CN114555100A - 用于治疗阿尔兹海默症的组合物和方法 - Google Patents

Abstract

本公开的特征在于用于治疗阿尔兹海默症的方法和组合物。所公开的方法包括向患有或易患阿尔兹海默症的受试者给药造血干祖细胞，所述造血干祖细胞表达至少一种神经保护剂，诸如ApoE2、Trem2和/或金属硫蛋白。

Description

用于治疗阿尔兹海默症的组合物和方法

技术领域

相关申请的交叉引用

本申请主张2019年10月1日提交的美国临时申请号62/908,913的权益，该临时申请的整体内容通过引用并入本文。

背景技术

阿尔兹海默症是一种神经退行性疾患，以进行性认知能力减弱为特征。在美国，阿尔茨海默症被认为是导致死亡的主要原因之一，也是导致痴呆症的主要原因，阿尔兹海默症是一种尚无已知的治愈方法或有效治疗方法的进行性疾病。据估计，超过500万美国人患有该疾病，但预计到2060年将有超过1400万人受到影响。脑内神经元丢失和纤维状β-淀粉样蛋白(Aβ)蛋白质斑块的细胞外沉积是该疾病的显著病理特征。Aβ斑块也普遍存在于大脑皮质、脑膜和大脑微血管的中小型动脉和小动脉内部并沿其分布，这种疾病称为大脑淀粉样蛋白血管病，在85％的阿尔茨海默病例中观察到。由于没有已知的针对阿尔兹海默症的治愈方法，亟需用于治疗阿尔兹海默症的治疗性方法。

发明内容

如下所述，本公开特征在于用于治疗阿尔兹海默症的组合物和方法。更具体地，在一些实施方案中，公开了治疗性方式，其包括向有需要的受试者给药包含表达至少一种治疗性转基因的细胞的组合物。

一方面，本发明的特征在于一种含有多核苷酸的表达载体或表达盒，该多核苷酸编码载脂蛋白E同种型2(ApoE2)多肽、在髓细胞上表达的触发受体2(Trem2)多肽、和金属硫蛋白、或其片段中的两者或更多者。

在上述方面的一些实施方案中，所述多核苷酸编码ApoE2和金属硫蛋白1G、TREM2和金属硫蛋白1G、ApoE2和TREM2、或者ApoE2、TREM2和金属硫蛋白1G(MT1G)。

另一方面，本发明的特征在于一种表达载体或表达盒，其含有编码TREM2多肽和ApoE2多肽或其片段的多核苷酸。

在任何上述方面，载体或盒含有金属硫蛋白的两个或更多个拷贝。在任何上述方面，载体含有编码MT1G的至少四个拷贝的多核苷酸。

另一方面，本发明的特征在于一种表达载体，其含有任一上述方面的表达盒。

在任何上述方面，载体是病毒载体。

在任何上述方面，载体含有驱动多核苷酸的表达的启动子。在一些实施方案中，启动子是人磷酸甘油酸激酶启动子。在一些实施方案中，启动子是小神经胶质细胞特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是TSPO、II类MHC、或CX3CR1启动子。

另一方面，本发明的特征在于一种慢病毒载体，其含有驱动编码TREM2多肽和ApoE2多肽或其片段的多核苷酸的表达的磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。

另一方面，本发明的特征在于一种慢病毒载体，其含有驱动编码TREM2多肽和ApoE2多肽或其片段的多核苷酸的表达的小神经胶质细胞特异性启动子。

在任何上述方面，载体含有编码金属硫蛋白的多核苷酸的一个或多个拷贝。

另一方面，本发明提供一种细胞，其含有任何上述方面的载体或任何上述方面的盒。在各种实施方案中，盒插入在CX3CR1或TSPO基因座。在一些实施方案中，细胞是小神经胶质细胞或其前体、造血干细胞、造血干祖细胞(HSPC)、或起源于造血干细胞或造血干祖细胞的细胞。在一些实施方案中，HSPC是CD34⁺和/或CD38^-和/或CD90⁺。在一些实施方案中，细胞对于CX3CR1基因是半合子的。

另一方面，本发明提供一种降低细胞或组织中的淀粉样蛋白β水平的方法，该方法涉及使细胞与编码ApoE2多肽、Trem2多肽和金属硫蛋白多肽或其片段中的两者或更多者的多核苷酸接触。

另一方面，本发明提供一种增加细胞对β淀粉样蛋白的吞噬的方法，该方法包括使细胞与编码ApoE2多肽、Trem2多肽和金属硫蛋白多肽或其片段中的两者或更多者的多核苷酸接触。

另一方面，本发明提供一种治疗患有阿尔兹海默症或具有发展阿尔兹海默症的倾向的受试者的方法，该方法包括向受试者给药有效量的细胞，该细胞含有编码ApoE2多肽和Trem2多肽和金属硫蛋白多肽或其片段中的两者或更多者的多核苷酸。

在一些实施方案中，阿尔兹海默症是家族性或早发性阿尔兹海默症。

另一方面，本发明提供一种治疗患有神经炎症或具有发展神经炎症的倾向的受试者的方法，该方法包括向受试者给药有效量的细胞，该细胞含有编码ApoE2多肽和Trem2多肽和金属硫蛋白多肽或其片段中的两者或更多者的多核苷酸。在任何上述方面，多核苷酸包含在病毒载体中。在一些实施方案中，表达载体是慢病毒载体。在任何上述方面，多核苷酸含有表达盒。在任何上述方面，多核苷酸编码ApoE2和TREM2、ApoE2和金属硫蛋白1G、TREM2和金属硫蛋白1G、或者ApoE2、TREM2和金属硫蛋白(MT1G)。在任何上述方面，多核苷酸编码金属硫蛋白的一个或多个拷贝。在任何上述方面，多核苷酸编码MT1G的至少四个拷贝。在任何上述方面，多核苷酸编码TREM2多肽和ApoE2多肽或其片段。在任何上述方面，多核苷酸进一步编码MT1G的一个或多个拷贝。

在任何上述方面，多核苷酸含有启动子。在任何上述方面，多核苷酸含有组成型启动子。在一些实施方案中，启动子是磷酸甘油酸激酶启动子。在一些实施方案中，启动子是小神经胶质细胞特异性启动子。在一些实施方案中，启动子是TSPO、II类MHC、或CX3CR1启动子。

在任何上述方面，细胞是小神经胶质细胞或其祖细胞、造血干细胞、造血干祖细胞(HSPC)、或自其起源的细胞。在一些实施方案中，该方法在体外或体内进行。在任何上述方面，细胞经脑室内、静脉内或鞘内给药。

在任何上述方面，细胞是造血干祖细胞(HSPC)。在一些实施方案中，HSPC是Lin^-、CD34⁺、CD38^-和/或CD90⁺。在一些实施方案中，HSPC在移植时在功能上等效于小神经胶质祖细胞。在一些实施方案中，HSPC植入在脑内。在一些实施方案中，所植入的HSPC在功能上等效于小神经胶质祖细胞或表达小神经胶质祖细胞的特征标记物。

在任何上述方面，受试者在该方法之前经历消融预处理。在一些实施方案中，消融预处理包括向受试者给药烷基化剂。在一些实施方案中，烷基化剂是白消安。在一些实施方案中，预处理包括给药CSF-1R抑制剂。在一些实施方案中，抑制剂是PLX3397、PLX5622或氯膦酸二钠脂质体。

在任何上述方面，HSPC是同种异体细胞或自体细胞。在任何上述方面，细胞对于CX3CR1基因是半合子的。

在任何上述方面，该方法减轻焦虑，增加认知能力，或增加短期工作记忆。在任何上述方面，该方法减少小神经胶质细胞活化和/或星形细胞应答。在任何上述方面，该方法降低Iba1和/或GFAP的水平。

另一方面，本发明提供一种药物组合物，其含有根据权利要求15所述的HSPC。

另一方面，本发明提供一种试剂盒，其含有根据权利要求15所述的HSPC和关于将其递送至受试者的操作指南。

从具体实施方式和权利要求书可明了本发明的其他特征和优点。

定义

除非另做定义，否则本文中使用的所有科技术语均具有本发明所属领域技术人员所一般理解的意义。下述参考文献对技术人员提供本发明中使用的多个术语的一般性定义：Singleton等人所著《微生物学和分子生物学词典(第二版)》(Singleton et al.,Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(2nd ed.1994))；《剑桥科技词典》(The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker ed.,1988))；Rieger等人编撰的《遗传性术语表(第五版)》(The Glossary of Genetics,5th Ed.,R.Rieger etal.(eds.),Springer Verlag(1991))；以及Hale和Marham所著《哈珀·柯林斯生物学词典》(Hale&Marham,The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)).如本文中所用，除非明确排除，否则下述术语具有归于其下方的意义。

如本文中所用，“消融预处理(ablative conditioning)”是指向受试者给药破坏内源性小神经胶质细胞的组合物。

“剂”意为任何小分子化学化合物、抗体、核酸分子、或多肽、或其片段。

“改变”意为基因或多肽的表达水平或活性的变化(增加或减少)，如通过该领域已知的方法如本文所述的那些方法所检测。如本文中所用，改变包括表达水平变化至少10％、变化25％、变化40％，以及表达水平变化50％或更高。

“缓解”意为减少、阻抑、衰减、缩减、迟滞或稳定化疾病的发展或进展。

“载脂蛋白E同种型2(ApoE2)多肽”意为一种蛋白质，其与GenBank登录号ALQ33369.1或其片段具有至少约85％的氨基酸序列一致性并且具有免疫调节活性。示例性ApoE2多肽序列提供于下。

>ALQ33369.1载脂蛋白E同种型2，部分[智人(Homo sapiens)]

MKVLWAALLVTFLAGCQAKVEQAVETEPEPELRQQTEWQSGQRWELALGRFWDYLRWVQTLSEQVQEELLSSQVTQELRALMDETMKELKAYKSELEEQLTPVAEETRARLSKELQAAQARLGADMEDVRAKLEEQAQQIRLQAEAFQARLKSWFEPLVEDMQRQWAGLVEKVQAAVGTSAAPVPSDNH

“载脂蛋白E同种型2(ApoE2)多核苷酸”意为编码ApoE2多肽的核酸分子。ApoE2基因编码膜蛋白，该膜蛋白介导脂蛋白颗粒的结合、内化和分解代谢。示例性ApoE2多核苷酸序列提供于下。

>KU177911.1智人载脂蛋白E同种型2(APOE)mRNA，部分cds，交替剪接

ATGAAGGTTCTGTGGGCTGCGTTGCTGGTCACATTCCTGGCAGGATGCCAGGCCAAGGTGGAGCAAGCGGTGGAGACAGAGCCGGAGCCCGAGCTGCGCCAGCAGACCGAGTGGCAGAGCGGCCAGCGCTGGGAACTGGCACTGGGTCGCTTTTGGGATTACCTGCGCTGGGTGCAGACACTGTCTGAGCAGGTGCAGGAGGAGCTGCTCAGCTCCCAGGTCACCCAGGAACTGAGGGCGCTGATGGACGAGACCATGAAGGAGTTGAAGGCCTACAAATCGGAACTGGAGGAACAACTGACCCCGGTGGCGGAGGAGACGCGGGCACGGCTGTCCAAGGAGCTGCAGGCGGCGCAGGCCCGGCTGGGCGCGGACATGGAGGACGTGCGCGCCAAGCTGGAGGAGCAGGCCCAGCAGATACGCCTGCAGGCCGAGGCCTTCCAGGCCCGCCTCAAGAGCTGGTTCGAGCCCCTGGTGGAAGACATGCAGCGCCAGTGGGCCGGGCTGGTGGAGAAGGTGCAGGCTGCCGTGGGCACCAGCGCCGCCCCTGTGCCCAGCGACAATCAC

“生物样品”意为源自有机体的任何组织、细胞、体液或其他材料。

本公开中，“包含”、“含有”和“具有”等可具有美国专利法中规定的属于它们的意义，且可意为“包括”等；“主要由...组成”等具有美国专利法中规定的属于它们的意义，且该术语是开放性的，允许超过其所引述者的存在，只要其所引述的基本或新颖特征没有被超过其所引述者的存在改变即可，但不包括先前技术实施方案.

