KR20130046283A

KR20130046283A - 히알루론산 카테콜 접합체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20130046283A
Application number: KR1020110110777A
Authority: KR
Inventors: 이해신; 조선애; 홍선기; 송인택; 엄태관; 조승우
Original assignee: 한국과학기술원
Priority date: 2011-10-27
Filing date: 2011-10-27
Publication date: 2013-05-07
Also published as: KR101340044B1

Abstract

본 발명은 히알루론산 카테콜 접합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히알루론산 카테콜 제조 후 의료용 이식물의 표면을 개질 시키는 기술과 생체활성물질을 고정화 시키는 방법을 포함하는 의료용 이식물 제조방법을 제공한다. 본 발명의 방법에 따라 제조된 히알루론산 카테콜 접합체는 임플란트, 치과용 임플란트, 스텐트, 나사, 골 대체물 등의 의료용 이식물 혹은 의료용 소재 표면에 고정화 하여 더 나은 소재로 개발할 수 있으므로 다양한 의료용 물질에 적용시킬 경우 매우 유용한 코팅 방법을 제공한다.

Description

히알루론산 카테콜 접합체 및 이의 용도 {Hyaluronic acid catechol conjugate and use thereof}

본 발명은 히알루론산 카테콜 접합체 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는 히알루론산 카테콜 제조 후 의료용 이식물의 표면을 개질 시키는 기술과 생체활성물질을 고정화 시키는 방법을 포함하는 의료용 이식물 제조방법을 제공한다.

상처가 나거나 훼손된 치아나 관절, 또는 조직을 치료하기 위해서 손실된 부분에 임플란트, 치과용 임플란트, 스텐트, 나사, 골 대체물 등의 의료용 이식물을 삽입한다. 하지만, 이 의료용 이식물은 체내에 삽입 되었을 때, 의료용 이식물 표면을 외부적 표면으로 체내에 인식되어 출혈과 혈액 손실을 방지하기 위해 응고기전이 활성화 된다. 또한 의료용 이식물은 영구적으로 생체조직과 접촉하게 되므로 표면의 적합성과 생체내 친화성 모두 가져야 한다.

종래의 히알루론산 용액을 이용한 의료용 이식물의 코팅에는 히알루론산을 안정적인 고정화기술이 적용되지 않았으며 또한 이것의 유효성을 검증되지 않은 문제점이 있다.

따라서 의료용 이식물의 표면을 개질 시키는 기술과 생체활성물질을 고정화 시키는 유효한 방법이 요구되어 왔다.

성공적인 임플란트를 제공하기위한 표면을 개질시키는 방법으로의 선행기술은 많이 공지 되어있다. 예로 10-2009-0117807호 에서는 초친수성 표면으로 개질하기위해 염을 이용하여 저장성 임플란트를 제조하는 방법이다. 하지만 이것은 본 특허와 달리 단순한 공정을 가지고 있지 못하며 또한 골성장 인자를 로딩한 임플란트가 생체 활성화를 가지는 지에 대한 결과를 가지고 있지 않다.

한편 스텐트의 경우 항응고성을 막기 위하여 표면을 개질시키기 위한 여러 시도가 있었다. 그중 헤파린을 이용하여 고정화 시키려는 기술의 과정이 복잡하였다.

이에 본 발명자들은 표면의 적합성과 생체내 친화성 모두 가진 의료용 이식물을 탐색하는 연구를 수행하던 중, 히알루론산 카테콜 접합체를 의료용 이식물 혹은 의료용 소재 표면에 고정화하여 더 나은 소재로 개발할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 히알루론산의 카르복시 그룹이 도파민의 아민기와 아마이드 결합으로 결합되어 형성된 히알루론산 카테콜 접합체를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 (a) 히알루론산 및 도파민의 혼합액에 EDC (1-Ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)와 NHS (N-hydroxysuccinimide)를 각각 도파민 당량과 같은 당량으로 넣는 단계; (b) 상기 합성물을 pH 2 내지 7에서 1 내지 18 시간동안 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 합성물을 pH 2 내지 7에서 정제하는 단계를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체를 유효성분으로 포함하는 의료용구의 표면 개질용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 (a) 히알루론산 카테콜 접합체의 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 용액을 제조하는 단계; 및 (b) pH를 2 내지 10 조건에서 산화제를 첨가하여 2 내지 24 시간동안 반응 시키는 단계;를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체 수화젤을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 (a) 히알루론산 카테콜 접합체의 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 용액을 제조하는 단계; 및 (b) pH를 2 내지 10으로 조절하여 2 내지 24 시간동안 반응시키는 단계;를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체 수화젤을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 히알루론산 카테콜 수화젤을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 본 발명의 수화젤을 유효성분으로 포함하는 세포배양 지지체를 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 히알루론산의 카르복시 그룹이 도파민의 아민기와 아마이드 결합으로 결합되어 형성된 히알루론산 카테콜 접합체를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 히알루론산 및 도파민의 혼합액에 EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)와 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 각각 도파민 당량과 같은 당량으로 넣는 단계; (b) 상기 합성물을 pH 2 내지 7에서 2 내지 18 시간동안 반응시키는 단계; 및 (c) 상기 합성물을 pH 2 내지 7에서 정제하는 단계를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체를 유효성분으로 포함하는 의료용구의 표면 개질용 조성물을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 히알루론산 카테콜 접합체의 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 용액을 제조하는 단계; 및 (b) pH를 2 내지 10 조건에서 산화제를 첨가하여 2 내지 24 시간동안 반응 시키는 단계;를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체 수화젤을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 히알루론산 카테콜 접합체의 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 용액을 제조하는 단계; 및 (b) pH를 2 내지 10으로 조절하여 2 내지 24 시간동안 반응시키는 단계;를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체 수화젤을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 제조방법에 의해 제조된 히알루론산 카테콜 수화젤을 제공한다.

