CN110468111B - 一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用 - Google Patents

一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种展示CyHV‑2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用，ORF25C在杆状病毒表面的展示通过将ORF25C的胞外区与杆状病毒AcMNPV gp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，以重组杆状病毒为载体表达的ORF25C融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。本发明获得的展示CyHV‑2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒无需注射，可以直接通过简单的浸浴方式为异育银鲫提供免疫保护，对CyHV‑2感染的相对保护率优于已报道的疫苗免疫效果，说明本发明构建的重组杆状病毒可以为CyHV‑2感染的防控提供一种免疫效果好而且使用方法简单、易操作的疫苗。

Description

一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于病毒载体疫苗技术领域，具体地说，涉及一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用。
背景技术
CyHV-2(鲤疱疹病毒2型)是感染异育银鲫引起疱疹病毒性造血器官坏死病的病原，春季和秋季是其致病的高发季节，死亡率可高达100％，近年来给我国的鲫鱼养殖业造成了严重的经济损失。CyHV-2是双链DNA病毒，基因组长达290kb,可编码150种蛋白，其中包括36种膜蛋白(Journal of virology 2013；87：2908-2922)。
疫苗免疫是控制病毒感染的重要手段。研究表明，针对CyHV-2的感染，灭活疫苗可以为异育银鲫提供71.4％的相对保护率(Fish&Shellfish Immunology 2016；49:344-350)。酵母表达系统表达纯化的CyHV-2的囊膜蛋白ORF25,ORF25C和ORF25D可以作为亚单位疫苗，为异育银鲫提供抵抗CyHV-2感染的保护性免疫(Fish&Shellfish Immunology 2015；47：1024-1031)。但是这些疫苗需要注射到鲫鱼体内，使用不够经济、高效。
杆状病毒具有携带外源基因、将外源蛋白展示在病毒颗粒表面、转导多种动物细胞并在转导细胞中表达所携带外源基因、作为疫苗佐剂刺激动物免疫反应等特点，因此在动物疫苗的研究和生产领域有广泛的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用，利用杆状病毒展示外源蛋白、对异育银鲫细胞具有转导能力的特点，构建了一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒，主要目的是为防控CyHV-2的感染提供一种简单、经济、高效的疫苗。
其具体技术方案为：
一种展示CyHV-2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒，ORF25C在杆状病毒表面的展示通过将ORF25C的胞外区与杆状病毒AcMNPV gp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，以重组杆状病毒为载体表达的ORF25C融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
一种展示CyHV-2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒的制备方法，包括以下步骤：a.制备CyHV-2编码的ORF25C胞外区基因片段；b.将上述基因片段克隆到表达载体，使ORF25C胞外区与AcMNPV gp64的跨膜区融合表达；c.将上述表达质粒与线性化的Bacmid共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒。具体为：
步骤1、从感染CyHV-2的组织匀浆中提取总DNA作为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ IDNO:2为引物，扩增ORF25C的胞外区基因片段。
步骤2、将获得的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切，克隆到pQBD表达载体，获得重组质粒pQBD-ORF25C。
步骤3、用pQBD-ORF25C和线性化的AcMNPV bacmid qBac-III共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒。继续扩增，获得高滴度重组病毒。
步骤4、将重组杆状病毒稀释至滴度为4×103TCID50/mL，将2cm大小的异育银鲫放入其中浸浴2小时进行免疫。