如本文中所用，术语“测定”、“评估”、“分析”、“测量”和“检测”指的是定量测定和定性测定两者，且就其本身而言，术语“测定”在本文中与“分析”、“测量”等可互换使用。若试图进行定量测定，则使用短语“测定被分析物等的量”。若试图进行定性和/或定量测定，则使用短语“测定被分析物的水平”或“检测”被分析物。

“检测”指的是证实待检测的被分析物的存在、不存在或量。

“可检测的标记”意为一种组合物，当连接至感兴趣的分子时，该组合物使得后者可经由光谱学、光化学、生物化学、免疫化学或化学手段检测。例如，有用的标记包括放射性同位素、磁性微珠、金属微珠、胶体离子、荧光染料、高电子密度试剂、酶(例如，一般用于ELISA)、生物素、地高辛或半抗原。

“疾病”意为损害或干扰细胞、组织或器官的正常功能的任何病症或病变。疾病的示例包括神经退行性疾病诸如阿尔兹海默症。

“有效量”意为相对于未治疗患者缓解疾病症状所需的化合物的量。用来实践本发明的用于治疗性处理疾病的活性化合物的有效量可变，取决于给药方式以及受试者的年龄、体重和一般健康情况。基本上，主治医生或兽医将决定适宜的量和用药方案。这一量被称为“有效”量。在特定实施方案中，有效量是减轻阿尔兹海默症的至少一种症状、增加认知功能或增加存活期的量。

“增强子”意为增加感兴趣基因的转录的多核苷酸。在一个实施方案中，增强子包含50至1,500个核苷酸。可用于本发明方法中的示例性增强子包括但不限于下列：

>MPP05A(hTSPO_上游_增强子)(“E1.1”)

agactctgtctcaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagagagagagaaaaaggaagttagaaaaacagccctagaggccctacattctgagtaataggagttccagaaaggaagtgattgctgcacaacataaatttgaaaagaaagagaagtgagaaaatagagggaaggaaatcaaagaaataatccaacttctgaaaagtaaagaatgagcttccagcgggaaagtgcctgttgagtgcaggcacagtggaggaaatgaagctgggtgtgttgccaggagttggaaacttgtctgagcaacatagcgcgaccctgtgtctacaaaaaaataaaaacaaaacaaaaaacaaccaaagacttccgaaacagaatggctttagcctgctcaaccgcacactggcacctggccaacagcatctcttcatgattctgaaggacaacgatctgcagctcagccaagcatcagccatctatggcctaggatgcaagaattcagcaatgttaccttc

>MPP05B(hTSPO_上游_增强子)(“E1.2”)

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>MPP06(hTSPO_内含子_增强子)(“E2”)

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在各种实施方案中，增强子是E1，其含有E1.1和E1.2。在各种实施方案中，E1增强子包含从5'至3'的指示顺序的序列E1.1+E1.2或E1.2+E1.1。

包含其他调节元件的可用于本发明方法中的序列如下：

>MPP03(hTSPO_上游_增强子_加_上游_及_内含子_启动子)

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>MPP06-01(hTSPO_近端5'启动子_加_近端_上游_启动子)

TaggtggcttcacccctctgcctgagcctgagtcctgtccctgccaagactccgcccagccgacgcccaccccagctttccctggactcatccctcagcagatatctggatcctgcctagcctggctcagcatgactcatcatgcagggtaccgcccctgcccacctgttccccaataccgcaattcaggagctgggcagttccccagaggccctaggaaactccccgcccccgaccaggctttctccactcctcccatctgaccgcctgttttctacgcctcacgaccctctgagccccttggcgcactccgacataaccacagccaggcctgagaagccgccagcctccgcagcgagtgtgagcacgggactcagaactggctttgcatcaccgcgttgcggcctcatcagtcccacgactttgtgcccattttactcatgaggagatggaggcccagagagccagtcagaaagtggctgggccaggactaagagtgcagcgcgctgcctccgtgccctgcgtcaacagctcaaggaactggggtgctccggaaatggggccaaggctgctgggcagcaggacgctcagggccttggcctcaggagagcaaattccccactcggagatcggtcttgttgctgcattttattcatgggaaatctgaggctagaagagacgacaaacgacacgccgttggacacacggcaacgttttagatgttgggtctggccgggcggccgtcaccggtcaccatggggaggaggaggagccgagagacttgctcgcggccggggggaggcagaagcgcgtcccgcgggagaggtggctttgaggagtgagctcccggtcccgcggggacgcgagtgggcccagtgcccgggctgccaggcggggcggggcggggccgggcgactgagaggggcggggcctggcggctgggaggggCGGGGCGGATGCGGGGACAGCGGCCTGGCTAACTCCTGCACGGCAGTGCCCTTCCCGGAGCGTGCCCTCGCCG

>MPP03(hTSPO_上游_加_内含子_启动子)

taggtggcttcacccctctgcctgagcctgagtcctgtccctgccaagactccgcccagccgacgcccaccccagctttccctggactcatccctcagcagatatctggatcctgcctagcctggctcagcatgactcatcatgcagggtaccgcccctgcccacctgttccccaataccgcaattcaggagctgggcagttccccagaggccctaggaaactccccgcccccgaccaggctttctccactcctcccatctgaccgcctgttttctacgcctcacgaccctctgagccccttggcgcactccgacataaccacagccaggcctgagaagccgccagcctccgcagcgagtgtgagcacgggactcagaactggcttGAGtgcatcaccgcgttgcggcctcatcagtcccacgactttgtgcccattttactcatgaggagatggaggcccagagagccagtcagaaagtggctgggccaggactaagagtgcagcgcgctgcctccgtgccctgcgtcaacagctcaaggaactggggtgctccggaaatggggccaaggctgctgggcagcaggacgctcagggccttggcctcaggagagcaaattccccactcggagatcggtcttgttgctgcattttattcatgggaaatctgaggctagaagagacgacaaacgacacgccgttggacacacggcaacgttttagatgttgggtctggccgggcggccgtcaccggtcaccatggggaggaggaggagccgagagacttgctcgcggccggggggaggcagaagcgcgtcccgcgggagaggtggctttgaggagtgagctcccggtcccgcggggacgcgagtgggcccagtgcccgggctgccaggcggggcggggcggggccgggcgactgagaggggcggggcctggcggctgggaggggCGGGGCGGATGCGGGGACAGCGGCCTGGCTAACTCCTGCACGGCAGTGCCCTTCCCGGAGCGTGCCCTCGCCGCTGcacagtgaggacgggacgcggagggggcagcgggaacacgccgcccgcatggctgcgacagttggcagcgccgcgggacagagggaaactgaggccggagccgcagactggacacccgagggggcgacccggggcagcacttggggctcggctacgcgcacagggggcggcgggcagcagagtctgggcctccgcggccggggttccaccgccggccgcctccggctcgcgcaacgggagggaaaacttggacaaccctgccacgcccagcccttggccgcgtggcttctcctgctcgaagcgcggtcccaggagtggccgacgctccctctcctgcccattccgcggatgggcaatcccaggcggaactcccttgagggtctcagaatatctgggagacctcgggctcttgatctccgagacaccccgtttcgtagtggagaacagtccagatcggggaagtttattttgcccaaagccgcatagaggccccctggccctcgattccctctgcggggctcagcagcgttgcagcctagacgggtcttactgtgagccgagcagcctctgggaccacagaccttcccctaccccaacgttagaagccggagcccagcaaggagaagcgcgcacctcctgctgtgaacgcgcacgacgccagggcagctgccagaggccatggcctggcgtgggcctggagcccctctggccagcctgcacggggccagggctacgggataccagcagcgtgccctgggctggatggcaggagagacaggacttgaggctgtcccagaatgggctcaggcagggcgaggatatcaggggaggtggtgtacaggaagcagccgcccagcttgcctggcacacagcaagccctgcccatgaaggcctactgccagaacagtgggcgaggcccggcgtctctgtggagtcggtggggcccgggacagggcagcctgaggcaggtttccactggcggtgaaaggggccgtgtggcaaggacaggagagccagcctcagcccagcaggggaaggcggcccctgagtctccacctggctgctggcagccccactcggagcatcggcgaaactgaggcttgccaaagaagcctttgtccagagtcacgcagctggcgcggtggagccagggccagaacccgtgcaggctgatcccagcctgccttctccactgtgccccg

如本文中所用，“外源核酸分子”是指核酸分子，该核酸分子不是内源核酸分子，即，它不是天然地存在于细胞内的核酸分子。

“表达盒”意为表达基因所需的那些载体元件。在一种实施方案中，表达盒包含启动子、编码感兴趣的多肽的多核苷酸、和终止子。

“片段”意为蛋白质或核酸的一个部分，其大致上与参考蛋白质或核酸一致。在一些实施方案中，该部分保留本文所述的参考蛋白质或核酸的生物学活性的至少50％、75％、或80％、85％、90％、95％或甚至99％。

“基因座”意为特定基因序列在基因组内所处的位置。

“造血干细胞(HSC)”意为产生各种血细胞的干细胞。

“造血干祖细胞(HSPC)”意为产生造血干细胞的细胞。

可以与本文所述组合物和方法协同使用的细胞(例如，HSC、HSPC)包括CD34+细胞、CD34+/CD90+细胞、CD34+CD38-细胞和CD34+/CD164+细胞。这些细胞可以含有更高百分比的HSC或HSPC。这些细胞在WO2015/059674、WO2017/218948、Radtke etal.Sci.Transl.Med.9:1-10,2017、Radtke et al.Mol Ther Methods Clin Dev.18:679-691,2020、和Pellin et al.Nat.Comm.10:2395,2019中有所描述，其各自的公开内容通过引用以其整体并入本文。

“杂交”意为互补核碱基之间的氢键键合，其可以是沃森-克里克(Watson-Crick)、胡斯坦(Hoogsteen)和反向胡斯坦氢键键合。例如，腺嘌呤和胸腺嘧啶是通过形成氢键而配对的互补核碱基。

“抑制性核酸”意为双链RNA、siRNA、shRNA、或反义RNA，或其部分，或其模拟物，当其给药至哺乳动物细胞时，导致靶标基因的表达降低(例如，降低10％、25％、50％、75％、或甚至90％至100％)。典型地，核酸抑制剂包含靶标核酸分子或其直系同源物的至少一部分，或包含靶标核酸分子的互补链的至少一部分。例如，抑制性核酸分子包含任何或所有本文所述核酸的至少一部分。

术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”指的是物质没有不同程度的在其天然状态下发现的正常伴随组分。“分离”表示与原始来源或周围物质分隔的程度。“纯化”表示高于“分离”的分隔程度。“纯化的”或“生物学纯的”蛋白质足够不含其他材料，使得任何杂质均不在材料上影响该蛋白质的生物学性质或不造成其他负面后果。换言之，如果本发明的核酸或肽基本上在通过重组DNA技术生产时不含细胞物质、病毒物质或培养基，或者当化学合成时不含化学前体或其他化学品，则该核酸或肽是纯化的。典型使用分析化学技术例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱来测定纯度和均质性。术语“纯化的”可表示核酸或蛋白质在电泳凝胶中给出实质上的一条谱带。对于可进行修饰如磷酸化或糖基化的蛋白质，不同的修饰可给出不同的分离的蛋白，它们可独立纯化。

“分离的多核苷酸”意为一种核酸(例如，DNA)，其不含在本发明的核酸分子所源自的有机体的天然出现的基因组中位于该基因侧翼的基因。该术语因此包括，举例而言，重组DNA，其被并入载体内、并入自主复制质粒或病毒内、或并入原核生物或真核生物的基因组DNA内，或作为独立于其他序列的单独分子而存在(举例而言，通过PCR或限制性内切酶消化制备的cDNA或基因组或cDNA片段)。此外，该术语包括从DNA分子转录的RNA分子，以及作为编码附加多肽序列的杂交基因的一部分的重组DNA。

“分离的多肽”意为已经与其天然伴随组分分离的本发明的多肽。典型地，以重量计，当多肽的至少60％不含其天然关联的蛋白质和天然出现的有机分子时，则该多肽是分离的。在一些实施方案中，以重量计，该制剂含有至少75％、至少90％、或至少99％的本发明的多肽。可通过例如从天然来源提取、编码多肽的重组核酸的表达、或化学合成蛋白质来获得本发明的分离的多肽。可通过任何适宜的方法例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析来测量纯度。

“标记物”意为任意蛋白质或多核苷酸，其在表达水平或活性上有与疾病或病变相关的改变。阿尔兹海默症的标记物包括但不限于，tau蛋白和β淀粉样肽。

“金属硫蛋白1G(MT1G)多肽”意为一种蛋白质，其与UniProt登录号P13640-1或其片段具有至少约85％的氨基酸序列一致性并且具有重金属结合活性。示例性MT1G多肽序列提供于下。

