CN115337470A

CN115337470A - 一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法

Info

Publication number: CN115337470A
Application number: CN202210854786.8A
Authority: CN
Inventors: 王翎任; 丁红艳; 周广宏; 叶玮; 刘静静
Original assignee: Huaiyin Institute of Technology
Current assignee: Huaiyin Institute of Technology
Priority date: 2022-07-20
Filing date: 2022-07-20
Publication date: 2022-11-15
Anticipated expiration: 2042-07-20
Also published as: CN115337470B

Abstract

本发明公开了一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，属于生物医用材料技术领域，本发明的步骤：S1.高磺化度水溶性高分子链（HSC）的制备；S2.多巴胺接枝HSC；S3.多巴胺接枝的HSC与壳聚糖组装制备高磺化度表面；S4.交联组装层提升稳定性。本发明结合层层自组装和多巴胺后交联技术制备稳定的表面涂覆层，在涂覆层表面引入高比例磺酸基和酚羟基等生物活性基团，利用高磺化度表面以及酚羟基对人体血管内皮细胞的促生长作用和对人体血管平滑肌细胞的抑制作用来达到促进内皮细胞增殖的同时抑制平滑肌细胞增生的目的，解决了临床上常用的抗增生药物支架（如雷帕霉素、紫杉醇等）在抗平滑肌细胞增生的同时抑制内皮细胞增殖的问题。此外，结合多巴胺交联技术保证了涂覆层的稳定性，并使涂覆层可在任意基材表面形成稳定结构。

Description

一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法

技术领域

本发明属于生物高分子材料领域，涉及一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法。

背景技术

动脉粥样硬化是影响人类健康的主要疾病之一。目前主要采用金属血管支架植入的方式进行治疗。但是，支架撑开造成的植入部位血管内壁损伤会引发血栓、炎症、内膜增生和血管重塑等一系列病理反应，导致支架内再狭窄。为了抑制因平滑肌细胞过度增殖造成的血管内膜增生，临床上常采用搭载特定药物的血管支架强力抑制平滑肌细胞的迁移与增殖。虽然该类型支架可以有效抑制平滑肌细胞的生长，但搭载的药物同时也会对内皮细胞的生长、迁移与增殖产生不良影响，这极大地降低了血管支架的治疗效果。此外，血管支架搭载的各种功能性药物还存在稳定性较差、释放速度过快等缺点。即使利用分子识别技术以避免药物分子构象的改变，但其仍然无法避免被体内生物物质替换或水解。因此，开发具有内皮细胞友好型的抗内膜增生表面依然是一个瓶颈。

近年来研究发现，某些生物活性分子的功能性来源于其独特的分子构象和功能基团。在众多生物活性分子中，肝素既是临床上常用的抗凝剂之一，也是生物医学领域常用的改性剂之一。不仅具有优异的抗凝血性能，还能结合多种生长因子以促进内皮细胞增殖，并对平滑肌细胞增殖有明显的特异性抑制作用。但直接使用肝素不仅难以保证活性，还易导致骨质疏松、自发性出血和血小板减少等症状。随着研究的深入，研究者发现肝素是通过离子键结合血管内皮生长因子以促进内皮细胞增殖。而肝素对平滑肌细胞的抑制作用也仅因为其较高的磺化度。此外，还有研究发现带有酚羟基的表面对内皮细胞和平滑肌细胞也能起到类似高磺化度表面的作用。如能在血管支架表面引入高密度的磺酸基和酚羟基，即可设计出一种较为完美的内皮细胞友好型抗内膜增生血管支架表面修饰层。

层层自组装是一种常见的表面改性方式，主要是利用氢键、电荷转移或静电力等作用在基材表面涂覆聚电解质层。通过不同电性和功能生物分子的交替组装，精确调控材料表面涂覆层的化学结构。但这种方式最大的缺点是涂覆层内部结合力弱，在体内环境下难以保持稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，结合采用层层自组装和多巴胺后交联技术，克服现有技术存在的缺陷。

本发明的技术方案如下：

一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，包括以下步骤：

S1. 高磺化度水溶性高分子链HSC的制备：以双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐、双3-氨基-4-羟苯基砜为反应物,或以双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐、双3-氨基-4-羟苯基砜、双（4-氟苯基）砜、双（4-羟苯基）砜为反应物，均以无水碳酸钾为催化剂，溶于有机溶剂中，在氮气流通条件下140-190°C缩聚，产物用顺丁烯二酸酐处理，获得HSC；

