CN101156970A - 超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明以重氮树脂或多价金属离子溶液为交联剂，通过静电吸引层层自组装技术制备超稳定的血管内支架抗凝血涂层，使其具有良好血液相容性和组织相容性。本发明是这样实现的：a.血管内支架表面清洗：用几种有机溶剂分别超声清洗1～120min，然后，用水漂洗干净。b.氧化处理：H₂O₂煮沸1～120min，清水漂洗；KOH溶液蚀刻1～120min，大量清水冲洗干净。c.抗凝血涂层制备：将带正电的重氮树脂和具有抗凝血活性的聚合物和/或其它聚阴离子溶液通过静电吸引作用交替沉积到材料的表面上，利用紫外光或可见光照射材料表面涂层，通过光化学反应使涂层内层间的离子键转变成共价键，得到超稳定的抗凝血涂层；或者将多价金属阳离子和具有抗凝血活性的聚合物或聚阴离子通过静电吸引作用交替沉积到支架材料表面上得到稳定抗凝血涂层。

Description

超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法

技术领域：

本发明属于生物医学材料领域，涉及对血管内支架进行抗凝血表面修饰和改性，使其具有良好血液相容性和组织相容性的方法。

背景技术：

据报道，全世界每年有300万人接受心血管支架置入手术。其中动脉粥样硬化心脏疾病是导致发病和死亡的原因之一，这种疾病使得动脉管径狭窄最终使血管堵塞。我国是一个人口大国，因创伤和疾病造成的血管缺损和功能性障碍位居世界之首。置入血管内支架是治疗心血管疾病的重要方法。经皮腔内血管成形术(Percutaneous transluminal angioplasty，PTA)，特别是经皮腔内冠状动脉成形术(Percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)，正逐渐成为基本的血管再通方法。影响PTA/PTCA效果的两个制约因素是急性闭塞和再狭窄。血管内支架(Intravascular stent，IVS)是治疗和预防这两项并发症的手段之一。

大多数情况下，支架是由金属材料，如不锈钢、钛、形状记忆合金(Ni-Ti合金)制成，这些材料满足了结构和力学性能要求，但其生物相容性和过敏反应问题，使得支架植入后，再狭窄仍然存在。因此，第二代血管支架，即生物涂层支架已经成为人们研究的热点。

材料与血液的相互作用取决于材料表面的性质，支架涂层正是对支架表面进行改性设计来提高血液相容性的。研究分析表明，影响支架血液相容性的表面因素很多，主要有：(1)表面粗糙度：表面粗糙度越大，暴露在血液中的面积越大，凝血的可能性越大。(2)表面张力与表面能：表面张力和表面能越大，固体表面和血液接触越容易凝血形成血栓。因而，降低支架的表面张力和表面能，可提高其抗凝血性。(3)表面亲水与疏水平衡：疏水性材料表面自由能较低，与血液中各成分的相互作用较小，因而呈现良好的抗凝血性能。具有亲水性表面的材料，由于与血液界面亲合性较大而使其界面自由能大大降低，减少了对血液多种组分的吸附和相互作用。因而同样呈现良好的抗凝血性能。因此优异的血液相容性需要亲水性和疏水性的适宜平衡。(4)表面电荷：正常血管壁内皮细胞表面电位为-8∽-13mV，而血细胞中血小板的膜表面带有部分负电荷。当材料表面带有负电荷时，由于静电作用可导致血小板的黏附和凝聚急剧减少。Andrade等研究表明，带有负电荷的材料表面表现出良好的抗凝血效果，并进一步指出材料表面的电荷分布及电荷密度更为重要。另外，裸露的金属支架在循环的血液中会释放出重金属离子，重金属离子可引起内皮损伤和增加血小板及嗜中性白细胞的活性，从而导致血栓形成，金属支架表面的涂层可在一定程度上抑制有害的重金属离子的释放。

目前，对血管内支架材料进行表面修饰是减少血栓形成，提高血液相容性最有效的方法。应用较多的方法主要有物理方法(低温等离子体等)、化学方法表面接枝(化学试剂法、偶联剂法、光化学固定法、高能辐射法以及臭氧化接枝法等)和生物方法(蛋白修饰、肝素固化和内皮细胞化)。其中，改善抗凝血乃至血液相容性最理想的途径应是在生物材料的表面种植、培养内皮细胞。但是，直接把内皮细胞种植在一般高分子生物材料表面不仅繁殖慢而且过一定时间后还容易从材料表面脱落下来。