본 발명의 또다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 본 발명의 수화젤을 유효성분으로 포함하는 세포배양 지지체를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 검토한다.

본 발명은 히알루론산 카테콜 접합체를 제조하고 표면 개질화 방법으로 의료 목적으로 쓰이는 인공적인 물질의 표면을 히알루론산 카테콜 접합체를 코팅하는 새로운 방법에 관한 것이다.

보다 구체적으로 본 발명은 히알루론산의 카르복시 그룹이 도파민의 아민기와 아마이드 결합으로 결합되어 형성된 히알루론산 카테콜 접합체(conjugate)를 제공한다.

본 발명에서 히알루론산(hyaluronate, hyaluronic acid: HA)은 β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 β-1,3과 β-1,4 결합으로 교대로 결합한 곧은 사슬상의 천연산성 뮤코다당류이다. 분자량은 조정법에 의해서 5만에서부터 800만에 이른다. 포유동물의 결합조직에 넓게 분포하는 외에, 태반, 눈의 초자체, 관절골액, A 및 C군 용혈성연쇄구균 등에서 발견되고 있다. 히알루로니다아제(뮤티니아제, 즉 히알루론산의 중합을 분해하는 효소의 총칭)에 의하져 글루쿠로니드 결합이나 N-아세틸글루코사미니드 결합이 분해된다.

또한 도파민(dopamine)은 C₈H₁₁NO₂의 화학식, 분자량 153.18을 가진다. L-도파의 방향족-L-아미노산탈카르복실화효소에 의한 반응에서 생성되는 최초의 카테콜아민이다. 그 자체가 신경전달물질의 작용을 하는 것 외에 카테콜아민의 노르아드레날린과 아드레날린의 전구체이다. 수용액은 대단히 불안정하며 쉽게 산화되지만 산성에서는 비교적 안정적이다. 말초조직에도 도파민은 존재하고 있으며 요로 배설된다. 도파민 수용체는 아데닐산고리화효소와 공역하고 있는 D1 수용체와 공역하지 않는 D2수용체로 구별할 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물일 수 있다.

[화학식 1]

상기식에서, L은

이고 K는 1 내지 10의 정수이며, X 는 각각 독립적으로 H 또는 OH 이고, n 은 2 내지 700의 정수이고, m 은 n 보다 작으며 1내지 300의 정수이다.

한편, 본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체를

(a) 히알루론산 및 도파민의 혼합액에 EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)와 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 각각 도파민 당량으로 넣는 단계;

(b) 상기 합성물을 pH 2 내지 7 에서 2 내지 18 시간동안 반응시키는 단계; 및

(c) 상기 합성물을 pH 2 내지 7에서 정제하는 단계를 포함하는 방법에 의해서 제조될 수 있다.

본 발명의 제조방법에 대해서 각 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

(a) 단계는 히알루론산 및 도파민의 혼합액에 EDC와 NHS를 각각 도파민 당량과 같은 당량으로 넣는 단계이다.

EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)는 C₈H₁₇N₃-HCl의 화학식을 가지며 수용성 카르보디이미드로서 개발한 대표적인 화합물이다. 주로 카르복실기와 아미노와의 탈수반응을 촉진 시키는 화합물이지만 다른 일반적인 탈수반응과는 달리수용액 내에서도 할 수 있는 장점이 있다. 펩티드 형성반응과 단백질의 카르복실기를 아미노화합물에서 아미드화하는 반응에 사용되어진다.

NHS(N-hydroxysuccinimide)는 C₄H₄NNaO₆의 화학식을 가지며, 주로 유기화학이나 생화학에서 카르복실 엑시드를 촉진시켜주는 물질(activating reagent)로 사용되어진다. 또한 EDC와 주로 사용되어 반응효율과 안정성을 높여준다.

