CN110237312B - 一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层及其制备方法和应用。所述构建方法包括如下步骤：S1：载miRNAs纳米颗粒的构建；S2：载miRNAs纳米颗粒的修饰；S3：聚多巴胺涂层的沉积与巯基化；S4：载miRNAs纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层的制备。本发明通过涂层的构建，可实现对载miRNAs纳米颗粒的控制释放和细胞内传递，选择性抑制凝血反应和平滑肌过度增殖，促进内皮细胞生长，有效改善了材料的生物相容性。

Description

一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于可降解高分子材料和纳米材料的制备技术以及生物医用材料表面改性技术领域，具体涉及一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层及其制备方法和应用。
背景技术
生物医用金属材料(如，316L不锈钢，钴合金，钛及钛合金等)在心血管内植入材料与器械方面(如，血管支架、血栓滤器等)具有非常广泛的应用。然而，由材料或器械植入而引发的表面凝血反应及内皮功能紊乱等并发症常常导致植入的失败。如，冠脉药物洗脱血管支架植入后会引起内皮损伤愈合延迟，进而引发晚期血栓及内膜增生，危及患者生命。因此，通过改变金属材料的表面性能和功能来合理调节血管内生物及生理反应，对改善植入物的生物相容性和安全性有非常重要的研究价值和应用意义。
通过材料表面生物功能设计与微环境构建，原位调控血管细胞生物学应答和诱导内皮再生是目前研究的主要方向。目前的研究主要通过在材料表面引入一种或多种具有特定生物功能的生物大分子，来实现对血液成分或血管细胞行为的调控。然而，表面涂层中的生物活性蛋白和细胞因子等成分的免疫原性问题以及在体内环境下的快速失活行为均限制了其临床应用。此外，当前研究中所用生物大分子存在的作用靶点多样、作用机制复杂的问题，难以实现在体内复杂环境下对血液成分和血管细胞行为的精准调控。
随着基因诊断技术的进步，越来越多的研究者发现，许多非编码小核酸序列(miRNAs，21-25nt.)在体内的差异化表达与心血管疾病的发生发展密切相关。这些miRNAs主要通过与细胞内特定mRNA上的靶序列结合来诱导mRNA降解或抑制基因表达，进而对单一或多种类型细胞的生物学应答进行精准调控，控制疾病进展。目前，已有多种miRNAs被发现与材料植入后血栓、内膜增生及血管功能修复密切相关。例如，miR-126是一种在血管内皮细胞中高表达的小核酸序列，具有调节血管内炎症应答和恢复损伤内皮功能的重要作用；miR-145是一种血管平滑肌细胞特异性的小核酸序列，具有抑制平滑肌细胞增殖和迁移的功能；miR-21则表现出选择性促进平滑肌细胞生长，抑制内皮细胞再生的功能。miRNAs精准的靶向性和精确的调节机制使其得到广泛的关注，但如何降低其脱靶效应，提高药物传递性和作用有效性是目前亟需解决的问题。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中非编码小核酸序列应用于表面涂层中是存在脱靶效应高，药物传递性和作用有效性较低的缺陷和不足，提供一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建方法。本发明利用PLL与miRNAs及肝素之间的相互作用，可制备出载miRNAs的PLL/肝素纳米颗粒；进一步使用具有膜穿透特性的KALA多肽进行修饰，可提高载miRNAs纳米颗粒的细胞膜穿透能力和溶酶体逃逸能力。另一方面，透明质酸水凝胶是一种具有良好生物相容性的生物材料，常用作生长因子、药物以及基因的运输载体。将载miRNAs的纳米颗粒包埋于具有MMP-2敏感性的透明质酸水凝胶中，并固定于心血管金属材料表面，构建载miRNAs的纳米复合涂层，将有助于进一步控制纳米颗粒中各类生物成分的持续释放，提高miRNAs和多种生物分子的传递性和有效性。本发明提供的载miRNAs的纳米复合涂层可通过miRNAs的控释及多种生物分子的协同作用精准调节血液和血管细胞应答，降低血栓和再狭窄的发生。
本发明的另一目的在于提供一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层。