S2.多巴胺接枝HSC：将多巴胺和HSC加入到2-吗啉乙磺酸缓冲液中，以碳二亚胺和N-酚羟基琥珀酰亚胺为催化剂，在氮气保护条件下将多巴胺接枝于HSC侧链；

S3.多巴胺接枝的HSC与壳聚糖组装制备高磺化度表面：分别配制多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液、多巴胺接枝的HSC水溶液和壳聚糖醋酸溶液；先以多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液处理基材表面，然后将基材循环浸没于壳聚糖醋酸溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液中制备涂覆层；

S4. 交联组装层提升稳定性：使用氧化剂交联涂覆层。

进一步改进方案是，步骤S1中，以双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐、双3-氨基-4-羟苯基砜作为反应物，其中端基是羟基的单体和端基是氟基的单体摩尔比例为1:1；或以双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐、双3-氨基-4-羟苯基砜、双（4-氟苯基）砜、双（4-羟苯基）砜作为反应物，投入的摩尔比1～5:1～5:0～4:0～4，其中端基是羟基的单体和端基是氟基的单体摩尔比例为1:1，双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐和双3-氨基-4-羟苯基砜两种单体摩尔比例之和必须大于等于60%；投入的无水碳酸钾与端基是氟基的单体摩尔比为1:1～2:1；所述的有机溶剂为N，N’-二甲基甲酰胺、N，N’-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮中的一种或两种混合；

进一步改进方案是，步骤S1中，所述的高温缩聚采用反应温度先在145～160℃油浴中反应4～6 h，然后将温度提升至180℃以上继续反应12 h以上。

进一步改进方案是，步骤S1中，所述的产物用顺丁烯二酸酐处理，是采用降温至80～120℃后加入过量顺丁烯二酸酐反应1 h以上。

进一步改进方案是，步骤S2中，所述的将多巴胺接枝于HSC侧链，投入的多巴胺和HSC中羧酸基团的摩尔比为0.2:1～3:1，投入的碳二亚胺和N-酚羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1～5:1，N-酚羟基琥珀酰亚胺与HSC中羧酸基团的摩尔比为0.2:1～3:1；反应温度为20-35℃。

进一步改进方案是，步骤S2中，得到多巴胺接枝于HSC侧链后，采用饱和氯化钠溶液和乙醇消除HSC和多巴胺之间的静电作用。即将多巴胺接枝的HSC浸泡于饱和氯化钠溶液和乙醇中。

进一步改进方案是，步骤S3中，所述的多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液的浓度分别为1mg/mL~20 mg/mL，壳聚糖醋酸溶液的浓度为1wt%~5wt%；所述多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液的pH值在5~6之间，多巴胺接枝的HSC水溶液的pH值在3～4之间，壳聚糖醋酸溶液的pH值在7～8之间。

进一步改进方案是，步骤S3中，所述的基材浸没于多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液的时间为6～12 h，然后循环浸没于壳聚糖醋酸溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液中，每次时间为10～15 min。

进一步改进方案是，所述的循环浸没于壳聚糖醋酸溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液中的次数至少各为5次以上，第一次和最后一次须浸没于多巴胺接枝的HSC水溶液。

进一步改进方案是，步骤S4中，所述的氧化剂为高锰酸钾、高碘酸钾、高碘酸钠、过氧化钠中的一种或两种以上混合。

有益效果：

多巴胺作为生物医学领域常用的生物粘接剂可与层层自组装技术结合，不仅能提升组装层的稳定性，其自身带有的酚羟基也能作为改性基团发挥作用。本发明设计一种多功能的表面涂覆层，通过在涂覆层表面引入大量磺酸基和酚羟基来实现提升内皮细胞相容性和抑制平滑肌细胞增生的目的。磺酸基由聚阴离子层高磺化度水溶性高分子提供，酚羟基由多巴胺提供，此外多巴胺还用于提升组装层的稳定性。因此，该表面涂覆层具有巨大的应用潜力。

本发明结合层层自组装和多巴胺后交联技术在生物材料表面构建涂覆层，与现有技术相比，本发明涂覆层表面引入了大量磺酸基和酚羟基，不仅能促进血管内皮细胞的增殖，还可特异性抑制平滑肌细胞增生，而多巴胺可增强涂覆层的稳定性并赋予涂覆层可稳定附着于任意生物材料表面的性能。

从图1和图2可知，实施例2组装15个双层（不包括最底层），内皮细胞的增殖效果和抑制平滑肌细胞增生效果都为最好。经实验知，组装15个以上双层，对内皮细胞的增殖效果和抑制平滑肌细胞增生效果提升很小。

附图说明

图1为人脐静脉内皮细胞对比例1和实施例1-5上培养不同时间后的细胞毒性（MTT数值）。

图2为人脐动脉平滑肌细胞对比例1和实施例1-5上培养不同时间后的细胞毒性（MTT数值）。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，以下结合实施例对本发明提供的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

