TWI593417B - 使用臍帶血細胞的腦損傷治療 - Google Patents
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Description
本申請案主張於2008年3月28日申請，且標題為使用臍帶血細胞的腦損傷治療(Treatment of Brain Damage Using Umbilical Cord Blood Cells)之美國臨時申請案序號61/072,173的權益，其完整內容係以引用方式納入本文中。
本發明係關於臍帶血細胞對治療腦損傷的用途。
中風通常意指阻斷或降低對全部或一部分腦之血液供應的任何事件。其在美國為第三大死因，並為成人失能的主要原因。中風每年影響大約750,000人。三分之一的中風患者在發生中風後的第一週內死亡。在那些存活者中，有相當大的比例仍有中等到嚴重的失能，包括但不限於顏面、肢體或全身麻痺。
已經嘗試各種對中風相關之慢性徵候的治療。最近，已經報告了G-CSF集結周圍血液細胞以治療急性和慢性中風徵候。然而，對於適合一般族群(包括可能不適合經自體集結之細胞療法的那些個體)之治療模式仍有需求。
就其最廣泛的意義而言，本發明提供使用臍帶血細胞治療腦損傷的方法。特別重要的是，使用臍帶血細胞治療慢性中風和神經變性疾病。根據本發明，已經意外地發現當投予臍帶血細胞至慢性中風個體的腦實質(parenchyma)內時，至少逆轉了一些個體所經歷的與中風有關的失能。
因此，本發明一方面提供治療患有腦組織損傷之個體的方法，其包括以有效治療腦組織損傷的量將針對CD34+、CD133+或CD34+/CD133+臍帶血細胞富集的經分離之臍帶血細胞族群投予至需要其之人類個體的腦實質內。
另一方面，本發明提供治療慢性中風的方法，其包括以有效治療中風的量將針對CD34+、CD133+或CD34+/CD133+臍帶血細胞富集的經分離之臍帶血細胞族群實質內投予至已經中風之人類個體的腦內，其中該經分離之族群係在中風之後超過7天投予。在一具體態樣中，該經分離之族群係在中風之後超過1個月投予。在另一具體態樣中，該經分離之族群係在中風之後超過3個月投予。在另一具體態樣中，該經分離之族群係在中風之後超過6個月投予。在另一具體態樣中，該經分離之族群係在中風之後超過1年投予。
另一方面，本發明提供治療起因於創傷性腦傷害之腦組織損傷的方法。更明確地，在一具體態樣中，本發明提供藉著將針對CD34+、CD133+或CD34+/CD133+細胞富集的經分離之臍帶血細胞族群投予至具有起因於創傷性腦傷害之腦組織損傷之個體的腦實質內而治療腦組織損傷的方法。這類腦損傷包括在發生創傷性腦傷害之後數個月(例如至少1個月)或數年仍存在的腦損傷。因此，個體可在在發生創傷性腦傷害之後超過1個月、超過3個月、超過6個月、超過1年或更久後治療(即將該細胞投予該個體)。
另一方面，本發明提供治療患有神經變性病症之個體的方法，其包括以有效治療神經變性病症的量將針對CD34+或CD133+臍帶血細胞富集的經分離之族群實質內投予至需要其之人類個體的腦內。神經變性病症可以是(但不限於)帕金森氏症(Parkinson’s disease)、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)、多發性硬化症(multiple sclerosis)、亨丁頓氏症(Huntington’s disease)、皮克氏症(Pick’s disease)、小腦變性(cerebellar degeneration)和肌萎縮性側索硬化(amyotrophic lateral sclerosis，ALS)。
在一具體態樣中，在發生腦組織損傷或最早觀察到這類損傷之後超過1個月投予該經分離之族群。在另一具體態樣中，在發生腦組織損傷或最早觀察到這類損傷之後超過6個月投予該經分離之族群。在另一具體態樣中，在發生腦組織損傷或最早觀察到這類損傷之後超過1年投予該經分離之族群。
各種具體態樣適用於前述之觀點，且其等在下文中詳述。
在一具體態樣中，該族群係針對CD34+臍帶血細胞富集。在相關之具體態樣中，該族群包括單核細胞，其為至少75% CD34+，或為至少90% CD34+。
在另一具體態樣中，該族群係針對CD133+臍帶血細胞富集。在相關之具體態樣中，該族群包括單核細胞，其為至少75% CD133+，或為至少90% CD133+。
在另一具體態樣中，該族群係針對CD34+/CD133+臍帶血細胞富集。在相關之具體態樣中，該族群包括單核細胞，其為至少75% CD34+/CD133+，或為至少90% CD34+/CD133+。
在一具體態樣中，該個體為至少60歲。
在一具體事實中，將至少2x106
個細胞投予該個體。在另一具體事實中，將至少5x106
個細胞投予該個體。在另一具體事實中，將至少8x106
個細胞投予該個體。
在一具體事實中，該族群係沿著受損之皮質脊髓束投予至三個位置。
在一具體態樣中，該族群衍生自單一臍帶血單位。在另一具體中，該族群衍生自多個臍帶血單位。在相關之具體態樣中，該族群與個體共享6個組織相容性標記中的4個以下。在另一具體態樣中，該族群與個體共享6個組織相容性標記中的至少4個。
在本文中會更詳細地描述本發明的這些及其他觀點和具體態樣。
本發明一部分是基於驚人且意外地發現：臍帶血細胞可逆轉與慢性中風有關之徵候。這令人意外，因為至今認為許多中風的影響是不可逆的，或使用其他治療時還是無法改善的。本發明打算使用臍帶血細胞治療慢性中風的患者，甚至在發生中風之後數年。
本發明一部分亦基於必須將臍帶血細胞投予至腦之實質內的發現。本發明的各種觀點和具體態樣提供了該細胞進入由於中風而受損之腦區域內更特別的位置。臍帶血細胞對這些個體的系統投藥，結果沒有任何的治療益處。
