JP5229769B2 - タンパク質フィルムの製造方法 - Google Patents
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Description
このようなタンパク質フィルムの製造方法としては、タンパク質の水溶液をシャーレ上に流延して乾燥するいわゆるキャスト法が知られている。
この成形物によれば、耐薬品性が向上したポリエステル成形物、およびセルロ−ス、絹、ウ−ル、綿等からなる成形物が得られる。
また、上記キャスト法は濃縮固化するので、フィルムの密度の調製も困難である。
さらに、上記キャスト法により得られるフィルムは、ポリペプチド鎖のβ構造化が不十分であったり、膜厚が薄すぎたりという原因から、水分を含むと、容易に変形してしまう傾向にある。
このため、タンパク質フィルムの濃度や圧力を調整することにより、得られるタンパク質フィルムの厚みや密度等を調整できる。
また、得られるタンパク質フィルムは、水分を含んでも殆ど変形しないものとなる。
また、挟圧の圧力を段階的に上昇させると、タンパク質の系全体に広がる分子鎖ネットワークが更に十分に形成される。
したがって、これらの方法によって得られるタンパク質フィルムは、より十分な密度と柔軟性を有し、機械強度にも優れるものとなる。
なお、図面中、同一要素には同一符号を付すこととし、重複する説明は省略する。
また、上下左右等の位置関係は、特に断らない限り、図面に示す位置関係に基づくものとする。
更に、図面の寸法比率は図示の比率に限られるものではない。
溶解工程は、節足動物が産出するタンパク質、水及び溶解促進剤を混合してタンパク質水溶液とする工程である。
よって、上記節足動物が産出するタンパク質としては、蜂又は蚕の幼虫が産出するタンパク質、クモ類が吐糸するタンパク質等が挙げられる。
すなわち、節足動物が産出するタンパク質が、蜂の幼虫が産出するタンパク質(ホーネットシルク)、蚕の幼虫が産出するタンパク質(絹フィブロイン、セリシン)であることが好ましい。
この場合、タンパク質の系全体に広がる分子鎖ネットワークが確実に形成されるので、十分な密度と柔軟性を有するものとなる。
また、かかる節足動物が産出するタンパク質の採取時期は、上記幼虫が体外へ分泌する前でも後でも良い。
すなわち、体内のタンパク質分泌器官から採取することも可能である。
これらの中でも、回収の容易さ等の観点から分泌後であることが好ましい。
この場合、後述する溶解促進剤及び水の混合液に溶解させ易くなる。
なお、尿素を用いる場合は、8M程度の濃度で用いるのがよい。
これらの中でも、溶解促進剤が無機塩であることが好ましく、臭化リチウムであることがより好ましい。
臭化リチウムは、安価で入手が容易であり、タンパク質を分解させることなく水に溶解させることができる。
これらの中でも、タンパク質フィルムに残存する不純物を減らす観点から、純水であることが好ましい。
タンパク質の含有割合が0.5質量%未満であると、含有割合が上記範囲内にある場合と比較して、十分な密度を有するタンパク質フィルムが得られない傾向にあり、タンパク質の含有割合が30質量%を超えると、タンパク質が水に溶けにくくなり、透析にも時間がかかる傾向にある。
溶解促進剤の濃度が5.0mol/l未満であると、含有割合が上記範囲内にある場合と比較して、タンパク質を十分に溶解できない傾向にあり、溶解促進剤の濃度が9.3mol/lを超えると、成形されるタンパク質フィルムに溶解促進剤が残存する傾向にある。
上記温度は、タンパク質の変性凝集(ゲル化とは違う、分子ネットワークがない)や分解が生じない範囲とすることが好ましく、具体的には4〜50℃の範囲とすることがより好ましい。
除去工程は、溶解工程で得られたタンパク質水溶液中の溶解促進剤を除去してタンパク質液を得る工程である。