本发明的另一目的在于提供上述可降解的载miRNAs纳米复合涂层在制备生物医疗器械中的应用。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建方法，包括如下步骤：
S1：载miRNAs纳米颗粒的构建：将多聚赖氨酸溶液和miRNAs mimics溶液混合，静置，然后在搅拌条件下加入肝素钠溶液，得载miRNAs的纳米颗粒悬液；所述多聚赖氨酸和miRNAs的质量摩尔比为1:0.1～10mg/nmoL；
S2：载miRNAs纳米颗粒的修饰：将载miRNAs的纳米颗粒悬液离心弃上清液后重悬于MES缓冲液，加入活化剂活化后，振荡，离心弃上清液后重悬于KALA多肽水溶液中，振荡，得KALA多肽修饰的纳米颗粒；
S3：聚多巴胺涂层的沉积与巯基化：将金属材料浸泡于多巴胺溶液中，静置反应，清洗后在金属材料表面沉积一层多巴胺涂层，重复浸泡—静置反应—清洗的步骤，在金属材料表面沉积多层多巴胺涂层；然后浸没于双端巯基化的PEG水溶液，静置反应得巯基化改性的多巴胺涂层样品；
S4：载miRNAs纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层的制备：向透明质酸-马来酰亚胺溶液中加入双端巯基化的MMP-2敏感性多肽和S2所得KALA多肽修饰的纳米颗粒，然后将S3所得巯基化改性的多巴胺涂层样品浸没，浸渍提拉，干燥即得所述可降解的载miRNAs纳米复合涂层。
多聚赖氨酸(PLL)是一种富含氨基的氨基酸聚合物，在酸性及中性环境下呈强正电性，能与成负电性的肝素通过静电交互作用形成具有三维结构的纳米粒子。
S1中利用聚阳离子电解质PLL与电负性的miRNAs相互作用，实现miRNAs的预装载，这一过程中，可通过调节生物分子浓度配比控制PLL/miRNAs复合物的电荷性。然后，进一步利用链状结构的肝素分子与PLL分子间的静电交互作用形成载miRNAs的纳米颗粒。
S2中使用活化剂活化纳米颗粒表面肝素衍生的羧基，并进一步与KALA多肽中的氨基发生交联反应，实现KALA多肽在纳米颗粒表面的固定。
S3中首先在金属材料表面引入多巴胺分子，并进一步利用多巴胺涂层能与双端巯基化的PEG分子发生迈克尔加成反应和希夫碱反应的特性，在表面引入大量巯基基团；然后，S4中将载miRNAs的纳米颗粒与马来酰亚胺修饰的透明质酸溶液混合，并选择双端巯基化的MMP-2敏感性多肽为交联分子，利用马来酰亚胺基团与巯基基团发生快速点击化学反应的特性，实现含纳米颗粒的透明质酸溶液交联成水凝胶结构；最后，通过浸渍提拉法实现纳米颗粒/水凝胶复合物在材料表面的涂覆，并进一步利用材料表面丰富的巯基基团与透明质酸中的马来酰亚胺基团发生点击化学反应的特性，实现复合涂层在材料表面的牢固结合。通过涂层的构建，可实现对载miRNAs纳米颗粒的控制释放和细胞内传递，选择性抑制凝血反应和平滑肌过度增殖，促进内皮细胞生长，有效改善了材料的生物相容性。
该构建方法具有如下优点：
(1)创造性地提出在材料表面构建具有良好生物相容性和MMP-2响应特性的可降解载miRNAs的纳米复合涂层，利用纳米颗粒和水凝胶双重复合结构实现miRNAs的控释和细胞内传递，实现在分子水平和基因水平上精准有序地调控血管靶细胞应答和血管内病理进程，原位诱导血管内膜组织修复，全面提高材料植入后的安全性和有效性。
(2)miRNAs主要通过静电交互作用引入材料表面，其生物活性得到较好的保持。同时，对载miRNAs的纳米粒子进行KALA多肽修饰有助于提高miRNAs的细胞膜穿透能力和溶酶体逃逸能力，从而提升其作用效率。
(3)利用该构建方法，可实现材料表面介导的一种或多种miRNAs的控制释放，利用不同miRNAs的功能互补，可进一步增强表面涂层的生物功能活性。
(4)心血管表面多巴胺涂层的制备及纳米复合涂层的构建均采用浸渍方式进行，可保证材料各个部分能均匀的固定上生物分子，有利于实现各种结构复杂的器械表面的生物功能化修饰，适用范围广。
优选地，S1中所述多聚赖氨酸溶液的浓度为1～10mg/mL；所述多聚赖氨酸的分子量为150～300Kda。
优选地，S1中所述miRNAs mimics溶液的浓度为1～10nmol/mL。
优选地，所述miRNAs为miR-126、miR-92a、anti-miR-21、miR-125、miR-145、miR-143、miR-195或miR-133a中的一种或几种。
优选地，S1中所述肝素钠溶液的浓度为5～50mg/mL。
优选地，S1中所述多聚赖氨酸溶液、miRNAs mimics溶液和肝素钠溶液的溶剂均为无菌生理盐水。
