CN102475919A

CN102475919A - 一种去细胞生物组织材料肝素涂层的制备方法

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Publication number: CN102475919A
Application number: CN2010105634486A
Authority: CN
Inventors: 陶运明; 吴忠仕
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-11-29
Filing date: 2010-11-29
Publication date: 2012-05-30
Anticipated expiration: 2030-11-29
Also published as: CN102475919B

Abstract

本发明涉及到一种用肝素修饰去细胞生物组织材料的制备方法。本发明所采用的材料主要是用于心血管以及其他组织修复的生物组织材料，包括各种异种动物血管壁、心包组织、硬脑膜，肠粘膜下层等。本发明提供的使用肝素修饰用于体内组织重建和再生的异种去细胞生物组织材料的制备方法，肝素涂层后的生物组织材料具有良好的生物相容性，具有免疫原性低，无细胞毒性，抗血栓，抗钙化，抗吻合口狭窄，有利于组织重建和宿主内皮细胞再生等良好性能。

Description

一种去细胞生物组织材料肝素涂层的制备方法

技术领域

本发明涉及到一种用肝素修饰去细胞生物组织材料的制备方法。

背景技术

血管移植在心血管疾病、肿瘤、创伤、器官移植再造和显微外科等领域得到广泛的应用，常用的移植替代血管包括自体血管(自体动脉和自体静脉)、同种异体管道和人工合成材料管道。自体血管和同种异体管道是较为理想的替代血管，但是来源有限。自体静脉血管供应相对多一些，但是其血管弹性较差，易于形成血栓和动脉瘤。而且部分患者合并有静脉曲张和动脉粥样硬化，也影响了自体血管的应用。人工合成材料供应丰富，但小口径血管移植物术后通畅率低，限制其临床使用。

去细胞异种血管作为替代血管是另一种选择，采用组织工程学技术构建心血管修复材料是当今医学及材料学领域的主要研究方向之一。采用去细胞生物组织材料作为心血管组织工程支架受到研究者们的青睐。这种去细胞血管及瓣膜支架具有以下特点：容易获取、良好的形态结构、保留了维持机械性能和有利于细胞附着的细胞外基质成分。然而，目前临床应用的材料均存在诸多缺陷，如血栓、钙化、吻合口狭窄等。

肝素具有抗血栓、抗平滑肌细胞增生(平滑肌细胞增生导致吻合口狭窄)、抗感染和调节各种生长因子的功能，促进血管内皮化和体内再生。目前国内外用于将肝素固定与生物组织材料表面的方法比较多：(1)使用戊二醛作为交联剂，将肝素与生物组织材料表面的共价交联，其缺点是肝素的结合量少，且交联剂戊二醛处理生物组织材料存在很多缺陷(醛基的存在，交联后组织易钙化；细胞毒性作用，在机体内缓慢释放不利于宿主内皮细胞在材料表面的增殖和生长)，而限制了其的应用；(2)使用EDC/NSH作为交联剂，以共价键结合的形式，将肝素固定与生物组织材料的表面，但是其缺点是肝素结合量少，且EDC/NSH本身改变了生物组织材料的免疫原性，促进了血小板、巨噬细胞、单核细胞的粘附，不利于抗血栓；(3)使用壳聚糖作为交联剂，以静电吸附将肝素吸附在生物组织材料表面，其缺点是壳聚糖与生物组织材料结合力弱，且壳聚糖具有溶胀性和溶解性，肝素和壳聚糖在材料表面保存时间短，不能达到理想的抗凝作用；(4)使用鱼精蛋白作为交联剂，通过静电吸附作用，将肝素固定与生物组织材料表面，其缺点是鱼精蛋白本生与生物组织材料结合能力力弱，肝素在材料表面保存时间很短，达不到有效的抗凝作用。

