CN117467074B - 一种基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶的制备与应用 - Google Patents

一种基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于新材料领域，具体公开了一种基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶的制备与应用；所述生物降解纳米酶的制备包括以下步骤：以2‑甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)为主要单体，甲基丙烯酸(MAA)为共聚单体，以含有二硫键的N,N'‑双(丙烯酰)胱胺(BAC)或者含有缩酮键的2,2‑二甲基丙烯酰氧基‑1‑乙氧基丙烷(DMAEP)为交联剂，乙腈为溶剂，采用回流沉淀聚合法制备获得P(MPC‑s‑s‑MAA)或P(MPC‑ketal‑MAA)纳米凝胶；以上述P(MPC‑s‑s‑MAA)或P(MPC‑ketal‑MAA)纳米凝胶为原料，使用FeCl2对纳米凝胶中磷酸酯基进行螯合，制备获得生物降解纳米酶；所述生物降解纳米酶可用于制备性能优异的可生物降解纳米酶药物递送系统，可广泛应用于肿瘤的靶向药物的研发。

Description

一种基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶的制备与 应用
技术领域
本发明属于新材料领域，具体公开了一种基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶的制备与应用。
背景技术
两性离子聚合物是一类在同一单体侧链上同时含有阴、阳离子基团，而整体呈电中性的高分子。根据两性离子聚合物的骨架构成，可分为磷酰胆碱类、甜菜碱类、氨基酸类、两性混合电荷材料类和其它类。目前研究较多的两性离子聚合物包括磷酰胆碱型、磺基甜菜碱型、羧基甜菜碱型聚合物。采用两性离子聚合物构筑的纳米凝胶，因其具有水化能力强、抗非特异性蛋白吸附等特性，显示出比聚乙二醇(PEG)更优异的血液长循环特性，作为药物载体具有显著的优势。以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)为单体的聚合物纳米凝胶是应用广泛的两性离子聚合物纳米凝胶之一。磷酰胆碱聚合物由于其磷脂极性基团，可以作为模拟细胞膜的仿生纳米载体，还可以与金属离子络合。
回流沉淀聚合是两性离子聚合物纳米凝胶常用的合成方法，其优点为：用简单的回流冷凝管代替复杂的蒸馏装置和溶剂收集装置，其效率更高，操作更简单，更适用于纳米微球的制备；同时适用的单体范围广，通过引入含有不同响应性断裂基团(如二硫、二硒、缩铜等)以获得不同环境降解性聚合物纳米凝胶。复旦大学杨武利教授团队以2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱(MPC)为单体、含有二硫键的N,N'-双(丙烯酰基)胱胺(BAC)为交联剂，通过回流沉淀聚合制备了含有N-乙烯基咪唑(VIm)的可还原降解两性离子PMPC纳米凝胶。在酸性pH 6.5条件下，VIm部分促使纳米凝胶从两性离子状态转变至带正电荷状态，增强了腺癌性人类肺泡基底上皮肿瘤细胞(A549)对纳米凝胶的摄取能力。
近年来，随着各种纳米复合材料的发展，科学家们发现，将生物学与纳米技术结合，可以制备一种同时具备纳米材料和模拟酶特性的人工酶，即“纳米酶”。作为具有明显类酶活性的纳米材料，纳米酶因稳定性强、催化活性可调节、制备简单等特点，可用于化学动力学疗法(Chemodynamic therapy,CDT)芬顿试剂，将肿瘤微环境中过度表达的H2O2原位转化为剧毒的羟基自由基(·OH)，从而导致肿瘤细胞凋亡或坏死。然而，由于肿瘤细胞强大的自我调节能力、转移性和免疫抑制性等特点，单一的治疗方式往往难以达到理想的治疗效果。
发明内容
针对上述问题，本发明公开了一种基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶的制备与应用，将CDT与化疗等其他治疗方式相结合，既能够克服单一疗法的缺陷，又能够取得协同的肿瘤治疗效果。
本发明的技术方案如下：
