CN113041409A - 一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层及其制备方法 - Google Patents

一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层及其制备方法，包括以下步骤：S1邻苯二酚改性透明质酸；S2改性透明质酸和胱胺的交联；S3制备水凝胶载药涂层。通过将透明质酸改性并且交联，可以形成具有含有S‑S键的水凝胶，并且将水凝胶与大蒜素依次喷涂在沉积了聚多巴胺的基底上，即可制得用于氧化应激环境的水凝胶载药涂层。该涂层可以针对特定的病理环境如心肌梗死、脓毒性心肌病、动脉粥样硬化等各种氧化应激引起的心脏疾病实现智能化精准药物释放，从而实现对氧化应激的抑制和其后续炎症反应的调控。

Description

一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层及其制备 方法
技术领域
本发明涉及水凝胶载体制备技术领域，具体涉及到一种用于治疗氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层及其制备方法。
背景技术
据世界卫生组织统计，心血管疾病已成为全球人类非正常死亡的主要原因之一，是我国所有疾病中最高的发病率和死亡率，且高于肿瘤等其他疾病。给人类的健康与生命造成了巨大的威胁。其中冠心病(冠状动脉性心脏病)是由动脉粥样硬化造成的具有极高危害性的一类血管源性疾病。动脉粥样硬化一般指发生于大、中动脉血管壁内膜的病变，由血浆中脂类物质在血管壁内膜中异常沉积引起的疾病。动脉粥样硬化实际上是一种持续的炎症反应过程，一些基础研究结果从炎症反应角度揭示了导致粥样硬化的危险因子与粥样硬化的发病机制的关系。近年来的研究表明，由多种机制所介导的氧化应激反应会导致细胞凋亡或者细胞坏死，这些原因是诱发心脏受损的重要机制之一。
氧化应激是指产生的过量活性氧通过直接对血管壁细胞造成损失和影响血管壁细胞转录因子水平，调节基因表达，参与冠心病的发生与发展；活性氧是一组在调节各种细胞功能和生物过程中发挥关键性作用的小反应分子，虽然对血管壁稳态起到了重要作用，但是活动氧的过量产生与血管损伤有关。机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如ROS及活性氮类产生量会增加，从而使氧化系统与抗氧化系统失去平衡，氧化程度超出氧化物可承受的清除能力，最后导致体内组织损伤。ROS被定义为未完全进行氧化还原产生的反应物质，最常见的是超氧自由基，其他的包括H2O2、羟基、过氧基和过氧自由基等，适当浓度的活性氧时可以维持细胞内正常能量代谢，但是体内过量活性氧的产生可能在DNA水平和蛋白质水平上产生氧化应激损伤，对心血管系统的结构和功能造成有害影响。冠心病、心肌梗死及脓毒性心肌病等病例的血管病理显示较高水平的ROS过量，过量ROS的产生致内皮细胞和平滑肌功能紊乱。ROS还可引起炎症信号的激活和线粒体介导的凋亡，从而促进心脏疾病的发生与发展。因此设计并开发出针对心血管疾病的炎症及氧化应激环境进行精准治疗的方法是非常必要的。
水凝胶是指在水中可以溶胀并能保持大量水分而又不溶解的交联聚合物，其作为一类与人体组织高度相似的聚合物材料，在生物医学领域已得到广泛的应用。通过调整水凝胶的分子结构，其聚合网状结构可以以智能的方式与环境交互响应。环境响应型水凝胶通常指一类能够根据其所处环境如温度、pH值、压力、氧化还原等物理化学反应或者酶、激素、细胞因子等生化环境等作出特异性响应如降解、释放、组装、黏附、活化等行为的水凝胶。氧化还原性水凝胶可以通过动态共价键(如二硫键、D-A反应、酰腙键等)或非共价键(如氢键、分子间作用力等)等制备。作为新兴的氧化还原性水凝胶，在外界氧化还原刺激环境，如心肌梗死、脓毒性心肌病、动脉粥样硬化等环境下发生结构、形态和性能响应性，因此可以作为药物控制释放的载体应用于心血管疾病中使药物在氧化应激环境下释放，从而达到精准治疗心血管疾病。