改进肝素在材料表面的有效、牢固的固定技术，是提高抗血栓、抗平滑肌细胞增生、抗感染和促进内皮化的重要环节。

发明内容

本发明的目的是提供一种将肝素修饰在去细胞生物组织材料表面的方法。

本发明提供的技术方案包括如下步骤：

a.材料预处理：用肝素或低分子肝素溶液浸泡去细胞生物组织材料，再清洗干净；

b.材料二羟基铁(Ⅲ)离子化处理：用二羟基铁(Ⅲ)离子溶液浸泡a步骤处理后的去细胞生物组织材料，再清洗干净；

c.材料肝素涂层制备：再次用肝素或低分子肝素溶液浸泡b步骤处理后的去细胞生物组织材料；重复b、c步骤数次。

肝素是富含磺酸根的带负电荷的直链生物大分子化合物，是一类结构异常复杂的粘多糖，具有抗凝血、抗血栓生成、抗平滑肌细胞增殖、抗炎症等功能。肝素的精确结构还不清楚。一般认为它是由α-L-艾杜糖醛酸-2-硫酸酯、N-磺基-α-D-氨基葡萄6-硫酸酯、β-D-葡萄醛酸和N-磺基-α-D-氨基葡萄糖-6-硫酸酯由糖苷键连接成“四糖”作为结构单元，再由“四糖”聚合成多糖。在一个肝素分子上就含有大量的羧基、羟基、氨基、磺酸基等基团。

铁离子是机体必需的微量元素，对机体无毒副作用，有文献报道利用三价铁离子溶液预处理生物材料增强其抗钙化的作用。

一个铁离子和六个水分子形成配合物，向水合铁离子中加入碱(OH^-)能够中和电离出来的氢离子(H⁺)，配位的水分子就相应的分解，从而在铁离子上产生更多的羟基使溶液变深，最终变成红褐色的氢氧化铁。本实验将NaOH溶液缓慢加入FeCl₃溶液中，按摩尔比Fe³⁺∶OH^-＝1∶2混合后，形成二羟基铁(Ⅲ)离子([Fe(OH)₂]⁺)溶液。其水解方程式为：

[Fe(H₂O)₆]³⁺+2OH^-＝[Fe(OH)₂(H₂O)₄]⁺+2H₂O。

带正电荷的二羟基铁(Ⅲ)离子能够和肝素分子中的磺酸根、羧酸根结合，通过离子键形成难解离的铁盐；铁(Ⅲ)离子能够提供多个空轨道，可以和多个提供孤对电子的配体通过配位键形成螯合物，所以二羟基铁(Ⅲ)离子还能够与肝素分子中提供孤对电子的基团(羧基、磺酸基、羟基、氨基)通过静电力、配位键结合，形成肝素/二羟基铁(Ⅲ)螯合物。

去细胞血管材料的内膜表面主要是基底膜成分，富含Ⅳ型胶原纤维、纤连蛋白、层粘连蛋白、氨基聚糖和蛋白聚糖；中膜和外膜富含胶原纤维、弹力纤维、氨基聚糖和蛋白聚糖。其中GAG和蛋白聚糖含有大量的氨基己糖、己糖醛酸和硫酸根，层粘连蛋白含有肝素结合位点，同时胶原纤维等蛋白质富含氨基、羧基、羟基等基团。所以二羟基铁(Ⅲ)离子能够通过离子键、配位键、和静电力等多种作用力与去细胞生物组织材料结合。

肝素在去细胞血管材料涂层原理：首先利用去细胞生物组织材料富含有羧基、羟基、氨基、磺酸基等基团，将二羟基铁(Ⅲ)固定在其表面；再以二羟基铁(Ⅲ)作为桥基团，将肝素固定在材料的表面；利用肝素分子富含有羧基、羟基、氨基、磺酸基等基团，再将二羟基铁(Ⅲ)固定在肝素的表面；通过肝素/二羟基铁(Ⅲ)层层自组装，反复数次，将大量肝素固定在去细胞生物组织材料的表面。