本发明所述展示CyHV-2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒在防控CyHV-2的感染疫苗制备过程中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明获得的展示CyHV-2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒无需注射，可以直接通过简单的浸浴方式为异育银鲫提供免疫保护，对CyHV-2感染的相对保护率优于已报道的疫苗免疫效果，说明本发明构建的重组杆状病毒可以为CyHV-2感染的防控提供一种免疫效果好而且使用方法简单、易操作的疫苗。
本分明将ORF25C抗原展示在重组病毒表面，使其可以作为亚单位疫苗刺激B细胞产生抗体，也可以将ORF25C基因转导到宿主细胞中表达，起到类似于DNA疫苗的效果。免疫后7天IL-11高于对照近3倍，免疫后4天IFNγ高于对照3倍。
附图说明
图1是本发明制备的重组杆状病毒的示意图；
图2是本发明纯化的重组杆状病毒表面展示CyHV-2ORF25C融合蛋白的免疫印迹图；
图3是本发明的重组杆状病毒转导鲫鱼肾细胞并在其表面表达CyHV-2ORF25C融合蛋白的流式细胞术检测结果；
图4是本发明的展示CyHV-2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒浸泡免疫后，经CyHV-2攻毒，异育银鲫的存活率。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
实施例1
1、展示CyHV-2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒的制备
从感染CyHV-2的组织匀浆中提取总DNA作为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，扩增ORF25C的胞外区基因片段。
将获得的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切，克隆到pQBD表达载体，获得重组质粒pQBD-ORF25C。用pQBD-ORF25C和线性化的AcMNPV bacmid qBac-III共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒。获得重组杆状病毒命名为rAcMNPV-ORF25C(重组杆状病毒携带ORF25C融合蛋白基因的示意图见附图1)。以该重组杆状病毒为载体表达的ORF25C融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2、重组杆状病毒的纯化和表面展示蛋白的检测
P0代rAcMNPV-ORF25C病毒扩增至P1代病毒，以0.5MOI感染Sf9细胞，感染后第四天收集培养液上清。培养液上清加到有1ml 20％蔗糖垫的离心管中，100000×g离心2h，沉淀部分用SDS上样缓冲液溶解，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、转膜，用抗体进行免疫印迹检测(附图2)。结果表明，CyHV-2膜蛋白ORF25C展示在杆状病毒表面。
3、重组杆状病毒转导鲫鱼肾细胞并在鲫鱼细胞表面表达CyHV-2膜蛋白ORF25C
将上述重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25C加到体外培养的鲫鱼肾细胞单层，以100MOI转导，28℃孵育4h后换新鲜培养基，继续培养2天后收集杆状病毒处理的细胞。用不表达ORF25C的杆状病毒作为对照病毒同样处理鲫鱼肾细胞作为对照细胞。细胞不经穿透处理，直接用抗ORF25C融合蛋白的抗体和FITC标记的二抗孵育，用流式细胞仪检测细胞的荧光强度(附图3)。比较后发现rAcMNPV-ORF25C处理的鲫鱼肾细胞表面的荧光强度明显高于rAcMNPV处理的细胞，说明重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25C能有效转导鲫鱼肾细胞并在其细胞表面表达ORF25C。
4、重组杆状病毒免疫异育银鲫及其对CyHV-2攻毒的保护力检测
将重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25C稀释到5L水中(稀释后的杆状病毒滴度为4×103TCID50/mL)，将35条异育银鲫放入其中浸浴2小时。以相同滴度的重组杆状病毒rAcMNPV-GFP作为对照杆状病毒处理免疫对照组，模拟免疫组(Mock)用相同体积的PBS处理。免疫后47天，每条鱼腹腔注射50μl CyHV-2样品进行攻毒。攻毒后30天内，每天记录鱼死亡的数量，绘制异育银鲫的生存率曲线(附图4)。
根据公式：RPS＝(1-免疫组死亡率/模拟免疫组死亡率)×100％，计算重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25C免疫后异育银鲫的相对存活率达87.5％。
本发明的创新思路：本发明构建的重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25C，不仅在感染昆虫细胞包装产生杆状病毒颗粒的过程中能将CyHV-2的膜蛋白ORF25C展示在重组杆状病毒表面，而且该重组杆状病毒能有效转导鲫鱼细胞，在鲫鱼细胞表达其基因组携带的ORF25C融合蛋白基因并将该融合蛋白展示在细胞膜上。用重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25C对异育银鲫进行简单的浸泡免疫，就可有效地刺激鱼产生针对CyHV-2感染的免疫保护反应。