>sp|P13640|MT1G_HUMAN金属硫蛋白-1G OS＝智人OX＝9606GN＝MT1G PE＝1SV＝2

MDPNCSCAAAGVSCTCASSCKCKECKCTSCKKSCCSCCPVGCAKCAQGCICKGASEKCSCCA

“金属硫蛋白1G(MT1G)多核苷酸”意为编码MT1G多肽的核酸分子。MT1G基因编码结合重金属的蛋白质。示例性MT1G多核苷酸序列提供于下。

>NM_005950.2智人金属硫蛋白1G(MT1G)，转录物变体1，mRNA

ACTCCGCCTTCCACGTGCACCCACTGCCTCTTCCCTTCTCGCTTGGGAACTCTAGTCTCGCCTCGGGTTGCAATGGACCCCAACTGCTCCTGTGCCGCTGGTGTCTCCTGCACCTGCGCCAGCTCCTGCAAGTGCAAAGAGTGCAAATGCACCTCCTGCAAGAAGAGCTGCTGCTCCTGCTGCCCTGTGGGCTGTGCCAAGTGTGCCCAGGGCTGCATCTGCAAAGGGGCATCGGAGAAGTGCAGCTGCTGCGCCTGATGTCGGGACAGCCCTGCTCCCAAGTACAAATAGAGTGACCCGTAAAATCCAGGATTTTTTGTTTTTTGCTACAATCTTGACCCCTTTGCTACATTCCTTTTTTTCTGTGAAATATGTGAATAATAATTAAACACTTAGACTTGAAAAAAAAAAAAAAAAAAA

“小神经胶质细胞”意为中枢神经系统的免疫细胞。

“纳米颗粒”意为纳米级维度的复合结构。特别地，纳米颗粒典型是尺寸在约1至约1000nm范围内的颗粒，且经常是球形但可以是不同的形貌，取决于纳米颗粒的组成。纳米颗粒的与该纳米颗粒外的环境接触的部分通常称为纳米颗粒表面。在本文所述的纳米颗粒中，尺寸限制可能限定在两个维度，并且使得本文所述的纳米颗粒包括具有约1至约1000纳米维度的复合结构，其中具体直径取决于纳米颗粒的组成并且取决于根据实验涉及的纳米颗粒的预期用途。例如，待用于几种治疗性应用的纳米颗粒典型具有约200nm或更小的尺寸，而特别是用于与治疗剂相关的递送的纳米颗粒典型具有约1至约100nm的直径。

如本文中所用，“神经退行性疾病”指的是以包括神经元死亡在内的神经元结构和/或功能的进行性丧失为特征的一组疾病中的任一种。示例性的神经退行性疾病包括而不限于阿尔兹海默症。

如本文中所用，如“获得一剂”中的“获得”包括合成、购买或以其他方法取得该剂。

“PLX3397”意为集落刺激因子群落-1受体(CSF-1R)抑制剂，其具有结构

“PLX5622”意为集落刺激因子群落-1受体(CSF-1R)抑制剂，其具有结构

如本文中所用，术语“预防”、“防止”、“预防性治疗”等指的是降低受试者体内发展出病变或病症的概率，其中该受试者不具有病变或病症但处于发展出病变或病症的风险下或易于发展出病变或病症。

“启动子”意为足以引导转录的多核苷酸。在一些实施方案中，启动子是转位子蛋白启动子(TSPO)。在一些实施方案中，启动子是CX3CR1启动子。在示例性实施方案中，CX3CR1启动子包含与GeneBank登录号GQ258357.1或其片段具有至少85％序列一致性的序列。GeneBank登录号GQ258357.1的序列提供于下。

GeneBank登录号GQ258357.1：

GCAACCTCCACCTTCCGGTTTCAAGCGATTCTCCTGCCTCAGCCTCCCAAGTAGTTGGGATTACAGGCACCCGCCACCACGCCTGGCTAATTTTTATATTTTTAGTAAAGACAGGGTTTCACCATTTTGGCCAGGCTGGTCTTGAACCCCTGATCTCGTGATCCACCCACGTTGGCCTCCCAAAGTGCTGGAATTACAGGCGTGAGCCACCATGCCTGGCCCACATTACATTCTTACTCACCTCCCCCTACCATGGAATTTTATTCCACAGATATGCTATTGGTTTAGCTACTATATGTATATCTGTGTTTTATACATAAAGCACAAGAACCTTCCAGAACCAATTTTCGCCACCTTGGAAGTAATACCACCTCTACTAAGAATGCACAGCATAGACCATAAAACCTCAATGCTAAGTTCAAATATTGGCCCTACCACACATGAGCTGTGTGGTCTTGTACAAGTTACATAACTTCTCCTCCTTGTCTCAAACTCCTCACATATAAGATGAGGATAATAATAGTACCTGCGGCCACACACAGTGGCTTAAACGTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGCTGCGGCAGAAGGATCACTCAAACTCAGGAGTTCAAGAGCAGCCTGGGTACATGGCGAAACTCTGTCTCTACAAAAAATACAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGATGTGTGCCTGTAGTTCCAGCTACTTGGGAGGCTGAGGTGAGAGGATCGTTCGAGCCCAGGAGATCAAGGATGCAGTGAGCTATGATCATGTGGCTGCACTCCAGCCTGGATAACAGAGCCAGACCCTGTCTGAAAGAAACAAAAACAAAAACATTAGCACCTGCATCATAGGGTCACTGGGGGCACTACATGAGTTCATGTACATCGAGGACTTAGGACATTGCCTCAGGCAGACCTAGTGCTGCACAATTGCTTATGTAATTATTCCCAAATTTCTCCAGGGCCCACAGAAGAACATGGAAGTATCTTGGTTTGGCAATTAAGGTGAATCACATTCTCACTCTCCTTTTCTGCATCTCTACCCCACATTCCCACAAAGCTTTATTCACACCAAGTCTCCAGTCCTTGCCTGCATTGTGTGATGGGTGCCTGCAGTGATGGGTGGGGACACCCATCACTGTCCAGGGCGTCCCCACCATCCTCACAGCCTCTCTGTCTGGCCTCCTGCCTTTGAGCCAGCCCACCACACTCTCATTTCTCTGCCCAGCAGAAACCAAACTGTCCTCTGCATTTACTGTCTCAACTGGAAGAGAAATGCAGAATGACAAAGAACTTGTGAACAAGGGTCAGCTCCAACAGAGAGTGAAGCCAAAGGGGCTGGGCAGAAAGAGAGATGAAGACGGGGGTCTGAGGAATAAGGCTGTACCAGAGTGAGAGTACGGGGGAGGGGTTGAACAAGAGTTCAGGGAGGAGAGAATTCCCAGCGCTGAGCCAGAGACTCCTTTACAGAGGCCCAAGGAGGCGTGGAGGGAGGGGGAAGGCTGCCAAGGCTCTTTCTGTCTCCATGAGTGTGTCAAGAATGCAAAGCACTAATGCTCTTCACTTGGTCCATCTTGCAGGGTTGAGTTTGCAGTGAGCAACCTTGAAGGATGAGCTGACATCTCGCTCAGGGCCAAATAACCGACTTGCTTACTGCTTGCTATAAAATGGCACGTTACCCAAGGTCAGAGTTCCCTTCCTATAACCTCCCCATCCCTCACACATTCACAGGTATCTATCCAAGCCATGGCATCACTCTGTGGGGCTTGGGGGCAAGGCAACTGACACTGCACGCTGGTTCTCATGCTTGCCAAGCATGAAGCCCTGTGCTGCTAGCAGCTGTGGAACATAGCCGTTAGCTTTAAAAGAGGGTAAAATCACGTCCTGGACAGGACAGCCAGGTGAGTTGGGAAGGGAAGAGAGCCTGCCACGGGCACAGGCATGTTGGGGGAAGTGGAAGTGGTGAGAGCACAGTAGGAAGTGAGAAGGGGCGGGCCGTGCTTACCAGGCCGTGGACTTAAACCAGG

“降低”意为至少10％、25％、50％、75％或100％的负向改变。

“参考”意为标准或对照条件。

“参考序列”是用作序列比对基础的定义序列。参考序列可以是特定序列的一部分或整体；例如，全长度cDNA或基因序列的链段、或完整的cDNA或基因序列。对于多肽，参考多肽序列的长度将通常为，在一些实施方案中，至少约16个氨基酸、至少约20个氨基酸、至少约25个氨基酸、或约35个氨基酸、约50个氨基酸或约100个氨基酸，或与之接近或之间的任何整数。对于核酸，参考核酸序列的长度将通常为至少约50个核苷酸、至少约60个核苷酸、至少约75个核苷酸、至少约100个核苷酸或约至少300个核苷酸或与之接近或之间的任何整数。

可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子无须与内源核酸序列100％相同，但典型将会展现基本同一性。具有与内源序列“实质同一性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。可用于本发明方法的核酸分子包括编码本发明的多肽或其片段的任何核酸分子。此类核酸分子无须与内源核酸序列100％相同，但典型将会展现基本同一性。具有与内源序列“实质同一性”的多核苷酸典型能与双链核酸分子的至少一条链杂交。“杂交”意为在互补多核苷酸序列(如，本文中揭示的基因)或其部分在多种严格条件下配对以形成双链分子。(见，例如，Wahl,G.M.andS.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152:399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152:507)。

术语“核苷酸分子”、“多核苷酸”或“核酸序列”可互换地使用，是指包含RNA或DNA的分子。在各种实施方案中，核苷酸分子或多核苷酸包含经修饰的核苷酸(例如，锁核酸(LNA))。在一些实施方案中，核苷酸分子或多核苷酸分子包含RNA和DNA。核苷酸分子的糖骨架是非限制性的并且可包含核糖、脱氧核糖或各种其他合适的糖。在一些实施方案中，核酸分子包含至少两个共价链接在一起的核苷酸。在一些实施方案中，本发明的核酸分子是单链的。在一些实施方案中，核酸分子是双链的。在一些实施方案中，核酸分子是三链的。在一些实施方案中，核酸分子包含磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸分子包含单链或双链脱氧核糖核酸(DNA)或者单链或双链核糖核酸(RNA)。在一些实施方案中，核酸分子包含核酸类似物。在一些实施方案中，核酸类似物具有骨架，该骨架包含并非是磷酸二酯键的键且/或除了包含磷酸二酯间之外还包含并非是磷酸二酯键的键，该并非是磷酸二酯键的键诸如，作为非限制性示例，磷酰胺、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或O-甲基亚磷酰胺链结。在一些实施方案中，核酸类似物选自具有选自阳离子骨架、非离子骨架和非核糖骨架的骨架的核酸类似物。在一些实施方案中，核酸分子含有一种或多种碳环糖。在一些实施方案中，核酸分子包含其核糖-磷酸酯骨架的修饰。在一些实施方案中，进行这些修饰以促进额外部分诸如标签的加成。在一些实施方案中，进行这些修饰以增加此类分子在生理环境中的稳定性和半衰期。在一些实施方案中，术语“多核苷酸”捕获序列，该序列包括DNA和RNA的任何已知碱基类似物诸如但不限于，4-乙酰基胞嘧啶、8-羟基-N6-甲基腺苷、吖丙丁基胞嘧啶、假异胞嘧啶、5-(羧基羟基-甲基)尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-羧甲基氨基甲基-2-硫尿嘧啶、5-羧甲基-氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基腺嘌呤、1-甲基假-尿嘧啶、1-甲基鸟嘌呤、1-甲基肌苷、2,2-二甲基-鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基-胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基-氨基-甲基-2-硫尿嘧啶、β-D-甘露糖基辫苷、5'-甲氧羰基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲硫基-N6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、氧丁苷(oxybutoxosine)、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶、5-甲基-2-硫尿嘧啶、2-硫尿嘧啶、4-硫尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、-尿嘧啶-5-氧乙酸甲酯、尿嘧啶-5-氧乙酸、假尿嘧啶、辫苷、2-硫胞嘧啶和2,6-二氨基嘌呤。

举例而言，严格的盐浓度一般为少于约750mM NaCl和75mM柠檬酸三钠、少于约500mM NaCl和50mM柠檬酸三钠、或约250mM NaCl和25mM柠檬酸三钠。低严格度杂交可在不存在有机溶剂如甲酰胺的情况下获得，而高严格度杂交可在存在至少约35％甲酰胺，且在一些实施方案中至少约50％甲酰胺的情况下获得。严格的温度条件一般将包括至少约℃、至少约37℃、或至少约42℃的温度。可变的附加因素，如杂交时间、洗涤剂如十二烷基硫酸钠(SDS)的浓度、以及包含或不包含载体DNA，是该领域技术人员所周知的。通过按需要组合这些多种条件来实施各种水平的严格度。在一种实施方案中，杂交将出现在30℃的750mMNaCl、75mM柠檬酸三钠和1％SDS中。在另一种实施方案中，杂交将出现在37℃的500mMNaCl、50mM柠檬酸三钠、1％SDS、35％甲酰胺和100μg/ml变性鲑鱼精DNA(ssDNA)中。在又一实施方案中，杂交将出现在42℃的250mM NaCl、25mM柠檬酸三钠、1％SDS、50％甲酰胺和200μg/ml ssDNA中。对这些条件的有用改变对于该领域技术人员是显而易见的。