これらの中でも、溶解促進剤の除去が透析により行われると、比較的容易に溶解促進剤を除去できるため好ましい。
そうすると、溶解促進剤が透析チューブの外側の水に移行するため、タンパク質水溶液中の溶解促進剤が除去される。
こうして、タンパク質水溶液から溶解促進剤が除かれたタンパク質液が得られる。
なお、透析チューブを備える透析装置は、特に限定されず、公知の装置が用いられる。
なお、上記ろ過は公知の方法で行えばよい。
上記温度は、タンパク質の変性凝集(ゲル化とは違う、分子ネットワークがない)や分解が生じない範囲とすることが好ましく、具体的には4〜50℃の範囲とすることがより好ましい。
ゲル化工程は、除去工程で得られたタンパク質液中のタンパク質をゲル化させる工程である。
なお、かかるゲル化工程は、タンパク質液が透析チューブに投入されたままの状態で行ってもよく、別の容器に移し替えて行ってもよい。
また、透析チューブを投入している容器の水にゲル化促進剤を加えることにより、タンパク質液中のタンパク質をゲル化させてもよい。
これらの中でも、酸性溶媒であることが好ましく、酢酸又は蟻酸であることがより好ましい。
これらは揮発性であるため、後の工程において、ゲル化促進剤を容易に除去できる。
また、安全性の観点から、ゲル化促進剤は酢酸であることがより好ましい。
酸濃度が高すぎると、酸の除去が困難になる傾向にある。
また、タンパク質が分解を起こす虞もある。
なお、ゲル化促進剤を加える代わりに、加熱したり、凍結融解してもよい。
そして、このゲルの持つ特徴を利用すれば、ゲルの構造を反映したタンパク質フィルムを成形することで、多種多様な用途に対応できる構造と物性を有するタンパク質フィルムの作製が可能となる。
フィルム成形工程は、ゲル化したタンパク質を含むタンパク質液を透水性の弾性容器に投入し、該弾性容器の両側面からろ紙等の吸水性材に挟んで挟圧することにより、タンパク質液中の水を強制的に排出させると共に、ゲル化したタンパク質をフィルム状に成形する工程である。
本実施形態に係るタンパク質フィルムの製造方法においては、かかる透水性の弾性容器として、除去工程において用いた透析チューブを用いる。
換言すると、本実施形態に係るタンパク質フィルムの製造方法においては、透水性の弾性容器と、透析チューブとが同一のものである。
この場合、タンパク質液を透析チューブから別の透水性の弾性容器に移し替えるという手間が省けるので、生産性が向上する。
かかる挟圧は、プレス装置を用いて行われる。
具体的には、一対のプレス間にタンパク質液を配置し、両側面からプレスする。
なお、かかる両側面は上下、左右等、いずれであってもよい。
この場合、減圧するとゴムシート11が多孔質板12に吸い付けられ、平板13が透析チューブ14を下方向に押す(加圧される)ことになる。
そうすると、ゲルが平板状に成形される。
このため、上記タンパク質フィルムの製造方法においては、水分を含んでも殆ど変形しないタンパク質フィルムが得られる。
なお、上述したゲル化促進剤はかかる工程にて除去される。
その中でも、かかる圧力は、100Pa以上であることが好ましく、1GPa以下であることがより好ましく、3.5〜41.3kPaであることが更に好ましい。
圧力が100Pa未満であると、圧力が上記範囲内にある場合と比較して、タンパク質フィルムの機械強度が不十分となる傾向にあり、圧力が1GPaを超えると、圧力が上記範囲内にある場合と比較して、柔軟性が低下する傾向にある。
換言すると、挟圧を、低圧の状態から初め、その後、圧力を徐々に上昇させ、最終的に所望の圧力とすることが好ましい。
この場合、弾性容器(透析チューブ)の破損が抑制されると共に、タンパク質の系全体に広がる分子鎖ネットワークが十分に形成されたタンパク質フィルムが成形される。
低圧のまま放置すると、フィルム化に時間がかかるだけでなく、ゲルの収縮が起こり、フィルムの平滑化が妨げられる等、良質のフィルムが得られなくなるという問題が生じる。