更为优选地，所述菌生理盐水的浓度为0.9％。
优选地，S2中所述MES缓冲液的浓度为0.05mol/L。
本领域中常规用于活化羧基的活化剂均可用于本发明中。
优选地，S2中所述活化剂为NHS和EDC。
优选地，所述EDC、NHS和MES的摩尔比为2:1:1。
优选地，S2中所述KALA多肽和载miRNAs的纳米颗粒的质量比为1:10～50。
优选地，S3中所述多巴胺溶液的浓度为0.5～5mg/mL；所述多巴胺溶液的溶剂为pH＝8.5的Tris缓冲液。
更为优选地，S3中所述多巴胺溶液的浓度为2mg/mL。
优选地，S3中多巴胺涂层的层数为2～5层。
更为优选地，S3中多巴胺的层数为3层。
优选地，S3中所述双端巯基化的PEG水溶液的浓度为1～10mg/mL。
本领域常规的生物医用金属材料均可作为金属材料用于本发明中，例如316L不锈钢，钴合金，钛及钛合金等。
优选地，S4中所述透明质酸-马来酰亚胺溶液的浓度为20～50mg/mL。
优选地，S4中所述透明质酸-马来酰亚胺的分子量为200Kda。
优选地，S4中所述透明质酸-马来酰亚胺溶液选用的溶剂为双蒸水。
优选地，S4中所述双端巯基化的MMP-2敏感性多肽为SH-RGDPQGIWGQ-HS。
优选地，S4中所述双端巯基化的MMP-2敏感性多肽的浓度为0.5～2μg/mL。
优选地，S4中所述浸渍提拉的速度为10～100mm/min。
一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层，通过上述制备方法制备得到。
上述可降解的载miRNAs纳米复合涂层在制备生物医疗器械中的应用也在本发明的保护范围内。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)创造性地提出在材料表面构建具有良好生物相容性和MMP-2响应特性的可降解载miRNAs的纳米复合涂层，利用纳米颗粒和水凝胶双重复合结构实现miRNAs的控释和细胞内传递，实现在分子水平和基因水平上精准有序地调控血管靶细胞应答和血管内病理进程，原位诱导血管内膜组织修复，全面提高材料植入后的安全性和有效性。
(2)miRNAs主要通过静电交互作用引入材料表面，其生物活性得到较好的保持。同时，对载miRNAs的纳米粒子进行KALA多肽修饰有助于提高miRNAs的细胞膜穿透能力和溶酶体逃逸能力，从而提升其作用效率。
(3)利用该构建方法，可实现材料表面介导的一种或多种miRNAs的控制释放，利用不同miRNAs的功能互补，可进一步增强表面涂层的生物功能活性。
(4)心血管表面多巴胺涂层的制备及纳米复合涂层的构建均采用浸渍方式进行，可保证材料各个部分能均匀的固定上生物分子，有利于实现各种结构复杂的器械表面的生物功能化修饰，适用范围广。
附图说明
图1为材料表面载miRNAs的纳米复合涂层的构建示意图：(A)肝素和多聚赖氨酸的化学结构图；(B)载miRNAs的纳米颗粒的制备过程示意图；(C)马来酰亚胺修饰的透明质酸的化学结构图；(D)双端巯基化的MMP-2敏感性多肽的化学结构图；(E)浸渍提拉法构建载miRNAs纳米复合涂层的过程示意图；
图2为凝胶化的载miRNAs纳米复合材料的示意图；
图3为模拟血流动态条件下，不同交联度的水凝胶在含MMP-2的PBS缓冲液中的释放行为，以及释放前后载miRNAs纳米颗粒的TEM形貌结果；
图4为血管内皮细胞摄取载miRNAs的纳米颗粒的荧光示意图；
图5为载miR-126纳米复合涂层表面血小板粘附2小时后的罗丹明123荧光染色结果；
图6为血管内皮细胞和平滑肌细胞在载miR-126纳米复合涂层表面培养1天后的荧光染色结果。
具体实施方式
下面结合实施例进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件；所使用的原料、试剂等，如无特殊说明，均为可从常规市场等商业途径得到的原料和试剂。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
常用的医用级金属材料有316L不锈钢、钴合金、钛及钛合金等；miRNAs包括miR-126、miR-92a、anti-miR-21、miR-125、miR-145、miR-143、miR-195和miR-133a等，本发明各实施例以316L不锈钢作为金属材料，miR-126作为miRNAs为例，对可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建及性能测试进行说明。各实施例中的316L不锈钢、miR-126可单独进行替换，得到对应生物功能化性能的复合涂层，这些复合涂层通过miRNAs的控释及多种生物分子的协同作用精准调节血液和血管细胞应答，降低血栓和再狭窄的发生。