对于大多数应用，杂交后的洗涤步骤的严格度也将改变。可通过盐浓度和温度来界定洗涤严格度条件。如上，可通过降低盐浓度或增加温度来增加洗涤严格度。举例而言，洗涤步骤的严格的盐浓度包括少于约30mM NaCl和3mM柠檬酸三钠，或少于约15mM NaCl和1.5mM柠檬酸三钠。用于洗涤步骤的严格的温度条件一般将包括至少约25℃、至少约42℃、或至少约68℃的温度。在一些种实施方案中，洗涤步骤将出现在25℃的30mM NaCl、3mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。在其他实施方案中，洗涤步骤将出现在42℃的15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。在其他实施方案中，洗涤步骤将出现在68℃的15mM NaCl、1.5mM柠檬酸三钠和0.1％SDS中。对这些条件的额外改变对于该领域技术人员是显而易见的。杂交技术是该领域技术人员所周知的，且揭示在例如Benton and Davis(Science 196:180,1977)；Grunstein and Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72:3961,1975)；《分子生物学现代技术》(Ausubelet al.(Current Protocols in Molecular Biology,WileyInterscience,New York,2001))；《分子克隆技术指南》(Berger and Kimmel(Guide toMolecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York))；以及《分子克隆：实验室手册》(Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York)中。

术语“受试者”或“患者”指的是作为治疗、观察或实验的目标的动物。仅作为实例，受试者包括但不限于，哺乳动物，包括但不限于人类和非人哺乳动物，诸如非人灵长类、鼠、牛、马、犬、羊或猫科动物。

“基本相同”意为多肽或核酸分子展现与参考氨基酸序列(例如，任何一种本文所述的氨基酸序列)或核酸序列(例如，任何一种本文所述的核酸序列)的至少50％同一性。在一些实施方案中，此序列在氨基酸水平或核酸与用于比较的序列的同一性为至少60％、80％或85％、90％、95％或甚至99％。

通常使用序列分析软件(例如，威斯康星大学生物技术中心的遗传学计算机公司(Genetics Computer Group,University of Wisconsin Biotechnology Center,1710University Avenue,Madison,Wis.53705)的序列分析软件包BLAST、BESTFIT、GAP、或PILEUP/PRETTYBOX程序)测量序列一致性。该软件通过设定多种替换、缺失、及/或其他修饰的同源性程度来匹配相同或相似的序列。保守替换典型包括下述各组的组内替换：甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。在示例性的测定一致性程度的途径中，可使用BLAST程序，其中介于e^-3与e^-100之间的可能性得分指示密切相关的序列。

“受试者”意为哺乳动物，包括但不限于人类和非人哺乳动物，诸如牛、马、犬、羊或猫科动物。

“转位子蛋白启动子”或“TSPO启动子”意为足以引导转基因在小神经胶质细胞中的表达的多核苷酸。在一种实施方案中，TSPO启动子可以对炎症产生应答。可用于本发明方法中的示例性启动子包括但不限于下列：

>MPP01(hTSPO_近端5'启动子)(“P1”)

TgcatcaccgcgttgcggcctcatcagtcccacgactttgtgcccattttactcatgaggagatggaggcccagagagccagtcagaaagtggctgggccaggactaagagtgcagcgcgctgcctccgtgccctgcgtcaacagctcaaggaactggggtgctccggaaatggggccaaggctgctgggcagcaggacgctcagggccttggcctcaggagagcaaattccccactcggagatcggtcttgttgctgcattttattcatgggaaatctgaggctagaagagacgacaaacgacacgccgttggacacacggcaacgttttagatgttgggtctggccgggcggccgtcaccggtcaccatggggaggaggaggagccgagagacttgctcgcggccggggggaggcagaagcgcgtcccgcgggagaggtggctttgaggagtgagctcccggtcccgcggggacgcgagtgggcccagtgcccgggctgccaggcggggcggggcggggccgggcgactgagaggggcggggcctggcggctgggaggggCGGGGCGGATGCGGGGACAGCGGCCTGGCTAACTCCTGCACGGCAGTGCCCTTCCCGGAGCGTGCCCTCGCCG

P1启动子包含对应于hTspo紧邻5’启动子的hTspo紧邻5'启动子的核苷酸残基-562至+73(大写字母)的635bp。

>MPP02(hTSPO_内含子5'启动子)(“P2”)

CTGcacagtgaggacgggacgcggagggggcagcgggaacacgccgcccgcatggctgcgacagttggcagcgccgcgggacagagggaaactgaggccggagccgcagactggacacccgagggggcgacccggggcagcacttggggctcggctacgcgcacagggggcggcgggcagcagagtctgggcctccgcggccggggttccaccgccggccgcctccggctcgcgcaacgggagggaaaacttggacaaccctgccacgcccagcccttggccgcgtggcttctcctgctcgaagcgcggtcccaggagtggccgacgctccctctcctgcccattccgcggatgggcaatcccaggcggaactcccttgagggtctcagaatatctgggagacctcgggctcttgatctccgagacaccccgtttcgtagtggagaacagtccagatcggggaagtttattttgcccaaagccgcatagaggccccctggccctcgattccctctgcggggctcagcagcgttgcagcctagacgggtcttactgtgagccgagcagcctctgggaccacagaccttcccctaccccaacgttagaagccggagcccagcaaggagaagcgcgcacctcctgctgtgaacgcgcacgacgccagggcagctgccagaggccatggcctggcgtgggcctggagcccctctggccagcctgcacggggccagggctacgggataccagcagcgtgccctgggctggatggcaggagagacaggacttgaggctgtcccagaatgggctcaggcagggcgaggatatcaggggaggtggtgtacaggaagcagccgcccagcttgcctggcacacagcaagccctgcccatgaaggcctactgccagaacagtgggcgaggcccggcgtctctgtggagtcggtggggcccgggacagggcagcctgaggcaggtttccactggcggtgaaaggggccgtgtggcaaggacaggagagccagcctcagcccagcaggggaaggcggcccctgagtctccacctggctgctggcagccccactcggagcatcggcgaaactgaggcttgccaaagaagcctttgtccagagtcacgcagctggcgcggtggagccagggccagaacccgtgcaggctgatcccagcctgccttctccactgtgccccg

>MPP03(hTSPO_上游_加_内含子_启动子)(“P1+P2”)

GAGtgcatcaccgcgttgcggcctcatcagtcccacgactttgtgcccattttactcatgaggagatggaggcccagagagccagtcagaaagtggctgggccaggactaagagtgcagcgcgctgcctccgtgccctgcgtcaacagctcaaggaactggggtgctccggaaatggggccaaggctgctgggcagcaggacgctcagggccttggcctcaggagagcaaattccccactcggagatcggtcttgttgctgcattttattcatgggaaatctgaggctagaagagacgacaaacgacacgccgttggacacacggcaacgttttagatgttgggtctggccgggcggccgtcaccggtcaccatggggaggaggaggagccgagagacttgctcgcggccggggggaggcagaagcgcgtcccgcgggagaggtggctttgaggagtgagctcccggtcccgcggggacgcgagtgggcccagtgcccgggctgccaggcggggcggggcggggccgggcgactgagaggggcggggcctggcggctgggaggggCGGGGCGGATGCGGGGACAGCGGCCTGGCTAACTCCTGCACGGCAGTGCCCTTCCCGGAGCGTGCCCTCGCCGCTGcacagtgaggacgggacgcggagggggcagcgggaacacgccgcccgcatggctgcgacagttggcagcgccgcgggacagagggaaactgaggccggagccgcagactggacacccgagggggcgacccggggcagcacttggggctcggctacgcgcacagggggcggcgggcagcagagtctgggcctccgcggccggggttccaccgccggccgcctccggctcgcgcaacgggagggaaaacttggacaaccctgccacgcccagcccttggccgcgtggcttctcctgctcgaagcgcggtcccaggagtggccgacgctccctctcctgcccattccgcggatgggcaatcccaggcggaactcccttgagggtctcagaatatctgggagacctcgggctcttgatctccgagacaccccgtttcgtagtggagaacagtccagatcggggaagtttattttgcccaaagccgcatagaggccccctggccctcgattccctctgcggggctcagcagcgttgcagcctagacgggtcttactgtgagccgagcagcctctgggaccacagaccttcccctaccccaacgttagaagccggagcccagcaaggagaagcgcgcacctcctgctgtgaacgcgcacgacgccagggcagctgccagaggccatggcctggcgtgggcctggagcccctctggccagcctgcacggggccagggctacgggataccagcagcgtgccctgggctggatggcaggagagacaggacttgaggctgtcccagaatgggctcaggcagggcgaggatatcaggggaggtggtgtacaggaagcagccgcccagcttgcctggcacacagcaagccctgcccatgaaggcctactgccagaacagtgggcgaggcccggcgtctctgtggagtcggtggggcccgggacagggcagcctgaggcaggtttccactggcggtgaaaggggccgtgtggcaaggacaggagagccagcctcagcccagcaggggaaggcggcccctgagtctccacctggctgctggcagccccactcggagcatcggcgaaactgaggcttgccaaagaagcctttgtccagagtcacgcagctggcgcggtggagccagggccagaacccgtgcaggctgatcccagcctgccttctccactgtgccccg

>MPP04(hTSPO_内含子_加_上游_启动子)(“P2+P1”)

CTGcacagtgaggacgggacgcggagggggcagcgggaacacgccgcccgcatggctgcgacagttggcagcgccgcgggacagagggaaactgaggccggagccgcagactggacacccgagggggcgacccggggcagcacttggggctcggctacgcgcacagggggcggcgggcagcagagtctgggcctccgcggccggggttccaccgccggccgcctccggctcgcgcaacgggagggaaaacttggacaaccctgccacgcccagcccttggccgcgtggcttctcctgctcgaagcgcggtcccaggagtggccgacgctccctctcctgcccattccgcggatgggcaatcccaggcggaactcccttgagggtctcagaatatctgggagacctcgggctcttgatctccgagacaccccgtttcgtagtggagaacagtccagatcggggaagtttattttgcccaaagccgcatagaggccccctggccctcgattccctctgcggggctcagcagcgttgcagcctagacgggtcttactgtgagccgagcagcctctgggaccacagaccttcccctaccccaacgttagaagccggagcccagcaaggagaagcgcgcacctcctgctgtgaacgcgcacgacgccagggcagctgccagaggccatggcctggcgtgggcctggagcccctctggccagcctgcacggggccagggctacgggataccagcagcgtgccctgggctggatggcaggagagacaggacttgaggctgtcccagaatgggctcaggcagggcgaggatatcaggggaggtggtgtacaggaagcagccgcccagcttgcctggcacacagcaagccctgcccatgaaggcctactgccagaacagtgggcgaggcccggcgtctctgtggagtcggtggggcccgggacagggcagcctgaggcaggtttccactggcggtgaaaggggccgtgtggcaaggacaggagagccagcctcagcccagcaggggaaggcggcccctgagtctccacctggctgctggcagccccactcggagcatcggcgaaactgaggcttgccaaagaagcctttgtccagagtcacgcagctggcgcggtggagccagggccagaacccgtgcaggctgatcccagcctgccttctccactgtgccccgtgcatcaccgcgttgcggcctcatcagtcccacgactttgtgcccattttactcatgaggagatggaggcccagagagccagtcagaaagtggctgggccaggactaagagtgcagcgcgctgcctccgtgccctgcgtcaacagctcaaggaactggggtgctccggaaatggggccaaggctgctgggcagcaggacgctcagggccttggcctcaggagagcaaattccccactcggagatcggtcttgttgctgcattttattcatgggaaatctgaggctagaagagacgacaaacgacacgccgttggacacacggcaacgttttagatgttgggtctggccgggcggccgtcaccggtcaccatggggaggaggaggagccgagagacttgctcgcggccggggggaggcagaagcgcgtcccgcgggagaggtggctttgaggagtgagctcccggtcccgcggggacgcgagtgggcccagtgcccgggctgccaggcggggcggggcggggccgggcgactgagaggggcggggcctggcggctgggaggggCGGGGCGGATGCGGGGACAGCGGCCTGGCTAACTCCTGCACGGCAGTGCCCTTCCCGGAGCGTGCCCTCGCCGGGATCC