本發明一部分亦基於發現了表現一或多個早期造血標記(如CD34或CD133)的臍帶血細胞，這在治療慢性中風上是特別有用的。因此，本發明提供了涉及在慢性中風個體之腦實質內投予具有造血祖先表現型之臍帶血細胞的方法。具有造血祖先表現型的細胞是表現CD34和CD133任一或兩者的那些。
當在本文中使用時，中風意指中斷了個體一部分或全部腦的血液供應，並因此減少氧氣，影響持續24小時以上。中風可能是因血栓症、栓塞或出血而引起，並可能稱之為局部缺血中風(包括血栓性中風和栓塞性中風，並起因於血栓症、栓塞、系統性低灌注以及類似者)或出血性中風(起因於大腦內出血、蜘蛛膜下出血、硬膜下出血、硬膜上出血以及類似者)。當在本文中使用時，中風排除了中暑(heat stroke)和暫時性腦缺血發作(transient ischemic attacks,TIA)。中暑起因於體溫升高，且其在腦部的臨床表現與在本文定義中風的那些(即在腦中中斷血液供應並減少氧氣)不同。TIA有時又被稱為「小中風」，然而歸因於其在發生24小時內完全解決的能力，而可與本文定義之中風區別。
在受影響的個體中，中風出現一或多個徵候。雖然這些徵候及其嚴重性可能隨著患者而有變化，但其等通常包括肌肉虛弱(偏癱(hemiplegia))、麻木(numbness)、減少感覺及/或震動感覺。在許多案例中，這些徵候只影響身體的一邊(而通常損傷出現在腦的另一邊)。其他的徵候包括失去知覺、頭痛、嘔吐、經改變之嗅覺、味覺、聽覺和視覺(全部或部分的)、眼皮下垂(下垂)、眼肌的虛弱、降低反射(咽反射(gag)、吞嚥和對光反射的瞳孔反應性)、顏面的減少感覺和肌肉虛弱、平衡問題、失衡、眩暈、眼球震顫(nystagmus)、經改變之呼吸及/或心搏速率、鎖胸乳突肌(sternocleidomastoid muscle,SCM)之虛弱，伴隨有頭不能轉向一側、舌頭的虛弱(結合有無法伸出及/或從一邊移到另一邊)、失語症(aphasis)(即不能說話或瞭解語言)、運動失調症(apraxia)(即經改變之隨意運動)、經改變之運動協調、視野缺陷、記憶缺失、單側忽略(hemineglect)、性慾亢進的姿勢(hypersexual gestures)、缺乏膀胱或腸控制，以及認知衰退(例如癡呆、無組織化的思想、混亂、有限的注意時距、不能專心)，以及經改變之步行方式。一些中風的獨特徵候包括急性顏面輕癱(paresis)、手臂漂移和異常的言語。經常使用預先建立的評分系統，像是但不限於國家衛生研究院中風量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)，將患者的徵候分級。
經由神經學檢查、血液測試及/或醫學顯影技術，如CT掃描(例如沒有對比劑)、MRI掃描、都卜勒(Doppler)超音波和動脈攝影術(srteriography)來診斷中風。
當在本文中使用時，急性中風意指在發生中風之後，受影響之個體立刻經歷一或多個徵候及/或一或多個危險(即在前七天的期間內)。主要的危險是死亡，因為大約三分之一的個體在該七日窗內死亡。在該期間內經歷的徵候包括許多上文列舉的那些，包括但不限於異常的言語、手臂漂移、失去知覺、頭痛、嘔吐、眼皮下垂(下垂)、平衡問題和失衡、急性顏面輕癱以及類似者。對某些患者而言，時間介入可降低徵候的嚴重性和次數。
然而，大部分的患者持續長時間經歷一或多個這些徵候，本發明考慮的就是這些患者。認為這些患者受慢性中風所苦(或稱為慢性中風患者)，因為其等之中風徵候在超過急性期仍存在(即其等持續超過7天及/或在發生中風之後超過7天顯現)。因此當在本文中使用時，慢性中風意指一或多個徵候及/或一或多個危險與最初的中風事件有關，且其等出現在已經中風之患者中超過先前的7天。通常這些徵候的嚴重性和聚集，導致患者的失能。例如慢性中風患者可能無法說話或瞭解語言，其等可能無法走路或可能走路有困難(藉著步態描寫證明)，其等可能有經改變或受損的顏面肌肉控制，其等可能有經改變或受損的整體肌肉控制，結果導致缺乏協調運動或四肢控制，其等可能有受損的視力，其等可能是部分或全部麻痺，其等可能陷入昏迷，以及類似者。
根據本發明，已經顯示這類患者大大地獲益於臍帶血細胞投予至腦實質內。本發明者已經證實以此方式處理之慢性中風個體再度獲得對其等肌肉功能的控制，證據為較有規律(或正常)的步態或樣態，及/或較大的四肢控制。
可對任何在治療之前已經中風超過7天的患者，以及持續經歷一或多個與中風有關之徵候的患者使用本發明之方法。本發明打算在超過急性期的任何時間治療這類患者。因此，可在中風發生之後第二週內(即發生中風之後8、9、10、11、12、13或14天)治療患者。在某些重要的具體態樣中，可在發生中風之後超過兩週(即在發生中風之後15、16、17、18、19、20或21天)、超過三週，或超過四週時治療患者。還可在發生中風之後1、2、3、4、5或6個月治療其他的患者，並可在發生中風之後超過6個月的期間(包括7、8、9、10、11或12個月)，或在發生中風之後1、2、3、4、5或更多年，治療其他的患者。當在本文中使用時，在例如發生中風之後1年時治療，意指自從患者中風後已經經過最少1年。並非意指治療發生在中風的一週年紀念日時。在本發明之前，可能已經認為在許多這些患者中的傷害是不可逆或無法治療的。
可基於患者之中風病史(即在發生中風到治療時間之間的時間)，並可視需要根據其等之中風分數，鑑認欲根據本發明治療之患者。中風分數是由患者所經歷徵候之嚴重性的數字表示。NIHSS、ESS、EMS和Barthel指數都是在患者中判定中風徵候之嚴重性的計分系統。在NIHSS的案例中，較低分代表較少的徵候和較低的失能。雖然可使用在本文中描述的方法，以治療任何中風患者，但較佳的是使用其等來治療有較嚴重徵候的患者。因此，在一具體態樣中，根據本發明治療具有9-20之NIHSS分數的患者，包括具有9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19和20之NIHSS分數的患者。具有NIHSS 9分之患者的實例為僅回應反射運動或自主影響、無言的(即無法使用語言或聽覺理解)，以及顏面一或兩側完全麻痺(即在上下臉部缺乏顏面運動)的患者。醫師會有對這類分數的知識，因此可使用在本文中提供之時間安排和中風分數指導，迅速鑑認出可根據本發明治療的個體。