一方面，本发明公开了一种基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶，由以下方法制备：
1)以2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)为主要单体，甲基丙烯酸(MAA)为共聚单体；
2)以含有二硫键的N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)或者含有缩酮键的2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷(DMAEP)为交联剂；
3)以乙腈或者四氢呋喃或者甲醇为溶剂；
4)以含有二硫键的N,N'-双(丙烯酰)胱胺(BAC)为交联剂，采用回流沉淀聚合法制备获得聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-s-s-甲基丙烯酸)即P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶；
或者以2,2-二甲基丙烯酰氧基-1-乙氧基丙烷(DMAEP)为交联剂，获得聚(2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱-ketal-甲基丙烯酸)即P(MPC-ketal-MAA)纳米凝胶；
5)以上述P(MPC-s-s-MAA)或P(MPC-ketal-MAA)或纳米凝胶为原料，使用FeCl2对纳米凝胶中磷酸酯基进行络合，制备获得生物降解纳米酶。
另一个方面，本发明公开了上述生物降解纳米酶在制备药物递送系统或肿瘤治疗药物中的应用。
本发明还公开了一种药物递送系统，含有上述生物降解纳米酶。
本发明还公开了一种负载药物的药物递送系统，其制备方法包括，将药物与所述的生物降解纳米酶共同分散于缓冲溶液中搅拌均匀，离心收集负载药物的生物降解纳米酶，得到所述含有药物的药物递送系统。
进一步的，上述一种含有药物的药物递送系统，所述药物为阿霉素。
进一步的，上述一种含有药物的药物递送系统所述阿霉素与生物降解纳米酶的质量比为2:10～5:10；进一步优选的，为阿霉素与生物降解纳米酶以质量比3:10混合。
进一步的，本发明还公开了上述药物递送系统在制备肿瘤治疗药物中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明公开了基于两性离子聚合物的纳米凝胶，形态可控，尺寸均一、水中分散性良好。本发明还接着公开了使用FeCl2与聚合物纳米凝胶中磷酸酯基进行络合，形成基于两性离子聚合物纳米凝胶的、具有过氧化物酶催化活性的可生物降解纳米酶。进一步的，本发明还发现上述纳米酶通过静电作用与疏水作用吸附抗肿瘤药物阿霉素，最终形成基于两性离子聚合物凝胶的可生物降解纳米酶药物递送系统，可用于CDT/化疗协同抗肿瘤治疗。
本发明还通过使用各种仪器如透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)、紫外分光光度计等方法对产物的结构、降解性、酶催化活性、载药与释药行为等进行表征，以改进实验条件，制备性能最佳的可生物降解纳米酶药物递送系统。并通过CCK-8法测定细胞毒性，以表征材料的生物相容性与肿瘤细胞杀伤效果。最终发现本发明公开的纳米凝胶、生物降解纳米酶以及药物递送系统，对正常细胞毒性低，对肿瘤细胞杀伤效果好，可广泛地用于肿瘤治疗，并能够取得良好的治疗效果。
附图说明
图1PMPC纳米凝胶TEM照片，(a)标尺为200nm；(b)标尺为100nm；
图2不同交联剂含量PMPC纳米凝胶的粒径；
图3MAA含量为10％的P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的电镜照片；
图4P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的还原响应性降解行为；
图5不同pH条件下的生物降解纳米酶过氧化物酶活性；
图6不同孵育时间(a)和不同浓度(b)生物降解纳米酶的过氧化物酶活性；
图7不同条件下的还原降解纳米凝胶的释药行为；
图8(a)P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶与纳米酶对正常细胞HEK293的24h细胞毒性，(b)载药生物降解纳米酶对MGC803肿瘤细胞的24h细胞毒性。
具体实施方式