现有文献报道的CyHV-2的疫苗免疫都采用注射的方式，难以进行大规模的免疫。本发明所述的重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25C的疫苗免疫方法简单、易操作，便于鲫鱼的大规模免疫。从免疫效果上来看，免疫后异育银鲫的相对存活率高于文献道的CyHV-2灭活疫苗(Fish&Shellfish Immunology 2016；49:344-350)和酵母来源的ORF25C亚单位疫苗(Fish&Shellfish Immunology 2015；47：1024-1031)。
总的说来，本发明构建的重组杆状病毒rAcMNPV-ORF25C具有转导鲫鱼细胞能力，和在杆状病毒表面及转导细胞表面展示CyHV-2抗原ORF25C的能力，用本发明所述的重组杆状病毒对异育银鲫进行浸泡免疫，可以对CyHV-2的感染提供高效的保护。由此说明采用上述实施例1的方法可以获取一种用于防控CyHV-2感染的重组杆状病毒载体疫苗。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
序列表
<110> 西北农林科技大学
<120> 一种展示CyHV-2膜蛋白的重组杆状病毒及其制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
acgatgacga caagggatcc tttggagcca ctctgaagcc c 41
<210> 2
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
acatgaccaa acatgaattc ggctgtgatg ctggttctgt cc 42
<210> 3
<211> 632
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Met Val Ser Ala Ile Val Leu Tyr Val Leu Leu Ala Ala Ala Ala His
1 5 10 15
Ser Ala Phe Ala Ala Ser Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Ser
20 25 30
Phe Gly Ala Thr Leu Lys Pro Phe Val Cys Pro Ala Ala Gly Leu Thr
35 40 45
Tyr Asn Val Gln Ala Val Phe Gln Ala Asp Asn Arg Thr Val Val Gly
50 55 60
Leu Gln Trp Leu Asn Ala Ala Asn Ala Ile Tyr Thr Asn Val Arg Tyr
65 70 75 80
Thr Val Ala Trp Glu Arg Val Gly Thr Thr Asp Ser Tyr Leu Thr Thr
85 90 95
Leu Thr Ile Asn Asn Phe Asn Ala Thr Val Asp Gly Pro Ala Leu Leu
100 105 110
Gly Ala Lys Leu Lys Val Ser Thr Gly Pro Ser Phe Phe Gln Pro Pro
115 120 125
Asn Leu Asn Thr Ile Ile Glu Leu Asn Leu Asn Thr Thr Leu Pro Ser
130 135 140
Glu Ile Thr Thr Lys Thr Arg Ile Phe Phe Ser Glu Ile Asp Ser Ser
145 150 155 160
Asn Thr Phe Ala Gly Thr Ile Leu Arg Cys Val His Ala Cys Pro Met
165 170 175
Ile Ala Gln Ala Ala Ser Thr Ile Asn Trp Phe Arg Ser Gly Val Leu
180 185 190
Ile Ala Gly Ala Ser Ser Glu Tyr Phe Thr Thr Thr Thr Ala Gly Arg
195 200 205
Tyr Ser Cys Glu Leu Ala Leu Ser Asp Val Asn Leu Arg Ser Asp Pro
210 215 220
Ile Trp Val Gly Thr Pro Val Phe Asp Cys Pro Phe Asn Leu Ala Ala
225 230 235 240
Trp Cys Pro Ala Gly Ala Thr Met Val His Glu Asn Leu Val Lys Thr
245 250 255
Phe Met Gly Glu Asp Asp Leu Arg Gln Pro Gly Asn Val Phe Val Cys
260 265 270
Gly Ser Leu Thr Asn Asn Ala Ala Pro Ala Ile Ser Thr Arg Gly His
275 280 285
Cys Pro Ile Arg Asp Val Cys Asn Ala Asp Gly Val Val Gly Ala Cys