本發明亦打算治療患有神經變性病症的個體。神經變性病症是特徵為神經元之漸進性退化及/或死亡的病症。實例包括但不限於帕金森氏症、阿茲海默氏症、多發性硬化症、亨丁頓氏症、皮克氏症、庫賈氏病(Creutzfeldt-Jakob disease)、進行性核上性麻痺(progressive supranuclear palsy,PSP)、帕金森氏症、夏伊-德雷格徵候群(Shy-Drager syndrome)、小腦皮質萎縮(cerebellar cortical atrophy)、弗來德瑞克氏共濟失調(Friedrich ataxia)、齒狀核紅核變性(dentatorubral degeneration)、馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease)、脊髓性肌肉萎縮症(spinal muscular atrophy)、蒼白球腦橋黑質變性(pallidopontonigral degeneration,PPND)、蒼白球黑質變性(pallidonigroluysian degeneration,PNLD)、肌萎縮性側索硬化(ALS)、關島型(Guam)-ALS徵候群、皮質基底核變性(corticobasal degeneration,CBD)、癲癇(epilepsy)、缺血性腦傷害、老年癡呆症(senile dementia)、柯薩科夫徵候群(Korsakov’s syndrome)、腦橋小腦萎縮(pontocerebellar atrophy)、橄欖腦橋小腦萎縮(olivopontocerebellar atrophy)或變性、戊二酸血症(glutaric acidaemia)、擴散性路易氏體癡呆(diffuse Lewy body dementia)、連鎖於17號染色體伴帕金森氏症的額顳葉癡呆(frontotemporal dementia with parkinsonism linked to chromosome 17,FTDP-17)、多發性腦梗塞性癡呆(multi-infarct dementia)、腦炎症反應、多系統萎縮(multiple system atrophy,MSA)和蒼白球變性(pallidal degeneration)。
本發明亦打算治療患有起因於創傷性腦傷害(TBI)之慢性腦損傷的個體。
可對任何患者(無論年齡或性別)實行本發明之方法，雖然預期老年患者可能是特別有利的。當在本文中使用時，老年患者是指60歲或更老的患者。在本說明的前後文中，要瞭解較佳的個體是人類個體。
當在本文中使用時，治療患有慢性中風之個體意指改善、降低或完全排除一或多個慢性中風徵候。舉例來說，根據本發明來治療患有中風之個體，以降低起因於中風之腦傷害的程度。可藉著使用標準醫學顯影技術判定梗塞的尺寸，來測量腦傷害。因此，可根據使用這些顯影技術檢視梗塞尺寸的減少，測量在腦傷害程度上的降低。在某些情況下，可減少梗塞面積(或體積)至少5%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%或可能使其完全消失。在較佳的具體態樣中，治療降低了梗塞面積至少10%。同樣地，亦可使用測量神經學功能的測試來判定腦傷害的程度。亦可使用諸如NIHSS之類的計分系統，以評估在患者中的治療。舉例來說，NIHSS分數降低1、2、3、4、5、10、15或20點，都表示治療。在較佳的具體態樣中，治療結果產生至少4點的降低。在其他的具體態樣中，治療結果產生0-8的NIHSS分數。
本發明之方法涉及對個體投予臍帶血細胞。臍帶血細胞是獲自臍帶靜脈和動脈的細胞。從臍帶中萃取這類細胞的方法為在技術領域中已知的，並已經發表。(參見例如美國公開申請案第20060275271號)。可在使用之前收穫並冷凍這些細胞，或可不冷凍便使用其等。冷凍這類細胞的方法亦為在技術領域中已知的，並已經發表。(參見例如美國公開申請案第20060275271號)。
當在本文中使用時，經分離之細胞族群為已經在物理上與其天然存在或出現於其中的環境及/或前後關係分開的細胞族群。因此，一旦從臍帶中移出臍帶血細胞，便將其等視為是經分離的。
在本發明重要的具體態樣中，將臍帶血細胞分級，以便產生經富集之細胞族群。當在本文中使用時，經富集之細胞族群為已經經過處理，以便增加特殊細胞類型在族群中之頻率(相對於在處理之前該細胞類型之頻率)的細胞族群。要瞭解欲富集之細胞類型是在處理之前便已出現在該族群中的細胞類型，且該富集起因於從該族群中移除其他細胞類型，而非加入感興趣的細胞類型。根據本發明，特別感興趣的是經針對CD34+、CD133+或CD34+/CD133+細胞富集的細胞族群。CD34和CD133是細胞表面蛋白質(或標記)，之前已經鑑認其出現在造血祖先細胞(包括在造血幹細胞)上。當在本文中使用時，CD34+細胞是在其細胞表面表現CD34的細胞。同樣地，CD133+細胞是在其細胞表面表現CD133的細胞。CD34+/CD133+細胞是在其細胞表面表現CD34和CD133兩者的細胞。CD34+和CD133+細胞分別代表大約0.1%的所有單核臍帶血細胞。此外，在CD34+和CD133+細胞族群之間有相當大的重疊，使得許多CD34+細胞亦表現CD133，反之亦然。當在本文中使用時，富集CD34+細胞、CD133+細胞或CD34+/CD133+細胞之族群，是其中CD34+細胞、CD133+細胞或CD34+/CD133+細胞分別在該族群中代表至少60%單核細胞的族群。這些族群可能有更高頻率的特殊細胞類型。例如，這些族群的單核部分可能是至少65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的CD34+、CD133+或CD34+/CD133+。舉例來說，為至少75%CD34+的細胞族群是其中它的單核細胞中至少有75%表現CD34的族群。在較佳的具體態樣中，所投予之族群為至少90%CD34+、至少90%CD133+或至少90%CD34+/CD133+。