この場合、タンパク質の系全体に広がる分子鎖ネットワークを更に成長させることができる。
これにより、より効率的に水を排出させることができる。
また、これらの水の排出は、得られるタンパク質フィルムの水含有割合が全量の10質量%未満となるまで行われることが好ましい。
また、上記フィルム成形工程によれば、透水性の弾性容器(透析チューブ)が加圧によるゲルの広がりを抑制するので、厚さの厚いフィルムの作製を可能にする等、フィルム厚のコントロールがより容易となる。
例えば、弾性容器の材質としては、再生セルロース、酢酸セルロースのようなセルロース由来の透水性材料、ポリメチルメタクリレート、エチレンビニルアルコール共重合体、ポリアクリロニトリル、ポリスルホンなどの合成高分子からなる透水性材料等が挙げられる。
本実施形態に係るタンパク質フィルムの製造方法によれば、使用用途に応じて厚みや密度等を調整することができる。
例えば、上記タンパク質フィルムは、適度な分子鎖ネットワークを形成することにより、乾燥後に再び水中に浸漬しても形状が崩れないものとなる。
すなわち、かかるタンパク質フィルムは、吸湿しても形状が乱れることはなく、乾燥することで元の透明なタンパク質フィルムに戻る。
このことから、上記タンパク質フィルムは、オートクレーブ滅菌によっても物性の低下がほとんど起こらない。
これによって、吸湿状態では容易にフィルムを切断することができ、任意の形に変形させることも可能となる。
具体的には、上記の方法によって得られた厚さ50μmのタンパク質フィルムは、室温の水中にて数分浸漬することで十分に柔軟になり、ハサミやカッターナイフで任意の形状に切断することが可能である。
図2に示す本発明のタンパク質フィルム100は、十分な密度と柔軟性を有し、水分を含んでも殆ど変形しないものである。
引っ張り弾性率が30MPa未満であると、引っ張り弾性率が上記範囲内にある場合と比較して、フィルムが軟弱となり、ハサミで切るなどの操作が困難になる傾向にあり、引っ張り弾性が300MPaを超えると、引っ張り弾性率が上記範囲内にある場合と比較して、剛直となるため、柔軟性が必要とされる生体医療材料等の使用が困難になる傾向にある。
すなわち、この場合、除去工程がゲル化工程を兼ねることになる。
なお、この場合、タンパク質液を所定期間放置し、タンパク質のゲルを成長させることが好ましい。
[溶解工程]
7mol/lの臭化リチウム水溶液(溶解促進剤)20mlにキイロスズメバチの巣から取り出した繭(ホーネットシルク)400mgを加え、35℃で15分間攪拌し、木くずとワックス成分を濾別することにより、ホーネットシルク(タンパク質)が完全に溶解したタンパク質水溶液を得た。
次いで、得られたタンパク質水溶液をセルロースチューブ(透析チューブ)(商品名:シームレスセルロースチューブ、和光純薬社製)に入れ、2日間蒸留水で透析することにより、臭化リチウムが除去されたタンパク質液を得た。
また、このとき、タンパク質液中に、ホーネットシルクのゲルが生成していた(ゲル化工程)。
得られたホーネットシルクのゲルの状態の写真を図3に示す。
次いで、ホーネットシルクのゲルが内在するセルロースチューブを吸水紙で挟み、セルロースチューブの両側面から挟圧した。
まず、3.5kPa、温度25℃で12時間放置した後、40kPaで2日間更に放置した。
そして、この挟圧した状態を維持したまま、3日間放置した。
そうすると、白濁していたホーネットシルクのゲルはしだいに透明になり、厚みが50μmの透明なフィルムを得た。
なお、挟圧乾燥時のホーネットシルクの写真を図4に示す。
[溶解工程]
9mol/lの臭化リチウム水溶液(溶解促進剤)20mlに精練済み絹フィブロイン400mgを加え、45℃で半日間攪拌することにより、絹フィブロインが完全に溶解したタンパク質水溶液を得た。