实施例1
参见图1，本实施例提供一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建方法，其步骤为：
A、载miRNAs纳米颗粒的构建：将浓度为1mg/mL的多聚赖氨酸溶液(PLL，分子量150～300KDa)与浓度为1nmol/mL的miRNAs mimics溶液等体积混合，室温下静止处理1小时后，在磁力搅拌条件下，将混合液逐滴滴加至等体积的浓度为5mg/mL的肝素钠溶液中，即得载miRNAs的纳米颗粒。
B、载miRNAs纳米颗粒的修饰：首先，将步骤A中获得的纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的浓度为0.05mol/L的MES缓冲液中；其次，向上述悬液内依次加入NHS和EDC粉末，使EDC、NHS和MES的摩尔比为2:1:1，室温下振荡反应30min；然后，将纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的KALA多肽水溶液中，其中KALA多肽与纳米颗粒的质量比为1:10，室温下振荡反应1h后，即得KALA多肽修饰的纳米颗粒，保存待用。所得颗粒通过真空冷冻干燥后，于-20℃条件下保存。
C、聚多巴胺涂层的沉积与巯基化：首先，将金属材料浸泡于2mg/mL的多巴胺溶液中(溶剂为pH＝8.5的Tris缓冲液)，室温下静置反应12h，双蒸水清洗后记为一层多巴胺涂层，重复该步骤，在材料表面沉积三层多巴胺涂层；然后，将金属材料浸没于含10mg/mL的双端巯基化的PEG水溶液中，室温下静置反应24h，即得巯基化改性的多巴胺涂层样品。
D、载miRNAs纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层的制备：首先，配置浓度为50mg/mL的透明质酸-马来酰亚胺(HA-Mal，分子量200KDa)溶液，搅拌均匀后，向其中加入双端巯基化的MMP-2敏感性多肽(SH-RGDPQGIWGQ-HS)和步骤B中的纳米颗粒，其中敏感性多肽的浓度为2μg/mL，纳米颗粒浓度为1mg/mL；然后，立即将步骤C中获得的样品浸没于上述含纳米颗粒的溶液中，并以100mm/min的速度进行浸渍提拉；提拉完成后，立即将样品置于30℃的烘箱内处理60min，即得目标样品。
实施例2
本实施例提供一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建方法，其步骤为：
A、载miRNAs纳米颗粒的构建：将浓度为10mg/mL的多聚赖氨酸溶液(PLL，分子量150-300KDa)与浓度为10nmol/mL的miRNAs mimics溶液等体积混合，室温下静止处理6小时后，在磁力搅拌条件下，将混合液逐滴滴加至等体积的浓度为50mg/ml的肝素钠溶液中，即得载miRNAs的纳米颗粒。
B、载miRNAs纳米颗粒的修饰：首先，将步骤A中获得的纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的浓度为0.05M的MES缓冲液中；其次，向上述悬液内依次加入NHS和EDC粉末，使EDC、NHS和MES的摩尔比为2:1:1，室温下振荡反应60min；然后，将纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的KALA多肽水溶液中，其中KALA多肽与纳米颗粒的质量比为1:50，室温下振荡反应3h后，即得KALA多肽修饰的纳米颗粒，保存待用。所得颗粒通过真空冷冻干燥后，于-20℃条件下保存。
C、聚多巴胺涂层的沉积与巯基化：首先，将金属材料浸泡于2mg/mL的多巴胺溶液中(溶剂为pH＝8.5的Tris缓冲液)，室温下静置反应12h，双蒸水清洗后记为一层多巴胺涂层，重复该步骤，在材料表面沉积三层多巴胺涂层；然后，将金属材料浸没于含1mg/mL的双端巯基化的PEG水溶液中，室温下静置反应6h，即得巯基化改性的多巴胺涂层样品。