国内外现有的公开技术中，还没有利用生物组织材料所含基团将肝素/二羟基铁(Ⅲ)修饰生物组织材料表面的报道。

本发明的关键点主要有：a、利用肝素分子上的羧基、羟基、胺基、磺酸基等基团与二羟基铁离子之间能够形成强有力的作用力，形成具有抗凝并缓慢释放的肝素/二羟基铁(Ⅲ)复合材料涂层；b、充分利用生物组织材料中富含胶原纤维、纤连蛋白、层粘连蛋白、氨基聚糖和蛋白聚糖中的羧基、羟基、胺基、磺酸基和硫酸根等基团，通过二羟基铁离子将外源性的肝素牢固的固定与去生物材料表面；c、肝素/二羟基铁离子通过层层自组装，多次重复的将肝素紧密的牢固在生物组织材料表面。

根据本发明的实施例，具体采取的操作如下：

a、使用浓度为1％～10％肝素(含1％～5％的氯化钠)预处理生物组织材料，处理的温度为0～20℃，处理的时间为1～48小时，处理完成后，用PBS液反复冲洗生物组织材料3次，每次5分钟；

b、制备1％～10％的二羟基铁(Ⅲ)离子([Fe(OH)2]⁺)溶液：用去离子水溶解FeCl₃·6H₂O；在磁力搅拌的条件下，按Fe³⁺∶OH^-摩尔比1∶2，将NaOH溶液缓慢滴入FeCl₃溶液中，再加入适量的水调整二羟基(Ⅲ)铁离子的浓度，制备pH值3.0质量浓度在1～20g/L之间的二羟基(Ⅲ)铁离子溶液。

c、使用1％～10％的二羟基铁(Ⅲ)离子溶液处理生物组织材料，处理的温度为0～20℃，处理的时间为3～10分钟，处理完成后，用PBS液反复冲洗生物组织材料3次，每次5分钟；

d、用1％～10％肝素(含1％～5％的氯化钠)处理生物组织材料，处理的温度为0～20℃，处理的时间为3～10分钟，处理完成后，用PBS液反复冲洗生物组织材料3次，每次5分钟；

e、重复步骤c和步骤d，反复3～10次；

f、肝素涂层材料置入1％～10％肝素钠(含1％～5％的氯化钠)中保存，保存温度为0～4℃。

上述步骤中，肝素溶液以及二羟基铁离子溶液的浓度对最终生物材料处理效果影响不大。浓度低，需要处理的时间就长些。

本发明所采用的材料主要是用于心血管以及其他组织修复的生物组织材料，包括各种异种动物血管壁、心包组织、硬脑膜，肠粘膜下层等。

本发明提供的使用肝素修饰用于体内组织重建和再生的异种去细胞生物组织材料的制备方法，肝素涂层后的生物组织材料具有良好的生物相容性，具有免疫原性低，无细胞毒性，抗血栓，抗钙化，抗吻合口狭窄，有利于组织重建和宿主内皮细胞再生等良好性能。

附图说明

图1A.未经肝素涂层BJV外观；B.肝素涂层BJV外观。

图2A.未经肝素涂层BJV切片甲苯胺蓝染色；B.肝素涂层BJV切片甲苯胺蓝染色。

图3A.未经肝素涂层BJV内膜表面扫描电镜照片；B.肝素涂层BJV表面层层自组装4次，内膜表面扫描电镜照片。

图4肝素涂层血管片在PBS中肝素释放曲线。

图5A.未经肝素涂层BJV表面有散在的血小板粘附和血小板团聚；B.肝素涂层BJV，表面偶见血小板粘附。

图6A、B、C、D分别是EA.hy926内皮细胞第1天、第3天、第5天、第7天在未经肝素涂层BJV内膜表面的增殖情况；E、F、G、H分别是EA.hy926内皮细胞第1天、第3天、第5天、第7天在肝素涂层BJV内膜表面的增殖情况。

具体实施例

实施例1

肝素涂层牛颈静脉(BJV)材料制备及肝素结合量测定

方法：(1)采集本地BJV 20根，每根分成2段，一段用于去细胞光氧化BJV(DP-BJV)、另一段用于去细胞光氧化后肝素涂层BJV(LBL-BJV)。去细胞光氧化采用CN100443064C专利方法制备：取材质量300～500kg健康水牛，热缺血时间30min内取出牛颈静脉，无菌条件下去除筋膜组织。置入0.5％曲那通X-100的PBS(pH 7.4)液浸泡48小时，再置入0.025％胰蛋白酶及0.02％EDTA的PBS溶液浸泡30分钟，PBS冲洗3次，然后置入含20μg/ml DNase·I及0.2mg/ml RNase·A的PBS溶液中24小时，PBS液冲洗3次.以上处理在震荡频率为75rpm、温度37℃的摇床进行。亚甲基蓝溶液平衡后，1000W白炽灯照射进行光氧化48小时。。