肝素(Hep)是一种天然的凝血抑制剂，具有很强的抗凝血作用。在材料表面固定肝素是提高材料血液相容性的最有效途径之一。肝素预涂的表面能够降低补体凝聚体系以及血细胞的活化。Weber研究表明，肝素预涂的表面具有血液相容性是因为其对血浆蛋白具有选择吸附性。通过离子键合的方式将肝素固定于生物材料的表面，虽然能够保持肝素的活性，但是容易从表面缓慢溶解下来，很快耗尽。共价键结合的肝素其稳定性大大提高，但是直接将这些肝素固定在材料表面会影响其抗凝活性的充分发挥，这可能是由于材料表面束缚了分子自由运动，改变了其具有活性功能的正常构象而造成的。为此，有研究通过在活性分子与材料表面之间引入一适宜长度的间隔体(spacer)可以克服这一不利因素，提高抗凝血活性。此外，还有研究报道在高分子材料表面固定抗凝血剂和生物相容性材料复合衬层的方法，以期获得良好的抗凝血表面。如Zhu等利用芳香叠氮类光偶联剂成功地将壳聚糖和肝素的复合物修饰在聚乳酸(PLA)表面，体外的血小板粘附实验和狗体内大隐静脉植入实验均显示材料具有良好的血液相容性。

近十年来静电吸引层层自组装技术受到国内外广泛重视，其基本方法和原理是通过聚阳离子和聚阴离子的静电吸引作用在基底表面交替吸附聚阴离子和聚阳离子的多层聚合物分子膜。该技术不仅可方便地在分子水平上控制膜的组成及结构，而且可以在纳米尺度上控制膜的厚度。但该方法的不足之处在于离子键合的分子膜在极性溶剂中的稳定性差。

发明内容：

本发明的目的在于针对共价键合的单分子层肝素浓度太低、而通过静电吸引层层自组装技术制备的离子键合的聚阳离子/肝素多层膜在极性溶剂中的稳定性差的缺点，以重氮树脂或多价阳离子代替传统的聚阳离子，通过静电吸引层层自组装的方法对血管内支架进行表面修饰和改性，使其具有良好血液相容性和组织相容性。该方法既充分利用了层状静电组装的简单性这一特点，又结合了重氮基团与硫酸基团在膜内的原位光化学反应，使膜内的离子键转变成共价键，或者通过多价金属阳离子与肝素通过离子键作用，在植入体表面形成稳定的难溶复合物，从而使肝素多层膜的稳定性大大提高。

本发明是这样实现的：a、支架材料清洗：依次用有机溶剂和水超声清洗1～120min。b、氧化预处理：H₂O₂煮沸1～120min，水漂洗；KOH溶液蚀刻1～120min，用大量水冲洗干净。c、抗凝血涂层制备：将重氮树脂及肝素和/或聚阴离子通过静电吸引作用交替沉积到材料的表面上，利用紫外光照射，通过光化学反应使涂层内层间的离子键转变成共价键；或者直接将多价阳离子和肝素或其它聚阴离子通过静电吸引作用交替沉积到材料表面上，即得到超稳定的抗凝血表面薄膜。

本发明的方法具有以下优点：

(1)以重氮树脂或多价阳离子为交联剂，通过静电吸引层层自组装技术，采用肝素或肝素与其它多糖(如海藻酸钠、硫酸葡聚糖等)形成的复合凝胶对血管内支架进行表面修饰与改性，不仅可提高其抗凝血性能，而且可大大增强其组织相容性。

(2)在血管内支架材料的表面肝素涂层中添加了多糖类天然高分子材料，不仅增加了人工血管的柔韧性，而且为支架材料肝素化提供了软支撑，使肝素分子与材料表面有一定距离，从而提高其抗凝血性能，克服了在传统肝素化方法中将肝素硬连接到材料的表面使抗凝血性能降低的缺点。

(3)不仅可方便地在分子水平上控制膜的组成及结构，而且可以在纳米尺度上控制共价键合的抗凝血涂层的厚度。可以根据需要通过增加肝素的层数提高表面固定化肝素的浓度，克服了传统的单层肝素固化方法中存在肝素浓度过低、由于溶解或生物降解而消耗过快的缺点。