此外，应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

对比例1

以生物医学领域常用的金属钛作为对比例。

为了便于比较反应物质以及组装层不同带来的不同效果，因此，实施例关于反应时间、温度、P_H值等都用具体数值。

实施例1

一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，包括如下步骤：

(1)高磺化度水溶性高分子链（HSC）的制备：以双（3-磺酸基-4-氟苯基）砜钠盐和双（3-氨基-4-羟苯基）砜为反应物，无水碳酸钾为催化剂，投入的摩尔比为1：1：1，溶于有机溶剂N，N’-二甲基甲酰胺中，将反应釜先抽真空再充氮气如此反复5次，每次5min，然后保持氮气流通环境，缩聚采用反应温度先在155℃油浴中反应5.5 h，然后将温度提升至180℃继续反应12 h得到产物，降温至100 ℃后加入3倍摩尔比的顺丁烯二酸酐反应1 h。产物用使用分子量3500的透析袋在去离子水中透析提纯3天，冻干获得HSC。

(2)多巴胺接枝HSC：将 0.2 g HSC和 0.05 g 多巴胺溶解在 30 mL MES 缓冲液（0.05 M，pH 5.3，0.1 M NaCl）中。完全溶解后，加入碳二亚胺（0.1915 g，1 mmol）和N-酚羟基琥珀酰亚胺（0.0575 g，0.5 mmol），在室温（25℃）氮气保护下剧烈搅拌混合物24小时，并通过添加 1 M HCl将 pH 值保持在 5.3。反应停止后，依次加入3mL饱和NaCl溶液和60mL冷乙醇。以 1000 g 离心 10 分钟后，将沉淀重新溶解在 1 M NaCl溶液中，并再次加入乙醇。乙醇与NaCl溶液的体积比为 10:1。该纯化步骤重复 3 次以最小化 HSC和多巴胺之间的静电相互作用。

(3)多巴胺接枝的HSC与壳聚糖组装制备高磺化度表面：配置多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液的浓度分别为5 mg/mL，壳聚糖醋酸溶液的浓度为1wt%。所述多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液的pH值在8.5，多巴胺接枝的HSC水溶液的pH值在3.5，壳聚糖醋酸溶液的pH值在7.5。

先将基材金属钛浸没于多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液中，时间为12 h，以此为基底层。然后将带有基底层的金属钛浸没于壳聚糖醋酸溶液中，时间为15 min，之后在去离子水中进行三次漂洗（每次20 s），然后再浸没于多巴胺接枝的HSC水溶液中，时间为15min，之后在去离子水中进行三次漂洗（每次20 s），此为1个双层。然后循环涂覆组装共10个双层（最外层为多巴胺接枝的HSC层）。每次洗涤程序后均不进行干燥步骤，最后一次清洗后对组装有涂覆层的基材进行冷冻干燥。

(4)交联组装层提升稳定性：将步骤（3）得到的半成品用高碘酸钠氧化交联，通过在 1 mM NaIO₄水溶液中氧化 12 h，使涂覆层与基材交联。

实施例2

先将基材金属钛浸没于多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液中，时间为12 h，以此为基底层。然后将带有基底层的金属钛浸没于壳聚糖醋酸溶液中，时间为15 min，之后在去离子水中进行三次漂洗（每次20 s），然后再浸没于多巴胺接枝的HSC水溶液中，时间为15min，之后在去离子水中进行三次漂洗（每次20 s），此为1个双层。然后循环涂覆组装共15个双层（最外层为多巴胺接枝的HSC层）。每次洗涤程序后均不进行干燥步骤，最后一次清洗后对组装有涂覆层的基材进行冷冻干燥。

其余实施如实施例1.

实施例3

先将基材金属钛浸没于多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液中，时间为12 h，以此为基底层。然后将带有基底层的金属钛浸没于壳聚糖醋酸溶液中，时间为15 min，之后在去离子水中进行三次漂洗（每次20 s），然后再浸没于多巴胺接枝的HSC水溶液中，时间为15min，之后在去离子水中进行三次漂洗（每次20 s），此为1个双层。然后循环涂覆组装共15个双层后再将材料浸没于壳聚糖醋酸溶液中，时间为15 min，之后在去离子水中进行三次漂洗（每次20 s）。每次洗涤程序后均不进行干燥步骤。最后一次清洗后对组装有涂覆层的基材进行冷冻干燥。其余实施如实施例1。

实施例4

(1)高磺化度水溶性高分子链（HSC）的制备：以双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐、双3-氨基-4-羟苯基砜、双（4-氟苯基）砜、双（4-羟苯基）砜为反应物，无水碳酸钾为催化剂，投入的摩尔比2:4:3:1:5，溶于有机溶剂N，N’-二甲基甲酰胺中，将反应釜先抽真空再充氮气如此反复5次，每次5min，然后保持氮气流通环境，缩聚采用反应温度先在155℃油浴中反应5.5 h，然后将温度提升至180℃继续反应12 h得到产物，降温至100 ℃后加入3倍摩尔比的顺丁烯二酸酐反应1 h。产物用使用分子量3500的透析袋在去离子水中透析提纯3天，冻干获得HSC。

其余实施如实施例1.