大蒜素是内源性气体分子硫化氢的供体，对许多微生物，包括细菌、真菌、病毒等均有抑制作用；对心血管有保护作用，可以缓解心肌梗死、脓毒性心肌病、动脉粥样硬化等心血管疾病。
目前对于治疗心血管疾病的介入载药涂层的问题的研究，具有以下不足：(1)现有的介入材料主要采用喷涂技术，涂层与支架的结合力较差，在植入之后涂层易脱落，黏附能力差，不利于细胞生长；(2)涂层多采用聚合物材料，降解产物有一定的毒副作用，如聚乳酸降解产物带有一定的酸性，会使生理局部微环境发生改变，从而影响正常的生理功能；(3)常用的抗凝血抗增生药物如雷帕霉素、紫杉醇等，治疗前期会抑制增生，因此同时会抑制内皮化的过程，从而引发晚期血栓等副作用针对；(4)不含动态化学键的凝胶不能根据心血管疾病病变微环境的变化响应性释放药物，无法根据病灶的实时情况针对性的治疗疾病。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层及其制备方法，可以制备一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层，使其对特定的病理环境如心肌梗死、脓毒性心肌病、动脉粥样硬化等各种氧化应激环境实现智能化精准药物释放，从而可以通过大蒜素释放的内源性气体硫化氢调控炎症产生的ROS，还可以减少或避免血管内再狭窄的发生、内皮延迟愈合及晚期血栓等风险。
为达上述目的，本发明提供了一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，包括以下步骤：
S1邻苯二酚改性透明质酸
S1.1于水中依次加入MES和透明质酸，溶解后调节溶液pH值至5.4-5.6；
S1.2配制EDC溶液，搅拌均匀后加入步骤S1.1所得溶液中，再加入NHS溶液，持续搅拌；
S1.3将步骤S1.2所得溶液持续搅拌25-35min后，加入多巴胺，并且调节pH值至5.4-5.6，持续搅拌3-5h；
S1.4将步骤S1.3所得溶液于水中透析，再经冷冻干燥，制得改性透明质酸；
S2改性透明质酸和胱胺的交联
S2.1将改性透明质酸溶解，然后加入EDC和NHS，于室温下搅拌1.5-2.5h；
S2.2于步骤S2.1所得溶液中加入胱胺，室温下搅拌22-26h后，于去离子水中透析，再冷却干燥，制得水凝胶；
S3制备水凝胶载药涂层
对基材进行清洗，然后浸没在聚多巴胺溶液中沉积聚多巴胺涂层，然后再依次将水凝胶与大蒜素喷涂在硅片上，清洗后干燥，制得。
采用上述方案的有益效果是：首先改性透明质酸，使用MES为缓冲体系，可以调节pH至弱酸环境，EDC溶液可以活化透明质酸中的羧基，与氨基发生反应，NHS溶液是一种活泼酯中间体，可以用来稳定EDC活化，加入多巴胺溶液，并调节pH值，可以防止多巴胺上的邻苯二酚结构被氧化，使得邻苯二酚结构上的氨基可以与透明质酸上被EDC催化后形成的酯键发生酰胺化反应，形成酰胺键，即将邻苯二酚基团通过化学反应枝接到透明质酸上；其次，改性透明质酸中的羧基和胱胺中的氨基发生反应，从而可以形成-CONH-键；最后使用triz溶液氧化多巴胺从而形成聚多巴胺，再使用聚多巴胺薄膜作为硅片基底与改性水凝胶的链接“纽带”，将改性水凝胶沉积在以聚多巴胺打底的硅片上，再将大蒜素载入具有改性水凝胶的硅片上，完成水凝胶载药涂层的制备；其中MES为吗啉乙磺酸，EDC为1,2-二氯乙烷，NHS为N-羟基丁二酰亚胺。
进一步地，步骤S1、S2和S3中，配制溶液所用的水和清洗所用的水均为RO水。