D、载miRNAs纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层的制备：首先，配置浓度为20mg/ml的透明质酸-马来酰亚胺(HA-Mal，分子量200KDa)溶液，搅拌均匀后，向其中加入双端巯基化的MMP-2敏感性多肽(SH-RGDPQGIWGQ-HS)和步骤B中的纳米颗粒，其中敏感性多肽的浓度为0.5μg/ml，纳米颗粒浓度为0.1mg/mL；然后，立即将步骤C中获得的样品浸没于上述含纳米颗粒的溶液中，并以10mm/min的速度进行浸渍提拉；提拉完成后，立即将样品置于45℃的烘箱内处理30min，即得目标样品。
实施例3
本实施例提供一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建方法，其步骤为：
A、载miRNAs纳米颗粒的构建：将浓度为5mg/mL的多聚赖氨酸溶液(PLL，分子量150-300KDa)与浓度为5nmol/mL的miRNAs mimics溶液等体积混合，室温下静止处理3小时后，在磁力搅拌条件下，将混合液逐滴滴加至等体积的浓度为25mg/mL的肝素钠溶液中，即得载miRNAs的纳米颗粒。
B、载miRNAs纳米颗粒的修饰：首先，将步骤A中获得的纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的浓度为0.05M的MES缓冲液中；其次，向上述悬液内依次加入NHS和EDC粉末，使EDC、NHS和MES的摩尔比为2:1:1，室温下振荡反应45min；然后，将纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的KALA多肽水溶液中，其中KALA多肽与纳米颗粒的质量比为1:20，室温下振荡反应2h后，即得KALA多肽修饰的纳米颗粒，保存待用。所得颗粒通过真空冷冻干燥后，于-20℃条件下保存。
C、聚多巴胺涂层的沉积与巯基化：首先，将金属材料浸泡于2mg/mL的多巴胺溶液中(溶剂为pH＝8.5的Tris缓冲液)，室温下静置反应12h，双蒸水清洗后记为一层多巴胺涂层，重复该步骤，在材料表面沉积三层多巴胺涂层；然后，将金属材料浸没于含5mg/mL的双端巯基化的PEG水溶液中，室温下静置反应12h，即得巯基化改性的多巴胺涂层样品。
D、载miRNAs纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层的制备：首先，配置浓度为30mg/ml的透明质酸-马来酰亚胺(HA-Mal，分子量200KDa)溶液，搅拌均匀后，向其中加入双端巯基化的MMP-2敏感性多肽(SH-RGDPQGIWGQ-HS)和步骤B中的纳米颗粒，其中敏感性多肽的浓度为1μg/mL，纳米颗粒浓度为0.5mg/mL；然后，立即将步骤C中获得的样品浸没于上述含纳米颗粒的溶液中，并以50mm/min的速度进行浸渍提拉；提拉完成后，立即将样品置于37℃的烘箱内处理45min，即得目标样品。
实施例4
本实施例提供一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建方法，其步骤为：
A、载miRNAs纳米颗粒的构建：将浓度为1mg/mL的多聚赖氨酸溶液(PLL，分子量150-300KDa)与浓度为10nmol/mL的miRNAs mimics溶液等体积混合，室温下静止处理3小时后，在磁力搅拌条件下，将混合液逐滴滴加至等体积的浓度为5mg/mL的肝素钠溶液中，即得载miRNAs的纳米颗粒。
B、载miRNAs纳米颗粒的修饰：首先，将步骤A中获得的纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的浓度为0.05M的MES缓冲液中；其次，向上述悬液内依次加入NHS和EDC粉末，使EDC、NHS和MES的摩尔比为2:1:1，室温下振荡反应60min；然后，将纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的KALA多肽水溶液中，其中KALA多肽与纳米颗粒的质量比为1:10，室温下振荡反应3h后，即得KALA多肽修饰的纳米颗粒，保存待用。所得颗粒通过真空冷冻干燥后，于-20℃条件下保存。
C、聚多巴胺涂层的沉积与巯基化：首先，将金属材料浸泡于2mg/mL的多巴胺溶液中(溶剂为pH＝8.5的Tris缓冲液)，室温下静置反应12h，双蒸水清洗后记为一层多巴胺涂层，重复该步骤，在材料表面沉积两层多巴胺涂层；然后，将金属材料浸没于含1mg/mL的双端巯基化的PEG水溶液中，室温下静置反应24h，即得巯基化改性的多巴胺涂层样品。