>MPP02(hTSPO_内含子5'启动子)

taggtggcttcacccctctgcctgagcctgagtcctgtccctgccaagactccgcccagccgacgcccaccccagctttccctggactcatccctcagcagatatctggatcctgcctagcctggctcagcatgactcatcatgcagggtaccgcccctgcccacctgttccccaataccgcaattcaggagctgggcagttccccagaggccctaggaaactccccgcccccgaccaggctttctccactcctcccatctgaccgcctgttttctacgcctcacgaccctctgagccccttggcgcactccgacataaccacagccaggcctgagaagccgccagcctccgcagcgagtgtgagcacgggactcagaactggcttCTGcacagtgaggacgggacgcggagggggcagcgggaacacgccgcccgcatggctgcgacagttggcagcgccgcgggacagagggaaactgaggccggagccgcagactggacacccgagggggcgacccggggcagcacttggggctcggctacgcgcacagggggcggcgggcagcagagtctgggcctccgcggccggggttccaccgccggccgcctccggctcgcgcaacgggagggaaaacttggacaaccctgccacgcccagcccttggccgcgtggcttctcctgctcgaagcgcggtcccaggagtggccgacgctccctctcctgcccattccgcggatgggcaatcccaggcggaactcccttgagggtctcagaatatctgggagacctcgggctcttgatctccgagacaccccgtttcgtagtggagaacagtccagatcggggaagtttattttgcccaaagccgcatagaggccccctggccctcgattccctctgcggggctcagcagcgttgcagcctagacgggtcttactgtgagccgagcagcctctgggaccacagaccttcccctaccccaacgttagaagccggagcccagcaaggagaagcgcgcacctcctgctgtgaacgcgcacgacgccagggcagctgccagaggccatggcctggcgtgggcctggagcccctctggccagcctgcacggggccagggctacgggataccagcagcgtgccctgggctggatggcaggagagacaggacttgaggctgtcccagaatgggctcaggcagggcgaggatatcaggggaggtggtgtacaggaagcagccgcccagcttgcctggcacacagcaagccctgcccatgaaggcctactgccagaacagtgggcgaggcccggcgtctctgtggagtcggtggggcccgggacagggcagcctgaggcaggtttccactggcggtgaaaggggccgtgtggcaaggacaggagagccagcctcagcccagcaggggaaggcggcccctgagtctccacctggctgctggcagccccactcggagcatcggcgaaactgaggcttgccaaagaagcctttgtccagagtcacgcagctggcgcggtggagccagggccagaacccgtgcaggctgatcccagcctgccttctccactgtgccccg

如本文中所用，“治疗”(动词、动名词、名称)等指的是减轻或缓解与其相关的病变和/或症状。应知晓，尽管未排除，但治疗病症或症状并不需要完全消除与该病症或症状相关的病症、症候或症状。

“转基因”意为将外源核酸分子引入宿主细胞内，该外源核酸分子编码待在该宿主细胞内表达的多肽或多核苷酸。

“髓细胞上表达的触发受体2(Trem2)多肽”意为一种蛋白质，其与UniProt登录号Q9NZC2或其片段具有至少约85％的氨基酸序列一致性并且具有免疫调节活性。示例性Trem2多肽序列提供于下。

>sp|Q9NZC2|TREM2_HUMAN髓细胞上表达的触发受体2 OS＝智人OX＝9606 GN＝TREM2 PE＝1 SV＝1

MEPLRLLILLFVTELSGAHNTTVFQGVAGQSLQVSCPYDSMKHWGRRKAWCRQLGEKGPCQRVVSTHNLWLLSFLRRWNGSTAITDDTLGGTLTITLRNLQPHDAGLYQCQSLHGSEADTLRKVLVEVLADPLDHRDAGDLWFPGESESFEDAHVEHSISRSLLEGEIPFPPTSILLLLACIFLIKILAASALWAAAWHGQKPGTHPPSELDCGHDPGYQLQTLPGLRDT

“髓细胞上表达的触发受体2(TREM2)多核苷酸”意为编码Trem2多肽的核酸分子。TREM2基因编码膜蛋白，该膜蛋白与TYPO蛋白酪氨酸激酶结合蛋白形成受体信号传导复合物。示例性TREM2多核苷酸序列提供于下。

>AK312215.1智人cDNA,FLJ92504，智人髓细胞上表达的触发受体2(TREM2)，mRNA

TCTTTTCTGCAGTTCAAGGGAAAGACGAGATCTTGCACAAGGCACTCTGCTTCTGCCCTTGGCTGGGGAAGGGTGGCATGGAGCCTCTCCGGCTGCTCATCTTACTCTTTGTCACAGAGCTGTCCGGAGCCCACAACACCACAGTGTTCCAGGGCGTGGCGGGCCAGTCCCTGCAGGTGTCTTGCCCCTATGACTCCATGAAGCACTGGGGGAGGCGCAAGGCCTGGTGCCGCCAGCTGGGAGAGAAGGGCCCATGCCAGCGTGTGGTCAGCACGCACAACTTGTGGCTGCTGTCCTTCCTGAGGAGGTGGAATGGGAGCACAGCCATCACAGACGATACCCTGGGTGGCACTCTCACCATTACGCTGCGGAATCTACAACCCCATGATGCGGGTCTCTACCAGTGCCAGAGCCTCCATGGCAGTGAGGCTGACACCCTCAGGAAGGTCCTGGTGGAGGTGCTGGCAGACCCCCTGGATCACCGGGATGCTGGAGATCTCTGGTTCCCCGGGGAGTCTGAGAGCTTCGAGGATGCCCATGTGGAGCACAGCATCTCCAGGAGCCTCTTGGAAGGAGAAATCCCCTTCCCACCCACTTCCATCCTTCTCCTCCTGGCCTGCATCTTTCTCATCAAGATTCTAGCAGCCAGCGCCCTCTGGGCTGCAGCCTGGCATGGACAGAAGCCAGGGACACATCCACCCAGTGAACTGGACTGTGGCCATGACCCAGGGTATCAGCTCCAAACTCTGCCAGGGCTGAGAGACACGTGA

本文中提供的范围理解为该范围内所有值的略写。例如，1至50的范围理解为包括来自由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所组成的组的任意数字、数字组合或子范围。

如本文中所用，“治疗”(动词、动名词、名称)等指的是减轻或缓解与其相关的病变和/或症状。应知晓，尽管未排除，但治疗病症或症状并不需要完全消除与该病症或症状相关的病症、症候或症状。

除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“或”理解为包含的。除非明确指出或从语境中明显可见，否则如本文中所用，术语“一”和“该”理解为单数或复数。

除非明确指出或从语境中明显可见，否则本文中使用的术语“约”理解为处于该领域正常公差范围内，例如，处于均值的2标准偏差内。“约”可理解为处于所指出值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％、0.1％、0.05％或0.01％内。除非从语境中明确排除，否则本文中提供的所有数值均以术语“约”修饰。

本文中，对任何变量定义中一系列化学基团的描述包括该变量作为任何单一基团或作为所列基团的组合的定义。对本文中变量或方面的实施方案的描述包括该实施方案作为任何单一输送方案或作为与任何其他实施方案或其部分的组合。

本文中提供的任何组合物或方法可与本文中提供的一种或多种任何其他组合物和方法组合。

附图说明

图1示出了根据本公开方法的转基因的表达。图1是西方印迹图，其显示在先前用编码人ApoE2和Trem2的cDNA的慢病毒载体转导的293T细胞和BV-2小神经胶质细胞中的Trem2和ApoE2表达。

图2A至图2E是示意图、注释序列、肽结构域映射和关于慢病毒载体生成和测试的柱状图。图2A是细胞膜上的Trem2蛋白结构的示意图。ECS，细胞外空间；ICS，细胞内空间。图2B是Trem2的注释氨基酸序列。阴影部分指示Trem2上的功能性结构域，而加粗或加阴影的字母指示阿尔兹海默症(AD)相关的Trem2上的单氨基酸突变。图2C提供以下ApoE变体的肽结构域映射：ApoE2、ApoE3和poE4。ApoE3是大多数人中占主导地位的“中性”变体。ApoE4与阿尔兹海默症(AD)的发病率增加相关，而ApoE2携带者显示对阿尔兹海默症(AD)的某种程度的抗性。图2D是体外模型的示意图，用来使用荧光成像系统评估小神经胶质细胞系、BV2细胞细胞吞噬Aβ的能力。图2E是柱状图，其显示通过经转导的细胞和对照细胞对AB寡聚物摄取定量。均值+/-SD。星号指示Kruskall Wallis检验时的显著性，“*”指示p<0.05，且“****”指示p<0.0001。

图3A和图3B是柱状图和西方印迹图，其显示用治疗性载体进行的5xFAD造血干细胞(HSC)转导。从5xFAD供体分离Lin-造血干祖细胞(HSPC)，并且用治疗性ApoE2、Trem2和MT1G慢病毒载体(LV)转导。图3A是柱状图，其呈现用所指示的载体对5xFAD HSPC的转导效率，表达为均值载体拷贝数(VCN)+/-SD。在用所指示的用于体外移植的慢病毒载体转导的HSPC的液体培养后裔中测量平均载体拷贝数。图3B提供西方印迹图，表明经转导的HSC的液体培养后裔中的人ApoE2和人Trem2表达。用所指示的慢病毒载体转导HSC。阳性对照：表达hApoE2的HepG细胞。

图4A至图4F是柱状图和曲线图，其显示在行为测试时的5xFAD小鼠表型。从4月龄至12月龄，5xFAD小鼠(未经治疗的和经虚拟移植的)和年龄匹配的野生型对照(未经治疗的和经虚拟移植的)每个月经历通过新物体识别测试(图4A)、Y迷宫(图4B)和高架十字迷宫(图4C)进行的行为测试；后者表明从6月龄开始，5xFAD小鼠中出现统计学显著的行为缺陷。在12月龄时，小鼠经历Morris Mater迷宫测试，其显示由多个参数决定的明显表型差异，包括探针试验(图4D)、到达隐藏平台的延迟(图4E)和反向试验延迟(图4F)。均值+/-SEM(均值的标准误差)，星号指示重复测量的多重t检验的显著性。

图5A至图5D是柱状图和曲线图，其显示在行为测试时的经治疗的5xFAD小鼠表型。治疗的5xFAD小鼠和年龄匹配的对照(未经治疗的和经虚拟移植的)每个月经历高架十字迷宫(图5A)以及Morris水迷宫-探针试验(图5B)、到达隐藏平台的延迟(图5C)、反向试验延迟(图5D)。均值+/-SEM(均值的标准误差)，星号指示使用以下检验进行双因素方差分析时的显著性：Dunnet测试后检验与图5A中的5xFAD，Tukey测试后检验与图5C中的野生型以及与图5D中的5xFAD；以及使用Tukey测试后检验进行单因素方差分析时与图5B中的WT的显著性。

图6A至图6H是柱状图和曲线图，其显示在组织学评估时的经治疗的5xFAD小鼠表型。经治疗的5xFAD小鼠和年龄匹配的对照(未经治疗的和经虚拟移植的)在>12月龄时经历牺牲，并对它们的脑进行染色并且进行对Iba1(图6A，皮层；图6B，海马体)、GFAP(图6C，皮层；图6D，海马体)、Ab(图6E，皮层；图6F，海马体；图6G，脑内载体拷贝数(VCN)>0.5的小鼠的皮层；图6H，脑内载体拷贝数(VCN)>0.5的小鼠的海马体)的信号定量。均值+/-SEM(均值的标准误差)，星号指示使用Dunnet测试后检验进行单因素方差分析时与图6A中的WT和与图6H中的5xFAD的显著性。

具体实施方式

本发明的特征在于组合物和方法，该组合物和方法可用于在HSPC移植时重构小神经胶质细胞以及可用于治疗或预防阿尔兹海默症。

如下文更详细地描述，本发明至少部分地基于以下发现：阿尔兹海默症小鼠模型中存在的行为症状在移植表达ApoE2的HSPC后减轻。据此，本发明提供使用HSPC治疗阿尔兹海默症的组合物和方法，该HSPC过度表达ApoE2和/或其他治疗剂，诸如TREM2和金属硫蛋白。