(2)肝素涂层BJV的制备：使用浓度为1％～10％肝素(含1％～5％的氯化钠)浸泡去细胞光氧化BJV，在0～4℃条件下浸泡1～48h。生理盐水漂洗3次后，1％～10％的二羟基铁(Ⅲ)溶液浸泡3～10min；生理盐水清洗3次，每次5min，用1％～10％肝素(含1％～5％的氯化钠)浸泡3～10min，生理盐水清洗3次，每次5min；重复上述步骤3～10次。

(3)分别采用甲苯胺蓝比色法和原子吸收火焰法检测二羟基铁溶液和肝素溶液浸泡BJV后溶液中残余的肝素和铁浓度，计算每层每平方厘米BJV结合肝素和二羟基铁的量。

(4)各组血管均置入1％～10％肝素钠(含1％～5％的氯化钠)中保存，保存温度为0～4℃。

结果：经肝素涂层后的BJV，表面呈现金黄色(见图1)，血管(特别是血管的瓣膜)的外形、柔韧性以及质地无明显的改变。

预处理过程中肝素的吸附量796±37ug·cm^-2，层层自组装涂层过程中每层固定肝素和二羟基铁的量分别是808±86ug·cm^-2和297±65ug·cm^-2。

结论：经过肝素/二羟基铁涂层后，有大量肝素固定在生物组织材料的表面。

实施例2

肝素涂层BJV材料电镜检测和甲苯胺蓝染色检测

方法：采集本地BJV 10根，每根分成2段，随机分成去细胞光氧化组、去细胞光氧化肝素涂层组，所有试验用BJV均距离瓣窦1cm以上裁剪成血管片(1cm×1cm)。去细胞光氧化方法同实施例1。肝素涂层BJV的制备：使用浓度为5％肝素(含2％氯化钠)浸泡去细胞光氧化BJV，在0～4℃条件下浸泡24h。生理盐水漂洗3次后，5％的二羟基铁(Ⅲ)溶液浸泡5min；生理盐水清洗3次，每次5min，用5％肝素(含2％的氯化钠)浸泡5min，生理盐水清洗3次，每次5min；重复上述步骤4次。

取肝素涂层血管片和未处理血管片(1cm×1cm)各5片，经4％甲醛固定后，乙醇梯度脱水，石蜡包埋并切片，脱蜡至水后用0.1％甲苯胺蓝溶液染色5min，脱水、中性树胶封片后光学显微镜观察。

取肝素涂层血管片和未处理血管片(1cm×1cm)各5片，在4％的戊二醛溶液中固定24h，1％锇酸后固定2小时，依次用50％、70％、90％、100％丙酮梯度脱水，每次10min，再依次用50％、70％、90％、100％醋酸异戊酯置换。临界点干燥仪干燥，喷金后JEOL-6409LV扫描电镜检测BJV表面获取图像。

结果：甲苯胺蓝染色(见图2)：LBL-BJV切片的内、外膜表面均被甲苯胺蓝染料深染，DP-BJV没有看到类似现象。

电镜检测结果(见图3)：肝素是紧密包裹在胶原纤维的表面；肝素涂层对BJV微结构没有明显的影响。

结论：经过肝素/二羟基铁(Ⅲ)涂层后，有大量肝素被固定在生物组织材料胶原纤维的表面。

实施例3

肝素涂层牛颈静脉(BJV)材料生物力学性能检测

方法：采集本地BJV20根，每根BJV在距离瓣窦1cm以上处横行裁剪血管条(4cm×1cm)两片(两血管片相邻)，分成去细胞光氧化组和肝素涂层组，每组20片(去细胞光氧化和肝素涂层方法同实施例2)。使用INSTRON拉力机检测两组血管条的生物力学性能。

