KR102606472B1 - 콜라겐 하이드로겔의 생성방법 - Google Patents

콜라겐 하이드로겔의 생성방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해파리 콜라겐 하이드로겔을 생성하기 위한 방법 및 이를 생성하기 위한 키트에 있다. 해파리 콜라겐 하이드로겔은 세포의 배양에 이용될 수 있다. 본 발명에 따르면, 해파리 콜라겐 피브릴을 포함하는 해파리 콜라겐 하이드로겔의 생성방법이 존재하며, 상기 방법은 정제된 해파리 콜라겐의 용액 및 수성 중화 버퍼를 혼합하는 단계; 및 해파리 콜라겐 피브릴의 형성을 가능하게 하는 충분한 시간 동안에 혼합물을 인큐베이팅(incubating)하는 단계;를 포함하는데, 가교제가 상기 혼합하는 단계 동안에 추가되거나 또는 혼합물의 인큐베이팅 동안에 또는 이후에 추가된다.

Description

콜라겐 하이드로겔의 생성방법
본 발명은 콜라겐 어셈블리(collagen assembly) 및 이의 제품의 제조방법에 관한 것이다.
콜라겐은 포유동물 단백체(mammalian proteome) 중에서 가장 도처에 있는 단백질(most ubiquitous protein)로, 모든 단백질의 최대 30%를 포함한다(Leitinger & Hohenester, 2007). 이는 세포 외 기질 및 결합조직의 많은 부분을 형성하며, 신체 내 조직에 힘과 유연성을 제공한다. 기계적 힘에서 이의 역할 외에도, 콜라겐은 신호전달 분자로서 작용하는데, 세포 이동 (Greenberg, et al., 1981), 분화 (Bosnakovski, et al., 2005) 및 증식 (Pozzi, et al., 1998)을 조절하고, 항상성에서 기능한다 (Farndale, et al., 2004).
생체재료(biomaterial)로서 콜라겐의 잠재력은 낮은 면역원성(low immunogenicity) 및 독성과 높은 인장강도(high tensile strength)와 같은 이의 가치있는 특성에 의해 명백해졌다. 지금까지, 콜라겐의 과도한 의학적 용도가 제안, 개발 및 적용되어왔다. 이러한 적용들 중 다수는 비평면 기질(non-planar substrate) 또는 스캐폴드(scaffold)로 조립되는(assembling) 경우에 콜라겐을 이용한다. 콜라겐 스캐폴드는 3D 세포 배양 기질 (Song, et al., 2006), 조직 재생 스캐폴드 (Hoyer et al., 2014), 각막 쉴드(corneal shield) (Willoughby & Batterbury, 2002), 국소 상처 수복제(topical wound reparative agent), 및 약물 전달을 위한 비히클(vehicle for drug delivery)로서 이용될 수 있다.
통상적으로 이용되는 콜라겐 스캐폴드의 한 유형은 콜라겐 하이드로겔이다. 콜라겐 하이드로겔은 고분자 얽힘(polymer entanglement) 및/또는 공유결합 가교(covalent cross-linking)에 의해 해리(dissociating)가 예방되는 가용성 콜라겐 섬유(collagen fibre)의 네트워크로 구성된다. 이들은 콜로이드성 현탁액(colloidal suspension)으로부터 또한 형성될 수 있다. 하이드로겔의 물리적 특성은 제조 경로에 따라 조율될 수 있다. 이 주제는 몇몇 자세한 리뷰(Drury & Mooney, 2003) (Hennink & van Nostrum, 2012) (Hoffman, 2012)에 의해 다뤄진다.
콜라겐 하이드로겔은 급속도로 현대 세포 배양 기법의 필수 구성요소가 되고 있다. 이들은 이들의 생체 내 환경을 더 연상시키는 3D 격자 내에서 세포의 성장을 가능하게 한다. 생체 내 환경에서 시험관 내 세포를 배양하는 능력은 세포 생물학의 연구에 명백한 이점을 가진다. 3D 하이드로겔은 연골 회복(cartilage repair)에서 특정 유용성이 있는 조직 엔지니어링 스캐폴드(tissue engineering scaffold)로서도 또한 이용될 수 있다.
가장 통상적인 콜라겐의 공급원은 포유동물 조직으로부터 유래된다. 그럼에도, 조직 엔지니어링에서 포유동물 콜라겐의 이용이 바이러스 전파의 상당한 위험과 관련 있다는 것이 주지된다. 더욱이, 포유동물 공급원으로부터 콜라겐의 정제는 상당한 비용과 관련있고, 정제 방법으로부터 이어진 오염 분자(contaminant molecule)는 포유동물 콜라겐 하이드로겔 형성의 재현성(reproducibility)을 악화시킨다. 이는 포유동물 콜라겐 하이드로겔이 세포 배양에서 이용될 경우, 이의 신뢰도를 현저히 위태롭게 할 수 있다. 따라서, 대안적인 콜라겐 공급원이 오랫동안 바람직한 것으로 고려되어왔다.
연어 피부로부터 추출된 콜라겐은 3D 스캐폴드의 제작에 이용하기 위한 대안적인 콜라겐 공급원 (US 특허 제8105629호)으로 제안되었다. 해파리 콜라겐은 또 다른 잠재적인 대안적 콜라겐 분자이다. 해파리 콜라겐은 탈수된 스폰지(dehydrated sponge)의 형성에서 3D 세포 배양 콜라겐으로서 이미 성공적으로 이용되었다. 해파리 콜라겐은 낮은 면역원성, 낮은 제조 비용을 보이면서 이 시도에서 매우 바람직한 대안인 것으로 판명되었고, 포유동물 콜라겐과 관련있는 바이러스 이동 및 질병 전파의 위험으로부터 자유롭다. 그럼에도, 상이한 기질은 상이한 임상 및 연구 적용에 유용해서, 해파리 콜라겐 하이드로겔 수득에 대한 갈망이 여전히 존재한다. 그러나, 해파리 콜라겐에 부과된 진화적 제약(evolutionary constraint)은 단백질이 보다 낮은 온도에서 최적으로 기능하도록 진화해온 것을 의미한다. 지금까지 낮은 열안정성(lower thermostability)은 생리학적 온도에서 사용하기에 적합한 해파리 콜라겐 하이드로겔의 제조를 불가능하게 했다.