히알루론산과 도파민은 이에 제한되지는 않으나, 반응이 원활하게 이루어질 수 있고 1 내지 20 : 1의 비율로 혼합될 수 있다.

상기에서 EDC와 NHS의 각각의 첨가량은 반응의 효율성을 위하여 도파민 당량, 즉 도파민 당량과 실질적으로 같은 당량일 수 있다. 상기에서 실질적으로 같은 당량이란 도파민 당량과 대비하여 95% 내지 105%의 범위에서 실험적으로 가능한 오차범위내에서 동일하다고 인정될 수 있는 당량 범위를 나타낸다. 더 바람직하게는 도파민 당량과 동일한 당량을 나타낸다.

본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 제조방법에 따라서, 히알루론산 카테콜 접합체를 제조하였다. 제조된 접합체를 UV visible spectroscopy를 이용하여 제조여부 및 히알루론산에 카테콜 그룹이 얼마나 결합하였는지 확인한 결과 약 2 내지 3% 결합한 것으로 확인 되었다.

본 발명의 일실시예에서는 세라믹에 glass와 ITO(Indium Tin Oxide)가 각각 코팅된 표면, 합성 고분자 물질에 PU(polyurethane)과 PTFE (polytetra- fluoroethylene)가 각각 코팅된 표면과 금속 및 금속 산화물에 SiO₂, PT와 St가 각각 코팅된 표면에 코팅하여 히알루론산 카테콜 접합체의 코팅 능력을 확인하였다. 그 결과, 세라믹, 합성 고분자 물질, 금속 및 금속 산화물 표면에서 모두 히알루론산 카테콜 코팅 후에 표면이 매우 친수성으로 바뀌는 것을 확인할 수 있어 물질 종류에 무관하게 매우 잘 코팅되는 것을 알 수 있었다.

본 발명의 일실시예에서는 히알루론산 카테콜의 코팅 효과를 각각 Dental implant fixture와 stent에 코팅하여 확인하였다. 그 결과, 표면처리에 따라 히알루론산 카테콜 접합체가 코팅된 dental implant fixture가 염증없이 잘 이식되고, stent 역시 코팅이 잘 이루어짐을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체는 의료용구의 소재로 활용되는 금속, 세라믹, 합성수지 등에 잘 코팅되어 이들이 생체내에서 불필요한 면역, 염증 반응을 일으키지 않고, 안정적으로 존재할 수 있도록 친화성을 증진시킬 수 있다. 따라서, 본 발명은 히알루론산 카테콜 접합체를 유효성분으로 포함하는 의료용구의 표면 개질용 조성물을 제공한다.

표면 개질은 입자표면의 화학적 구조와 물리적 구조를 바꾸는 것을 의미한다. 이 중, 화학적 표면 개질은 주로 플라스틱 등 화학적으로 결합 에너지가 낮은 소재에서 높은 에너지의 전자나 이온이 충돌하여 금속, 유리, 플라스틱 표면에 충돌한다. 이 충돌로 라디컬이나 이온이 생성되고, 이들 주위의 산소, 질수, 수분 등이 표면의 탄소, 수소 등과 반응하여 카르보닐기, 카르복실기, 하이드록시기, 시안기 등 극성이 높은 관능기가 생성되어 화학적으로 표면이 친수성으로 개질 된다. 표면이 개질되면 친수성의 향상, 접착성의 향상, 표면 조도의 변화, 표면 유분의 제거. 인쇄성의 향상, 코팅, 인쇄 특성 향상 등의 효과를 얻을 수 있다.

본 발명에서는 히알루론산 카테콜 접합체의 표면을 개질을 통해 생체활성이 낮은 티타늄이나 티타늄 합금으로 사용되어지는 임플란트와 같은 의료용구 주재료와의 생체친화성을 높여준다.

본 발명에서 의료용구는 사람이나 동물의 질병·진단·치료예방 또는 사람이나 동물의 신체구조·기능상 영향을 미치는 것을 목적으로 하는 기구기계·의료용품·치과재료·위생용품 등이고 법령으로 지정된 것을 특징으로 하는 용구를 말한다. 이러한 의료용구의 구체적인 예로는, 예를 들면, 임플란트, 스텐트, 혈액 백, 채뇨 백, 수혈 세트, 봉합실, 드레인 튜브, 각종 카테터, 혈액 액서스, 혈액회로, 인공혈관, 인공신장, 인공심폐, 인공밸브, 혈장 교환막, 각종 흡착제, 연속 휴대식 복막관류 투석장치(CAPD), 대동맥내 벌룬 펌프(IABP), 페이스 메이커, 인공관절, 인공 골두, 치과재료, 눈안렌즈, 소프트콘택트렌즈 등을 들 수 있지만 이들에 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는 본 발명의 의료용구는 임플란트, 스텐트, 인공관절, 인공 골두, 치과재료, 세포 배양기구로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물이다.