製備富集特殊細胞類型之細胞族群的方法為在技術領域中已知的。在藉由細胞表面標記定義細胞族群(如CD34+、CD133+和CD34+/CD133+細胞)的情況下，這些方法通常使用對所表現之標記專一的抗體。可將這些抗體附接在某些固體支撐物上，包括培養盤(例如在盤淘法(panning method)中)、管柱基質(例如在管柱富集法中)、磁珠(例如在磁分離法中)，以及類似者。然後使這些支撐物與感興趣的細胞族群接觸，並允許表現感興趣標記之細胞與該抗體結合，同時移除仍未結合的細胞。然後藉著幾種技術(例如酵素、機械、競爭性結合、溫度等等)，移出經結合的細胞。亦可藉著使細胞與感興趣之抗體接觸，然後使用螢光激活細胞分類，基於抗體的有無分類細胞，產生經富集的族群。通常藉著以螢光探針(例如FITC)標示抗體，或藉著使細胞與二級抗體(其認得第一個抗體，並以螢光探針標示自己)接觸，觀察抗體的存在。這些及其他方法均為在技術領域中已知的，而一般技藝人士能夠迅速地富集想要的族群。
抗-CD34抗體包括但不限於QBend10、563、HPCA-2、581、AC136和Birma K3。抗-CD133抗體包括但不限於ANC9C5。這些抗體可購自諸如R&D System,Santa Cruz Biotechnology之類的來源。
按照在本文中描述的，以有效治療患者的量(或數目)，將經分離之經富集族群投予患者。治療所需之細胞數目會視若干因素而定，包括由個體所經歷之徵候的嚴重性(可從例如NIHSS分數推論)、使用醫學顯影技術，如MRI判定之梗塞尺寸(或面積)、在所投予之族群中想要細胞類型的富集程度、患者的年齡及/或體重，以及類似者。通常，預期可將範圍在1到10x106
個，而較佳的是2到8x106
個中的細胞數目投予患者。因此，依據特殊的患者和欲投予之族群，所投予之細胞數目可以是大約2x106
、大約3x106
、大約4x106
、大約5x106
、大約6x106
、大約7x106
或大約8x106
個。這些量可意指CD34+、CD133+或CD34+/CD133+細胞的總量，或投予個體之總單核細胞，視具體態樣和細胞富集的程度而定。
可以單一臍帶血單位提供欲投予之細胞，雖然在許多情況下，必須混合多個臍帶血單位，以達到欲投予之細胞數目。當在本文中使用時，臍帶血單位是獲自單一臍帶的臍帶血量。典型地，每個臍帶血單位均含有大約120-150x107
單核細胞，其中僅有大約0.1%為CD34+及/或CD133+。
無論是否將一或多個單位投予個體，在某些情況下投予與欲治療之個體為組織可相容的細胞可能是合理的。當在本文中使用時，組織相容性意指欲移植之細胞和欲治療之個體共享6個主要組織相容性標記中的至少4個。顯然本發明亦考慮到其中該細胞與該個體共享5或甚至6個相同組織相容性標記的狀況。根據本發明，亦已經發現在某些情況下，該細胞與該個體共享4個以下、3個以下、2個以下或沒有共享組織相容性標記時，對該個體仍是有治療益處的。組織相容性標記包括第I類標記HLA-A、HLA-B和HLA-C，第Ⅱ類標記HLA-DP、HLA-DQ和HLA-DR，以及非典型第I類標記HLA-E、HLA-F、HLA-G、HLA-H、HLA-J和HLA-X、MIC。在某些具體態樣中，這6個組織相容性標記可以是HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR、HLA-DQ和HLA-DP。亦考慮其他的組合。
因為將族群投予至腦實質內，以儘可能合理之小體積投予該族群是很重要的。所投予之體積可視患者的年齡及/或體重，以及欲投予之細胞的數目等等因素而改變。通常，所投予之量少於1毫升，較佳的是少於0.75毫升，而更佳的是大約或少於0.5毫升。在某些情況下，投予0.4、0.3或0.2毫升。
將細胞族群投予至腦實質(即腦的組織)內。關於此點，這類投藥意指實質內投藥。較佳的是，將細胞放置在腦實質內，較佳的是在損傷區中及/或其周圍，並可包括在損傷區周圍，以及損傷區邊界的區域。
再更佳的是，將所投予之族群總量的等分放置在腦實質中的二、三或多個地方。舉例來說，可沿著已涉及或受影響之皮質脊髓束放置細胞，將一份放在超越損傷區域，將一份放在損傷區域的中央，並將一份放在損傷區域和頭骨之間。可使用立體定向裝置決定放置的地方。注射和放置細胞的座標會隨患者而改變，但可由一般技藝人士迅速地決定。
使用例如26號Hamilton微量注射針，或相當的注射筒或裝置，將細胞投予至腦實質。為了解釋，在一具體態樣中，將細胞裝到注射筒內，並沿著受損的皮質脊髓束將針頭插入腦實質內，直到其尖端到達超過損傷區域(或在其邊界)的位置為止。將大約三分之一的細胞(或在注射筒筒管中類似的體積)放置在這個位置。然後抽回針頭，直到其尖端到達損傷區域中的位置(較佳的是，但不一定是在或接近損傷的中央)為止，在此時放置另三分之一的細胞(或在注射筒筒管中的體積)。然後再次抽回針頭，直到其尖端到達損傷區域的後面(或在其邊界)的位置為止。將剩下的三分之一細胞(或在注射筒筒管中的體積)放置在該位置。在每次放置後將針頭保持在那裡大約5分鐘。一旦完全抽回針頭，便塞住進入的位置，以防止所注射體積的漏出(和流失)。這可藉著使用例如骨蠟而完成。然而，要瞭解本發明打算一次移植細胞至受損的腦中，而非多-天數的投藥攝生法。