(4)金属阳离子溶液(Fe³⁺)与肝素可以通过离子键形成稳定难溶的复合物涂层，而对肝素自身的生物活性影响不大。

(5)血管内支架的肝素化涂层可以阻止支架材料的有害成分如重金属离子等释放到血液中。

(6)带有负电荷的肝素与海藻酸钠、肝素与硫酸葡聚糖凝胶可以减少带负电荷的血小板的粘附和聚集。

(7)本发明工艺简单，反应条件温和，易操作，重现性好，环境友好，适用于多种复杂体型的材料表面、生物医用装置和多孔组织工程支架材料及其宏观制品的抗凝血表面修饰，具有良好的应用前景。

附图说明：

图1在石英玻璃片上组装的多层膜(PA/Hep)_n(n＝1，2，3，4，5)的吸收光谱随PA/Hep双层数目的变化关系图。

图2在石英玻璃片上组装的多层膜(PA/Hep)₅的吸收光谱随紫外光照射时间的变化关系图。

图3在Ni-Ti合金片上组装的多层膜的接触角随组装层数增加的变化关系图：图3a表示(PA/Hep)_n(n＝8)，图3b表示(PA/Alg/PA/Hep)_n(n＝4)

图4涂有(PA/Alg/PA/Hep)₄的Ni-Ti合金片在紫外光交联前后的掠角反射红外光谱图。

图5涂有(PA/Hep)₈和(PA/Alg/PA/Hep)₄Ni-Ti石英玻璃片在紫外光交联前后涂层稳定性的变化。

图6涂有(PA/Hep)₈和(PA/Alg/PA/Hep)₄Ni-Ti合金片的溶血度变化。

图7涂层前后的Ni-Ti合金片的血小板粘附的扫描电镜结果：图7a表示未涂层的Ni-Ti合金，图7b表示涂有(PA/Hep)₈的Ni-Ti合金，图7c表示涂有(PA/Alg/PA/Hep)₄的Ni-Ti合金。

图8Fe³⁺/Hep多层膜组装过程示意图。

图9在石英玻璃片上组装的多层膜(Fe³⁺/Hep)₁₀的吸收光谱随Fe³⁺/Hep双层数目的关系变化图。

图10在Ni-Ti合金片上组装的(Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep)₅多层膜的接触角随组装层数增加的变化关系图，其中“○”表示接触角小于10，无法检测。

图11涂有(Fe³⁺/Hep)₁₀和(Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep)₅的Ni-Ti合金片的溶血度变化。

图12涂层前后Ni-Ti合金片的血小板粘附的扫描电镜结果：图12a表示未涂层的Ni-Ti合金，图12b表示涂有(Fe³⁺/Hep)₁₀的Ni-Ti合金，图12c表示涂有(Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep)₅的Ni-Ti合金。

具体实施方式：

具体实施方式一：本实施方式是这样实现的：

1)清洗血管内支架材料：将Ni-Ti合金浸泡在有机溶剂中，超声1～120min，去离子水漂洗。

2)用H₂O₂溶液煮沸1～120min，去离子水漂洗；用KOH溶液蚀刻1～120min，去离子水漂洗干净。

3)静电吸引层层自组装重氮树脂/肝素涂层：将Ni-Ti合金放入0.001～100mg/ml带正电荷的二苯胺重氮树脂溶液中，吸附0.5～30min，移去溶液并用去离子水洗涤干净；再将合金放入0.001～100mg/ml带负电荷的聚阴离子溶液中，吸附0.5～30min，移去溶液并用去离子水洗涤干净。重复上述步骤，使重氮树脂和聚阴离子交替组装在Ni-Ti合金片表面上，直至达到所需要的层数为止(厚度一般为1～10000nm)。氮气吹干或真空干燥。

4)利用紫外光将自组装膜层间的离子键转变成共价键：用紫外光或者可见光照射Ni-Ti合金，发生光化学反应，使重氮树脂和包括肝素在内的聚阴离子之间的离子键转变成共价键。

本实施方式中，清洗人工植入体用的有机溶剂分别为丙酮、无水乙醇或者它们的混合物。

本实施方式中，血管内支架材料可以是Ni-Ti合金制成的各种形状血管内植入支架，也可以是包括各种金属或各种聚合物以及用玻璃、陶瓷、硅等材料制成的各种形状的生物医学装置，也可以是各种材料制成的各种口径的血液导管、聚合物膜或多孔支架。