아울러, 본 발명의 의료용구는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 및 구리(Cu)를 포함하는 귀금속류 물질, 강철(steel), 탄탈륨(Ta), 마그네슘(Mg), 니켈(Ni), 크롬(Cr), 철(Fe), 니티놀합금(NiTi), 코발트-크롬 합금(CoCr) 갈륨비소(GaAs), 및 티타늄(Ti)를 포함하는 금속류 물질, 폴리테트라플루오르에틸렌 (polytetrafluoroethylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리우레탄(polyurethane), 니트로셀룰로스(nitrocellulose), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리에틸렌 텔레프탈레이트(PET), 폴리디메틸실록산(PDMS), 및 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK)를 포함하는 고분자계 물질, 산화규소(SiO₂), 산화티타늄(TiO₂), 산화알루미늄(Al₂O₃), 및 산화니오븀(Nb₂O₅)을 포함하는 산화금속 류 물질, 및 실리콘, 실리콘 고무, 및 유리를 포함하는 비금속류의 물질과 같은 소재로 제작 또는 제조될 수 있다.

한편, 본 발명의 일실시예에서는 본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체가 하이드로젤(수화젤)을 형성하는지 여부와 그 물성을 확인하였다. 히알루론산 카테콜 용액을 PBS에 녹인 뒤에 산화제인 과요오드산나트륨(NaIO₄)을 넣은 결과, 카테콜의 산도 민감성 가교 성질에 의해 히알루론산 카테콜이 가교되어 하이드로젤을 형성되었다. 형성된 하이드로젤의 기계적 강도를 레올로지 분석(Rheology) 방법으로 측정한 결과, 저장탄성률(Storage modulus, G') 550 Pa 와 손실탄성률(loss modulus, G'') 200 Pa 의 기계적 강도를 가지며, 형성된 하이드로젤의 기공 크기(Pore size)는 약 40um 정도임을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일실시예에서 상기와 같은 본 발명의 하이드로젤에서 신경 줄기 세포를 배양한 결과, 일반적으로 사용되는 물질인 HA-methacrylate(히알루론산-메타아크릴레이트) 하이드로젤에서 보다 본 발명의 히알루론산 카테콜로 만들어진 하이드로젤에서 신경 줄기 세포의 생존 정도가 더 우세한 것을 알 수 있었다.

따라서, 본 발명은

(a) 히알루론산 카테콜 접합체의 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 용액을 제조하는 단계; 및

(b) pH를 2 내지 10 조건에서 산화제를 첨가하여 2 내지 24 시간동안 반응 시키는 단계;

를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체 수화젤을 제조하는 방법을 제공한다.

아울러, 본 발명은

(b) pH를 2 내지 10으로 조절하여 2 내지 24 시간동안 반응시키는 단계;

(a) 단계는 히알루론산 카테콜 접합체의 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 용액을 제조하는 단계이다. 상기에서 용액의 용매는 PBS(phosphate beffer saline), 완충용액으로 쓰이는 것들 중에 HCl, Sodium citrate, Citric acid, Acetic acid, Sodium acetate, Borax, Sodium hydroxide 중 2가지 이상을 사용하여 만든 것으로도 사용할 수 있으며 이외의 생물학 실험에서 사용되는 TAPS, Bicine, Tris, Tricine, TAPSO, HEPES, TES, MOPS, PIPES, Cacodylate, SSC, MES등의 완충제를 사용할 수 있다.

(b) 단계는 pH를 2 내지 10 조건에서 산화제를 첨가하여 2 내지 24 시간동안 반응 시키는 단계이다. 상기 pH 조건하에서 카테콜의 산도 민감성 가교 성질에 의해 히알루론산 카테콜이 서로 가교되어 하이드로젤을 형성하게 된다. 상기에서 산화제는, NaIO₄, Na₂S₂O₈ Fe³ ⁺, Cr⁶ ⁺, Mn⁷ ⁺, I⁷ ⁺로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 금속염 화합물, Oxygen(O₂), Ozone(O₃), Hydrogen peroxide(H₂O₂) 등의 무기 과산화물과 Fluorine(F₂), chlorine(Cl₂) 등의 할로겐 화합물, Nitric acid(HNO₃), Sulfuric acid(H₂SO₄), Persulfuric acids(H₂SO₅ 과 H₂SO₈) 등의 산성화합물, 과망간산염(MnO₄ ^-) 화합물, 망간산염(MnO₄ ² ^-) 화합물, 과붕산염 화합물, silver oxide(Ag₂O), Osmium tetroxide(OsO₄), Tollens' reagent, 2,2'-Dipyridyldisulfide(DPS) 등의 산화제를 포함한다.