结果：检测结果见表1。肝素涂层BJV的抗张强度增高，弹性模量、最大载荷和最大拉伸应力与去细胞光氧化BJV相比均有明显提高。

表1拉力检测结果

提示两组在统计学上有显著差异(P＜0.05)。

结论：肝素涂层处理后，提高了生物组织材料的生物力学性能。

实施例4

肝素涂层稳定性检测

方法：采集本地BJV，所有试验用BJV均距离瓣窦1cm以上裁剪血管片(1cm×1cm)(n＝10)，去细胞光氧化后肝素/二羟基铁在血管片层层自组装涂层6次(去细胞光氧化、肝素涂层、计算肝素结合量的方法同实施例1)。将肝素涂层BJV血管片浸泡在20mlPBS液中，37℃恒温摇床以80rpm的速度振摇。分别在1d、1周、2周、4周和5周时取50ulPBS液，采用甲苯胺蓝比色法检测样本中肝素的浓度，计算PBS液中肝素的释放量。

结果：经5周浸泡振摇，血管片表面仍为金黄色，提示血管片仍含有大量的肝素。在1d，1w，2w，3w，4w，5w肝素的释放量分别是281±43ug·cm^-2、422±60ug·cm^-2、854±81ug·cm^-2、1253±116ug·cm^-2、1618±187ug·cm^-2和1945±268ug·cm^-2(释放曲线见图4)，肝素的释放量与结合量之比分别约为5.1％、7.7％、15.5％、22.8％、29.4％和35.4％。

结论：生物组织材料经肝素涂层后，肝素与材料表面结合稳定，在PBS中是均匀的缓释肝素。

实施例5

肝素涂层BJV材料的抗凝血活性检测

方法：采集本地BJV 10根，每根分去细胞光氧化(DP)组、肝素涂层(LBL)组2段(去细胞光氧化、肝素涂层方法同实施例2)，均距离瓣窦1cm以上裁剪血管片(1cm×1cm)。取去细胞光氧化组、肝素涂层洗脱1天(LBL-1d)组(浸泡洗脱方法同实施例4)、肝素涂层洗脱1周(LBL-1w)组、肝素涂层洗脱2周(LBL-2w)组、肝素涂层洗脱3周(LBL-3w)组、肝素涂层洗脱4周(LBL-4w)组，共6组，每组10片。每片分别浸泡在2ml枸橼酸钠抗凝新鲜血中，37℃条件下孵育60min后取出血管片，3000rpm离心15min得血浆，按照凝血酶原时间(PT)、部分活化凝血酶原时间(APTT)试剂盒说明，用自动血凝仪检测样本的PT和APTT值。

结果：肝素涂层各组与血液接触了60min后，PT和APTT均大于正常值，而去细胞光氧化组在正常值范围，结果见表2。

表2.DP-BJV血管片和经PBS洗脱后不同时间段LBL-BJV血管片的抗凝血活性

(DP组与LBL经PBS洗脱后不同时间段各组分别行ANOVA分析，均P＜0.01)

结论：肝素与材料结合后仍有良好的生物活性，肝素涂层BJV具有优良的抗凝血活性。

实施例6

肝素涂层BJV材料的血液相容性检测

方法：采集本地BJV 10根，每根分新鲜组、去细胞光氧化组、去细胞光氧化肝素涂层组3段(实施方法同实施例2)，所有试验用BJV均距离瓣窦1cm以上处裁剪血管片(1cm×1cm)，取新鲜组、去细胞光氧化组、肝素涂层组血管片各10片。将8ml枸橼酸钠抗凝新鲜血加9g/L氯化钠溶液10ml稀释。待测样品与氯化钠溶液(9g/L)10ml37℃孵育30min，再加稀释血0.2ml，保温60min，850rpm离心5min。用波长545nm测上清吸光度(A)值，按文献方法计算材料的溶血度。评判标准：溶血度大于5％时，可判断该材料具有溶血作用。