따라서, 세포 배양 및 의학적 적용에 사용하기에 적합한 해파리 콜라겐 하이드로겔의 향상된 제조 방법에 대한 필요성이 존재한다.
본 발명은 포유동물 또는 어류 콜라겐에 비해서 대단히 상이한 해파리 콜라겐의 물리화학적 특성에도, 해파리 콜라겐이 생리학적 조건하에서 안정한 3D 하이드로겔의 형성에 이용될 수 있다는 완전히 예상하지 못한 발견에 기초한다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 해파리 콜라겐 피브릴(jellyfish collagen fibril)을 포함하는 해파리 콜라겐 하이드로겔 (jellyfish collagen hydrogel)의 생성방법이며, 상기 방법은 (a) 정제된 해파리 콜라겐의 용액 및 수성 중화 버퍼를 혼합하는 단계; 및 (b) 콜라겐 피브릴의 형성을 가능하게 하는 충분한 시간 동안에 혼합물을 인큐베이팅하는 단계;를 포함하는데, 가교제(cross-linking agent)가 상기 혼합하는 단계 (a) 동안에 추가되거나 또는 단계 (b)로부터 수득된 콜라겐 피브릴에 추가된다.
본 발명의 제2 측면은 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 방법으로부터 수득 가능한 해파리 콜라겐 하이드로겔을 제공한다. 이 하이드로겔은 열적으로 및 기계적으로 반응함으로써(thermally and mechanically responsive) 가역적인 겔화(reversible gelation)을 가진다.
본 발명의 제3 측면은 분리된 해파리 콜라겐 하이드로겔을 제공하며, 상기 해파리 콜라겐 하이드로겔은 25oC 내지 50oC의 온도에서 안정하다.
본 발명의 제4 측면은 3D 세포 배양 스캐폴드의 제조에서 본 발명의 제2 측면 또는 제3 측면의 분리된 해파리 콜라겐 하이드로겔을 이용한다.
본 발명의 제5 측면은 의료 장치의 제조에서 본 발명의 제2 측면 또는 제3 측면의 분리된 해파리 콜라겐 하이드로겔을 이용한다.
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 제2 측면 또는 제3 측면의 해파리 콜라겐 하이드로겔을 포함하는 의료 장치를 제공한다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제2 측면 또는 제3 측면의 해파리 콜라겐 하이드로겔을 포함하는 3D 세포 배양 스캐폴드를 제공한다.
본 발명의 제8 측면은 세포를 배양하는 본 발명의 제6 측면의 3D 세포 배양 스캐폴드를 이용한다.
본 발명의 제9 측면은 정제된 해파리 콜라겐의 용액, 중화 버퍼, 및 가교제를 포함하는 키트를 제공한다.
본 발명은 하기 도면에 의해 설명된다.
도 1은 해파리 콜라겐에서 피브릴 형성에 대한 pH의 영향을 제시한다.
도 2는 해파리 콜라겐 (JFC) 피브릴형성(fibrillogenesis)에 대한 NaCl농도의 영향을 제시한다.
도 3은 BDDGE 또는 제니핀 (GP) 가교 콜라겐 피브릴 하이드로겔의 열안정성에 대한 시간 및 pH의 영향을 제시한다.
도 4는 열안정성에서 가교제(cross-linker) 농도의 효과를 제시한다. 모든 겔은 pH 7에서 120시간 동안 형성되었다. 각 농도에 대해 n=3. 대조 시료= 가교제가 없는 JFC 하이드로겔, pH 7에서 120시간 후.
본 발명은 하이드로겔의 제작을 위한 실행 가능하며 실질적인 포유동물 콜라겐-대안으로서 해파리 콜라겐 (jellyfish collagen, JFC)의 이용을 가능하게 하는 방법의 실현이다.
본 발명은 JFC 하이드로겔이 생리학적 온도 및 pH에서 형성될 수 있고 안정해진다는 놀라운 발견에 의해 가능해진다. 이전에, JFC의 낮은 열안정성으로 인해 이러한 하이드로겔의 제조는 불가능했었다. 포유동물과 해파리 콜라겐 사이의 상이한 환경 조건 및 진화적 거리(evolutionary distance)는 JFC가 보다 낮은 온도에서 최적으로 기능하도록 진화되어온 것을 의미한다. 더욱이, JFC의 고유의 물리화학적 특성 때문에, JFC의 응집을 좌우하는 열역학 법칙(thermodynamic principle)은 포유동물 또는 어류 콜라겐의 응집을 제어하는 이들에 비해서 현저히 상이할 가능성이 높다. 콜라겐 하이드로겔을 형성하기 위해, 피브릴으로의 콜라겐 분자의 강인한 응집체가 일반적으로 필요하다. 따라서, JFC의 감소된 열안정성 및 알려지지 않은 응집체 특성에 비추어보면, JFC가 포유동물 콜라겐 하이드로겔의 형성에 이용된 환경과 유사한 환경하에서 콜라겐 하이드로겔을 형성하도록 유도될 수 있는 것은 완전히 놀라운 것이다. 더욱이, JFC의 감소된 열안정성에 대해서, 이러한 하이드로겔이 포유동물 및 어류 콜라겐 하이드로겔의 효과적인 대체제로서 이들의 이용을 가능하게 하는 생리학적 조건하에서 충분히 안정하다는 것은 더더욱 놀라운 것이다.