첨가되는 산화제는 반응시간 및 생성되는 수화젤의 물리화학적 성질에 비추어 볼 때, 카테콜 당량 대비 0.1 내지 10 당량으로 첨가되는 것이 바람직하다.

또한, (b) 단계는 산화제의 첨가 없이 pH를 2 내지 10으로 조절하여 2 내지 24 시간동안 반응시키는 단계일 수 있다. 상기 pH 조건 하에서 카테콜의 산도 민감성 가교 성질에 의해 히알루론산 카테콜이 서로 가교되어 하이드로젤을 형성하게 된다.

한편, 본 발명은 본 발명의 수화젤 제조방법에 의해 제조된 히알루론산 카테콜 수화젤을 제공한다. 아울러, 본 발명은 상기 수화젤을 유효성분으로 포함하는 세포배양 지지체(scaffold)를 제공한다. 본 발명의 세포배양 지지체는 세포독성이 거의 없이 세포가 배양되므로 그 효율이 우수하다. 본 발명의 세포배양 지지체는 신경 세포 또는 신경 줄기세포의 배양에 있어서 지지체로 작용할 수 있으며, 이식을 위한 세포배양이나, 일반 세포 배양 등의 용도로 다양하게 사용될 수 있다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체는 용이하게 생체적합성 히알루론산에 접착성을 부여할 수 있을 뿐만 아니라, 다양한 고체 표면에 생체적합성 히알루론산을 코팅하는 것이 가능하게 된다. 특히, 본 발명에 따르면 기존의 코팅방법뿐만 아니라 치과용 임플란트 표면, 스텐트 표면, 세포를 배양하는 배양접시에 적용할 수 있는 효과를 제공하는 장점이 있다. 또한 실제 의료용으로 사용되는 골드, 타이타늄, 실리콘, 세라믹과 같은 임플란트 재료 개발과 관련하여, 본 발명에서 히알루론산에 결합되는 도파민이 다양한 표면에 잘 코팅된다는 점과 친수성을 갖고 있으므로 본 발명은 생체 적합성 재료 개발에 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 히알루론산 카테콜 접합체 합성 구조식이다.
도 2는 히알루론산 카테콜 접합체 반응율을 구하기 위한 히알루론산 카테콜 접합체의 UV visible spectra 이다.
도 3은 다양한 표면에 히알루론산 카테콜을 코팅 할 때, 코팅 전후의 표면 친수성 변화를 비교한 것이다.
도 4는 히알루론산 카테콜의 화학적 산화제에 의한 가교 전의 용액과 산도 민감성 가교에 의해 형성된 하이드로젤을 비교하는 사진이다.
도 5는 과요오드산나트륨 당량에 따른 히알루론산 카테콜 하이드로젤의 형성시간을 나타내는 그래프이다.
도 6은 히알루론산 카테콜의 산도 민감성 가교에 의해 형성된 하이드로젤의 기계적 강도를 측정한 결과이다.
도 7은 히알루론산 카테콜의 산도 민감성 가교에 의해 형성된 하이드로젤의 기공 (pore) 크기를 측정한 것이다.
도 8은 Micro-pig의 tibia에 임플란트를 식립한 사진이다.
도 9는 XPS를 이용하여 히알루론산 카테콜 접합체로 코팅 전후 표면 조성 분석 결과이다.
도 10은 XPS를 이용하여 히알루론산 카테콜 접합체로 코팅 전후 N peak에 대한 분석 결과이다.
도 11은 히알루론산 카테콜로 코팅된 폴리스티렌 (Polystyrene) 과 유리 표면에서의 신경 줄기 세포 부착 능력을 코팅 전후에 비교한 것이다.
도 12는 도 13의 결과를 그래프로 나타낸 것이다.
도 13은 히알루론산 카테콜을 이용한 하이드로젤에서의 신경 줄기 세포 생존 정도를 기존의 히알루론산 메타크리레이트(HA-methacrylate) 하이드로젤과 비교한 것이다.
도 14는 도 15의 신경줄기세포 생존 정도를 그래프로 나타낸 것이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하시 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1>

히알루론산 카테콜 접합체 제조

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

<실시예 1>

히알루론산 카테콜 접합체 제조

본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체(Conjugate) 제조를 하기 위하여 하기와 같이 실험을 수행하였다. 본 발명에서 히알루론산 카테콜 접합체 제조를 위해 (a) 히알루론산과 도파민을 준비한 다음 히알루론산의 COOH 그룹과 도파민의 NH₂ 그룹을 이용하여 화학적 결합으로 아마이드 결합을 만들기 위하여 EDC와 NHS를 도파민 당량과 같은 당량으로 넣는 단계; (b) pH 5를 갖는 0.2M PBS 상에서 18시간동안 반응시키는 단계; (c) 상기 합성물을 pH 2에서 0.1M PBS에 MWCO: 3000의 membrane을 이용하여 dialysis하여 정제하는 단계; (d) 상기 합성물을 다시 5M HCl을 이용하여 pH 2를 맞추어 증류수로 dialysis하여 정제하는 단계; (d) Freeze dryer을 이용하여 물을 제거하여 히알루론산 카테콜(HA-catechol) 을 얻는 단계를 통해 히알루론산 카테콜을 제조하였다.