本实施方式中，重氮树脂为二苯胺-4-重氮树脂或取代二苯胺重氮树脂，比如3-甲氧基二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-4-重氮树脂、2-硝基二苯胺-4-重氮树脂、2-磺酸二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-2-重氮树脂等中的一种或几种的混合物。

本实施方式中，聚阴离子可选用肝素、硫酸肝素、海藻素钠、聚苯乙烯磺酸钠、硫酸葡萄糖、硫酸软骨素、聚丙烯酸钠、聚甲基丙烯酸中的一种或几种的混合物。上述阴离子还可选用具有两性电荷性质的各种蛋白、生长因子和分化诱导因子，这些蛋白、生长因子和分化诱导因子可通过调节pH值来得到不同的带电性质。

本实施方式在经过H₂O₂/KOH溶液氧化处理后的Ni-Ti合金表面上通过静电吸引作用将带正电荷的二苯胺重氮树脂和带负电荷的肝素分子交替沉积到Ni-Ti合金表面上。重氮树脂的重氮基带正电荷，肝素的硫酸基带负电荷，通过静电吸引作用，重氮基团与肝素的硫酸基团之间发生光化学反应，二者形成离子复合物，在紫外光照射下，发生原位光化学反应，生成硫酸酯，使膜内的离子键转变成共价键，便制得了共价键合的多层膜，使肝素在膜中的稳定性大大提高。肝素分子经层层自组装和光化学反应后仍然保持其原有的生物活性，具有明显的抗凝血作用。本实施方式所制备的肝素薄膜的表面具有活性基团，还可在其表面继续组装其它材料的薄膜，如聚电解质、生物功能分子、导电聚合物等。肝素(Hep)和二苯胺重氮树脂(PA)的光化学反应方程式为：

从图1可以看出，最大吸收波长为377nm的吸收峰归属于PA上重氮基的π-π^*跃迁。随着PA/Hep双层数目的增加，在最大波长处的吸光度呈线性增加，有力地证明了PA和Hep可以通过静电吸引作用形成均匀的涂层。这不仅说明了层层静电自组装过程的发生，也说明了PA和Hep形成了均匀的高分子涂层。

从图2可以看出，随着紫外光照射时间增加，在377nm处的吸光度显著降低，吸收峰消失；同时，在290nm处出现了一个新的峰，吸光度随照射时间增加而增加。这有力地证明了PA的重氮基团与Hep的硫酸基团之间发生了光化学反应，从而使膜内的离子键转变成共价键。

具体实施方式二：本实施方式是这样实现的：

1)静电吸引层层自组装二苯胺重氮树脂和包括海藻酸钠及肝素在内的聚阴离子超薄膜：将经过氧化预处理过的Ni-Ti合金片放入0.001～100mg/ml带正电荷的二苯胺重氮树脂溶液中，吸附0.5～30min，移去溶液并用去离子水洗涤干净；再将合金片放入0.001～100mg/ml带负电的聚合物溶液(海藻酸钠或肝素)中，吸附0.5～30min，移去溶液并用去离子水洗涤干净。重复上述步骤，使二苯胺重氮树脂和聚阴离子交替组装在Ni-Ti合金片表面上，直至达到所需要的层数为止(厚度一般为1～1000nm)。反应结束后，取出溶液用去离子水洗涤干净，氮气吹干。

2)将自组装膜层间的离子键转变成共价键：用紫外光或者可见光照射Ni-Ti合金上的肝素涂层，发生光化学反应，使二苯胺重氮树脂和包括肝素在内的聚阴离子之间的离子键转变成共价键。

本实施方式中，含羧酸基团的聚合物可选用海藻素钠、聚谷氨酸、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、透明质酸、聚甲基丙烯酸中的一种或几种的混合物，优选为海藻酸钠。

本实施方式步骤1)中，二苯胺重氮树脂和聚阴离子水溶液浓度优选1mg/ml，吸附时间优选为1min，吸附层数优选8个双层。

本实施方式步骤2)中，照射时间优选为15min。

PA的重氮基带正电荷，海藻酸钠的羧基和肝素的硫酸基带负电荷，通过静电吸引作用，重氮基团与海藻酸钠的羧基及肝素的硫酸基团之间发生光化学反应，形成离子复合物，在光照射条件生成羧酸酯和硫酸酯，使膜内的离子键转变成共价键。此外本实施方式中加入了海藻酸钠，为支架材料肝素化提供了软支撑，使肝素分子与材料表面有一定距离，从而提高其抗凝血性能。肝素(Hep)、海藻酸钠(Alg)和二苯胺重氮树脂(PA)的光化学反应方程式为：