본 발명은 본원에서 이용된 하기 정의를 참조하여 더 기술된다.
"정제된 해파리 콜라겐의 용액"은 실질적으로 단량체이거나, 대안적으로는, 실질적으로 콜라겐 피브릴이 없는(free) 분리된 JFC의 용액을 의미한다. 이와 관련해서, "실질적으로 없는- "은 피브릴로 구성된 콜라겐이 2 wt% 미만으로 있는 콜라겐의 용액을 의미한다. 이러한 조건하에서 콜라겐 용액을 유지하기 위해, 분리된 콜라겐은 콜라겐 피브릴 형성에 불리한 조건하에서 저장될 수 있다. 이는 콜라겐이 산성 조건하에서 (여기서 산성은 pH 1 내지 pH 6.5의 pH를 보이는 임의의 용액을 의미한다), 또는 대안적으로는 염기성 조건하에서 (여기서 염기성은 pH 8 내지 pH 14의 pH를 보이는 임의의 용액을 의미한다)저장되는 것을 의미할 수 있다. 비제한적인 예시로서, 콜라겐은 0.1 M의 약산 용액에 저장될 수 있다. 약산은 아세트산이거나 염산일 수 있다. 콜라겐 용액 내의 콜라겐의 농도는 0.1 mg/ml 내지 30 mg/ml의 범위에 속할 수 있다. 바람직하게는, 콜라겐 용액의 농도는 1 mg/ml 내지 10mg/ml이다.
해부학적 환경(anatomical milieu)으로부터 해파리 콜라겐을 "분리" 또는 "정제"하는 다양한 방법이 존재한다. 이들 중 다수는 통상의 기술자에게 주지되고 일상적일 것이다. 예를 들어, 콜라겐은 산 추출(acid extraction)에 의해 해파리로부터 정제될 수 있는데, 이로써 해파리의 상이한 해부학적 부분(anatomical part)이 산성 용액에서 중탕된다(bathed). "중탕하는- (bathing- )" 또는 "중탕된- (bathed- )"은 콜라겐 분자를 유리시키기 위해 해파리를 산성 용액에서 충분한 시간 동안에 인큐베이팅(incubationg)하는 과정을 의미한다. 콜라겐 정제의 대안적 방법은 효소 추출인데, 이로써 해파리는 콜라겐 분자를 유리하기 위해서 적어도 하나의 단백질 분해효소(proteolytic enzyme)로 충분한 시간 동안에 해부학적 환경의 분해에 유리한 조건하에서 인큐베이팅된다. 효소 추출 방법의 정확한 온도, pH 및 인큐베이션 시간은 사용된 단백질 분해효소에 따라 달라질 것이다. 가장 적합한 조건은 통상의 기술자에게 주지될 것이다. 비제한적인 예시로서, 콜라겐 분자를 유리하기 위해서 효소 펩신은 산성 조건하에서 해파리와 인큐베이팅될 수 있다. 효소 추출 방법에서 임의의 효소가 이용될 수 있으며, 상기 예시는 결코 제한하려는 의도가 아니라는 것이 예상된다.
이어서, 콜라겐은 산 추출 방법 또는 효소 추출 방법의 원치 않는 오염 물질로부터 많은 다른 수단에 의해 더 분리되거나, 정제될 수 있다. 예를 들어, 불용성 오염 물질은 원심분리에 의해 제거될 수 있다. 더 순도가 높은 콜라겐 공급원이 필요한 경우에, 추출 과정의 다른 가용성 오염 물질에 대해서, 분리된 콜라겐을 콜라겐 분자의 정제를 가능하게 하는 겔 여과(gel filtration), 또는 대안적인 크로마토그래피 방법으로 처리할 수 있다. 추가적인 정제의 정확한 방법이 특히 제한되는 것은 아니다. 단백질 생화학자(protein biochemist)에 의해 주지되고 일상적으로 이용되는 임의의 방법은 정제되거나 분리된 해파리 콜라겐을 수득하는 목적을 위해 조정될 수도 있다. 목적하는 정제된 해파리 콜라겐의 용액을 수득하기 위해, 이 단계는 해파리 콜라겐의 목적하는 저장 버퍼(storage buffer)로의 이동을 또한 가능하게 할 수 있다. 이는 정제 이전에 목적하는 저장 버퍼로 크로마토그래피 기구(chromatographic apparatus)를 제1 평형화(first equilibrating) 함으로써 달성될 수 있다. 이 목적을 위해 이용될 수도 있는 많은 대안적인, 주지된 방법들이 존재한다. 바람직하게는, 본 발명에서 이용된 콜라겐 용액은 70% 내지 99% 순도이고, 여기서 순도란 콜라겐 분자에 기인하는 용액 내 % wt를 의미한다. 더욱 바람직하게는, 콜라겐 용액은 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 순도이다.
용어 "중화 버퍼"는 pH를 pH 4 내지 pH 9의 pH로 증가시키거나 감소시키기 위해 정제된 해파리 콜라겐의 용액이 희석될 수 있는 임의의 버퍼를 의미한다. 콜라겐 피브릴 형성이 진행될 수 있도록, 중화 버퍼의 조성은 정제된 해파리 콜라겐 용액의 pH를 증가시키거나 감소시켜야 한다는 점에서만은 특히 제한적이지 않다. 더욱이, 버퍼는 임의의 가교 과정을 방해할 수 있는 이온, 화합물, 또는 분자가 실질적으로 없어야 한다. 따라서, 미반응 아민(unreacted amine)이 실질적으로 없는 버퍼는 특히 바람직하다. 단지 비제한적인 예시로서, 중화 버퍼는 1x 내지 10x 포스페이트 완충 생리 식염수 (phosphate buffered saline, PBS)일 수 있는데, 여기서 1x 또는 10x는 PBS의 농도를 의미한다. 1x PBS의 조성은 통상의 기술자에게 주지될 것이다. 콜라겐 피브릴 형성이 진행될 수 있도록 정제된 해파리 콜라겐의 용액이 실질적으로 중화되기 위해, PBS의 정확한 농도 (즉, 1x 또는, 예를 들어, 10 x)는 정제된 해파리 콜라겐의 용액과 혼합하는 경우에 필요한 희석 배율(dilution factor)에 전적으로 좌우될 것이다. 일부 양태에서, 중화 버퍼는 소듐 하이드록시드(sodium hydroxide)이다.