< 실시예 2>

히알루론산 카테콜 접합체 합성 여부 확인

실시예 1에서 히알루론산 카테콜 접합체 합성여부와 반응율을 측정하기 위하여 UV visible spectroscopy를 이용하였고, 다음 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 하였다(Chem. Mater. 2004, 16, 1202-1208 과 J. AM. CHEM. SOC. 2007, 129, 2482-2487).

도 2에서 보듯이 카테콜인 도파민이 280 nm에서 흡수하는 물질이기에 히알루론산에 카테콜 그룹이 얼마나 결합하였는지 확인한 결과 2 내지 3% 결합한 것으로 확인 되었다.

< 실시예 3>

히알루론산 카테콜 접합체의 코팅 능력 확인

합성된 히알로론산 카테콜을 2% (w/v)의 농도로 1x PBS(Phosphate Buffered Saline)에 녹인 뒤에 산화제인 과요오드산나트륨(NaIO₄)을 Catechol의 1.5당량으로 넣어주었다. 만들어진 용액의 pH를 2로 낮춘 뒤에 도 3 의 세라믹에 glass와 ITO(Indium Tin Oxide)가 코팅된 표면, 합성 고분자 물질에 PU(polyurethane)과 PTFE(polytetrafluoroethylene)이 코팅된 표면과 금속 및 금속 산화물에 SiO₂, PT과 St가 코팅된 표면을 넣고 1시간 동안 흔들어 주고 용액을 꺼내서 증류수로 씻어주었다. 물의 접촉각 측정 방법(Contact angle measurement)으로 표면 코팅 전후의 친수성을 비교하였다.

그 결과, 도 3에서 보듯이, 세라믹, 합성 고분자 물질, 금속 및 금속 산화물 표면에서 모두 히알루론산 카테콜 코팅 후에 표면이 매우 친수성으로 바뀌는 것을 확인할 수 있다. 한편, 표면의 적외선 분광 분석 방법(Fourier transform infrared spectroscopy, FT-IR) 을 통해 표면에 코팅된 히알루론산 카테콜의 화학적 작용기를 확인하였고, X-선 광전자 스펙트럼(X-ray Photoelectron Spectrum, XPS) 분석 방법을 통해 표면에 도입된 히알루론산 카테콜의 탄소 원자의 화학적 상태를 확인였다(결과 미도시).

이 결과는, 금나노파티클에 히알루론산 카테콜 접합체와 유사한 물질을 코팅하여 XPS를 통하여 분석한 결과와 같음을 보인다(Advanced Functional Materials에 Volume 19, Issue 12, pages 18841890, June 23, 2009).

< 실시예 4>

히알루론산 카테콜 접합체 하이드로젤의 형성 및 물성 확인

히알루론산 카테콜을 10 % (w/v) 농도로 1x PBS에 녹인 뒤에 pH를 8-9 사이로 조절해주었다. 여기에 산화제인 과요오드산나트륨(NaIO₄)을 Catechol의 1.5 당량으로 넣으면 카테콜의 산도 민감성 가교 성질에 의해 히알루론산 카테콜이 가교되어 하이드로젤을 형성한다.

도 4 에서 가교 전의 히알루론산 카테콜 용액과 가교 후에 형성된 붉은 갈색의 하이드로젤의 차이를 확인할 수 있다. 하이드로젤의 형성시간은 가해주는 NaIO₄ 농도를 조절함에 따라 (1 - 2.3 당량 사이에서 조절) 달라지는데, 도 5의 그래프에서 볼 수 있듯이, 1분 이하의 빠른 시간에서 7분 이내로 조절된다. 형성된 하이드로젤의 기계적 강도는 레올로지 분석(Rheology) 방법으로 측정 되었는데, 도 6 에서 볼 수 있듯이 저장탄성률(Storage modulus, G') 550 Pa 와 손실탄성률(loss modulus, G'') 200 Pa 의 기계적 강도를 가진다. 형성된 하이드로젤의 기공 크기 (Pore size)는 약 40um 정도이며, 도 7 의 주사전자현미경(Scanning Electron Microscopy, SEM) 측정 결과로부터 알 수 있었다.