D、载miRNAs纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层的制备：首先，配置浓度为20mg/ml的透明质酸-马来酰亚胺(HA-Mal，分子量200KDa)溶液，搅拌均匀后，向其中加入双端巯基化的MMP-2敏感性多肽(SH-RGDPQGIWGQ-HS)和步骤B中的纳米颗粒，其中敏感性多肽的浓度为1μg/mL，纳米颗粒浓度为0.1mg/mL；然后，立即将步骤C中获得的样品浸没于上述含纳米颗粒的溶液中，并以10mm/min的速度进行浸渍提拉；提拉完成后，立即将样品置于45℃的烘箱内处理60min，即得目标样品。
实施例5
本实施例提供一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建方法，其步骤为：
A、载miRNAs纳米颗粒的构建：将浓度为10mg/mL的多聚赖氨酸溶液(PLL，分子量150-300KDa)与浓度为1nmol/mL的miRNAs mimics溶液等体积混合，室温下静止处理3小时后，在磁力搅拌条件下，将混合液逐滴滴加至等体积的浓度为50mg/mL的肝素钠溶液中，即得载miRNAs的纳米颗粒。
B、载miRNAs纳米颗粒的修饰：首先，将步骤A中获得的纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的浓度为0.05M的MES缓冲液中；其次，向上述悬液内依次加入NHS和EDC粉末，使EDC、NHS和MES的摩尔比为2:1:1，室温下振荡反应30min；然后，将纳米颗粒悬液以12000rpm的速度进行离心处理，弃上清液，并重悬于等体积的KALA多肽水溶液中，其中KALA多肽与纳米颗粒的质量比为1:50，室温下振荡反应1h后，即得KALA多肽修饰的纳米颗粒，保存待用。所得颗粒通过真空冷冻干燥后，于-20℃条件下保存。
C、聚多巴胺涂层的沉积与巯基化：首先，将金属材料浸泡于2mg/mL的多巴胺溶液中(溶剂为pH＝8.5的Tris缓冲液)，室温下静置反应12h，双蒸水清洗后记为一层多巴胺涂层，重复该步骤，在材料表面沉积五层多巴胺涂层；然后，将金属材料浸没于含10mg/mL的双端巯基化的PEG水溶液中，室温下静置反应6h，即得巯基化改性的多巴胺涂层样品。
D、载miRNAs纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层的制备：首先，配置浓度为50mg/ml的透明质酸-马来酰亚胺(HA-Mal，分子量200KDa)溶液，搅拌均匀后，向其中加入双端巯基化的MMP-2敏感性多肽(SH-RGDPQGIWGQ-HS)和步骤B中的纳米颗粒，其中敏感性多肽的浓度为0.1μg/mL，纳米颗粒浓度为1mg/mL；然后，立即将步骤C中获得的样品浸没于上述含纳米颗粒的溶液中，并以100mm/min的速度进行浸渍提拉；提拉完成后，立即将样品置于30℃的烘箱内处理30min，即得目标样品。
性能测试
本发明各实施例在生物医用级316L不锈钢材料表面构建了载miR-126的纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层。下面以实施例3构建的复合涂层为例，对其性能进行测定。
如图3所示，通过体外动态释放条件下对纳米颗粒/水凝胶复合涂层的稳定性研究发现，载miR-126的纳米颗粒能通过水凝胶有效释放，且颗粒尺寸形貌未发生明显变化。而通过改变水凝胶的交联度有助于调节复合涂层降解速率，进而控制生物分子释放行为。
另一方面，经KALA多肽修饰的载miR-126纳米颗粒与血管内皮细胞的共培养实验发现，经纳米颗粒处理的细胞内部含有大量荧光点(图4)，表明纳米颗粒能有效穿透细胞膜进入细胞内部，并通过细胞内控释miR-126来发挥其生物学效应。
体外血小板粘附实验结果显示(图5)，在316L不锈钢材料表面出现大量血小板粘附，且部分血小板已经团聚，这表明不锈钢材料血液相容性差，植入体内后有引发急性或亚急性血栓的风险，而经过载miR-126的纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层修饰后，样品表面血小板的粘附数量大幅下降，表现出优异的抗凝血功能，这种抗凝性能的提升认为主要与透明质酸分子和肝素分子的存在有关。