进一步地，步骤S1中，MES、透明质酸、EDC、NHS和多巴胺的质量比为8-10:8-10:3-5:2-3:4-6，其中，透明质酸的分子量为120wDa。
进一步地，步骤S2中，改性透明质酸、EDC、NHS和胱胺的质量比为1:1-6:1-6:1-6。
进一步地，步骤S2.1中PBS溶液的浓度为0.0067M。
进一步地，步骤S2.2透析过程还包括室温搅拌后将反应后的产物移入截留分子量为Mwco＝2500Da的透析袋，再于去离子水中进行。
采用上述方案的有益效果是：透析袋可以除去盐、少量有机溶剂、生物小分子杂质以及浓缩样品。
进一步地，步骤S2.3中的去离子水的pH值为5.4-5.5。
采用上述方案的有益效果是：保持pH值范围不变，使水凝胶结构稳定。
进一步地，步骤S3还包括以下步骤：用pH为8.0-9.0的Trizma base溶液配制浓度为2mg/mL的多巴胺溶液，再使用该溶液浸没基材。
进一步地，步骤S3中，大蒜素的浓度为2-20μg/mL。
采用上述方案的有益效果是：大蒜素为三硫代烯丙醚类化合物，天然存在于百合科植物大蒜的鳞茎中。对多种革兰氏阳性和阴性菌均有抗菌作用，对杆菌、真菌、巨细胞病毒、阿米巴原虫、阴道滴虫和蛲虫等均有抑制杀灭作用，尤其对大肠杆菌、痢疾杆菌等肠道细菌作用强。大蒜素对心血管疾病和肿瘤疾病有较好的治疗作用，还有抗氧化、抗炎等作用。此外，大蒜素还是一种可以稳定释放H2S的供体材料。
综上所述，本发明具有以下优点：
1、通过本发明制备出的水凝胶载药涂层，其网状结构中含有的动态化学键会凝胶强度增强，令涂层在溶剂中可溶胀但不会分解破坏，并且可以实现溶胶-凝胶的多次可逆转换，具有很强的自修复功能；
2、其结构可以应用于低pH值、高氧化应激环境的心血管病变环境，能够长效、缓释以及智能化治疗心血管类疾病，该水凝胶载药涂层对氧化应激环境具有平衡调控功能，可以调控炎症产生的ROS；
3、大蒜素H2S作为一种气体信号分子对动脉粥样硬化及心肌受损部位微环境的影响与调控，可以促进内皮生长，一定程度上修复损伤的内皮和抑制巨噬细胞生长等；
4、在心血管类疾病的治疗中，具有潜在的优势，特别是，该水凝胶载药涂层能精准治疗由于氧化损伤导致的心血管疾病，有望减少或避免血管内再狭窄的发生、促进心肌疾病修复的潜能。
附图说明
图1为交联形成的水凝胶的网状结构示意图；
图2为邻苯二酚改性透明质酸的示意图；
图3为水凝胶的红外吸收光谱图；
图4为水凝胶的扫描电镜谱图；
图5为水凝胶载药涂层的X射线光电子能谱图及硫元素谱图分峰分析；
图6为水凝胶载药涂层滴加过氧化氢前后的红外吸收光谱对比图；
图7为装载不同浓度大蒜素的水凝胶涂层的水接触角；
图8为不同载药浓度水凝胶涂层孵育内皮细胞的AO染色荧光图；
图9为不同载药浓度水凝胶涂层孵育巨噬细胞的AO染色荧光图；
图10为不同载药浓度的样品表面巨噬细胞炎性因子抗炎因子白介素IL-10和TNF-α表达量的测试结果；
图11为不同载药浓度水凝胶涂层的药物的罗丹明B释放曲线；
其中，a为不同浓度罗丹明B全波长的吸光度值；b为不同浓度罗丹明B在550nm处对应吸光度值的标准曲线；c为载罗丹明B水凝胶涂层在PBS、GSH、H2O2溶液中的药物释放情况。
具体实施方式
实施例1
本发明提供了一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，包括以下步骤：
S1邻苯二酚改性透明质酸
S1.1于RO水中依次加入976mg MES和1g分子量为120wDa透明质酸，溶解后调节溶液pH值至5.5；
S1.2于RO水中加入388mg EDC，搅拌均匀后加入步骤S1.1所得溶液中，再加入288mg NHS，持续搅拌；
S1.3将步骤S1.2所得溶液持续搅拌30min后，加入471mg多巴胺，并且调节pH值至5.5，持续搅拌4h；
S1.4将步骤S1.3所得溶液于RO水中透析48h，冷冻干燥后真空保存，制得改性透明质酸；