< 실시예 5>

히알루론산 카테콜의 코팅 효과 확인

3.5mm의 직경과 8.5mm의 길이를 갖는 Dental implant fixture를 준비하였다. 대조군으로 아무런 처리도 하지 않은 dental implant fixture와 실시예 3에 기재된 히알루론산 카테콜 접합체 코팅방법을 이용하여 히알루론산 카테콜 접합체를 고정화시킨 dental implant fixture를 제조하였다. 이를 각각 micro pig의 Tibia부분에 식립하여 16일 동안 노화시킨 후, 임플란트-골의 계면력을 확인 하였다. 각각의 implant fixture를 제거하는데 필요한 힘이 강할수록 임플란트-골의 계면력이 강함을 의미한다.

그 결과, 도 8에서 보듯이 임플란트가 식립이 잘 되어짐을 보여주고 있으며 16일 노화시킨 후, 뼈가 성장한 것을 보여주고 있다. 표 1에서는 각각의 식립한 임플란트를 제거하는 데 드는 힘을 측정한 결과이다.

표면처리에 따라 임플란트-골의 계면력이 달라졌으며, 히알루론산 카테콜 접합체 경우는 대조군보다 높은 결과가 측정되었다. 대조군보다 히알루론산 카테콜 접합체를 코팅한 임플란트가 더 좋은 결과를 보여주고 있으며, 이는 히알루론산 카테콜 접합체가 코팅된 dental implant fixture가 염증없이 잘 이식되었다는 것과 골과 임플란트의 계면력이 매우 단단함을 의미한다.

[표 1] 식립하여 16일 동안 노화시킨 임플란트를 micro-pig의 tibia에서 제거시 필요힘

<실시예 6>

히알루론산 카테콜 접합체의 스텐트 코팅 효과 확인

완충용액(Phosphate buffer salin ,PBS)에 히알루론산 카테콜을 0.04 mM 로 녹였다. 그 후, 카테콜과 산화제 당량 1:1 로 하여 산화제인 NaIO₄를 첨가한다. 이렇게 만들어진 코팅용액에 Stent를 18시간동안 담구어 둔다. 일정시간이 지나면 stent를 꺼내어 증류수로 세척한 다음 질소기체로 말린다. 히알루론산 카테콜로 코팅 된 stent 표면 분석으로 XPS를 이용하여 실험했다.

그 결과, 도 9와 도 10과 같이 아무처리 하지 않은 stent 표면에서는 보이지 않았던 N peak가 히알루론산 카테콜 접합체가 코팅된 stent에서는 나타남을 확인할 수 있었다. 이는 히알루론산 카테콜에 의한 코팅이 잘 이루어졌음을 나타내며 의료용으로 쓰이고 있는 장치 혹은 이식물 표면을 본 발명의 접합체가 잘 개질 시킬 수 있음을 나타낸다.

<실시예 7>

히알루론산 카테콜 접합체의 신경 줄기 세포 배양 능력 확인

히알루론산 카테콜로 코팅된 폴리스티렌(Polystylene) 과 유리 표면에서 신경 줄기 세포(Neural Stem Cell)의 표면 부착 능력을 확인하였다. 표면에 세포를 5.0 X 10⁵ 개 올린 뒤에 15, 38, 그리고 50시간 후 각각 표면에 붙은 세포의 상태를 현미경으로 확인하였고, 이를 코팅되지 않은 표면에서의 세포 상태와 비교하였다.

그 결과, 도 11에서 보듯이, 시간이 지남에 따라 초기에 구 모양으로 뭉쳐있던 세포가 표면에 안정적으로 부착되는 것을 관찰할 수 있으며, 표면에 부착된 세포의 개수를 정량한 결과, 코팅하지 않은 표면에 비해 코팅 후에 신경 줄기 세포의 부착 정도가 5배 증가한 것을 확인 할 수 있다 (도 12 참조).

표면 코팅과 함께 히알루론산 카테콜로 형성된 하이드로젤 에서도 신경 줄기 세포를 배양하여 세포의 생존 정도를 확인하였다. 신경 줄기 세포를 겔 용액 300 mL 당 4.0 X 10⁵ cells 의 농도로 히알루론산 카테콜 용액과 섞어준 뒤에 실시예 3 에서와 같은 방법으로 과요오드산나트륨을 넣고 하이드로젤을 형성하였다. 대조군으로 일반적으로 사용되는 물질인 HA-methacrylate 하이드로젤에서의 세포 배양 정도와 비교하였다.

그 결과, 도 13 에서 볼 수 있듯이 히알루론산 카테콜로 만들어진 하이드로젤에서 신경 줄기 세포의 생존 정도가 더 우세한 것을 알 수 있었다. (Green: Live, Red: Dead) 이것을 정량화하여 도 14에서 그래프로 나타내었는데 HA-methacrylate에서는 생존 정도가 40% 정도 밖에 되지 않았지만, 히알루론산 카테콜에서는 100% 에 근접하는 정도로 거의 모든 배양된 세포가 생존하였음을 알 수 있었다.