实施例5

(1)高磺化度水溶性高分子链（HSC）的制备：以双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐、双3-氨基-4-羟苯基砜、双（4-氟苯基）砜、双（4-羟苯基）砜为反应物，无水碳酸钾为催化剂，投入的摩尔比5:1:4:5，溶于有机溶剂N，N’-二甲基甲酰胺中，将反应釜先抽真空再充氮气如此反复5次，每次5min，然后保持氮气流通环境，缩聚采用反应温度先在155℃油浴中反应5.5h，然后将温度提升至180℃继续反应12 h得到产物，降温至100 ℃后加入3倍摩尔比的顺丁烯二酸酐反应1 h。产物用使用分子量3500的透析袋在去离子水中透析提纯3天，冻干获得HSC。

其余实施如实施例1。

Claims

1.一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

S3.多巴胺接枝的HSC与壳聚糖组装制备高磺化度涂覆层：分别配制多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液、多巴胺接枝的HSC水溶液和壳聚糖醋酸溶液；先以多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液处理基材表面，然后将基材循环浸没于壳聚糖醋酸溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液中制备涂覆层；

S4. 交联组装层提升稳定性：使用氧化剂交联涂覆层。

2.根据权利要求1所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：步骤S1中，以双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐、双3-氨基-4-羟苯基砜作为反应物，其中端基是羟基的单体和端基是氟基的单体摩尔比例为1:1；

或以双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐、双3-氨基-4-羟苯基砜、双（4-氟苯基）砜、双（4-羟苯基）砜作为反应物，投入的摩尔比1～5:1～5:0～4:0～4，其中端基是羟基的单体和端基是氟基的单体摩尔比例为1:1，双3-磺酸基-4-氟苯基砜钠盐和双3-氨基-4-羟苯基砜两种单体摩尔比例之和必须大于等于60%；

投入的无水碳酸钾与端基是氟基的单体摩尔比为1:1～2:1；所述的有机溶剂为N，N’-二甲基甲酰胺、N，N’-二甲基乙酰胺或N-甲基吡咯烷酮中的一种或两种混合。

3.根据权利要求1所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述的高温缩聚采用反应温度先在145～160℃油浴中反应4～6 h，然后将温度提升至180℃以上继续反应12 h以上。

4.根据权利要求1所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：步骤S1中，所述的产物用顺丁烯二酸酐处理，是采用降温至80～120℃后加入过量顺丁烯二酸酐反应1 h以上。

5.根据权利要求1所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：步骤S2中，所述的将多巴胺接枝于HSC侧链，投入的多巴胺和HSC中羧酸基团的摩尔比为0.2:1～3:1，投入的碳二亚胺和N-酚羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1:1～5:1，N-酚羟基琥珀酰亚胺与HSC中羧酸基团的摩尔比为0.2:1～3:1；反应温度为20-35℃。

6.根据权利要求1所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：步骤S2中，得到多巴胺接枝于HSC侧链后，采用饱和氯化钠溶液和乙醇消除HSC和多巴胺之间的静电作用。

7.根据权利要求1所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述的多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液的浓度分别为1mg/mL~20mg/mL，壳聚糖醋酸溶液的浓度为1wt%~5wt%；所述多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液的pH值在5~6之间，多巴胺接枝的HSC水溶液的pH值在3～4之间，壳聚糖醋酸溶液的pH值在7～8之间。

8. 根据权利要求1所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：步骤S3中，所述的基材浸没于多巴胺接枝的HSC磷酸缓冲盐溶液的时间为6～12 h，然后循环浸没于壳聚糖醋酸溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液中，每次时间为10～15 min。

9.根据权利要求8所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：所述的循环浸没于壳聚糖醋酸溶液和多巴胺接枝的HSC水溶液中的次数至少各为5次以上，第一次和最后一次须浸没于多巴胺接枝的HSC水溶液。

10.根据权利要求1所述的一种内皮细胞友好型抗内膜增生涂覆层的制备方法，其特征在于：步骤S4中，所述的氧化剂为高锰酸钾、高碘酸钾、高碘酸钠、过氧化钠中的一种或两种以上混合。