结果：肝素涂层组与血液接触了30min后，溶血度为(0.13±0.01)％，而新鲜组和去细胞光氧化组溶血度也相近似，远远小于国家规定的标准5％。

结论：生物组织材料经肝素涂层后的材料具有很好血液相容性能。

实施例7

肝素涂层BJV材料的抗血小板粘附性能检测

方法：采集本地BJV 6根，每根分成2段，去细胞光氧化组、去细胞光氧化肝素涂层组(方法同实施例2)，所用BJV均距离瓣窦1cm以上处裁剪成血管片(1cm×1cm)。取去细胞光氧化组、肝素涂层组血管片各6片。将新鲜抗凝人血800rpm离心15min得富血小板血浆，每个血管片浸入1ml血浆中，在37℃、5％CO₂条件下，培养箱中孵育3h，PBS液冲洗后，4％戊二醛固定30min，PBS液冲洗，50％、70％、90％、100％乙醇梯度脱水，10min/次，真空干燥、喷金后用扫描电镜观察。

结果：去细胞光氧化组血管片可见血小板粘附、聚集，并有血小板碎片；而肝素涂层组表面上偶见血小板聚集和粘附(见图5)。

结论：生物组织材料经肝素涂层处理后，具有明显的抗血小板粘附性能和抗凝血作用。

实施例8

肝素涂层BJV材料的抗钙化性能研究

方法：采集本地牛颈静脉10根，每根分成新鲜组、0.625％戊二醛固定组(0.625％戊二醛24h)、去细胞光氧化组、肝素涂层组4段(实施方法同实施例2)，所用BJV均距离瓣窦1cm以上处裁剪成血管片(1cm×1cm)，每组取10片。选择离乳的雄性SD大鼠10只(中南大学动物部提供)，皮下对称包埋，饲养60天后获取标本，原子分光光度计检测标本中钙含量。

结果：戊二醛固定组血管片中钙含量最高，肝素涂层组含量最低。结果见表4。

表4，不同技术处理的血管片经皮下包埋后检测钙含量

(P＜0.001，有显著统计学差异)

结论：肝素涂层的生物组织材料的具有良好的抗钙化性能。

实施例9

肝素涂层BJV材料对内皮细胞粘附增殖性能影响

方法：采集本地牛颈静脉，均距离瓣窦1cm以上处裁剪1cm×1cm的血管片，经去细胞光氧化和肝素涂层处理(方法同实施例2)后，取去细胞光氧化组、肝素涂层两组血管片(n＝24)，经γ射线20KGy照射后，置于48孔培养板内，选用EA.hy926内皮细胞系，每孔加入1ml细胞密度为1×10⁵/ml细胞悬液(10％胎牛血清DMEM培养液)，置于CO₂培养箱(37℃，5％CO₂，90％相对湿度)中孵育。分别在1d，3d，5d，7d取出血管片(每组每次6个样本)，经DioC₁₈细胞膜荧光染料染色10min后，荧光显微镜观察内皮细胞在血管片表面的粘附、增殖情况。

结果：EA.hy926内皮细胞能在BJV血管片上粘附、增殖。经1天培养后DP-BJV组内膜表面的细胞数明显较LBL-BJV组多，培养3天时两组细胞数相近，培养5天后LBL-BJV组内膜表面的细胞数超过DP-BJV组(见图6)。

结论：肝素涂层后生物组织材料适合人内皮细胞生长。

Claims

1.一种将肝素修饰在去细胞生物组织材料表面的方法，其特征在于包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的将肝素修饰在去细胞生物组织材料表面的方法，其特征在于包括如下步骤：

a、使用含1％～5％的氯化钠浓度为1％～10％肝素预处理生物组织材料，处理的温度为0～20℃，处理的时间为1～48小时，处理完成后，用PBS液反复冲洗生物组织材料3次，每次5分钟；

d、用含1％～5％氯化钠的1％～10％肝素溶液处理生物组织材料，处理的温度为0～20℃，处理的时间为3～10分钟，处理完成后，用PBS液反复冲洗生物组织材料3次，每次5分钟；

e、重复步骤c和步骤d，反复3～10次；

f、肝素涂层材料置入含1％～5％氯化钠的1％～10％肝素钠溶液中保存，保存温度为0～4℃。