phe Ser Phe Asp Arg Tyr Asp Ile
85 90 95
Arg Asn Leu Gln Trp Leu Ala Phe Asp Ala Val Leu Ala Ala Pro Lys
100 105 110
Phe Val Phe Thr Leu Thr Arg Pro Pro Ser Thr Pro Tyr Gly Ala Asn
115 120 125
Asn Pro Met Ile Thr Thr Leu Arg Val Asn Pro Phe Leu Tyr Thr Asp
130 135 140
Ala Thr Val Asp Tyr Ala Ile Ser Ala Val Gly Leu Leu Pro Thr Phe
145 150 155 160
Asp Leu Ile Lys Met Tyr Ser Pro Leu Pro Ser Gly Ser Ile Lys Val
165 170 175
Ser Ser Leu Ser Val Tyr Thr Thr Gly Ile Asp Pro Ile Thr Tyr Gly
180 185 190
Thr Ile Leu Thr Cys Gln Ser Ser Cys Gln Leu Asp Pro Glu Leu Lys
195 200 205
Phe Ala Trp Tyr Asn Tyr Asp Gln Leu Val Val Gly Ala Glu Thr Asn
210 215 220
Thr Leu Thr Thr Ser Asn Pro Gly Leu Tyr Met Cys Thr Val Gln Gly
225 230 235 240
Ser Leu Leu Phe Ser Thr Lys Thr Trp Val Gly Arg Pro Val Phe Asp
245 250 255
Cys Pro Phe Asn Ala Asn Ala Trp Cys Thr Pro Ser Thr Thr Gln Arg
260 265 270
Ile Gln Arg Tyr Glu Asp Asp Ser Pro Arg Ser Phe Ile Glu Asp Asp
275 280 285
Leu Lys Gln Pro Gly Thr Val Leu Ala Cys Leu Ser Ala Asn Asp Thr
290 295 300
Val Lys Asp Ile Val Ser Leu Arg Gly Arg Cys Ser Asp Arg Thr Val
305 310 315 320
Cys Asn Met Glu Val Ser Asp Gln Cys Ser Asn Phe Ile Pro Asn Val
325 330 335
Tyr Asn Pro Cys Asn Val Thr Val His Lys Phe Cys Pro Thr Gln Leu
340 345 350
Pro Phe Thr Trp Thr Ser Pro Thr Pro Glu Leu Val Ser Val Ala Leu
355 360 365
Gly Thr Asn Asn Leu Met Phe Ser Ser Gly Ile Val Asn Thr Tyr Cys
370 375 380
Gly Asn Gln Ala Asp Ile Phe Ala Val Cys Ala Gly Pro Asp Lys Val
385 390 395 400
Thr Glu Leu Ser Lys Arg Lys Ile Val Phe Gln Leu Pro Thr Leu Asp
405 410 415
Val Met Gln Ile Asn Asp Asp Val Pro Thr Pro Glu Ile Val Val Leu
420 425 430
Ser Ala Gly Gln Val Phe Asp Met Ala Cys Pro Ser Thr Asn Leu Val
435 440 445
Val Tyr Trp Arg Arg Glu Ser Gln Arg Met Ala Ser Ser Leu Gly Pro
450 455 460
Gly Asn Val Arg Leu Leu Arg Lys Thr Val Thr Arg Glu Asp Leu Asn
465 470 475 480
Ala Thr Trp Ser Cys Val Asp Phe Asp Thr Tyr Asn Ala His Thr Ala
485 490 495
Val Leu Phe Arg Lys Val Phe Leu Thr Asp Val Pro Pro Thr Thr Pro
500 505 510
Ala Pro Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Pro Ser Thr Val Pro Thr Thr
515 520 525
Pro Lys Thr Thr Thr Gln Arg Thr Thr Thr Pro Thr Thr Thr Thr Thr
530 535 540
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Pro Ala Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ile
545 550 555 560
Ala Ala Thr Pro Pro Pro Thr Thr Thr Ala Glu Pro Thr Ala Gly Asp
565 570 575
Thr Ser Pro Thr Leu Thr Glu Phe Met Phe Gly His Val Val Asn Phe
580 585 590
Val Ile Ile Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys Met Ile Arg Asn
595 600 605
Arg Asn Arg Gln Tyr
610

Claims (3)

1.一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒，其特征在于，ORF25在杆状病毒表面的展示通过将ORF25的胞外区与杆状病毒AcMNPV gp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，重组杆状病毒为载体表达的ORF25融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.如权利要求1所述的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、从感染CyHV-2的组织匀浆中提取总DNA作为模板，以SEQ ID NO:1和SEQID NO:2为引物，扩增ORF25的胞外区基因片段；
步骤2、将获得的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切，克隆到pQBD表达载体，获得重组质粒pQBD-ORF25；
步骤3、用pQBD-ORF25和线性化的AcMNPV bacmid qBac-III共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒；继续扩增，获得高滴度重组病毒；
步骤4、将重组杆状病毒稀释至滴度为4×10 3TCID 50/mL，将2cm大小的异育银鲫放入其中浸浴2小时进行免疫。
3.权利要求1所述展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒在防控CyHV-2的感染疫苗制备过程中的应用。
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