S2改性透明质酸和胱胺的交联
S2.1将1g改性透明质酸溶解于95mL0.0067M的PBS溶液中，搅拌均匀；
S2.2于步骤S2.1所得溶液中依次加入77.6mg EDC和288mg NHS，于室温下搅拌2h；
S2.3于步骤S2.2所得溶液中加入2.816g胱胺，室温下搅拌24h后，将反应过后的产物移入截留分子量为Mwco＝2500Da的透析袋中，于pH值为5.5的去离子水中透析24h，冷却干燥后真空保存，制得水凝胶；
S3制备水凝胶载药涂层
S3.1使用乙醇、RO水分别超声清洗硅片3次，每次10min，干燥备用；
S3.2使用pH＝8.5的Trizma base溶液配置浓度为2mg/mL的多巴胺溶液，并将干燥后的硅片浸没在多巴胺溶液后再清洗；
S3.3清洗后干燥，依次将水凝胶与浓度为2μg/mL的大蒜素喷涂在硅片上，清洗后干燥，制得。
实施例2
本发明提供了一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，包括以下步骤：
S1邻苯二酚改性透明质酸
S1.1于RO水中依次加入1g MES和1g分子量为120wDa的透明质酸，溶解后调节溶液pH值至5.6；
S1.2于RO水中加入400mg EDC，搅拌均匀后加入步骤S1.1所得溶液中，再加入300mg NHS，持续搅拌；
S1.3将步骤S1.2所得溶液持续搅拌35min后，加入500mg多巴胺，并且调节pH值至5.6，持续搅拌4h；
S1.4将步骤S1.3所得溶液于RO水中透析48h，冷冻干燥后真空保存，制得改性透明质酸；
S2改性透明质酸和胱胺的交联
S2.1将500mg改性透明质酸溶解于95mL0.0067M的PBS溶液中，搅拌均匀；
S2.2于步骤S2.1所得溶液中依次加入1g EDC和1g NHS，于室温下搅拌1.5h；
S2.3于步骤S2.2所得溶液中加入胱胺，室温下搅拌24h后，将反应过后的产物移入截留分子量为Mwco＝2500Da的透析袋中，于pH值为5.5的去离子水中透析24h，冷却干燥后真空保存，制得水凝胶；
S3制备水凝胶载药涂层
S3.1使用乙醇、RO水分别超声清洗硅片3次，每次10min，干燥备用；
S3.2使用pH＝8.5的Trizma base溶液配置浓度为2mg/mL多巴胺溶液，并将干燥后的硅片浸没在多巴胺溶液中并清洗；
S3.3清洗后干燥，依次将水凝胶与浓度为10μg/mL的大蒜素喷涂在硅片上，清洗后干燥，制得。
实施例3
本发明提供了一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，包括以下步骤：
S1邻苯二酚改性透明质酸
S1.1于RO水中依次加入900mg MES和900mg分子量为120wDa的透明质酸，溶解后调节溶液pH值至5.5；
S1.2于RO水中加入500mg EDC，搅拌均匀后加入步骤S1.1所得溶液中，再加入350mg NHS，持续搅拌；
S1.3将步骤S1.2所得溶液持续搅拌35min后，加入550mg多巴胺，并且调节pH值至5.5，持续搅拌5h；
S1.4将步骤S1.3所得溶液于水中透析45h，冷冻干燥后真空保存，制得改性透明质酸；
S2改性透明质酸和胱胺的交联
S2.1将1g改性透明质酸溶解于95mL0.0067M的PBS溶液中，搅拌均匀；
S2.2于步骤S2.1所得溶液中依次加入5g EDC和6g NHS，于室温下搅拌2.5h；
S2.3于步骤S2.2所得溶液中加入3g胱胺，室温下搅拌26h后，将反应过后的产物移入截留分子量为Mwco＝2500Da的透析袋中，于pH值为5.5的去离子水中透析26h，冷却干燥后真空保存，制得水凝胶；
S3制备水凝胶载药涂层
S3.1使用乙醇、RO水分别超声清洗硅片3次，每次10min，干燥备用；