技术方案
(1)P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的制备：
在100mL的圆底烧瓶中加入25～50mg 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和甲基丙烯酸(MAA)(MAA的含量为0～30％)，5～30mg N,N′-(双丙烯酰基)胱胺(BAC)，1～5mg偶氮二异丁腈(AIBN)，10～40mL的乙腈溶液，超声分散均匀后，通氮气，安装加热回流装置，打开磁力搅拌，搅拌速度200～600rpm/min，升温至85～95℃开始反应，恒温回流0.5～2h结束反应。将白色乳液倒出，用高速离心机以8000～12000r/min速度离心10～15min，倾去上清液，用去离子水洗涤、离心，反复2～3次。产物冷冻干燥，得到白色粉末状产品。
(2)P(MPC-s-s-MAA)-Fe纳米酶的制备
将5mg纳米凝胶、25～50mg FeCl2及15～30mL乙醇依次加入50mL的单口烧瓶中，超声分散均匀后，氮气保护下在200～400r/min转速下搅拌0.5～1h，升温至50～70℃并稳定反应1.5～2.5h，反应结束后，用高速离心机以8000～12000r/min速度离心10～15min，倾去上层溶液，得到粗产品。使用乙醇对粗产品进行离心洗涤，反复3～5次。经冷冻干燥，得到灰白色粉末状产品。
(3)P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的粒径、形貌与电势分析
通过TEM对P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的形貌进行表征，使用DLS对纳米凝胶的粒径、电势与单分散性进行表征。
(4)P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的还原降解性测定
配制pH 7.4磷酸盐缓冲溶液和GSH浓度为0～20mM的pH 6.5磷酸盐缓冲溶液，分别加入少量P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶，置于37℃空气浴中，在0～12h里取出少许样品直接用于DLS表征。通过计算不同时间点的样品的散射光强与初始的未发生降解的样品的散射光强的比值，分析降解过程中凝胶粒子相对浊度的变化，以初始的未发生降解的纳米凝胶散射光强为参照标准，设相对浊度初始值为100％。
(5)过氧化物酶催化活性
将0.020～0.040mol/L TMB 0.1～0.2mL、0.100～0.200mol/L H2O2 0.1～0.2mL、2.4～2.7mL pH 2～8缓冲溶液和0.1～0.2mL纳米酶(0～900μg/mL)均匀混合，5～20min后在紫外分光光度计上测定652nm处的最大吸光度。
(6)载药与释药实验
选用一线临床肿瘤药物阿霉素(DOX)为模型药物，将DOX与纳米凝胶以质量比2:10～5:10充分分散于2～5mL pH 7.4PBS缓冲溶液中。室温下搅拌24h后，上述混合物经离心收集负载DOX的纳米凝胶，并用纯水离心洗涤2～4次以除去表面吸附的DOX。收集上清液，通过紫外吸收光谱定量分析纳米凝胶的载药量和包封率。(生物降解纳米酶的载药方法同上,需在N2保护下操作。)
为了模拟正常生理环境和肿瘤弱酸环境，药物释放实验是在以下2种不同的缓冲溶液中进行的：pH分别为7.4的磷酸盐缓冲溶液以及含有10mM GSH的pH 6.5磷酸盐缓冲溶液。释放实验操作步骤如下：称取1～2mg负载DOX的纳米凝胶或纳米酶分散于1～2mL对应的缓冲溶液中，然后转移至截留分子量为14000Da的透析袋中，紧接着快速地将透析袋完全浸渍于上述模拟释放环境(体积100～200mL，温度37℃)中，轻微磁力搅拌。按照设定的时间(0～24h)从释放介质中取出1～2mL溶液，再向释放介质中补加1～2mL对应的新鲜缓冲溶液，以保持释放介质的体积不变。用紫外光谱测定释放出来的DOX浓度，所有不同释放介质中的释放实验均重复3次并取平均值。
(7)细胞毒性实验