용어 "피브릴 형성 (fibril formation) 또는 "피브릴형성(fibrillogenesis)"은 콜라겐 분자가 제어된 응집을 겪어서 고차의, 잘-구조화된 거대분자 어셈블리(higher order, well-structured macromolecular assembly)를 형성하는 절차를 의미한다. 생체 내 콜라겐은 피브릴 구조체(fibrillar structure)로의 이의 응집이 세포 외 기질의 구성요소 및/또는 주변 조직을 위한 건축학적 지지체(architectural support)를 제공하는 주된 세포 외 단백질이다. 콜라겐, 특히 포유동물 콜라겐의 응집체는 주지된 현상이다. 포유동물 콜라겐 및 마린 콜라겐(marine collagen)의 상이한 이소폼(isoform)은 상이한 거대분자 구조체(macromolecular sturcture)로 우선적으로 응집한다. 각각의 콜라겐 이소폼으로부터 형성된 고유의 거대분자 구조체는 콜라겐 펩티드의 물리화학적 특성 및 피브릴형성이 촉진되는 조건에 의해 좌우된다. 고차 콜라겐 구조체(Higher-order collagen structure), 즉, 포유동물 또는 어류로부터 수득된 콜라겐 피브릴은 포유동물 및/또는 어류 콜라겐 하이드로겔을 형성하기 위해 시험관 내에서 이용되었다. 따라서, 해파리 콜라겐으로부터 하이드로겔을 형성하기 위해, 해파리 콜라겐이 고차 구조체로 조립되는 것(assembling)이 바람직하다. 바람직하게는, 고차 구조체는 피브릴이다.
용어 "가교제 (cross-linker 또는 cross-linking agent)"는 특정 조건하에서 두 개의 별도의 분자 사이에서 공유 결합을 형성할 수 있는 반응성 화학적 화합물(reactive chemical compound)을 의미한다. 본 발명의 맥락에서, 가교제는 두 개의 별도의 콜라겐 분자의 공유결합에 이용된다. 바람직하게는, 가교될 콜라겐 분자는 콜라겐 섬유(collagen fibre)의 형태이다. 바람직하게는, 피브릴간 가교(inter-fibril cross-linking)가 발생한다. 통상적으로 가교제는 탄화수소 사슬에 의해 함께 연결된 둘 이상의 반응성 작용기(reactive functional group)로 구성된다. 이 둘 이상의 작용기는 반드시 동일하지 않아도 된다. 또한, 탄화수소 사슬의 길이는 작용기 사이의 거리를 제어하기 위해 달라질 수 있다. 본 발명의 문맥에서 탄화수소 사슬의 정확한 길이는 제한적이지 않다. 더욱이, 가교제의 반응성 작용기의 유형은 특히 제한적이지 않다. 콜라겐 피브릴이 형성되는 조건하에서 가교하는 것으로 공지된 임의의 가교제가 본 발명에서 사용하기 위한 적합한 가교제가 될 것이 예상된다. 특정한 적용에서, 세포에 비독성인 가교제를 사용하는 것은 바람직 할 수 있다. 특정 양태에서, 가교제는 제니핀, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-BDDGE), 또는 무코클로르산으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 가교제는 제니핀 또는 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-BDDGE)이다. 25oC 내지 50oC의 온도에서 안정한 하이드로겔을 만들기 위해, 가교제의 함유는 하이드로겔의 열안정성의 증가에 특히 유리하다.
따라서, 본 발명의 제1 측면은 해파리 콜라겐 피브릴을 포함하는 해파리 콜라겐 하이드로겔을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 (a) 정제된 해파리 콜라겐의 용액 및 수성 중화 버퍼(aqueous nutralisation buffer)를 혼합하는 단계; 및 (b) 콜라겐 피브릴의 형성을 가능하게 하는 충분한 시간 동안에 혼합물을 인큐베이팅(incubating)하는 단계를 포함하는데, 가교제가 혼합하는 단계 (a) 동안에 추가되거나 또는 단계 (b)로부터 수득된 콜라겐 피브릴에 추가된다.
바람직한 양태에서, 혼합하는 단계 (a)는 pH 4 내지 pH 9의 pH의 용액을 생성한다. 바람직하게는, 혼합하는 단계는 pH를 pH 7.4로 상승시킨다.
다른 바람직한 양태에서, 단계 (b)는 4oC 내지 25oC의 온도에서 수행된다. 피브릴이 이 위온도 범 밖에서 형성될 수 있으나, 이 위온도 범가 콜라겐 피브릴 형성의 유도에 대한 최적의 위온도 범이다.