次いで、得られたタンパク質水溶液を、透析装置のセルロースチューブに入れ、4日間蒸留水で透析することにより、臭化リチウムが除去されたタンパク質液を得た。
次いで、得られたタンパク質液をセルロールチューブに入れたまま、7日間放置すると、絹フィブロインの一部がゲル化した。
そして、セルロールチューブごと、酢酸水溶液(水で10倍希釈したもの)に浸漬させ、半日間放置し、絹フィブロインのゲルを成長させた。
次いで、絹フィブロインのゲルが内在するセルロースチューブを吸水紙で挟み、プレス装置に配置し、セルロースチューブの両側面から挟圧した。
まず、3.5kPa、温度25℃で12時間放置した後、次いで40kPaで2日間放置した。
そして、この挟圧した状態を維持したまま、3日間放置した。
そうすると、白濁していた絹フィブロインのゲルはしだいに透明になり、厚みが50μmのフィルムを得た。
[溶解工程]
まず、蚕の繭からセリシンを取り出す方法として、80℃の8M尿素水溶液を用いて、セリシンを繭から溶出させ、溶液の3倍量のエタノールを加えて溶出セリシンを沈殿させ、セリシンを回収した。
次いで、9mol/lの臭化リチウム水溶液(溶解促進剤)20mlにセリシン400mgを加え、40℃で12時間攪拌することにより、セリシンが完全に溶解したタンパク質水溶液を得た。
次いで、得られたタンパク質水溶液を、透析装置のセルロースチューブに入れ、4日間蒸留水で透析することにより、臭化リチウムが除去されたタンパク質液を得た。
また、このとき、タンパク質液中に、セリシンのゲルが生成していた(ゲル化工程)。
次いで、セリシンのゲルが内在するセルロースチューブを吸水紙で挟み、プレス装置に配置し、セルロースチューブの両側面から挟圧した。
まず、3.5kPa、温度25℃で12時間放置した後、次いで40kPaで2日間放置した。
そして、この挟圧した状態を維持したまま、3日間放置した。
そうすると、白濁していたセリシンのゲルはしだいに透明になり、厚みが50μmの透明なフィルムを得た。
得られたセリシンフィルムを図5に示し、セリシンフィルムの乾燥状態の写真を図6の(a)に、湿潤状態の写真を図6の(b)にそれぞれ示す。
実施例1の除去工程を経たタンパク質溶液を、凍結乾燥して得た粉末を、1,1,1,3,3,3−ヘキサフルオロ−2−プロパノール(HFIP)(東京化成製)に溶解した(ホーネットシルク200mgに対してHFIP20ml)。
この溶液をプラスチックシャーレ(商品名:Bio―BIK、オプティカ社製〕に流延した。
そして、室温にて2日間静置し、HFIP溶媒を蒸発させることにより、透明なフィルムを得た。
実施例2の除去工程を経たタンパク質溶液(ゲル化する前の状態)を、比較例1と同様にして、プラスチックシャーレに流延した。
そして、室温にて2日間静置し、溶媒を蒸発させることにより、透明なフィルムを得た。
セリシン蚕の繭を9M臭化リチウム水溶液に溶解し、透析によって臭化リチウムを除去したセリシン水溶液をプラスチックシャーレに流延した。
そして、室温にて2日間静置し、水分を蒸発させることにより、透明なフィルムを得た。
[形状安定性]
1.寸法変化
実施例1〜3及び比較例1〜3で得られたフィルムを水中に30分間浸漬させた。このときの実施例1で得られたホーネットシルクフィルムの浸漬後の写真を図7に示す。
また、湿潤時のフィルムの体積変化を測定した。
得られた結果を表1に示す。
表1中、「シルク濃度」は、9mol/lの臭化リチウム水溶液100mg(V)中に溶解したシルクの重量(W)から求められ、「長さ変化率」は、
湿潤時のフィルムの長手方向の長さ×100/乾燥時のフィルムの長手方向の長さ
から求められ、「厚さ変化率」は、
湿潤時のフィルムの厚さ×100/乾燥時のフィルムの厚さ
から求められる。
なお、比較例1〜3のキャスト法においては、浸漬させるとフィルムの形態を維持できなかったので、測定できなかった。