除其他方面外，本发明提供用于有效地基因工程化改性中枢神经系统(CNS)小神经胶质细胞和髓细胞以将治疗剂递送至脑部，从而治疗神经退行性疾病的方法。在基因疗法临床试验中，在移植经基因修饰的造血干细胞(HSC)之后的神经小胶质细胞替换已经证明了制止单基因神经退行性疾病的神经恶化的可能性。不受缚于理论，在发育早期，一组髓系造血祖细胞整合到中枢神经系统(CNS)中以提供终生支持。事实上，造血细胞移植(HCT)的最新进展证明，在将HSC去髓并输注之后，新的小神经胶质细胞样细胞出现并驻留在中枢神经系统(CNS)中。这些细胞可以局部且功能性地整合，并且除了向周边细胞提供治疗性分子之外，还可以通过限定并重塑神经元网络、维持神经元稳态、修剪突触棘对神经环境带来潜在地积极贡献，并且当然是免疫系统的功能性部分，用于监视和吞噬两种作用。已经开发了基因疗法临床试验以靶向单基因神经退行性疾患，在该疾患中，关键溶酶体酶的旁分泌释放表明了治疗性益处。因此，经由基因修饰的造血干细胞(HSC)的CNS内移植来工程化改性小神经胶质细胞可提供对目前不可治愈的神经退行性疾患诸如肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)和阿尔兹海默症(AD)的医疗干预途径。

治疗剂：ApoE2、TREM2和金属硫蛋白

本发明的特征在于过度表达载脂蛋白E(ApoE)和髓细胞上表达的触发受体2(TREM2)的细胞。ApoE是中枢神经系统(CNS)中的一种主要的载脂蛋白，通常已知参与不同器官中的脂质代谢。但是，ApoE也由星形细胞、小神经胶质细胞合成并分泌，并且在较低程度上由中枢神经系统中的神经元合成并分泌。脑ApoE通过脂质的再分配以及神经突起生长和脑血管完整性的调节而参与损伤修复。ApoE密切参与迟发性阿尔兹海默症的发病机制，其中APOE4等位基因与显著增加的发展AD的风险相关联，而APOE2是神经保护性的(AD风险降低50％并且延迟疾病发作)(Serrano-Pozo et al.,Ann Neurol 2015；10:371)。与后一个观察结果一致，APOE2到AD小鼠模型中的CNS-基因直接递送是神经保护性的并且降低Aβ水平和淀粉样蛋白斑块(Zhao et al.,Neurobiol Aging 2016；44:159)。

TREM2(髓细胞上表达的触发受体2)是一种小神经胶质细胞表面受体，其缺陷或单倍体不足可能由于细胞的功能失调应答而增加Aβ蓄积，从而导致细胞凋亡(Wang et al.,Cell 2015；160(6):1061)(Guerreiro&Hardy,2014)。恢复或增加小神经胶质细胞中的TREM2功能似乎改善对AD中神经毒性Ab的拯救。在AD小鼠的脑内，病毒载体介导TREM2的上调，如果在疾病发展的早期应用，则减轻AD相关的神经病理学，包括Aβ沉积、神经炎症以及神经元和突触丢失，伴随着空间认知功能的改善(Jiang et al.,Neuropsycopharmacology2014；39(13):2949)。

有趣的是，用抗Aβ抗体染色已经显示，在检测到TSPO选择性放射受体结合升高的同一区域内，淀粉样蛋白沉积相对广泛。这与所提出的淀粉样病变和反应性小神经胶质细胞增生之间的关联一致。因此，除其他方面之外，本发明提供基于经慢病毒载体(LV)转导的造血干祖细胞(HSPC)的移植的基因疗法策略，目标为生成经基因工程化改造的小神经胶质细胞后裔，以在TSPO启动子的控制下以经调节的方式表达TREM2和/或APOE2。这允许在疾病部位(淀粉样蛋白斑块)附近招募的新生成的小神经胶质细胞特异性地释放治疗性因子，有可能在神经元死亡部位更有效地特异性地拯救错误折叠的蛋白质。在本发明的各种实施方案中，TREM2和/或APOE2在源自经移植的造血干祖细胞(HSPC)的脑髓细胞/小神经胶质细胞后裔中的过表达是已经测试的中枢神经系统(CNS)基因递送方法的一种有价值的替代物，因为本发明允许保护因子在整个脑实质中的更广泛递送。金属硫蛋白(MT)属于细胞内富含半胱氨酸的金属结合蛋白，并且参与必需金属诸如锌和铜的稳态、有毒金属诸如镉的解毒作用和抗氧化应激的保护作用。此外，MT已经参与了包括AD在内的多种情况下的神经保护和神经再生过程(Juarez-Rebollar,Rios,Nava-Ruiz,&Mendez-Armenta,2017；Ruttkay-Nedecky et al.,2013)。此外，金属硫蛋白(诸如MT1G)的过表达有助于婴儿型神经元蜡样质脂褐质沉积症和克拉伯病(Krabbe disease)的LSD小鼠模型中的神经保护。因此，金属硫蛋白也可能对阿尔兹海默症(AD)有益。

阿尔兹海默症中的HSC移植

神经退行性疾病诸如阿尔兹海默症，以功能性神经元的进行性损失为特征。在一些神经退行性疾病中，观察到了驻留在中枢神经系统中的小神经胶质细胞与神经退化之间的关系。例如，患者脑内神经胶质细胞的活化在疾病扩张至中枢神经系统的其他区域中发挥作用，并且阿尔兹海默症患者的小神经胶质细胞的异常活化可能促成神经毒性环境，这可能有助于运动神经元的识别标志丢失。

本公开的特征在于包含过度表达ApoE2和/或其他治疗剂诸如TREM2和金属硫蛋白的造血干祖细胞(HSPC)的组合物，其可用于移植到罹患阿尔兹海默症的受试者脑内，该受试者已接受消融预处理以摧毁内源性小神经胶质细胞。这一预处理改善了所移植的HSPC的植入。在一些实施方案中，通过脑室内注射(ICV)将HSPC直接递送至脑部。在其他实施方案中，通过静脉内(IV)注射提供HSPC。用来重构小神经胶质细胞群的HSPC经过修饰以表达ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白。

在消融预处理后进行ICV递送优于使用HSC移植治疗神经退行性疾病的常规方法，后者通常因为所移植细胞的后裔缓慢替换驻留小神经胶质细胞而无效。用于HSC移植的常规方法包括使用总骨髓或单采血液成分产品(aphaeretic product)或脐带血，或者在自体基因疗法的情况下，移植造血干祖细胞(HSPC)。相比之下，本发明提供富含具有小神经胶质细胞再植活性的细胞群。此外，已经发现，与单一静脉内(IV)移植相比，使用脑室内注射(ICV)直接递送至脑内的造血干祖细胞(HSPC)或HSPC池的级分改善了所移植的细胞重构小神经胶质细胞的速度和程度，并且增加了到脑的治疗性蛋白质递送。ICV方法在治疗上有益，且增强了所移植细胞对小神经胶质细胞的替换。此外，本公开涉及小神经角质系表的分子工程化改造以进行治疗性基因表达(例如，ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白的表达)。

再生中枢神经系统中的经工程化改造的小神经胶质细胞

小神经胶质细胞的发育起源不同于骨髓来源的髓单核细胞(Ginhoux etal.Science 330,841-845(2010)，其内容通过引用以其整体并入本文)。但是，具有小神经胶质细胞样表型的细胞可以源自所移植的供体HSPC。能够在移植到经去髓处理的接受者后生成小神经胶质细胞样细胞的HSPC保留在人和鼠的长期造血干细胞(HSC)内，从而提供能够分化为用于治疗阿尔兹海默症的治疗性小神经胶质细胞的多能细胞的储池。

表达ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白的HSPC经全身性给药至受试者，可以迁移到脑部并分化为小神经胶质细胞样细胞，从而替换死亡或受损的小神经胶质细胞。但是，如本文所述，作为另一种选择的过程，即HSPC的脑室内给药，导致了更快且更广泛的小神经胶质细胞重构。因此，在本公开的一些实施方案中，将HSPC经脑室内给药至受试者。在一些实施方案中，HSPC被递送至脑室的脑脊液中。这一给药路径避免了与经全身给药的组合物必须跨越血脑屏障有关的无效性。在本公开的一些实施方案中，脑室内给药导致了比全身性给药更快的后裔细胞在接受者脑室内的建立。在一些实施方案中，使用这一直接递送方法的小神经胶质细胞的替换更为广泛。

在包含内源性小神经胶质细胞的环境中，HSPC可能难以植入和分化。内源性小神经胶质细胞可能比所移植的HSPC更具竞争力，并且与濒死小神经胶质细胞相关的神经炎症可能产生对于HSPC植入不利的环境(例如，炎症增加)。为了克服HSPC植入的这些障碍，在一些实施方案中，通过暴露于能够去除内源性小神经胶质细胞的药剂将现有小神经胶质细胞清除。例如，在移植前给予采用烷基化剂的预处理方案对于清除内源性小神经胶质细胞前体而言是有效手段(Capotondo et al.(2012)；Wilkinson et al.Mol Ther 21,868-876(2013)，其内容通过引用以其整体并入本文)。在本公开的一些实施方案中，烷基化剂是白消安。除了烷基化剂诸如白消安之外，也可使用CSF-1R抑制剂(例如，PLX3397和PLX5622)和氯膦酸二钠脂质体(Han et al.Molecular Brain,10:25,2017)，任选地，它们可以与例如并入本文的WO2019191650中所述的纳米颗粒组合使用。

通常，术语“纳米颗粒”是指直径小于1000nm的颗粒。在某些优选实施方案中，本发明的纳米颗粒的最大维度(例如，直径)为500nm或更小。在其他优选实施方案中，本发明的纳米颗粒的最大维度在25nm至200nm范围内。在其他优选实施方案中，本发明的纳米颗粒的最大维度为100nm或更小。在其他优选实施方案中，本发明的纳米颗粒的最大维度在35nm至60nm范围内。本发明中涵盖的纳米颗粒可以不同形式提供，例如，作为固体纳米颗粒(例如，金属诸如银、金、铁、钛)、非金属、基于脂质的固体、聚合物)、纳米颗粒的悬浮液，或其组合。可以制备金属、介电和半导体纳米颗粒，以及混杂结构(例如，核壳纳米颗粒)。由半导体材料作成的纳米颗粒如果足够小(典型小于10nm)，以至于发生电子能级的量子化，则它们也可以用量子点标记。此类纳米级颗粒作为药物载体或成像剂用于生物医学应用中，并且可能适用于本发明的类似目的。已经制造了半固体和软纳米颗粒，它们也处于本发明范畴内。半固体属性的一种原型纳米颗粒是脂质体。各种类型的脂质体纳米颗粒目前在临床上用作抗癌药物和疫苗的递送系统。一半是亲水性且另一半是疏水性的纳米颗粒称为Janus颗粒，且在稳定化乳液中特别有效。它们可以在水/油界面处自组装并且充当固体表面活性剂。在一种实施方案中，设想基于自组装生物粘合聚合物的纳米颗粒，其可以用于药剂的口服递送、药剂的静脉内递送和药剂的鼻内递送，全部递送至脑。也设想其他实施方案诸如疏水药物的口服吸收和眼部递送。分子包膜技术包括经工程化改造的聚合物包膜，该包膜经保护并递送至疾病位点(Mazza et al.ACS Nano 7,1016-1026(2013)；Siew et al.Mol Pharm9,14-28(2012)；Lalatsa et al.J Control Release 161,523-536(2012)；Lalatsa etal.Mol Pharm 9,1665-1680(2012)；Garrett et al.J Biophotonics 5,458-468(2012)；Uchegbu,Expert Opin Drug Deliv3,629-640(2006)；Uchegbu et al.Int J Pharm 224,185-199(2001)；Qu et al.Biomacromolecules 7,3452-3459(2006))。

几种类型的颗粒递送系统和/或制剂已知可用于多种生物医学应用中。通常，颗粒定义为关于其运输和性质方面表现为一个整体的小物体。颗粒根据直径进一步分类。大颗粒覆盖2,500纳米至10,000纳米之间的范围。细颗粒的尺寸为100纳米至2,500纳米之间。超细颗粒或纳米颗粒的尺寸通常在1纳米至100纳米之间。100-nm限值的基础是以下事实：将颗粒与大块材料区分开来的新颖性质典型在小于100nm的临界长度规格下出现。