일부 양태에서, 단계 (b)는 최대 12시간 동안 수행될 수 있다. 다른 바람직한 양태에서, 단계 (b)는 5 내지 60분 동안 수행된다. 단계 (b)에서 이용된 온도가 콜라겐 피브릴 형성의 역학을 제어할 것이므로, 정확한 시간은 이 온도에 좌우될 것이다. 통상의 기술자는 상이한 온도에서 시간에 따른 콜라겐 피브릴의 형성 이후에 분광분석 기법(spectroscopic technique)을 이용하여, 상이한 온도에서 단계 (b)를 수행하기 위한 최적의 시간을 계산할 수 있을 것이다. 예를 들어, 콜라겐 피브릴 형성을 모니터링하기 위해서, 313 nm 파장의 빛의 자외선-가시광선 흡광도(UV-vis absorption)가 시간에 따라서 측정될 수 있다. 흡광도의 증가는 피브릴 형성이 진행중임을 나타낸다. 이 증가가 플래토(plateau)가 되는 경우에, 피브릴 형성은 끝나고, 따라서 단계 (b)를 수행하기 위한 충분한 시간을 규정한다.
다른 바람직한 양태에서, 수성 중화 버퍼는 포스페이트계(phosphate-based)이다.
다른 바람직한 양태에서, 가교제는 제니핀, 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-BDDGE) 또는 무코클로르산으로부터 선택된다. 바람직하게는, 가교제가 제니핀인 경우에, 이 가교제는 0.001% 내지 5%, 바람직하게는 0.025% (w/v)의 최종 농도로 추가되거나; 가교제가 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-BDDGE)인 경우에, 이 가교제는 0.001% 내지 5%, 바람직하게는 4% (w/v)의 최종 농도로 추가되거나; 또는 가교제가 무코클로르산인 경우에, 이 가교제는 0.001% 내지 5%, 바람직하게는 0.25% 내지 4% (w/v)의 최종 농도로 추가된다. 바람직하게는, 가교제는 제니핀 또는 BDDGE이다.
다른 바람직한 양태에서, 정제된 해파리 콜라겐의 용액은 효소 추출에 의해 콜라겐 공급원으로부터 정제된다. 효소 추출 방법에서 이용되는 효소는 펩신 또는 이의 조합으로부터 선택될 수 있다. 대안적으로는, 정제된 해파리 콜라겐의 용액은 산 추출(acid extraction)에 의해 콜라겐 공급원으로부터 정제된다.
다른 바람직한 양태에서, 해파리 콜라겐은 바렐해파리 , 숲뿌리해파리 , 로필 레마 노마디카 , 대형해파리, 아우렐리아 종, 노무라입깃해파리 , 또는 이의 조합으로부터 정제된다. 바람직하게는, 콜라겐은 바렐해파리로부터 정제된다.
본 발명의 제2 측면은 본 발명의 제1 측면에 의해 정의된 방법으로부터 수득 가능한 해파리 콜라겐 하이드로겔을 제공한다.
본 발명의 제3 측면은 25oC 내지 50oC의 온도에서 안정한 분리된 해파리 콜라겐 하이드로겔을 제공한다. 바람직하게는, 하이드로겔은 세포 배양 조건하에서 적어도 37oC까지는 안정하다. 세포 배양 조건은 포유동물 콜라겐 하이드로겔이 세포를 배양하기 위한 3D 기질로서 이용될 수도 있는 임의의 조건이다. "안정한-"의 의미는 하이드로겔이 주어진 조건하에서 실질적으로 변성하지 않는다는 것을 의미한다. 실질적 변성은, 예를 들어, 언급된 조건하에서 하이드로겔을 인큐베이팅하는 48시간 이내에, 하이드로겔 부피의 25%가 넘는 손실일 수도 있다.
바람직한 양태에서, 이러한 하이드로겔의 형성은 기계적으로 가역적(mechanically reversible)이며, 이는 3D 세포 구조체의 하이드로겔 후-형성(hydrogel post-formation)의 제거 및 세포의 마이크로캡슐화(microencapsulation)를 가능하게 한다. 본 발명에서 사용된 "기계적으로 가역적인- "은 콜라겐의 용액을 형성하기 위한 하이드로겔의 기계적 파괴를 의미한다. 이는 임의의 지점에서, 예를 들어, 3D 세포 구조의 제작물이 배양된 후에, 하이드로겔의 제거가 필요한 경우에 유리할 수 있다.
본 발명의 제4 측면은 3D 세포 배양 스캐폴드의 제조에서 본 발명의 제2 측면 또는 제3 측면의 분리된 해파리 콜라겐 하이드로겔을 이용한다. 세포 배양 스캐폴드는 삼차원 배향(3D orientation)에서 시험관 내 세포 배양에 적합한 해파리 콜라겐 하이드로겔이다.
본 발명의 제5 측면은 의료 장치의 제조에서 본 발명의 제2 측면 또는 제3 측면의 분리된 해파리 콜라겐 하이드로겔을 이용한다. 바람직하게는, 의료 장치는 상처 드레싱(wound dressing)이다. 본 발명의 문맥에서 상처(wound)는 통상적으로 피부가 베이거나 찢어지도록 야기하는 베임(cut), 타격(blow), 또는 다른 충격으로 인한 살아있는 조직에 대한 상처를 의미한다. 상처 드레싱은 통상적으로 상처를 덮어서, 치유 동안에 살균 환경(sterile environment)을 제공하도록 설계된다. 상처 드레싱은, 예를 들어, 약제가 상처 드레싱으로, 피부에 접촉될 표면상에 도포된 경우에 치유 과정을 촉진시킬 수 있다. 콜라겐은 이러한 수복제 중 하나로, 조직 회복을 강화하기 위해 섬유아세포(fibroblast) 및 각질형성세포(keratinocyte)와 같은 세포를 상처 부위로 유인하는 역할을 한다. 콜라겐 하이드로겔은 새 조직 성장을 위한 구조적 지지체(structual support)를 또한 제공할 수 있다.