使用CCK-8法测定细胞毒性。选用人类胚胎肾细胞(HEK 293细胞)评价纳米凝胶和纳米酶的生物相容性，选用人胃癌细胞(MGC803细胞)评价游离DOX和负载DOX的纳米酶杀死肿瘤细胞的能力。细胞的培养方法和具体操作步骤如下：将细胞消化、计数、配制成浓度为5×104～1×105个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入50～200μL细胞悬液(每孔5×103～1×104个细胞)；将细胞培养板置于37℃，5％CO2培养箱中培养24h；使用完全培养液(80％～90％RPMI1640培养液+10％～20％胎牛血清)分别配置含浓度为5～200μg/mL纳米凝胶、纳米酶工作液(HEK 293细胞)或DOX含量为0～10μg/mL的游离DOX、载药纳米酶工作液(MGC803细胞)；每孔加入50～200μL相应工作液，每种浓度设置3重复；细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养24h后弃上清液；将96孔板进行CCK-8染色，于λ＝450nm处测定OD值。
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明实施例中使用的试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。
实施例1
P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的制备
在100mL的圆底烧瓶中加入25.3mg 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和6.3mg的甲基丙烯酸(MAA)，12.6mg N,N′-(双丙烯酰基)胱胺(BAC),1.2mg偶氮二异丁腈(AIBN)，20mL的乙腈溶液，超声分散均匀后，放入磁子，安装加热回流装置，打开磁力搅拌，搅拌速度300rpm/min，升温至90℃开始反应，恒温回流1h结束，得到白色乳液。将白色乳液以10000r/min速度离心10min，倾去上清液，用去离子水反复离心洗涤2次。冷冻干燥后得到白色粉末状产品。
实施例2
P(MPC-s-s-MAA)-Fe纳米酶的制备。
将5.0mg实施例1制备的凝胶、30.0mg FeCl2及20mL乙醇依次加入50mL的单口烧瓶中，超声分散均匀后，400r/min转速下磁力搅拌，通入N2 0.5h后升温至60℃并反应2h，反应结束后，用高速离心机以10000r/min速度离心10min，倒去上层溶液，得到粗产品。使用乙醇对粗产品进行反复离心洗涤3次。经冷冻干燥，得到灰白色粉末状产品。
实施例3
P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的粒径、形貌与电势分析
通过TEM和DLS对PMPC纳米凝胶的形貌和粒径进行表征，从图1和图2来看，纳米凝胶呈现规则的球形相貌，具有良好的分散性，当MAA的含量为0，PMPC纳米凝胶的粒径随着交联剂含量的增加而减小，从449nm(BAC,10％)变化至280nm(BAC,40％)。
使用DLS对P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的粒径、电势与单分散性进行表征，具体结果如表1所示。
表1P(MPC-co-MAA)纳米凝胶的粒径、粒径分布以及电势
如表1所示，当MAA的含量从0％增加至30％时，P(MPC-co-MAA)纳米凝胶在pH 7.4磷酸盐缓冲溶液中的粒径从280nm增加至374nm，粒径随着MAA含量的增加而增加；电势从-7.4650mV变化到-40.4204mV，表明随着MAA含量的增加，电势降低，凝胶表面的负电荷增加。考虑到纳米凝胶的稳定性、粒径的大小与单分散性，选择MAA含量为10％的纳米凝胶作为药物递送的载体。
MAA含量为10％的P(MPC-co-MAA)纳米凝胶的电镜照片如图3所示，从图中可以看出，粒径大小约为220nm。
实施例4
P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的还原降解性
配制pH 7.4磷酸盐缓冲溶液和含10mM GSH的pH 6.5磷酸盐缓冲溶液，分别加入少量P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶，置于37℃空气浴中，在设定的时间取出少许样品直接用于DLS表征。通过计算不同时间点的样品的散射光强与初始的未发生降解的样品的散射光强的比值，分析降解过程中凝胶粒子相对浊度的变化，以初始的未发生降解的纳米凝胶散射光强为参照标准，设相对浊度初始值为100％。