290 295 300
Ser Asn Pro Thr Pro Val Val Tyr Ala Pro Cys Asn Thr Thr Ile Ser
305 310 315 320
Lys Leu Cys Pro Thr Gly Val Gly Leu Tyr Arg Thr Gly Ser Ala Val
325 330 335
Gln Ala Thr Glu Arg Ser Asn Arg Phe Ile Ile Thr Gly Gly Thr Val
340 345 350
Lys Val Tyr Cys Gly Ser Gln Thr Glu Ile Tyr Ala Met Cys Ala Asp
355 360 365
Asn Ala Thr Val Ala Ser Leu Gln Ala Thr Arg Thr Thr Ala Thr Ile
370 375 380
Gly Ala Lys Asp Pro Trp Ile Asp Ser Thr Pro Ser Ala Gln Ile Glu
385 390 395 400
Tyr Leu Asn Val Thr Glu Asn Ser Val Leu Ser Leu Thr Cys Pro Gly
405 410 415
Gly Ala Leu Met Gln Thr Leu Leu Arg Asp Asp Gln Phe His Ala Ile
420 425 430
Gly Phe Val Gly Ala Ala Gln Val Ala Ala Pro Lys Thr Phe Ile Lys
435 440 445
Thr Val Thr Gly Pro Glu Ile Leu Ser Asn Trp Ser Cys Ile Ala Tyr
450 455 460
Thr Ser Leu Gly Val Gly Ser Asn Thr Gly Thr Arg Thr Lys Leu Phe
465 470 475 480
Leu Leu Asn Pro Pro Pro Pro Thr Thr Pro Gly Pro Thr Thr Val Gly
485 490 495
Pro Ser Thr Thr Thr Thr Ile Thr Thr Thr Thr Leu Ala Ser Thr Thr
500 505 510
Thr Thr Thr Gly Thr Thr Thr Thr Thr Ser Thr Thr Thr Thr Ser Thr
515 520 525
Leu Ala Asn Thr Thr Leu Leu Pro Thr Val Ala Asn Thr Thr Leu Leu
530 535 540
Pro Thr Thr Thr Thr Ala Val Val Asn Thr Thr Thr Thr Ile Gln Pro
545 550 555 560
Ser Thr Ala Thr Thr Asn Val Glu Thr Thr Ser Thr Val Val Thr Ser
565 570 575
Gln Pro Leu Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Glu Thr
580 585 590
Pro Thr Asp Arg Thr Ser Ile Thr Ala Glu Phe Met Phe Gly His Val
595 600 605
Val Asn Phe Val Ile Ile Leu Ile Val Ile Leu Phe Leu Tyr Cys Met
610 615 620
Ile Arg Asn Arg Asn Arg Gln Tyr
625 630

Claims (3)

1.一种展示CyHV-2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒，其特征在于，ORF25C在杆状病毒表面的展示通过将ORF25C的胞外区与杆状病毒AcMNPV gp64的信号肽和跨膜区进行融合表达来实现，以重组杆状病毒为载体表达的ORF25C融合蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:3。
2.如权利要求1所述的重组杆状病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、从感染CyHV-2的组织匀浆中提取总DNA作为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，扩增ORF25C的胞外区基因片段；
步骤2、将获得的PCR产物用BamHI和EcoRI双酶切，克隆到pQBD表达载体，获得重组质粒pQBD-ORF25C；
步骤3、用pQBD-ORF25C和线性化的AcMNPV bacmid qBac-III共转染Sf9昆虫细胞，转染后5天收集P0代重组病毒；继续扩增，获得高滴度重组病毒；
步骤4、将重组杆状病毒稀释至滴度为4×10 3TCID 50/mL，将2cm大小的异育银鲫放入其中浸浴2小时进行免疫。
3.权利要求1所述展示CyHV-2膜蛋白ORF25C的重组杆状病毒在防控CyHV-2的感染疫苗制备过程中的应用。
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