接触角检测的结果可以证实PA、Hep和Alg能够交替沉积到支架材料表面上(图3a和3b)。当最外层为PA时，接触角较大；当最外层为肝素或海藻酸钠时，接触角较小。从图中可以看出，PA/Hep和PA/Alg/PA/Hep这两个体系，接触角随着组装层数增加交替变化，有力地说明PA、Hep和Alg已经组装到材料表面上，而且还能看到，PA/Alg/PA/Hep这个体系的亲水性较PA/Hep体系好。

本实验采用掠角反射红外光谱法检测光化学反应前后肝素化的Ni-Ti合金片(PA/Alg/PA/Hep)₄涂层变化。图4中，未经过紫外光照射得合金片在2227和2173cm^-1处的对称和非对称伸缩振动峰为重氮基的特征谱带。在1586cm^-1有PA中苯基的特征吸收，而1119cm^-1处则归属于重氮基与硫酸根/羧酸基团由于强离子对作用引起的N→O伸缩振动。经过紫外光照射后，重氮基特征吸收完全消失，这证明了重氮基在光照后完全分解。而且在光照前后均能够看到-SO₃ ^-(1033cm^-1)的对称伸缩振动，说明肝素和海藻酸钠已经成功地通过PA的光聚合作用交联在材料表面，形成了薄膜结构。

图5为PA/Hep和PA/Alg/PA/Hep这两个体系在紫外光交联前后涂层稳定性的变化。在紫外-可见分光光度计下分别检测290nm(紫外交联前)和377nm(紫外交联后)的石英玻璃片的吸光度变化，随着时间延长，可以观察到经过紫外交联后的涂层，PA的含量下降速度明显低于交联前。经过4h水洗后，未交联的(PA/Hep)₈和(PA/Alg/PA/Hep)₄的涂层PA的吸光度分别下降了60％和80％，交联后的则没有那么明显的降低。而且(PA/Alg/PA/Hep)₄的稳定性高于(PA/Hep)₈。

对PA/Hep和PA/Alg/PA/Hep这两个体系进行体外血液相容性检测，部分凝血酶原激活时间(aPTT)较未涂层Ni-Ti合金片延长，而且随着合金片与血液接触时间的增加，aPTT也随之增加。与血液接触30min后，(PA/Hep)₈和(PA/Alg/PA/Hep)₄的aPTT值分别为98.1s和90.8s，明显高于正常参考值范围。这个结果说明涂有(PA/Hep)₈和(PA/Alg/PA/Hep)₄的支架材料具有良好的抗凝血性能。理论上来讲(PA/Alg/PA/Hep)₄的肝素含量较(PA/Hep)₈少一半左右，但是从图中看到，这两个体系的抗凝血性能差别不大，分析其原因一是海藻酸钠将肝素与材料表面之间拉开一定距离，使得肝素的活性基团暴露在最外层；二是肝素结合了血液中的抗凝血酶III(AT-III)后，AT-III与凝血酶形成凝血酶/AT-III复合物，使凝血酶失活后，凝血酶/AT-III复合物从固定的肝素表面脱离下来，固定的肝素能够继续结合其它的AT-III，因而凝血时间延长。

根据国家规定标准，与血液相接触的材料溶血度应小于5％。从图6可以看出，涂有(PA/Hep)₈和(PA/Alg/PA/Hep)₄的Ni-Ti合金溶血度分别为0.52±0.241％和0.34±0.064％，均小于国家规定标准，而且添加了海藻酸钠的涂层由于其亲水性能的提高导致了溶血度的相对降低。

图7为未涂层、涂有(PA/Hep)₈和(PA/Alg/PA/Hep)₄的Ni-Ti合金血小板粘附扫描电镜结果。未涂层的粘附有数量较多的血小板，而且血小板已经被激活，伸出了伪足，形态发生了变化。涂有(PA/Hep)₈的粘附数量较少，形态完整，尚未被激活，而涂有(PA/Alg/PA/Hep)₄的Ni-Ti合金并未观察到有血小板粘附。上述几个血液试验结果说明了这两种体系均具有良好的血液相容性。