如本文所用，颗粒递送系统/制剂定义为任何生物递送系统/制剂，其包括根据本发明的颗粒。根据本发明的颗粒是任何具有小于100微米(μm)的最大维度(例如直径)的实体。在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度小于10p.m.在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度小于2000纳米(nm)。在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度小于1000纳米(nm)。在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度小于900nm、800nm、700nm、600nm、500nm、400nm、300nm、200nm或100nm。典型地，本发明颗粒的最大维度(例如，直径)为500nm或更小。在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度(例如，直径)为250nm或更小。在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度(例如，直径)为200nm或更小。在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度(例如，直径)为150nm或更小。在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度(例如，直径)为100nm或更小。在本发明的一些实施方案中，使用最大维度为50nm或更小的较小颗粒。在一些实施方案中，本发明颗粒的最大维度在25nm至200nm范围内。

使用多种不同技术进行颗粒表征(包括例如，表征形貌、维度等)。常用技术是电子显微镜(TEM、SEM)、原子力显微镜(AFM)、动态光散射(DLS)、X射线光电子显微镜(XPS)、粉末X射线衍射(XRD)、傅里叶变换红外光谱(FTIR)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)、紫外-可见光谱、双偏振光干涉测量和核磁共振(NMR)。可对天然颗粒(即，加载前)或在加载负荷(本文中，负荷是指例如CRISPR-Cas系统的一个或多个组分，例如，CRISPR酶或mRNA或向导RNA或其任意组合，并且可包括额外的载体和/或赋形剂)后进行表征(维度测量)，以提供最优尺寸的颗粒进行本发明的任何体外、间接体内和/或体内应用。在某些较佳实施方案中，颗粒维度(例如，直径)表征基于使用动态激光散射(DLS)的测量。

本发明范畴内的颗粒递送系统可以任意形式提供，包括但不限于固体、半固体、乳液或胶体颗粒。因此，本文所述的任何递送系统可提供为本发明范畴内的颗粒递送系统。

烷基化剂可通过任何本领域已知的方法递送至受试者。例如，烷基化剂可以口服、静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、皮下、鞘内、通过区域性导管输注或通过任何本领域已知的其他手段递送。

在一些实施方案中，在将内源性小神经胶质细胞或其前体清除之后，将表达ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白的HSPC给药至受试者。在一些实施方案中，在将内源性小神经胶质细胞或其前体清除之后，经脑室内递送HSPC。在一些实施方案中，在将内源性小神经胶质细胞或其前体清除之后，经静脉递送HSPC。

经修饰的细胞

本公开的一些方面提供经修饰以表达一种或多种外源性分子(例如，ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白)的细胞。在一些实施方案中，外源性核酸分子编码神经保护剂(例如，ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白)，该分子减轻患有或易患阿尔兹海默症的受试者的神经元损失或痴呆。在一些实施方案中，提供表达神经保护剂(例如，ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白)的细胞，该细胞抑制神经退化。

在一些实施方案中，本公开的经修饰的细胞是HSPC。在一些实施方案中，细胞是源自经修饰的HSPC的小神经胶质细胞。HSPC可以从患有、易患阿尔兹海默症或具有发展阿尔兹海默症倾向的患者分离。随后，该细胞经修饰以表达ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白，培养，并给药至受试者。这些自体细胞在被给药至受试者后起的免疫应答似乎比同种异体细胞少。然而，在一些实施方案中，HSPC是从健康供体分离的。从供体分离HSPC的方法是本领域中已知的。

ApoE2

在本公开的一些实施方案中，本公开的细胞经修饰以表达载脂蛋白E(ApoE)。在本公开的一些实施方案中，经修饰的细胞表达来自外源性核酸分子的ApoE2。例如，HSPC可以经修饰以表达来自外源性核酸分子的ApoE2并随后被给药至受试者，从而将神经保护剂引入患有或易患阿尔兹海默症或具有发展阿尔兹海默症体质的受试者的脑内。在一些实施方案中，源自经修饰的HSPC的细胞表达ApoE2。例如，在一些实施方案中，小神经胶质细胞或小神经胶质细胞样细胞表达来自外源性核酸分子的ApoE2。

Trem2

本公开的一些实施方案提供表达Trem2的经修饰的细胞。经修饰的细胞可以是被给药至受试者的HSPC，该受试者患有或易患阿尔兹海默症或具有发展该疾病的倾向。在一些实施方案中，表达Trem2的细胞是源自HSPC的细胞。例如，在一些实施方案中，经修饰的源自HSPC的细胞是小神经胶质细胞或小神经胶质细胞样细胞。

金属硫蛋白

本公开的一些实施方案提供经修饰的细胞，该细胞表达由外源性核酸分子编码的金属硫蛋白。在一些实施方案中，金属硫蛋白是MT1、MT2、MT3或MT4金属硫蛋白。在一些实施方案中，金属硫蛋白是MT1。在一些实施方案中，MT1金属硫蛋白是MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1L、MT1M或MT1X金属硫蛋白。在一些实施方案中，细胞表达来自外源性核酸分子的超过一种金属硫蛋白。在一些实施方案中，细胞表达来自外源性核酸分子的MT1G。在一些实施方案中，细胞是HSPC或其后裔。在一些实施方案中，细胞是小神经胶质细胞或小神经胶质细胞样细胞。金属硫蛋白在国际申请号PCT/US2018/013908和PCT/US2018/013909中有所描述，其内容通过引用以其整体并入本文。

本公开的一些实施方案提供经修饰的细胞，该细胞表达ApoE2或其片段，以及由外源性核酸分子编码的金属硫蛋白。在一些实施方案中，金属硫蛋白是MT1、MT2、MT3或MT4金属硫蛋白。在一些实施方案中，经修饰的细胞表达MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1L、MT1M或MT1X金属硫蛋白和ApoE2或其片段。在一些实施方案中，经修饰的细胞表达来自外源性核酸分子的MT1G和ApoE2或其片段。在一些实施方案中，细胞是HSPC或其后裔。在一些实施方案中，细胞是小神经胶质细胞或小神经胶质细胞样细胞。

本公开的一些实施方案提供经修饰的细胞，该细胞表达Trem2或其片段，以及由外源性核酸分子编码的金属硫蛋白。在一些实施方案中，金属硫蛋白是MT1、MT2、MT3或MT4金属硫蛋白。在一些实施方案中，经修饰的细胞表达MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1L、MT1M或MT1X金属硫蛋白和Trem2或其片段。在一些实施方案中，经修饰的细胞表达来自外源性核酸分子的MT1G和Trem2或其片段。在一些实施方案中，细胞是HSPC或其后裔。在一些实施方案中，细胞是小神经胶质细胞或小神经胶质细胞样细胞。

本公开的一些实施方案提供经修饰的细胞，该细胞表达ApoE2、Trem2、或其片段，以及由外源性核酸分子编码的金属硫蛋白。在一些实施方案中，金属硫蛋白是MT1、MT2、MT3或MT4金属硫蛋白。在一些实施方案中，经修饰的细胞表达MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1L、MT1M或MT1X金属硫蛋白、ApoE2和Trem2或其片段。在一些实施方案中，经修饰的细胞表达来自外源性核酸分子的MT1G、ApoE2和Trem2或其片段。在一些实施方案中，细胞是HSPC或其后裔。在一些实施方案中，细胞是小神经胶质细胞或小神经胶质细胞样细胞。

半合子CX3CR1细胞

CX3CR1也称为fractalkine受体，是一种七跨膜结构域受体，属于G蛋白偶联受体家族。作为G蛋白偶联受体，CX3CR1的作用主要是抑制性的，因为它发挥作用以减少cAMP的产生并且阻止由第二信使介导的信号传导级联的触发。由CX3CR1信号传导控制的细胞内途径主要包括PLC、PI3K和ERK调节，它们调控细胞迁移、粘附、增殖和存活。它在几种细胞类型(例如，单核细胞、天然杀手细胞、T细胞和平滑肌细胞)内表达。小神经胶质细胞是中枢神经系统中表达CX3CR1的唯一细胞，它们以高水平表达，特别是在发育期间和应答脑损伤/病理。

Fractalkine(CX3CL1)是趋化因子受体CX3CR1的唯一配体并且被表达为膜结合分子或可溶形式。Fractalkine裂解由至少两种酶ADAM10和ADAM17介导，这两种酶分别在内稳条件下和炎性条件下具有活性。Fractalkine主要以其膜结合形式充当粘附分子，而其可溶形式对CX3CR1具有驱化性质。CX3CL1以及CX3CR1的局部产生和膜表达受控于其他细胞因子如TNFα、IL-1、IFNγ、NO及缺氧。

CX3CR1–CX3CL1轴的活化导致小神经胶质细胞维持在静止状态并且神经网络维持在稳态。在生理条件下，CX3CR1似乎抑制小神经胶质细胞活化，而在特定条件下，可能发生自相矛盾的对炎性应答的促进。神经元是脑中CX3CL1的主要生产者，并且该轴对于与小神经胶质细胞的通讯非常重要。星形细胞(GFAP⁺)也展示CX3CL1的组成型mRNA表达。与其他位置的内皮细胞相反，脑和脊髓中的内皮细胞不在表面上呈递组成型CX3CL1表达，这暗示组成型CX3CL1表达相当依赖于内皮细胞的活化。CX3CL1和CX3CR1也在脉络丛中表达。

为了提高HSPC在移植时生成小神经胶质细胞样后裔的能力，使用对于CX3CR1为半合子的小鼠模型(且在该模型中，GFP受体基因已经替换一种CX3CR1等位基因(B6.129P-CX3CR1tm1Litt/J))来证明：i)与标准野生型供体相比，移植来自对于CX3CR1基因为单倍体不足的供体小鼠的全骨髓或HSPC导致小神经胶质细胞样供体系统在接受者脑内更多且更快地出现，和ii)在竞争性移植的情况下，与野生型供体细胞相比，源自单倍体不足的供体的细胞在更大程度上有助于接受者的造血器官和脑髓隔室的细胞群恢复。对所植入细胞进行的分支研究表明，CX3CR1^+/GFP细胞也获得了更成熟的小神经胶质细胞样形貌。CX3CR1半合子小鼠有不明显表型。

因此，本公开设想分离HSPC并敲除CX3CR1的一个等位基因，以创建半合子细胞，可培养该半合子细胞以生成对于CX3CR1为半合子的细胞群。可将此类细胞给药至有此需要的受试者。本公开还设想修饰CX3CR1半合子HSPC以将编码ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白的核酸序列并入缺失的CX3CR1等位基因基因座中。以这种方式，操纵半合子HSPC以表达治疗剂。作为另一种选择，可编辑经分离的HSPC以去除CX3CR1的一个拷贝，以生成半合子HSPC。编辑CX3CR1的单一拷贝包括，在一些实施方案中，将CX3CR1等位基因替换为编码治疗剂的外源性核酸分子。使用本领域中已知的任何方法进行该编辑。

修饰细胞

可以使用本领域中已知的任何方法来产生本文所述的任何CX3CR1半合子细胞。例如，可以通过编辑内源性基因诸如CX3CR1来修饰细胞。基因编辑是生物医学研究的一个主要焦点，其属于基础科学和临床科学的交叉学科。“基因编辑”工具可以操纵位于特定染色体基因座处的细胞DNA序列而不在该基因组其他位点引入突变。这一技术有效地令研究者能够在体外或体内操纵细胞的基因组。

在一种实施方案中，基因编辑涉及将核酸内切酶靶向至基因组中的具体位点以在该具体位置生成双链断裂。如果引入了供体DNA分子(例如，质粒或寡核苷酸)，则包含双链断裂的核酸与所引入的DNA之间可能发生相互作用，尤其是如果两个核酸共享同源序列。在这一实例中，可发生被称为“基因靶向”的过程，在该过程中，染色体的DNA末端通过同源性重组侵入供体DNA的同源序列中。使用供体质粒序列作为同源重组的模板，可实施所关注基因的无缝敲除。重要的是，如果供体DNA分子包括位于靶标基因(例如，CX3CR1)内的缺失，则同源重组介导的双链断裂修复将会把供体序列引入染色体中，导致该缺失被引入染色体基因座内。通过将核酸酶靶向至含有靶标基因的基因组位点，该概念为使用双链断裂形成来刺激同源重组并因而将功能性靶标基因替换为该基因的缺失形式。同源重组路径的优点是，它具有在原先的野生型等位基因位置处无缝生成基因敲除的潜力。