从图4可看出，P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶在正常生理环境(pH 7.4)中很稳定，散射光强不发生变化。当置于模拟肿瘤细胞环境中(pH 6.5,10mM GSH)，纳米凝胶的内部二硫键发生还原断裂，纳米凝胶发生降解，散射光强迅速降低，6h后散射光强仅约为初始光强的30％。
实施例5
生物降解纳米酶的过氧化物酶催化活性
过氧化物酶活性的特征在于能够催化H2O2氧化底物TMB形成蓝色混合物，并在652nm处具有最大吸光度。我们分析不同pH条件下的生物降解纳米酶的过氧化物酶活性。结果如图5所示，当pH为4时，生物降解纳米酶的活性最强，pH为5和6时，生物降解纳米酶仍能保持较高的活性，表明当进入肿瘤细胞后，在肿瘤弱酸性环境中能够催化过氧化氢生成羟基自由基，表现出较强的杀死肿瘤细胞的活性。
进一步的，我们分析最佳pH条件下，反应时间与纳米酶浓度对活性的影响。具体的实验步骤为，将pH＝4.0的缓冲溶液(2.7mL)、TMB(0.030M,0.1mL)、H2O2(0.150M,0.1mL)和纳米酶(300μg/mL,0.1mL)均匀混合，分别孵育5，10，15min后在紫外可见分光光度计上测定652nm处的最大吸光度。
结果如图6所示，生物降解纳米酶与TMB、H2O2混合后，能够迅速催化H2O2氧化TMB为蓝色氧化物，表现在波长652nm处出现最大吸收波长，且吸收强度随着时间的增长和纳米酶浓度增加而增大。
实施例6
载药与释药实验
选用抗肿瘤药物阿霉素(DOX)为模型药物，将DOX与纳米凝胶以质量比3:10充分分散于3mL pH 7.4PBS缓冲溶液中。室温下搅拌24h后，上述混合物经离心收集负载DOX的纳米凝胶，并用纯水离心洗涤2次以除去表面吸附的DOX。收集上清液，通过紫外吸收光谱测定纳米凝胶的载药量为15％，包封率为50％。(生物降解纳米酶的载药方法同上,需在N2保护下操作。)
称取1mg负载DOX的纳米凝胶P(MPC-s-s-MAA)分散于1mL对应的缓冲溶液中，然后转移至截留分子量为14000Da的透析袋中，紧接着分别将透析袋快速地完全浸于pH 7.4磷酸盐缓冲溶液和含有10mM GSH的pH 6.5磷酸盐缓冲溶液中(体积100mL，温度37℃)中，轻微磁力搅拌。按照设定的时间从释放介质中取出2mL溶液，再向释放介质中补加2mL对应的新鲜缓冲溶液，以保持释放介质的体积不变。用紫外光谱测定释放出来的DOX浓度，所有不同释放介质中的释放实验均重复3次并取平均值。
实验结果如图7所示，释药结果表明，在pH 7.4生理条件下，药物在24h内的释放率小于20％，表明载药粒子能够在血液循环中保持稳定；在含有10mM GSH的pH 6.5模拟肿瘤细胞还原环境中，24h后，约有90％的DOX从载药体系中释放出来，表明在细胞还原环境中，纳米凝胶因内部二硫键断裂而发生降解，极大地促进了药物的充分释放。
实施例7
细胞毒性实验
使用CCK-8法测定细胞毒性。选用人类胚胎肾细胞(HEK 293细胞)评价纳米凝胶和生物降解纳米酶的生物相容性，选用人胃癌细胞(MGC803细胞)评价游离DOX和负载DOX的生物降解纳米酶杀死肿瘤细胞的能力。细胞的培养方法和具体操作步骤如下：将细胞消化、计数、配制成浓度为8×104个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔8×103个细胞)；将细胞培养板置于37℃、5％CO2培养箱中培养24h；对于HEK 293细胞，使用完全培养液(90％RPMI1640培养液+10％胎牛血清)分别配制含浓度为5～200μg/mL的纳米凝胶和生物降解纳米酶工作液，对于MGC803细胞，分别配制DOX含量为0～10μg/mL的游离DOX和载药生物降解纳米酶工作液；每孔加入100μL相应工作液，每种浓度设置3重复；细胞在37℃、5％CO2培养箱中培养24h后弃上清液；将96孔板进行CCK-8染色，于λ＝450nm处测定OD值。