본 발명의 제6 측면은 본 발명의 제2 측면 또는 제3 측면의 해파리 콜라겐 하이드로겔을 포함하는 의료 장치를 제공한다. 바람직하게는, 의료 장치는 상처 치유제(wound healing agent)이다. 바람직하게는, 의료 장치는 각막 쉴드(corneal shield), 연골(cartilage), 뉴런들의 집합(collection of neurones), 또는 정형외과적 장치(orthopaedic device)일 수 있다.
본 발명의 제7 측면은 본 발명의 제2 측면 또는 제3 측면의 해파리 콜라겐 하이드로겔을 포함하는 3D 세포 배양 스캐폴드를 제공한다.
본 발명의 제8 측면은 세포를 배양하는 본 발명의 제6 측면의 3D 세포 배양 스캐폴드를 이용한다. 세포 배양 스캐폴드는 간세포(hepatocyte), 근세포(myocyte), 심근세포(cardiocyte), 각질형성세포(keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 뉴런(neuron), 신장세포(renal cell), 상피세포(epithelial cell), 신경교세포(glial cell), 호르몬-분비세포(hormone-secreting cell), 장벽 기능 세포(barrier function cell), 세포 외 기질세포(extracellular matrix cell), 수축세포(contractile cell), 수정체 세포(lens cell), 줄기세포, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 혈액-유래 줄기세포(blood-derived stem cell), 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell), 또는 이의 조합으로 이루어진 목록으로부터 선택된 1차 포유동물 세포의 배양에 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 세포 배양 스캐폴드는 간세포의 배양에서 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 세포 배양 스캐폴드는 심근세포(cardiocyte)의 배양에서 이용될 수 있다. 일부 양태에서, 1차 세포는 인간 세포이다. 세포를 배양하기 위한 3D 스캐폴드의 이용은 다양한 연구 및 의학적 적용을 가질 수 있는 3D 세포 구조체의 성장을 가능하게 할 수 있다. 예를 들어, 스캐폴드는 이용되어 외과적 이식(surgical transplantation)을 위한 새 조직을 조작할 수도 있다. 예시로서의 이러한 조직은 각막 쉴드, 뼈, 뉴런 또는 연골일 수 있다. 스캐폴드로서 해파리 콜라겐 하이드로겔을 이용하여 성장할 수 있는 다른 조직들은 통상의 기술자에게 주지될 것이다.
본 발명의 다른 측면에서, 정제된 해파리 콜라겐의 용액, 중화 버퍼 및 가교제를 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 본원에서 기술된 각각의 구성요소의 임의의 양태를 포함할 수 있다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예를 참고하여 더 기술된다.
실시예
[ 실시예1 : 해파리 콜라겐의 추출]
바렐해파리 ( Rhizostomas pulmo ) 로부터 산 가용성 콜라겐 (acid soluble collagen)의 추출
해파리 (바렐해파리) 물질을 400 μm 필터로 통과시켰고, 추후의 사용을 위해 투석유물(retentate)을 동결시켰다. 동결된 조직을 규칙적인 교반(regular stirring)과 함께 24시간 동안 해동시켰다. 완전히 해동되면, 50% NaOH을 이용해서 조직을 pH 13에 이르게 하고, 추가로 24시간 동안 두었다. 24시간 후에, 농축된 아세트산(concentrated acetic acid)을 0.5 M의 농도로 추가하였고, HCl을 이용해 pH를 3.0으로 조정하였다. 이후에 조직을 3-5일 동안 둬서 매우 낮은 고체 함량의 점성 용액(viscous solution of very low solid content)을 수득하였다. 모든 단계들은 4oC에서 수행하였다.
콜라겐 정제
용액을 20000 RCF에서 1시간 동안 원심분리하여 임의의 남은 고형물을 제거하였다. 원심분리 후에, NaCl을 1 M의 농도로 추가하여 용액으로부터 콜라겐을 침전시켰고 추가로 20분 동안 후속으로 원심분리하여 침전된 콜라겐을 수득하였다. 이후에 펠렛(pellet)을 0.1M 아세트산에 재현탁하였고, 농축된 HCl을 이용하여 pH를 pH 3으로 조정하였다. 생성되는 용액을 총 10시간 동안 더 교반시킨 후에, 무색의 투명한 JFC 용액이 수득될 때까지, 0.1 M 아세트산으로 100 kDa 멤브레인 필터를 포함한 싸토리우스 비바플로우 200 시스템(Sartorius Vivaflow 200 system)을 통해 6 정용여과 부피(diavolume) 동안 정용여과시켰다(diafiltered). 다시, 모든 단계는 4oC에서 수행하였다.
[ 실시예 2: JFC 하이드로겔 형성에 대한 용액 조건의 영향]
JFC의 피브릴형성 검정- 산가용성 pH 의존도.
산가용성 JFC를 3 mg/ml으로 희석시켰고 9:1의 비율로 10x 포스페이트 완충 생리 식염수(phosphate buffered saline, PBS)에 추가하였다. 1 M NaOH를 이용하여 시료의 pH를 pH 3, 5, 6, 7, 8, 및 9로 조정하였다 (도 1). 이후 시료를 UV-vis 큐벳(UV-vis cuvette)에 트리플리케이트(triplicate)로 추가하였고, 플래토(plateau)에 도달할 때까지 313 nm에서 정기적인 흡광도 판독(regular absorbance reading)을 수행하였다.
도 1은 JFC의 피브릴형성이 pH 6 내지 pH 9의 pH에 있는 용액에서 일어날 수 있음을 제시한다.
JFC의 피브릴형성 검정- NaCl 농도의 영향.
산가용성 JFC를 3 mg/ml으로 희석하였고 1 M NaOH를 이용해서 용액의 pH를 pH 7.4로 조정했다. 0 M, 0,69 M, 1.38 M 및 2.74 M NaCl을 함유하는 10xPBS를 9:1 (JFC : 10x PBS)의 비율로 이후에 추가하였고, 필요한 경우에 pH를 pH 7.4로 다시 조정하였다. 이후에 시료를 트리플리케이트로(triplicate) UV-vis 큐벳으로 추가하였고, 플래토(plateau)에 도달할 때까지 313 nm에서 정기적인 흡광도 판독(regular absorbance reading)을 수행하였다 (도 2).