具体实施方式三：本实施方式是这样实现的：

静电吸引层层自组装多价金属阳离子溶液和包括肝素在内的聚阴离子超薄膜：将用经过预处理的Ni-Ti合金放入0.001～100mg/ml带正电荷的多价金属阳离子溶液中，吸附0.5～30min，移去溶液并用去离子水振荡洗涤；再将合金Ni-Ti放入0.001～100mg/ml带负电荷的聚阴离子溶液中，吸附时间为0.5～30min，待吸附上一层聚阴离子后，移去溶液并用去离子水洗涤干净，这时表面带上负电荷。重复上述步骤，使金属离子和聚阴离子交替组装在Ni-Ti合金片表面上，直至达到所需要的层数为止(厚度一般为1～10000nm)。为了证明Fe³⁺和Hep可以通过静电作用形成均匀的多层高分子膜，用石英玻璃片代替Ni-Ti合金片作基底重复上述步骤。

本实施方式中，多价金属阳离子溶液可以是FeCl₃溶液，也可以是其它Fe³⁺的盐溶液，也可以是Tb³⁺、Cr³⁺、Al³⁺或其它多价阳离子盐溶液。优选FeCl₃溶液。

本实施方式中，三价金属阳离子水溶液浓度优选5mg/ml，聚阴离子水溶液浓度优选1mg/ml，吸附时间优选为5min，吸附层数优选8个双层。

本实施方式在经过H₂O₂/KOH溶液氧化处理后的Ni-Ti合金表面上通过静电吸引作用将带正电荷的Fe³⁺和带负电荷的肝素分子交替沉积到Ni-Ti合金表面上。Fe³⁺带正电荷，肝素的硫酸基带负电荷，通过静电吸引作用以及水中-OH基团的作用，在合金片上沉积了含有-OH的化合物(Fe(RSO₃)_x(OH)_3-x)该化合物能够稳定的涂布在合金表面上，而且具有良好的抗凝血活性。Fe³⁺和肝素涂层的过程示意图如图8所示。

以石英玻璃片为基底，紫外-可见光分光光度计证明Fe³⁺和Hep可以通过静电作用形成均匀的多层高分子膜(图9)。随着Fe³⁺/Hep双层数目的增加，在350nm处的吸光度呈线性增加，有力地证明了Fe³⁺和Hep可以通过静电吸引作用形成均匀的涂层。

具体实施方式四：本实施方式是这样实现的：

将经过H₂O₂/KOH溶液氧化处理后的Ni-Ti合金放入0.001～100mg/ml多价金属阳离子溶液中，吸附0.5～30min，移去溶液并用去离子水振荡洗涤，这时表面带上正电荷；再将合金放入0.001～100mg/ml带负电荷的硫酸葡聚糖(或肝素)溶液中，吸附0.5～30min，移去溶液并用去离子水洗涤干净。重复上述步骤，使金属离子和硫酸葡聚糖/肝素交替组装在Ni-Ti合金片表面上，直至达到所需要的层数为止(厚度一般为1～10000nm)。反应结束后，取出溶液用去离子水洗涤干净，室温干燥。

本实施方式中，多价金属阳离子溶液可以是FeCl₃溶液，也可以是其它Fe³⁺的盐溶液，也可以是Tb³⁺、Cr³⁺、Al³⁺或其它多价阳离子盐溶液。优选FeCl₃溶液。

本实施方式步骤中，多价金属阳离子水溶液浓度优选5mg/ml，pH值优选3.0，聚阴离子水溶液浓度优选1mg/ml，吸附时间优选为5min，吸附层数优选12个双层。

从图10也可以看出，Fe³⁺、Hep和DS能够交替沉积到支架材料表面上。从图中可以看出，Fe³⁺/Hep和Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep这两个体系，接触角随着组装层数增加交替变化，说明Fe³⁺、Hep和DS已经组装到材料表面上，而且还能看到，Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep这个体系的亲水性明显较Fe³⁺/Hep体系好，说明引入DS增加了肝素涂层的亲水性。

涂有(Fe³⁺/Hep)₁₀和(Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep)₅的Ni-Ti合金aPTT和检测结果如表1，涂层的Ni-Ti合金在与血液接触30min后，aPTT值都大于了120s，超出了仪器的测量范围。