实验结果如图8所示，实验结果表明，P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶、生物降解纳米酶分别与人类胚胎肾细胞(HEK 293细胞)共孵育24h后，在5～200μg/mL浓度范围内仍能保持90％以上的细胞活性(图8(a))，表明材料具有良好的生物相容性，适合作为药物载体；当游离DOX与载药的生物降解纳米酶(实施例6的方法制备)与人胃癌细胞(MGC803细胞)共孵育24h后，DOX浓度为10μg/mL时，加入载药生物降解纳米酶的细胞存活率仅为20％(图8(b))，低于游离的DOX(30％)，表明载药生物降解纳米酶表现出较强的肿瘤杀伤能力，说明基于两性离子聚合物纳米凝胶的生物降解纳米酶药物递送系统能够发挥CDT/化疗协同抗肿瘤作用。
由以上实施例可以看出：本发明公开了基于两性离子聚合物的纳米凝胶，形态可控，尺寸均一、水中分散性良好。本发明还接着公开了使用FeCl2与聚合物纳米凝胶中磷酸酯基进行络合，形成基于两性离子聚合物纳米凝胶的、具有过氧化物酶催化活性的可生物降解纳米酶。进一步的，本发明还发现上述纳米酶通过静电作用与疏水作用吸附抗肿瘤药物阿霉素，最终形成基于两性离子聚合物凝胶的可生物降解纳米酶药物递送系统，可用于CDT/化疗协同抗肿瘤治疗。
本发明还通过使用各种仪器如透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)、紫外分光光度计等方法对产物的结构、降解性、酶催化活性、载药与释药行为等进行表征，以改进实验条件，制备性能最佳的可生物降解纳米酶药物递送系统。并通过CCK-8法测定细胞毒性，以表征材料的生物相容性与肿瘤细胞杀伤效果。最终发现本发明公开的纳米凝胶、生物降解纳米酶以及药物递送系统，对正常细胞毒性低，对肿瘤细胞杀伤效果好，可广泛的用于肿瘤治疗，并能够取得良好的治疗效果。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述,本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (8)

1.一种基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶，其特征在于，由以下方法制备：
(1) P(MPC-s-s-MAA)纳米凝胶的制备：
在100 mL的圆底烧瓶中加入25~50 mg 2-甲基丙烯酰氧乙基磷酰胆碱(MPC)和甲基丙烯酸(MAA)，其中MAA的终含量为10-30%，5~30 mg N,N′-(双丙烯酰基)胱胺(BAC)，1~5 mg偶氮二异丁腈(AIBN)，10~40 mL的乙腈溶液，超声分散均匀后，通氮气，安装加热回流装置，打开磁力搅拌，搅拌速度200~600 rpm/min，升温至85~95℃开始反应，恒温回流0.5~2 h结束反应，将白色乳液倒出，用高速离心机以8000~12000 r/min速度离心10~15 min，倾去上清液，用去离子水洗涤、离心，反复2~3次，产物冷冻干燥，得到白色粉末状产品，即为P(MPC-s- s-MAA)纳米凝胶；
2）P(MPC-s-s-MAA)-Fe纳米酶的制备：
将5 mg 纳米凝胶、25~50 mg FeCl2及15~30 mL乙醇依次加入50 mL的单口烧瓶中，超声分散均匀后，氮气保护下在200~400 r/min转速下搅拌0.5~1 h，升温至50~70℃并稳定反应1.5~2.5 h，反应结束后，用高速离心机以8000~12000 r/min速度离心10~15 min，倾去上层溶液，得到粗产品，使用乙醇对粗产品进行离心洗涤，反复3~5次，经冷冻干燥，得到灰白色粉末状产品，即为基于两性离子聚合物凝胶的生物降解纳米酶。
2.如权利要求1所述的一种生物降解纳米酶在制备药物递送系统以及肿瘤治疗药物中的应用。
3.一种药物递送系统，其特征在于，含有如权利要求1所述的生物降解纳米酶。
4.如权利要求3所述的一种药物递送系统在制备肿瘤治疗药物中的应用。
5.一种含有药物的药物递送系统，其特征在于，其制备方法包括，将药物与权利要求1所述的生物降解纳米酶共同分散于缓冲溶液中搅拌均匀，离心收集负载药物的生物降解纳米酶，得到所述含有药物的药物递送系统。
6.根据权利要求5所述的一种含有药物的药物递送系统，其特征在于，所述药物为阿霉素。
7.根据权利要求6所述的一种含有药物的药物递送系统，其特征在于，所述阿霉素与生物降解纳米酶的质量比为2:10~5:10。
8.如权利要求7所述的一种含有药物的药物递送系统在制备肿瘤治疗药物中的应用。
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