將細胞懸浮於在藥學上可接受之載劑中，並與其一起投予，而將該形式視為醫藥組合物或製劑。當在本文中使用時，在藥學上可接受之載劑意指一或多個可相容的液態填料、稀釋劑以及類似者，其適合投予至人類中。當在本文中使用時，載劑意指有機或無機的成分，天然或合成的，將其與活性成分混合，以促進效力及/或投藥。藥學製劑可含有適當的緩衝劑，包括但不限於在鹽中的醋酸；在鹽中的檸檬酸；在鹽中的硼酸；和在鹽中的磷酸。醫藥組合物亦可視需要含有適當的防腐劑，如苯扎氯銨(benzalkonium chloride)、氯丁醇、對羥苯甲酸酯類(parabens)和乙汞硫柳酸鈉(thimerosal)。醫藥組合物之組份與細胞族群混雜，且彼此之間在某種意義上，沒有實質上會損害想要之藥學效力的交互作用。醫藥組合物或製劑亦可包括含有非-細胞製劑的其他物質，其本身為在治療上有效的，或其提高所投予之細胞的治療效力。可在小瓶中一起，在套組中分開的小瓶中，或在分開的套組中提供這些組份。
適合投藥的組合物可包括細胞的無菌水性懸浮液，較佳的是其與接受者之血液為等張的。可根據已知的方法，使用適當的分散劑或濕潤劑和懸浮劑，調配該水性製劑。無菌的注射用製劑亦可以是在無毒性、非經腸可接受之稀釋劑或溶劑中的無菌注射用溶液或懸浮液，例如像是在1,3-丁二醇中的溶液。在可接受之媒劑和溶劑中，可使用者為水、林格氏液(Ringer’s solution)和等張的氯化鈉溶液。此外，在傳統上亦可使用無菌的非揮發性油作為溶劑或懸浮介質。為了該目的，可使用任何溫和的非揮發性油，包括合成的單-或二-甘油酯。此外，在製備注射劑時，亦可使用脂肪酸，如油酸。可在雷明頓氏醫藥科學(Remington’s Pharmaceutical Sciences),Mack Publishing Co.,Easton,PA中找到適合口服、皮下、靜脈內、肌肉內等等投藥的載劑調配物。
實施例
材料和方法
CD34 +
/133 + hUCBs(hUCB 34/133 )的純化和選擇
從完整的人類臍帶血(hUCBW
)(Stemcyte,USA)中製備單核細胞(MNCs)。收集MNC層，並以在PBS中的1mM EDTA沖洗兩次。藉著磁珠分離法(MACS；Miltenyi Biotec,Gladbach,Germany)，根據製造者的說明書，從2X108
個MNCs中分離CD34+
和CD133+
MNCs兩者。簡言之，將MNCs懸浮於300微升PBS和5mM EDTA中。以與半抗原-共軛之對抗CD34和CD133的單株抗體(Miltenyi Biotec,Gladbach,Germany)標示這些細胞，接著在4℃下以每108
個細胞100微升珠子的比例，將抗-半抗原抗體與微珠偶聯15分鐘。在磁場中，在陽性-選擇-管柱組上富集珠子-陽性細胞(即CD34+
和CD133+
MNCs)。使用以藻紅素(phycoerythrin)(PE)(Becton Dickinson,USA)標示之抗-CD34和抗-CD133抗體(Miltenyi Biotec,Gladbach,Germany)，經MACS-分類細胞的FACS分析，顯示所選出細胞的90%±3%，對CD34和CD133兩者為陽性的，如在圖1B中所示。然後，以1微克/毫升雙苯甲醯亞胺(bisbenzimide)(Hoechst 33342；Sigma,USA)標示細胞，再懸浮於300微升伊思考夫氏經修改之杜貝可氏培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium)(Gibco/Invitrogen,UK)加2%FBS(Hyclone,Road Logan,UT)中，並在37℃下，在5%CO2
/95%空氣的潮濕大氣和抗生素中，將其與3毫升含有重組細胞介素和紅血球生成素的MethoCult GF H4434(StemCell Technologies,USA)混合1小時，為了移植進行準備。
大鼠實驗性的中風模式
使30隻重約250-300克的成年雄性Sprague-Dawley大鼠接受三條血管結紮。根據大學學會(University Institution)指導方針，使用無菌/消毒技術進行所有的手術程序。以水合三氯乙醛(chloral hydrate)(0.4克/公斤)腹腔內麻醉大鼠。藉著修改自Chen等人之描述(Stroke,1986,17(4):738-743)的方法，在第0天進行右中腦動脈(MCA)和兩側總頸動脈(CCAs)的結紮。以無-創傷動脈夾夾住CCAs。在手術顯微鏡下，在與鱗骨融合之顴骨處鑽孔-2x2顱骨切開術(craniotomy)。以10-0尼龍縫線結紮右MCA。在經麻醉之動物中，以雷射都卜勒流量計(PF-5010,system,Perimed system,Perimed AB,Stockholm,Sweden)，連續測量皮質血流。在右額頂區中鑽孔(1毫米直徑)，以允許放置光偵測器。以立體定向之方式將探針(直徑0.45毫米)放到皮質中(前囟後方1.3毫米，側面2.8毫米，及硬膜下1.0毫米)。在結紮90分鐘之後，移除在MCA上的縫線和在CCAs上的動脈夾，以允許再灌注。以熱敏探針監視核心體溫，並在麻醉期間利用加熱墊維持在37℃。在每隻大鼠恢復之後，利用加熱燈使體溫維持在37℃。如同預期，在大腦局部缺血之後第1天，以及任何細胞投藥之前，所有大鼠均發展出明顯的身體不對稱，並從對側轉向缺血腦的那一邊。
以大腦內hUCB
34/133
細胞或媒劑治療實驗動物
然後如在圖1A中所示，將大鼠分成三組。第1組在實驗性中風之後第1天，僅投予媒劑。第2組在實驗性中風之後第1天，投予hUCB34/133
細胞。這一組代表急性中風的實驗模式，因為在實驗性中風之後第1天投予細胞。第3組在第7天投予hUCB34/133
細胞。這一組代表慢性中風的實驗模式。將細胞或僅有媒劑立體定向地注射到尾殼核(caudate putamen)的受損椎體徑(pyramidal tract)內。使用26-號Hamilton微量注射針，將懸浮於3-5微升PBS中，以雙苯甲醯亞胺標示的大約2x105