도 2는 NaCl의 농도가 JFC 피브릴형성에 대해 현저하게 영향을 끼지지 않는다는 것을 제시한다.
해파리 콜라겐 하이드로겔의 형성- pH 및 온도의 영향.
3 mg/ml의 산가용성 JFC의 시료에 10xPBS를 9:1 비율(JFC:PBS)로 추가함으로써 JFC를 겔 상태로 만들었다. NaOH를 추가하여 용액을 pH 3, 5, 6, 7, 8 및 9로 조정하였다. 이후 각 pH로부터의 시료를 4oC 또는 19oC에서 8시간 동안 두어 겔이 전개되도록하였다.
이용된 조건하에서, JFC 피브릴 형성 및 겔화는 4oC에서 최적으로 발생했다.
열안정성의 측정
하이드로겔의 열안정성을 pH 9 및 4oC에서 PBS 내 형성된 하이드로겔을 이용하여 연구했다. JFC 용액을 2.74 M NaCl과 함께 보충했다. 생성되는 JFC 하이드로겔을 수조에서 5분 동안 18oC, 20oC, 22oC, 24oC 및 26oC에서 침지했다(immersing). 변성 온도는 겔의 절반이 붕괴되는 지점으로 결정하였다.
도 4는 가교제가 없을 경우에 하이드로겔이 약 20oC의 열안정성을 가진다는 것을 제시한다.
[ 실시예 3: 하이드로겔 열안정성의 증가]
해파리 콜라겐 (jellyfish collagen, JFC) 하이드로겔의 열안정성을 증가시키는 가교제 제니핀, BDDGE, 및 무코클로르산의 능력을 >37oC에서 장시간 동안 안정한 JFC 하이드로겔의 생성을 목표로 평가하였다.
해파리 콜라겐 ( JFC ) 겔의 제조.
3.5 mg/ml의 산 가용화된 JFC(acid solubilized JFC)의 다수의 분취물(multiple aliquot)을 9:1 (JFC:10xPBS)의 비율로 10x 포스페이트 완충 생리 식염수 (phosphate buffered saline, PBS)를 이용해 희석하였다. 이후, 농축된 NaOH를 추가함으로써 각 용액을 pH 3 내지 pH 9 사이로 pH-조정하였다. 이어서, 가교제 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-BDDGE), 제니핀 또는 무코클로르산을 각각 1% 내지 4%, 0.025% 내지 5%, 또는 0.1% 내지 5%의 최종 농도로 추가하였다. 이후에 용액을 교반시켜서 가교제의 확산을 허용하였고, 4oC 내지 25oC에서 0.5시간 내지 24시간 동안에 인큐베이팅하여 피브릴형성 및 겔화(gelation)가 완료되도록 하였다.
열안정성의 측정
열안정성을 측정하기 위해, 가교된 겔을 20oC의 인큐베이터에 두었다. 온도를 매시간 마다 1oC씩 증가시켰고, 열안정성을 기록하였다 (도 3). 열안정성은 겔이 처음으로 수축되거나/되고 녹기 시작하는 온도로 정의되었고, Tm으로 지칭되어 여기에 있을 것이다.
1% BDDGE 또는 0.1% 제니핀 하이드로겔로 가교된 하이드로겔의 열안정성의 시간에 따른 평가는 pH 용액의 범위에서 조사하였다 (도 3). 하이드로겔 열안정성에 대해서 시간 또는 pH가 영향을 가지는지에 대한 여부를 결정하기 위해, 이를 수행하였다. 도 3은 pH와 상관없이 BDDGE-가교된 하이드로겔이 초기 24시간 동안에 대략 13oC의 열안정성의 증가를 겪는 것을 제시하였다. 이후, 열안정성은 pH 8에서 하이드로겔의 열안정성의 일정한 증가가 관찰되는 지점인 72시간까지 플래토가 된다 (120시간 후, 45oC의 열안정성).
이와 대조적으로, 제니핀으로 가교된 JFC 하이드로겔은 24시간 후에 열안정성의 시간-의존성 또는 pH-의존성 증가를 보이지 않는다. 제니핀-가교된 하이드로겔의 열안정성은 24시간 후에 pH와 관계없이 약 45oC으로 증가한다 (도 3).
따라서, 제니핀-가교 하이드로겔은 BDDGE와 가교된 하이드로겔 (pH 8에서 120시간 동안 인큐베이팅된 BDDGE-가교 하이드로겔을 제외한) 보다 큰 열안정성을 가진다.
상이한 농도의 BDDGE 및 GP에서 가교된 하이드로겔의 열안정성
37oC에서 안정한 하이드로겔의 형성을 허용할 수 있는 각 가교제의 가능한 최저의 농도를 결정하기 위해, 제니핀 및 BDDGE 모두의 두 농도를 이용하였다. 가교된 하이드로겔을 1% 및 4%의 BDDGE (v/v) 및 0.025%, 0.05%, 0.075% 및 0.1%의 제니핀을 이용하여 pH 7에서 120시간 동안 형성하였고, Tm에 대한 효과를 도 4에 제시한다. 도시된 것과 마찬가지로, 1% BDDGE 하이드로겔은 4% BDDGE 하이드로겔과 정확히 같은 Tm을 가졌다. 두 농도는 모두 15oC의 Tm의 증가-가교되지 않은 하이드로겔의 20 oC로부터 1% 및 4%의 가교된 하이드로겔의 35oC로-를 야기했다. 이들이 pH 8.0에서 인큐베이팅되지 않음에 따라, 두 농도 모두 37oC에서 안정한 하이드로겔을 생성하지 않았다. 모든 제니핀 농도는 37oC에서 열적으로 안정한 (thermostable) 하이드로겔을 생성하였는데, 0.025% 제니핀-가교 하이드로겔에서 43oC의 최저 Tm이 존재했다(도 4). 이는 가교되지 않은 대조 시료보다 23oC 더 높다. 0.05%, 0.075% 및 0.1%의 세 개의 높은 농도의 GP 모두는 45oC의 Tm을 가졌다.