体外细胞相容性评价结果显示(图6)，与316L不锈钢相比，载miR-126的纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层修饰的样品表面内皮细胞粘附数量明显增多，铺展形态较好，但平滑肌细胞粘附数量大幅下降，且多为皱缩形态。这表明复合涂层改性的样品表面具有选择性促进血管内皮细胞生长和抑制平滑肌细胞增殖的功能，这一功能主要与miR-126特异性的生物学功能有关，有助于实现在促进血管内膜损伤修复的同时，抑制内膜增厚，从而降低不良心脏事件发生率。
综上，本发明在材料表面所构建的复合涂层能够有效控制载miRNAs的纳米颗粒的释放和细胞内传递。通过控制释放和多种生物成分间协同作用，复合涂层表现出良好的抗凝血性能，且能选择性调控血管内皮细胞和平滑肌细胞的生长增殖行为，进而精准有序的调控血管内膜原位修复进程，有望从根本上解决心血管材料植入后不良心脏事件发生的问题。
以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：载miRNAs纳米颗粒的构建：将多聚赖氨酸溶液和miRNAs mimics溶液混合，静置，然后在搅拌条件下加入肝素钠溶液，得载miRNAs的纳米颗粒悬液；所述多聚赖氨酸和miRNAs的质量摩尔比为1:0.1~10 mg/nmoL；
S2：载miRNAs纳米颗粒的修饰：将载miRNAs的纳米颗粒悬液离心弃上清液后重悬于MES缓冲液，加入活化剂活化后，振荡，离心弃上清液后重悬于KALA多肽水溶液中，振荡，得KALA多肽修饰的纳米颗粒；
S3：聚多巴胺涂层的沉积与巯基化：将金属材料浸泡于多巴胺溶液中，静置反应，清洗后在金属材料表面沉积一层多巴胺涂层，重复浸泡—静置反应—清洗的步骤，在金属材料表面沉积多层多巴胺涂层；然后浸没于双端巯基化的PEG水溶液，静置反应得巯基化改性的多巴胺涂层样品；
S4：载miRNAs纳米颗粒/透明质酸水凝胶复合涂层的制备：向透明质酸-马来酰亚胺溶液中加入双端巯基化的MMP-2敏感性多肽和S2所得KALA多肽修饰的纳米颗粒，然后将S3所得巯基化改性的多巴胺涂层样品浸没，浸渍提拉，干燥即得所述可降解的载miRNAs纳米复合涂层；
所述miRNAs为miR-126、miR-92a、anti-miR-21、miR-125、miR-145、miR-143、miR-195或miR-133a中的一种或几种。
2.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，S1中所述多聚赖氨酸溶液的浓度为1~10mg/mL；所述多聚赖氨酸的分子量为150~300 Kda。
3.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，S1中所述miRNAs mimics溶液的浓度为1~10 nmol/mL；S1中所述肝素钠溶液的浓度为5~50 mg/mL。
4.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，S2中所述KALA多肽和载miRNAs的纳米颗粒的质量比为1:10~50。
5.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，S3中所述多巴胺溶液的浓度为0.5~5mg/mL；所述多巴胺溶液的溶剂为pH=8.5的Tris缓冲液。
6.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，S3中所述双端巯基化的PEG水溶液的浓度为1~10 mg/mL。
7.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，S4中所述透明质酸-马来酰亚胺溶液的浓度为20~50 mg/mL；所述透明质酸-马来酰亚胺的分子量为200 Kda；所述透明质酸-马来酰亚胺溶液选用的溶剂为双蒸水。
8.根据权利要求1所述构建方法，其特征在于，S4中所述双端巯基化的MMP-2敏感性多肽为SH-RGDPQGIWGQ-HS；所述双端巯基化的MMP-2敏感性多肽的浓度为0.5~2μg/mL。
9.一种可降解的载miRNAs纳米复合涂层，其特征在于，通过权利要求1~8任一所述构建方法制备得到。
10.权利要求9所述可降解的载miRNAs纳米复合涂层在制备生物医疗器械中的应用。
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