個hUCB34/133
細胞注射到3個皮質區內，硬膜下3-5毫米。皮質位置的約略座標是(1)前囟前面1.0到2.0毫米，並在中線側面3.5到4.0毫米，(2)前囟後面0.5到1.5毫米，並在中線側面4.0到4.5毫米，以及(3)前囟後面3.0到4.0毫米，並在中線側面4.5到5.0毫米。在每次注射之後，使針頭保持在那裡5分鐘，並將一片骨蠟施用在頭骨缺口處，以防止所注射之溶液漏出。以生理鹽水立體定向地處理媒劑組中的實驗大鼠。對每隻實驗大鼠每天投予環孢靈A(10毫克/公斤，腹腔內，Novartis)注射，同時按照先前的描述，讓媒劑對照組接受等體積的生理鹽水(Zhao等人,2004)。
結果
神經學功能及其他行為評估
欲評估這三組實驗大鼠的神經學功能，在大腦局部缺血之前3天(即在第-3天)，以及局部缺血傷害之後1、7、14、21、28和35天，進行行為評估。該評估測量(a)身體不對稱、(b)自發活動和(c)抓力強度。記錄基準線-測試分數，以便將在大腦局部缺血之後取得的那些標準化。
以由Borlongan等人描述之方式，使用提高身體擺動測試(elevated body swing test,EBST)，定量評估在MCA結紮之後的身體不對稱。(Neuroreport,1998,9(12):2837-2842)。一開始，檢查每隻大鼠的側面運動，同時用尾巴將其身體吊起。在20次連續測試中，計算最初頭從對側擺動至缺血側的頻率，並以由Chang等人描述之方式(Stroke. 2003;34(2):558-564)將其標準化。
在自發活動測試中，為了行為紀錄，使每隻大鼠接受動物活動監視(Accuscan Instruments,Inc.,Columbus,OH)大約2小時。動物活動監視器包含16個水平和8個垂直的紅外線感應器，相隔87公分。垂直感應器位在離房間地板10公分處。按照在房間中光束被大鼠移動打斷的次數來計算自發活動。在晚上2小時內計算在製造者之菜單選項中定義的三個垂直參數：(i)垂直活動、(ii)垂直時間和(iii)垂直運動的次數。
將行為測量分數全部對基準線分數標準化。發現在治療後14到28天或35天，以hUCB治療之大鼠，與對照組大鼠相比較，展現出明顯降低的身體不對稱，如在圖2中所示。在hUCB組中的大鼠，與對照組大鼠相比較，亦顯示出明顯增加的垂直活動(圖3A)，垂直運動之次數(圖3B)和垂直運動時間(圖3C)。
藉著從Stephen之描述(Neurosci. Lett. 1998,264:1-4)修改的方法，使用抓力強度計(TSE-Systems,Germany)分析抓力強度。簡言之，在每隻前腳上測量抓力強度比，並按照在20次從對側拉到局部缺血側和同一側之平均強度之間的比例計算。此外，亦計算在治療之前(「治療前」)和治療之後(第28天，「治療後」)與基準線的抓力強度比，並以基準線值的百分比表示改變。發現第1組(對照組)、第2組(在第1天投藥)和第3組(在第7天投藥)的比例為大約0.95、1.8和1.95，如在圖4中所示。抓力強度結果顯示投予hUCB的大鼠，顯示出比未經治療之對照組大鼠更高的抓力強度比。
腦代謝和解剖
圖5顯示在對照組和經治療動物中，藉著FDG PET掃描監視的腦代謝。圖12顯示對照組和經治療鼠的MRI腦掃描。
免疫組織化學
進行免疫螢光染色以判定所投予之hUCB細胞是否能在局部缺血的腦中分化成神經元、神經膠質細胞或內皮細胞。進行共焦顯微鏡檢，以鑑認細胞類型-專一性標記是否與經外源移植者(經雙苯甲醯亞胺-標示)同-定位(co-localized)。以水合三氯乙醛(0.4克/公斤，腹腔內)麻醉大鼠，並藉著以生理鹽水經頭骨灌注固定其等的腦，接著灌注並浸泡在4%仲甲醛中，然後包埋在30%蔗糖中。以冠狀面從每個腦中切下一連串相鄰的20微微米-厚之切片。將每個冠狀切片與細胞類型-專一性抗體一起培養：神經膠質細胞纖維酸性蛋白質(「GFAP」，對星狀細胞，1:400，Sigma)、溫韋伯氏因子(Von-Willebrand factor)(「vWF」，對內皮細胞，1:400，Sigma)、神經元核抗原(「Neu-N」，對神經元核，1:200，Chemicon)、微管-關聯蛋白2(「MAP-2」，對神經元樹突，1:200，BM)、CXCR4(CD184，1:100，Toney Pines Biolab)，或微管相關蛋白(Doublecortin)(Dcx，1:100，Santa Cruz Biotechnology)，利用Cy3(Jackson Immunoresearch PA USA,1:500)染色。
結果顯示一些經雙苯甲醯亞胺標示的細胞(藍色，細胞核自動發出螢光)，在經hUCB-治療之局部缺血大鼠腦的半影(penumbra)中，與對抗MAP-2、Neu-N和GFAP的抗體(綠色，神經細胞類型專一性標記)同-定位(圖6-11)。
欲判定hUCB治療是否導致血管生成，藉著雙重免疫螢光染色分析得自經hUCB治療和對照組大鼠的腦切片。以上述之方式進行免疫螢光染色。結果指出數個經外源移植之hUCB細胞(經雙苯甲醯亞胺標示)在經治療大鼠之局部缺血半球的血管周圍和內皮區周圍顯示出血管表現型(vWF+)(圖7)。
細胞沿著皮質脊髓束移動
圖12和13證實細胞及/或經注射染料的存在，並沿著再生的皮質脊髓束移動。
總括而論，結果指出在腦中實質內接受hUCB細胞的大鼠，與對照組大鼠相比較，在慢性腦局部缺血之後，顯示出明顯改善的神經學功能。在經hUCB治療組中，看見經外源移植之幹細胞朝著大腦梗塞帶移動，並分化成神經膠質細胞(GFAP)、神經元(Nestin+
、MAP-2+
和Neu-N+
)，以及血管內皮細胞(vWF+
)，藉此在局部缺血的腦中提高了神經可塑性(neuroplasticity)。