実施例1及び比較例1で得られたフィルムの湿潤時と乾燥時の赤外吸収スペクトルを、フーリエ変換赤外分光装置(FT−IR)(日本分光社製)を用いて測定した。
得られた結果を図8に示す。
図8の(a)は比較例1で得られたフィルムの赤外吸収スペクトルを示し、(b)は実施例1で得られたフィルムの赤外吸収スペクトルを示す。
また、図8の(a)及び(b)中、Xは乾燥時の赤外吸収スペクトルを示し、Yは湿潤時の赤外吸収スペクトルを示す。
実施例1で得られたフィルムの湿潤時と乾燥時の13C−NMRスペクトルを、Infinity 300NMR装置(Varian−Chemagnetics社製)を用いて測定した。
得られた結果を図9に示す。
図9の(a)は、乾燥時の13C−NMRスペクトルを示し、Yは湿潤時の13C−NMRスペクトルを示す。
実施例1で得られたフィルムにオートクレーブにより120℃、20分間の水蒸気滅菌処理を施した。
水蒸気滅菌処理前後のタンパク質のバンドを図10に示す。
図10の(a)は、滅菌処理後のタンパク質のバンドを示し、(b)は、滅菌処理前のタンパク質のバンドを示す。
一方、比較例1〜3のフィルムは、湿潤させると溶解してしまい、十分に形態を維持できなかった。
また、赤外吸収スペクトルにおいて、1650cm−1はヘリックスもしくはランダム構造に由来し、1610cm−1はβシート構造に由来する吸収であるところ、実施例1〜3のフィルムは、二次構造の変化が殆ど起こらない。
一方、比較例1〜3のフィルムは、二次構造が大きく変化した。
実施例1〜3のフィルムにおいて、吸湿による二次構造変化を示さなかったことが、水中にフィルムを浸漬しても形状が乱れなかったことに起因すると考えられる。
さらに、13C−NMRスペクトルにおいて、水を吸収するとピークがシャープになり、分子の運動性が向上したことを示唆している。
水を吸収することによるフィルムの柔軟化は、分子の運動性が向上することに起因していると考えられる。
さらにまた、水蒸気滅菌処理を施しても、タンパク質は分解されず、十分な安定性を有することが確認された。
12…多孔質板
13…平板
14…透析チューブ
100…タンパク質フィルム
Claims (7)
- 節足動物が産出するタンパク質、水及び溶解促進剤を混合してタンパク質水溶液とする溶解工程と、
前記タンパク質水溶液中の前記溶解促進剤を除去してタンパク質液を得る除去工程と、
前記タンパク質液中のタンパク質をゲル化させるゲル化工程と、
前記ゲル化したタンパク質を含むタンパク質液を透水性の弾性容器に投入し、前記弾性容器の両側面から挟圧することにより、前記タンパク質液中の水を強制的に排出させると共に、前記ゲル化したタンパク質をフィルム状に成形するフィルム成形工程と、
を備え、
前記節足動物が、蜂、蚕又はクモ類であることを特徴とするタンパク質フィルムの製造方法。 - 前記挟圧の圧力が100Pa以上であることを特徴とする請求項1記載のタンパク質フィルムの製造方法。
- 前記挟圧の圧力を段階的に上昇させることを特徴とする請求項1記載のタンパク質フィルムの製造方法。
- 前記タンパク質水溶液全量に対するタンパク質の含有割合が0.5〜30質量%であることを特徴とする請求項1記載のタンパク質フィルムの製造方法。
- 前記除去工程において、前記溶解促進剤の除去が透析により行われることを特徴とする請求項1記載のタンパク質の製造方法。
- 前記透析が、前記タンパク質水溶液を透析チューブに投入して行われ、
前記透析チューブと、前記弾性容器とが同一のものであることを特徴とする請求項5記載のタンパク質フィルムの製造方法。 - 前記挟圧が、減圧による吸引力で行われることを特徴とする請求項1のタンパク質フィルムの製造方法。
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