S3.2使用pH＝8.5的Trizma base溶液配制浓度为2mg/mL的多巴胺溶液，并将干燥后的硅片浸没在多巴胺溶液中并清洗；
S3.3清洗后干燥，依次将水凝胶与浓度为20μg/mL大蒜素喷涂在硅片上，清洗后干燥，制得。
实施例4
实施例4的步骤与实施例3一致，仅步骤S3.3中大蒜素的浓度为5μg/mL。
实施例5
实施例5的步骤与实施例3一致，仅步骤S3.3中大蒜素的浓度为15μg/mL。
对比例1
S1邻苯二酚改性透明质酸
S1.1于RO水中依次加入900mg MES和900mg分子量为120wDa的透明质酸，溶解后调节溶液pH值至5.5；
S1.2于RO水中加入500mg EDC，搅拌均匀后加入步骤S1.1所得溶液中，再加入350mg NHS，持续搅拌；
S1.3将步骤S1.2所得溶液持续搅拌35min后，加入550mg多巴胺，并且调节pH值至5.5，持续搅拌5h；
S1.4将步骤S1.3所得溶液于水中透析45h，冷冻干燥后真空保存，制得改性透明质酸；
S2改性透明质酸和胱胺的交联
S2.1将1g改性透明质酸溶解于95mL0.0067M的PBS溶液中，搅拌均匀；
S2.2于步骤S2.1所得溶液中依次加入5g EDC和6g NHS，于室温下搅拌2.5h；
S2.3于步骤S2.2所得溶液中加入3g胱胺，室温下搅拌26h后，将反应过后的产物移入截留分子量为Mwco＝2500Da的透析袋中，于pH值为5.5的去离子水中透析26h，冷却干燥后真空保存，制得水凝胶；
S3制备水凝胶载药涂层
S3.1使用乙醇、RO水分别超声清洗硅片3次，每次10min，干燥备用；
S3.2使用pH＝8.5的Trizma base溶液配制浓度为2mg/mL的多巴胺溶液，并将干燥后的硅片浸没在多巴胺溶液中并清洗；
S3.3清洗后干燥，将水凝胶喷涂在硅片上，清洗后干燥，制得。
试验例1
对实施例1制备的水凝胶载药涂层进行红外吸收光谱测试，测试结果见图3。由图3可知，在2883cm-1处发现吸收峰，说明成功合成O＝C-键；在1314cm-1处发现吸收峰，说明成功合成酰胺的C-N键(透明质酸中的羧基-COOH和DOPA中的氨基发生反应形成C＝O、C-N键)，这两种键的吸收峰出现，说明我们成功的改性了透明质酸。在1207cm-1处发现吸收峰，说明该物质中存在-C-S-键，说明改性的透明质酸已经成功的和胱胺交联(胱胺自身含有C-S键，出现C-S键说明水凝胶中有胱胺，透明质酸和胱胺成功交联)。
试验例2
对实施例1-5以及对比例制备的水凝胶载药涂层进行扫描电子显微镜分析，观察不同浓度载药涂层的表面形貌以及药物分布是否均匀，将载药涂层在3000x放大率的扫描电子显微镜下观察形貌，见图4。
由图4可知，别为载大蒜素浓度为0μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL和20μg/mL的水凝胶的涂层经过烘箱烘干后在扫描电镜下1000倍的形貌图谱图。当水凝胶涂层没有装载大蒜素时，涂层表面相对光滑致密没有裂纹，但是在表面上有不同数量的小的颗粒状物质，这可能是在沉积聚多巴胺基底的时候，多巴胺氧化形成了大小较为均匀的聚多巴胺颗粒约500nm，被水凝胶涂层吸附后有剩余，当水凝胶涂层装载大蒜素时，药物会与涂层表面的聚多巴胺颗粒相互结合，从而使得表面相对均匀。而加入过量药物时，过量的药物分子在表面聚集，从而增加了表面的粗糙度。
试验例3
对实施例4制备的水凝胶载药涂层进行X射线光电子能谱分析，判断药物装载是否成功：利用XPS检测载药涂层的元素含量以及S元素的高分辨率图谱反映不同浓度水凝胶载药涂层的药物含量，侧面反映了药物装载是否成功(见图5)。
由图5可知，载药浓度为5μg/mL的涂层(c-HA-Cys-DADS)与未载药的涂层(c-HA-Cys)均含有C、O、N、S的峰，是因为改性透明质酸和胱胺中均含有C、N、O、S的元素，而大蒜素因其含有-RSS(O)R-基团使得载药涂层在165.3eV处的吸收峰增加。