본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체는 의료용 이식물의 표면을 개질 시키는 기술과 생체활성물질을 고정화 시키는 방법이 제공된다. 따라서, 본 발명의 히알루론산 카테콜 접합체를 이용하여 성공적인 의료용 이식물 제조방법을 목적으로 유용하게 이용될 수 있다.

Claims

히알루론산의 카르복시 그룹이 도파민의 아민기와 아마이드 결합으로 결합되어 형성된 히알루론산 카테콜 접합체.
제1항에 있어서, 상기 히알루론산 카테콜 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 화합물인 것을 특징으로 하는 히알루론산 카테콜 접합체.

[화학식 1]

상기식에서, L은
이고 K는 1 내지 10의 정수이며, X 는 각각 독립적으로 H 또는 OH 이고, n 은 2 내지 700의 정수이고, m 은 n 보다 작으며 1내지 300의 정수이다.
(a) 히알루론산 및 도파민의 혼합액에 EDC(1-Ethyl-3-[3-dimethyl aminopropyl]carbodiimide Hydrochloride)와 NHS(N-hydroxysuccinimide)를 각각 도파민 당량과 같은 당량으로 넣는 단계;
(b) 상기 합성물을 pH 2 내지 7에서 2 내지 18 시간동안 반응시키는 단계; 및
(c) 상기 합성물을 pH 2 내지 7에서 정제하는 단계를 포함하는 히알루론산 카테콜을 제조하는 방법.
제1항의 히알루론산 카테콜 접합체를 유효성분으로 포함하는 의료용구의 표면 개질용 조성물.
제4항에 있어서, 상기 의료 용구는 임플란트, 스텐트, 인공관절, 인공 골두, 치과재료, 세포 배양기구로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서, 상기 의료 용구는 금(Au), 은(Ag), 백금(Pt), 팔라듐(Pd), 구리(Cu), 강철(steel), 탄탈륨(Ta), 마그네슘(Mg), 니켈(Ni), 크롬(Cr), 철(Fe), 니티놀합금(NiTi), 코발트-크롬 합금(CoCr) 갈륨비소(GaAs), 티타늄(Ti), 폴리테트라플루오르에틸렌 (polytetrafluoroethylene), 폴리카보네이트(polycarbonate), 폴리우레탄(polyurethane), 니트로셀룰로스(nitrocellulose), 폴리스티렌(polystyrene), 폴리에틸렌(polyethylene), 폴리에틸렌 텔레프탈레이트(PET), 폴리디메틸실록산(PDMS), 폴리에테르 에테르 케톤(PEEK), 산화규소(SiO₂), 산화티타늄(TiO₂), 산화알루미늄(Al₂O₃), 산화니오븀(Nb₂O₅)을, 실리콘, 실리콘 고무, 및 유리로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나의 소재로 제작된 것임을 특징으로 하는 조성물.
(a) 히알루론산 카테콜 접합체의 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 용액을 제조하는 단계; 및
(b) pH를 2 내지 10 조건에서 산화제를 첨가하여 2 내지 24 시간동안 반응 시키는 단계;
를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체 수화젤을 제조하는 방법.
(a) 히알루론산 카테콜 접합체의 1 mg/mL 내지 200 mg/mL의 용액을 제조하는 단계; 및
(b) pH를 2 내지 10로 조절하여 2 내지 24 시간동안 반응시키는 단계;
를 포함하는 히알루론산 카테콜 접합체 수화젤을 제조하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 산화제는 NaIO₄, Na₂S₂O₈, Fe³ ⁺, Cr⁶ ⁺, Mn⁷ ⁺, I⁷ ⁺로 이루어진 군으로부터 선택된 하나의 금속염 화합물, Oxygen(O₂), Ozone(O₃), Hydrogen peroxide(H₂O₂), Fluorine(F₂), chlorine(Cl₂), Nitric acid(HNO₃), Sulfuric acid(H₂SO₄), Persulfuric acids(H₂SO₅ 과 H₂SO₈), 과망간산염(MnO₄ ^-) 화합물, 망간산염(MnO₄ ² ^-) 화합물, 과붕산염 화합물, silver oxide(Ag₂O), Osmium tetroxide(OsO₄), Tollens' reagent 및 2,2'-Dipyridyldisulfide(DPS)로 이루어진 군에서 선택된 것임을 특징으로 하는 방법.
제7항 또는 제8항의 제조방법에 의해 제조된 히알루론산 카테콜 수화젤.
제10항의 수화젤을 유효성분으로 포함하는 세포배양 지지체.
제11항에 있어서, 상기 세포는 신경 세포 또는 신경 줄기세포인 것을 특징으로 하는 지지체.