表1  修饰前后Ni-Ti合金的体外抗凝血性

图11也证实了涂有(Fe³⁺/Hep)₁₀和(Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep)₅的Ni-Ti合金的溶血度分别为0.13±0.009％和0.31±0.091％，均低于国家规定的标准，说明这两种体系的涂层也同样具有良好的血液相容性。

图12为未涂层、涂有(Fe³⁺/Hep)₁₀和(Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep)₅的Ni-Ti合金血小板粘附扫描电镜结果。可以看到Fe³⁺/Hep和Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep体系均在Ni-Ti合金表面上形成了粒径较为均一，圆球样的颗粒，而且后者较前者更为均匀，光滑。没有肝素涂层Ni-Ti合金粘附了很多血小板碎片等血液成分，血小板已经被活化，而在涂有(Fe³⁺/Hep)₁₀和(Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep)₅的Ni-Ti合金表面上几乎看不到血小板聚集和粘附。这些结果证明了涂有(Fe³⁺/Hep)₁₀和(Fe³⁺/DS/Fe³⁺/Hep)₅的Ni-Ti合金抗凝血效果好，具有良好的血液相容性。

Claims (8)

1.以重氮树脂或多价金属离子溶液为交联剂，通过静电吸引层层自组装技术制备超稳定血管内支架抗凝血涂层的方法，其特征在于它是这样实现的：

a、血管内支架表面清洗：用几种有机溶剂分别超声清洗1～120min，然后，用水漂洗干净。

b、氧化处理：H₂O₂煮沸1～120min，清水漂洗；KOH溶液蚀刻1～120min，大量清水冲洗干净。

c、抗凝血涂层制备：将带正电的重氮树脂和具有抗凝血活性的聚合物和/或其它聚阴离子溶液通过静电吸引作用交替沉积到材料的表面上，利用紫外光或可见光照射材料表面涂层，通过光化学反应使涂层内层间的离子键转变成共价键，得到超稳定的抗凝血涂层；或者将多价金属阳离子和具有抗凝血活性的聚合物或聚阴离子通过静电吸引作用交替沉积到支架材料表面上得到稳定抗凝血涂层。

2.根据权利要求1所述的超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法，其特征在于所述清洗人工植入体用的有机溶剂分别为丙酮、无水乙醇或者它们的混合物。

3.根据权利要求1所述的超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法，其特征在于所述血管内支架材料可以是Ni-Ti合金制成的各种形状血管内植入支架，也可以是包括各种金属或各种聚合物以及用玻璃、陶瓷、硅等材料制成的各种形状的生物医学装置，也可以是各种材料制成的各种口径的血导管、聚合物膜或多孔支架。优选Ni-Ti合金。

4.根据权利要求1所述的超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法，其特征在于所述重氮树脂可以是二苯胺重氮树脂、取代二苯胺重氮树脂(如3-甲氧基二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-4-重氮树脂、2-硝基二苯胺-4-重氮树脂、2-磺酸二苯胺-4-重氮树脂、N-甲基二苯胺-2-重氮树脂)中的一种或几种的混合物，优选二苯胺重氮树脂。

5.根据权利要求1所述的超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法，其特征在于所述多价金属阳离子溶液可以是FeCl₃溶液，也可以是其它Fe³⁺的盐溶液，也可以是Tb³⁺、Cr³⁺、Al³⁺或其它多价阳离子盐溶液。优选FeCl₃溶液。

6.根据权利要求1所述的超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法，其特征在于所述具有抗凝血活性的聚合物为肝素、硫酸肝素或其它合成的抗凝血聚合物中的一种或几种的混合物，优选肝素。

7.根据权利要求1所述的超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法，其特征在于所述聚阴离子可选用海藻酸钠、硫酸葡聚糖、聚谷氨酸、羧甲基纤维素钠、聚阴离子纤维素、全氟磺酸(Nafion)、聚苯乙烯磺酸钠、硫酸软骨素、聚丙烯酸钠、透明质酸、聚甲基丙烯酸中的一种或几种的混合物，优选海藻酸钠和硫酸葡聚糖。

8.根据权利要求1所述的超稳定血管内支架抗凝血涂层的制备方法，其特征在于所述特征在于所述抗凝血表面超薄膜的厚度为1～10000nm。

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