따라서, 임의의 상기 농도의 제니핀으로 가교된 하이드로겔은 37oC 이상의 Tm을 갖는 하이드로겔을 생성한다 (도 4).

Claims (38)

  1. 해파리 콜라겐 피브릴(jellyfish collagen fibril)을 포함하는 해파리 콜라겐 하이드로겔 (jellyfish collagen hydrogel)의 생성방법으로서, 상기 생성방법은
    (a) 하기를 혼합하는 단계:
    i. 정제된 해파리 콜라겐의 용액, 및
    ii. 수성 중화 버퍼(aqueous nutralisation buffer); 및
    (b) 콜라겐 피브릴의 형성을 가능하게 하는 충분한 시간 동안에 혼합물을 인큐베이팅(incubating)하는 단계;를 포함하고,
    가교제(cross-linking agent)가 상기 혼합하는 단계 (a) 동안에 추가되거나 또는 단계 (b)로부터 수득된 콜라겐 피브릴에 추가되는 것인, 생성방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혼합하는 단계 (a)는 pH 4 내지 pH 9의 pH를 갖는 용액을 생성하는 것인, 생성방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혼합하는 단계 (a)는 pH 7.4의 pH를 갖는 용액을 생성하는 것인, 생성방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 (b)는 4oC 내지 25oC의 온도에서 수행되는 것인, 생성방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 충분한 시간은 5분 내지 12 시간인 것인, 생성방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 충분한 시간은 5분 내지 60분인 것인, 생성방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 수성 중화 버퍼는 포스페이트계(phosphate-based)인 것인, 생성방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 가교제는 제니핀(genipin), 1,4-부탄디올 디글리시딜 에테르 (1,4-BDDGE), 또는 무코클로르산(mucochloric acid)으로부터 선택되는 것인, 생성방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 정제된 해파리 콜라겐의 용액은 콜라겐 공급원으로부터 효소 추출에 의해 정제된 것인, 생성방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 정제된 해파리 콜라겐의 용액은 콜라겐 공급원으로부터 산 추출(acid extraction)에 의해 정제된 것인, 생성방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 정제된 해파리 콜라겐의 용액은 바렐해파리(Rhizostomas pulmo), 숲뿌리해파리(Rhopilema esculentum), 로필레마 노마디카(Rhopilema nomadica), 대형해파리(Stomolophus meleagris), 아우렐리아 종(Aurelia sp.), 노무라입깃해파리(Nemopilema nomurai), 또는 이의 조합으로부터 정제된 것인, 생성방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 정제된 해파리 콜라겐의 용액은 바렐해파리로부터 정제된 것인, 생성방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의해 정의된 생성방법으로부터 수득 가능한 해파리 콜라겐 하이드로겔로서, 상기 해파리 콜라겐 하이드로겔은 세포 배양 조건하에서 25oC 내지 50oC의 온도에서 안정한, 해파리 콜라겐 하이드로겔.
  14. 제13항에 있어서, 상기 해파리 콜라겐 하이드로겔은 세포 배양 조건하에서 25oC 내지 37oC의 온도에서 안정한, 해파리 콜라겐 하이드로겔.
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  17. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의해 정의된 생성방법으로부터 수득 가능한 해파리 콜라겐 하이드로겔을 포함하는, 3D 세포 배양 스캐폴드.
  18. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 의해 정의된 생성방법으로부터 수득 가능한 해파리 콜라겐 하이드로겔을 포함하는 의료 장치.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 의료 장치는 상처 드레싱(wound dressing)인 것인, 의료 장치.
  20. 제13항에 기재된 해파리 콜라겐 하이드로겔을 포함하는 약물 전달 비히클.
  21. 삭제
  22. 제17항에 있어서,
    상기 3D 세포 배양 스캐폴드는 세포를 배양하기 위한, 3D 세포 배양 스캐폴드.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 세포는 간세포(hepatocyte), 근세포(myocyte), 심근세포(cardiocyte), 각질형성세포(keratinocyte), 지방세포(adipocyte), 뉴런(neuron), 신장세포(renal cell), 상피세포(epithelial cell), 신경교세포(glial cell), 호르몬-분비세포(hormone-secreting cell), 장벽 기능 세포(barrier function cell), 세포 외 기질세포(extracellular matrix cell), 수축세포(contractile cell), 수정체 세포(lens cell), 줄기세포, 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell), 혈액-유래 줄기세포(blood-derived stem cell), 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell), 또는 이의 조합으로 이루어진 목록(list)으로부터 선택된 1차 포유동물 세포(primary mammalian cell)인 것인, 3D 세포 배양 스캐폴드.
  24. 제22항에 있어서,
    (i) 상기 세포는 배양되어 약물 발견(drug discovery)에서 이용하기 위한 3D 세포 조직 구조체를 형성하거나;
    (ii) 상기 세포는 배양되어 각막 쉴드(corneal shield)를 형성하거나;
    (iii) 상기 세포는 배양되어 연골(cartilage)을 생성하거나;
    (iv) 상기 세포는 배양되어 뼈를 형성하거나; 또는
    (v) 상기 세포는 배양되어 뉴런을 형성하는 것인, 3D 세포 배양 스캐폴드.
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