试验例4
测试水凝胶载药涂层是否具有氧化还原性，在制备好的涂层表面滴加一定量的过氧化氢溶液，之后进行红外吸收光谱测试、扫描电子显微镜分析，与最初水凝胶的数据进行对比分析，观察S-S键是否断裂，表面形貌是否发生明显变化，从而判断出来该涂层是否具有氧化还原性(见图6)。
由图6可知，在1240cm-1处发现吸收峰，说明成功合成-SO2-O-键，说明二硫键(-s-s)被氧化，该水凝胶涂层可以被过氧化氢氧化，具有ROS响应能力，可以在炎症高于正常组织ROS环境下，智能化释放药物。
试验例5
对实施例1-5和对比例制备得到的水凝胶载药涂层以及空白硅片进行水接触角测试，使用德国产的OCA358测角度仪测量，将每次测量的水滴降落量设置为3μl，所有测量至少重复5次，每次3个平行样本，得到的结果见图7和表1：
表1 水接触角数据表
Figure BDA0002992269050000131
由表1和图7可知，水凝胶会使涂层表面粗糙度增加；装载不同浓度的大蒜素后，会不同程度的降低涂层的粗糙度以及提高涂层的亲水性。装载DADS药物浓度为5μg/mL时水接触角较小，说明此浓度的载药涂层亲水性最好。
试验例6
通过与经过氧化低密度脂蛋白造模的内皮细胞的培养，判断载药涂层是否调节氧化应激环境的能力(如图8所示)。
空白水凝胶涂层对照组的内皮细胞在1day、3day、5day时都在正常增殖。加入低密度脂蛋白(oxldl)后，内皮细胞数量明显减少，且细胞出现破裂等情况，说明氧化低密度脂蛋白对内皮细胞造模成功，成功制造出氧化应激环境。随着大蒜素的加入，内皮细胞的数量相对增多，说明载药涂层对损伤后的内皮细胞起到了修复作用，从而说明载药涂层对氧化应激环境起到了调节作用。
试验例7
通过与巨噬细胞的培养，判断涂层对巨噬细胞的增殖是否具有抑制作用(如图9所示)。
由图9可知，不同载药浓度水凝胶涂层孵育巨噬细胞在1day、3days和5days时的200倍放大倍数下的AO染色荧光图。可以看出，从1day至5days，空白水凝胶涂层组的巨噬细胞的数量随着时间增长而快速增长且细胞形态较好。反观载大蒜素水凝胶涂层组，与空白凝胶组相比，巨噬细胞的增殖均受到不同程度的抑制。
试验例8
对水凝胶载药涂层进行抗炎实验，检测其是否具有抗炎能力：巨噬细胞在外界环境改变的情况下会分泌大量的细胞因子，如炎性因子白介素-1，TNF-α和促修复因子VEGF，白介素IL-10，这两类细胞因子的表达量会影响组织的炎症加剧或组织愈合。图10从左至右依次为不同载药浓度的样品表面巨噬细胞炎性因子抗炎因子白介素IL-10和TNF-α表达量的测试结果。图10中，由左至右依次为：空白硅片、对比例、实施例1、实施例4、实施例2和实施例3的数据。
由图10可知：IL-10在1D时的表达量差异不大，在3D、5D时S浓度为5μg/mL大蒜素制备的载药涂层表面白介素IL-10的表达量明显高于其余组分，可能是因为用浓度为5μg/mL大蒜素制备的载药涂层具有较好的抗炎效果，会分泌较多抗炎因子。
试验例9
测试载药水凝胶涂层的药物释放性能
本发明制备的水凝胶中含有大量的二硫键，二硫键可以在氧化或者还原条件下断裂，从而使得水凝胶孔隙增加，从而加快药物的释放，因此水凝胶可以响应型释放药物。本试验例中使用罗丹明B(Rhodamine B)来作为模型药物。
在合成好的水凝胶溶液中加入5mg罗丹明B并搅拌均匀。把制备好的四种装载罗丹明B的水凝胶放置在2mL使用PBS配置的2mM H2O2缓冲液中，对照组使用2mL的PBS缓冲液。在1h、6h、12h、24h、72h和144h时，使用移液枪取出100μL至96孔板，使用酶标仪检测其在550nm处的吸光度值，并补回等量的原溶液。同时取一定量的罗丹明B梯度稀释，绘制标椎曲线。