本發明在其應用上不限於在先前說明中陳述或在圖片中解釋的結構細節和組份排列。本發明有其他的具體態樣且能夠以各種方式實行或完成。再者，在本文中使用的語法和術語是為了說明，而不應視為限制。在本文中使用「包含」、「包括」或「具有」、「含有」、「涉及」及其變化，意指包括其後所列舉之項目及其相等物，以及額外的項目。
經描述本發明之至少一個具體態樣的數個觀點後，應了解對熟諳此藝者而言，會輕易地存在各種改變、修改和改良。這類改變、修改和改良應被視為本揭示內容的一部分，並視為在本發明之精神及範圍內。因此，先前的說明和圖片僅為舉例說明。
所附圖式不打算按比例描繪。以同樣的數字代表在各種圖片中圖解的每個相同或幾乎相同的組份。為了清晰，在每個圖片中可能沒有標示每一個組份。
圖1A是所進行模式研究之實驗設計的圖解說明。
圖1B為顯示經富集CD34和CD133之細胞族群之表現型的系列圖。
圖2為顯示在兩個實驗和一個對照組中呈隨著時間之函數的身體擺動恢復的圖。
圖3A為顯示在兩個實驗和一個對照組中呈隨著時間之函數的垂直活動的圖。
圖3B為顯示在兩個實驗和一個對照組中呈隨著時間之函數的垂直移動次數的圖。
圖3C為顯示在兩個實驗和一個對照組中呈隨著時間之函數的垂直移動時間的圖。
圖4為顯示在兩個實驗和一個對照組中抓力強度之百分比的圖。
圖5為在對照組和實驗動物中大鼠腦部的PET影像。
圖6為顯示針對GFAP或Neu-N(綠)和雙苯甲醯亞胺(藍)染色之腦組織切片的照片。
圖7為顯示針對MAP-2或vWF(綠)和雙苯甲醯亞胺(藍)染色之腦組織切片的影像。
圖8A和8B為顯示針對NG2(綠)和雙苯甲醯亞胺(藍)染色之腦組織切片的影像。
圖9為顯示針對A2B5(綠)和雙苯甲醯亞胺(藍)染色之腦組織切片的影像。
圖10為顯示針對CNP酶(綠)和雙苯甲醯亞胺(藍)染色之腦組織切片的影像。
圖11為顯示針對層粘蛋白(laminin)(綠)和雙苯甲醯亞胺(藍)染色之腦組織切片的影像。
圖12顯示MRI-T2掃描和得自慢性中風動物之腦組織切片的普魯士藍(Prussian blue)染色。在慢性中風動物中注意到皮質梗塞。在注射之後7天，在右基底核區中注意到所注射之幹細胞。這些細胞沿著神經纖維移動至梗塞區，在移植之後14天減少了該區的尺寸。
圖13A和B顯示所注射之染料沿著再生皮質脊髓束運送的圖解和實際顯微照片。
Claims (45)
- 一種經分離之臍帶血細胞族群的用途，其係用以製造用於治療慢性中風之醫藥品，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD34+、CD133+或CD34+/CD133+細胞富集，且該醫藥品係用於在中風之後超過7天腦實質內(intraparenchymally)投予至已經歷中風之人類個體的腦。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD34+臍帶血細胞富集。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD133+臍帶血細胞富集。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD34+/CD133+兩者之臍帶血細胞富集。
- 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少75% CD34+。
- 如申請專利範圍第1或2項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少90% CD34+。
- 如申請專利範圍第1或3項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少75% CD133+。
- 如申請專利範圍第1或3項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少90% CD133+。
- 如申請專利範圍第1或4項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少75% CD34+/CD133+。
- 如申請專利範圍第1或4項之用途，其中該經分離 之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少90% CD34+/CD133+。
- 如申請專利範圍第1項之用途，其中該個體為至少60歲。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該醫藥品的投藥導致至少2x106個細胞被投予該個體。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該醫藥品的投藥導致至少5x106個細胞被投予該個體。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該醫藥品的投藥導致至少8x106個細胞被投予該個體。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該醫藥品係用於在中風之後超過1個月投予。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該醫藥品係用於在中風之後超過6個月投予。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該醫藥品係用於在中風之後超過1年投予。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該醫藥品係用於沿著受損之皮質脊髓束投予至三個位置。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係衍生自單一臍帶血單位。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係衍生自多個臍帶血單位。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群與該個體共享6個組織相容性標 記中的少於4個。
- 如申請專利範圍第1、2、3或4項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群與該個體共享6個組織相容性標記中的至少4個。
- 一種經分離之臍帶血細胞族群的用途，其係用以製造用於治療腦組織損傷之醫藥品，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD34+、CD133+或CD34+/CD133+臍帶血細胞富集，且該醫藥品係用於腦實質內投予至已經歷腦組織損傷之人類個體的腦，其中該醫藥品係用於在腦組織損傷之後超過1個月投予。
- 如申請專利範圍第23項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD34+臍帶血細胞富集。
- 如申請專利範圍第23項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD133+臍帶血細胞富集。
- 如申請專利範圍第23項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD34+/CD133+臍帶血細胞富集。
- 如申請專利範圍第23或24項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少75% CD34+。
- 如申請專利範圍第23或24項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少90% CD34+。
- 如申請專利範圍第23或25項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少75%CD133+。
- 如申請專利範圍第23或25項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少90%CD133+。
- 如申請專利範圍第23或26項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少75% CD34+/CD133+。
- 如申請專利範圍第23或26項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群包括單核細胞，其為至少90% CD34+/CD133+。
- 如申請專利範圍第23項之用途，其中該個體為至少60歲。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其中該醫藥品的投藥導致至少2x106個細胞被投予該個體。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其中該醫藥品的投藥導致至少5x106個細胞被投予該個體。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其中該醫藥品的投藥導致至少8x106個細胞被投予該個體。
- 如申請專利範圍第24項之用途，其中該醫藥品係用於在腦組織損傷之後超過6個月投予。
- 如申請專利範圍第24項之用途，其中該醫藥品係用於在腦組織損傷之後超過1年投予。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其中該醫藥品係用於沿著受損之皮質脊髓束投予至三個位置。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群係衍生自單一臍帶血單位。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其 中該經分離之臍帶血細胞族群係衍生自多個臍帶血單位。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群與該個體共享6個組織相容性標記中的少於4個。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其中該經分離之臍帶血細胞族群與該個體共享6個組織相容性標記中的至少4個。
- 如申請專利範圍第23、24、25或26項之用途，其中該腦組織損傷係起因於帕金森氏症(Parkinson’s disease)、阿茲海默氏症(Alzheimer’s disease)、多發性硬化症(multiple sclerosis)或亨丁頓氏症(Huntington’s disease)。
- 一種經分離之臍帶血細胞族群的用途，其係用以製造用於治療腦組織損傷之醫藥品，其中該經分離之臍帶血細胞族群係針對CD34+、CD133+或CD34+/CD133+臍帶血細胞富集，且該醫藥品係用於在發生創傷性腦傷害之後超過1個月腦實質內投予至具有起因於創傷性腦傷害之腦組織損傷之人類個體的腦。
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Non-Patent Citations (1)
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| Medical Hypotheses and Research, Vol. 3, No. 2, April 2006 BMC Cell Biology 2006, 7:30, p1-10 * |
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