如图11所示是水凝胶在PBS缓冲液以及2mM H2O2的PBS缓冲液中的罗丹明释放曲线。可以看出，水凝胶在前6小时均有明显的突释情况，释放曲率极快，可能是由于罗丹明B药物分子可以在水凝胶网络中自由扩散导致。释放25h后，释放速率开始趋于稳定，开始平稳释放。
综上所述，本发明成功地改性了透明质酸并且成功地将改性透明质酸与胱胺交联，并以此制备出具有H2S释放功能的透明质酸(HA)涂层，该涂层中含有稳定的具有氧化还原功能的交联基团，并且大蒜素的载入，使得涂层可以针对特定的病理环境如心肌梗死、脓毒性心肌病、动脉粥样硬化等各种氧化应激引起的心脏疾病实现智能化精准药物释放，从而实现对氧化应激的抑制和其后续炎症反应的调控。
虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了详细地描述，但不应理解为对本专利的保护范围的限定。在权利要求书所描述的范围内，本领域技术人员不经创造性劳动即可作出的各种修改和变形仍属本专利的保护范围。

Claims (7)

1.一种用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1邻苯二酚改性透明质酸
S1.1于水中依次加入MES和透明质酸，溶解后调节溶液pH值至5.4-5.6；
S1.2配制EDC溶液，搅拌均匀后加入步骤S1.1所得溶液中，再加入NHS溶液，持续搅拌；
S1.3将步骤S1.2所得溶液持续搅拌25-35min后，加入多巴胺，并且调节pH值至5.4-5.6，持续搅拌3-5h；
S1.4将步骤S1.3所得溶液于水中透析，再经冷冻干燥，制得改性透明质酸；
S2改性透明质酸和胱胺的交联
S2.1将改性透明质酸溶解，然后加入EDC和NHS，于室温下搅拌1.5-2.5h；
S2.2于步骤S2.1所得溶液中加入胱胺，室温下搅拌22-26h后，于去离子水中透析，再冷却干燥，制得水凝胶；
S3制备水凝胶载药涂层
对基材进行清洗，然后浸没在聚多巴胺溶液中沉积聚多巴胺涂层，然后再依次将水凝胶与大蒜素喷涂在硅片上，清洗后干燥，制得。
2.如权利要求1所述的用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，MES、透明质酸、EDC、NHS和多巴胺的质量比为8-10:8-10:3-5:2-3:4-6，其中，透明质酸的分子量为120wDa。
3.如权利要求1所述的用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，改性透明质酸、EDC、NHS和胱胺的质量比为1:1-6:1-6:1-6。
4.如权利要求1所述的用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤S2.2透析过程还包括室温搅拌后将反应后的产物移入截留分子量为Mwco＝2500Da的透析袋，再于去离子水中进行。
5.如权利要求1所述的用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤S3还包括以下步骤：用pH为8.0-9.0的Trizma base溶液配制浓度为2mg/mL的多巴胺溶液，再使用该溶液浸没基材。
6.如权利要求1所述的用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，大蒜素的浓度为2-20μg/mL。
7.采用权利要求1-6任一项所述的用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层的制备方法制备的用于氧化应激环境下治疗的水凝胶载药涂层。
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