基因组编辑工具可使用双链断裂来增强细胞基因操纵。此类方法可采用锌指核酸酶(例如在美国专利6,534,261、6,607,882、6,746,838、6,794,136、6,824,978、6,866,997、6,933,113、6,979,539、7,013,219、7,030,215、7,220,719、7,241,573、7,241,574、7,585,849、7,595,376、6,903,185和6,479,626中以及美国专利公布20030232410和US2009020314中有所描述，其通过引用并入本文)；转录激活子样效应子核酸酶(TALEN；例如在美国专利8,440,431、8,440,432、8,450,471、8,586,363和8,697,853中以及美国专利公布20110145940、20120178131、20120178169、20120214228、20130122581、20140335592和20140335618中有所描述，其通过引用并入本文)；和CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)/Cas9系统(例如在美国专利8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,871,445、8,889,356、8,906,616、8,932,814、8,945,839、8,993,233和8,999,641中以及美国专利公布20140170753、20140227787、20140179006、20140189896、20140273231、20140242664、20140273232、20150184139、20150203872、20150031134、20150079681、20150232882和20150247150中有所描述，其通过引用并入本文)。例如，锌指核酸酶DNA序列识别能力和特异性可能是不可预测的。类似地，TALEN和CRISPR/Cas9不仅在所希望的位点处裂解，而且经常也在其他“脱靶”位点处裂解。这些方法具有与脱靶双链断裂诱导和潜在的有害突变(包括与这些脱靶效应有关的indel、基因组重排和染色体重排)相关的显著问题。锌指核酸酶和TALEN一定要使用模块化序列特异性DNA结合蛋白来生成对于基因组中的约18个碱基的序列的特异性。

RNA引导的核酸酶介导的基因组编辑，基于2型CRISPR(成簇规则间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR缔合的)系统，为改变基因组提供了一个有价值的途径。简而言之，Cas9(由单向导RNA(sgRNA)引导的核酸酶)结合至紧随前间区序列邻近基序(PAM)之后的靶向基因组基因座并生成双链断裂。然后，通过导致插入/缺失(indel)突变的非同源性末端接合，或通过需要外源性模板并且可在靶标基因座生成精确修饰的同源导向修复来修复锌指核酸酶(Mali et al.,Science,Feb 15,2013；339(6121):823-6，其内容通过引用以其整体并入本文)。不同于将功能性或部分功能性的基因拷贝添加到受试细胞但保留该基因的最初功能失调拷贝的基因疗法，这一系统可去除失能拷贝中的缺陷。使用修饰的核酸酶进行的基因矫正已经在组织培养细胞和罕见病啮齿动物模型中得以证明。

CRISPR已经被广泛用于有机体中，包括面包酵母(S.cerevisiae)、斑马鱼、线虫(例如，C.elegans)、植物、小鼠和数种其他有机体。此外，已经对CRISPR做出修饰以制备可编程的转录因子，该转录因子允许科学家靶向并激活或沉默特定基因。现在可获得数万种向导RNA的文库。通过插入包含cas基因和特异性设计的CRISPR的质粒，可在任何所希望的位置切割有机体的基因组。

CRISPR重复序列的尺寸在24至48个碱基对范围内。它们往往显示某种二元对称性，暗指二级结构诸如发夹的形成，但不是真正的回文。重复序列通过类似长度的间隔序列分隔开来，其中一些CRISPR间隔序列准确地匹配来自质粒和噬菌体的序列，但一些间隔序列匹配原核生物基因组(自我靶向间隔序列)。可快速地添加新间隔序列以应对噬菌体感染。

CRISPR相关(cas)基因往往与CRISPR重复序列-间隔序列阵列相关。截至2013年，已有超过四十个不同的Cas蛋白质家族被描述。这些蛋白质家族中，Cas1在不同的CRISPR/Cas系统中似乎无处不在。已经使用cas基因与重复序列结果的具体组合来定义八个CRISPR亚型(Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern和Mtube)，其中的一些与编码重复序列相关神秘蛋白(RAMP)的额外基因模块有关。单个基因组中可能出现超过一种CRISPR亚型。CRISPR/Cas亚型的零星分布暗示，该系统在微生物进化期间受到水平基因转移的影响。

外源性DNA显然被由Cas基因编码的蛋白质加工为小元件(长度为约三十个碱基对)，然后，这些小元件被插入到邻近前导序列的CRISPR基因座中。来自CRISPR基因座的RNA被构成性的表达并且被Cas蛋白加工为小RNA，这些小RNA包含单个的具有侧翼重复序列的外源性衍生序列元件。这些RNA引导其他Cas蛋白以RNA或DNA水平沉默外源性基因元件。证据表明了CRISPR亚型间的功能多样性。Cse(Cas亚型Ecoli)蛋白(称为大肠杆菌(E.coli)中的CasA-E)形成功能性复合物Cascade，其将CRISPR RNA转录物加工成Cascade保留的间隔序列-重复序列单元。在其他原核生物中，Cas6加工CRISPR转录物。有趣的是，在大肠杆菌中进行基于CRISPR的噬菌体失活需要Cascade和Cas3，但既不需要Cas1也不需要Cas2。在强烈火球菌(Pyrococcus furiosus)和其他原核生物中发现的Cmr(Cas RAMP模块)与小CRISPRRNA形成功能性复合物，该复合物识别并裂解互补性靶标RNA。RNA引导的CRISPR酶被分类为V型限制性内切酶。也见美国专利公布2014/0068797，其通过引用而以其整体并入本文。

作为RNA引导的蛋白质，Cas9需要RNA分子来引导对DNA靶标的识别。尽管Cas9优先询问含有前间隔邻近基序(PAM)序列(即，NGG)的DNA序列。但是，Cas9-gRNA复合体需要在向导RNA(gRNA)与靶标核酸序列之间实质性互补以创建双链断裂。合成gRNA可以被设计为将用于Cas9靶向的必需RNA序列组合成单一RNA，该单一RNA由RNA聚合酶2I型启动子U6驱动表达。合成gRNA的最小长度略微超过100个碱基，并且含有一个以在PAM序列NGG前与之紧邻的20个原间隔序列核苷酸为靶标的部分。

在一种方法中，使用CRISPR-Cas系统改变HSPC细胞以使CX3CR1等位基因缺失或失活。Cas9可用来靶向CX3CR1基因。一旦识别靶标，Cas9就将双链断裂引入CX3CR1靶标基因中。在双链断裂位点处的同源导向修复(HDR)可允许插入灭活或删除形式的CX3CR1序列。在一些实施方案中，在双链断裂位点处的同源导向修复(HDR)可允许插入本发明的表达盒。

在一种方法中，使用CRISPR-Cas系统改变HSPC细胞以使TSPO等位基因缺失或失活。Cas9可用来靶向TSPO基因。一旦识别靶标，Cas9就将双链断裂引入TSPO靶标基因中。在双链断裂位点处的同源导向修复(HDR)可允许插入灭活或删除形式的TSPO序列。在一些实施方案中，在双链断裂位点处的同源导向修复(HDR)可允许插入本发明的表达盒。

以下美国专利和专利公布通过引用并入本文：8,697,35、20140170753、20140179006、20140179770、20140186843、20140186958、20140189896、20140227787、20140242664、20140248702、20140256046、20140273230、20140273233、20140273234、20140295556、20140295557、20140310830、20140356956、20140356959、20140357530、20150020223、20150031132、20150031133、20150031134、20150044191、20150044192、20150045546、20150050699、20150056705、20150071898、20150071899、20150071903、20150079681、20150159172、20150165054、20150166980、和20150184139。

外源性治疗剂的表达

ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白是可用于治疗阿尔兹海默症的治疗性多肽。通过本领域中已知的技术将编码此类蛋白质的多核苷酸插入表达载体中。例如，可通过涉及使用合成DNA链接基的限制酶链接或通过钝端连接将双链DNA克隆到适当的载体中。一般使用DNA连接酶来连接该DNA分子，且可通过使用碱性磷酸酯酶处理而避免不希望的接合。

本公开还包括载体(例如，重组质粒)，该载体包括编码如本文所述的ApoE2、TREM2和/或金属硫蛋白的核酸分子。术语“重组载体”包括已经被变更、修饰或工程化的载体(如，质粒、噬菌体、噬菌粒、病毒、粘粒、福斯质粒(fosmid)、或其它纯化的核酸载体)，从而使得该重组载体含有比该重组载体所来自的原生或天然核酸分子中所包括的核酸序列更大、更小或不同的核酸序列。例如，重组载体可包括编码多肽或其片段的核苷酸序列，其可操作地连接至调控序列，诸如启动子序列、终止子序列、长末端重复序列、未转译区、增强子等，如本文所定义。重组表达载体允许表达其内部包括的基因或核酸。在特定实施方案中，启动子在美国临时申请号62/908,966中有所描述，该临时申请通过引用以其整体并入。在一些实施方案中，启动子包含转位子蛋白(TPSO)启动子。在一些实施方案中，调节序列包含与一种或多种增强子组合的转位子蛋白(TPSO)启动子。在一些实施方案中，调节序列包含单独的或与E1、E2、E1.1和E1.2中的一者或多者组合的P1、P2、P1+P2、或P2+P1。在一些实施方案中，调节序列包含P1+P2、P1、或E1+P1，其中在“+”左侧的序列为“+”右侧序列的5'方向。

在本公开的一些实施方案中，一个或多个具有编码本文所述的一种或多种多肽或多核苷酸的核苷酸序列的DNA分子被可操作地连接至一个或多个调控序列，其可将所希望的DNA分子整合到真核细胞内。例如，可通过引入一种或多种允许选择含有该表达载体的宿主细胞的标记物，选择已经被所引入的DNA稳定转染或转导的细胞(例如，HSPC、小神经胶质细胞)。可选择的标记物基因可直接连接至待表达的核酸序列，或可通过共转染或共转导被引入相同的细胞内。本文所述多核苷酸或多肽的最有合成所需的任何额外元件对于本领域普通技术人员而言是显而易见的。

在一些实施方案中，可通过将外源性核酸分子引入细胞中来修饰HSPC。外源性核酸可以包含编码用于治疗阿尔兹海默症的治疗剂的转基因。在一些实施方案中，外源核酸包含调节元件以用于表达转基因。例如，外源核酸分子可以包含编码用于治疗阿尔兹海默症的治疗剂的转基因和，在一些情况下，用于表达该转基因的启动子。在一些实施方案中，启动子是组成性活性启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)启动子。在一些实施方案中，启动子可以是组织特异性启动子，其中该转基因在HSPC植入和分化后被表达。例如，四环素是可用来活化四环素敏感性启动子的药物。在一些实施方案中，神经元特异性启动子是突触蛋白(Syn)启动子。在一些实施方案中，启动子可以是诱导型启动子，其中该转基因仅在特定化合物存在或不存在下被表达。在一些实施方案中，源自被移植到受试者脑内的包含由脑特异性启动子驱动的转基因的HSPC的小神经胶质细胞或小神经胶质细胞样细胞将表达该转基因。在一些实施方案中，外源核酸分子除了包含转基因外，还可以包含允许鉴定细胞的可检测标记或其他标记物，这些细胞已经被成功修饰或源自已经被成功修饰以表达该转基因的细胞。

将外源核酸分子引入细胞内的方法是本领域中已知的。例如，真核细胞可以通过转染(例如，磷酸钙介导的转染)从环境中摄取核酸分子。转染不采用病毒或病毒载体来将外源核酸引入接受体细胞内。真核细胞的稳定转染包括将所转染的核酸整合到接受体细胞基因组内，所转染的核酸随后可以被接受体细胞的后裔遗传。

真核细胞(即，HSPC)可以通过转导进行修饰，在转导中，病毒或病毒载体将外源核酸分子稳定地引入接受体细胞内。真核转导递送系统是本领域中已知的。大多数细胞类型的转导可以使用逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒和禽病毒系统实施，并且此类系统是本领域中众所周知的。尽管逆转录病毒系统通常与神经元细胞转导不相容，但慢病毒是非常适合转导干细胞以及神经元细胞的逆转录病毒的一个属。因此，在本公开的一些实施方案中，病毒载体系统是慢病毒系统。在一些实施方案中，病毒载体系统是禽病毒系统，例如，US8642570、DE102009021592、PCT/EP2010/056757和EP2430167中所述的禽病毒载体系统，其内容通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，在与预期的接受体细胞接触之前，病毒载体被组装或封装在封装细胞内。在一些实施方案中，载体系统是自灭活系统，其中病毒载体被组装在封装细胞内，但在与接受体细胞接触之后，病毒载体不能在接受体细胞内产生。

病毒载体的组分被编码在质粒上，并且因为使用大质粒尺寸有效地降低了转导，多种具有封装所必需的不同病毒序列的质粒可能是必要的。例如，在慢病毒载体系统中，第一质粒可以包含编码一组抗原(例如，gag)和/或逆转录酶(pol)基因的核苷酸序列，而第二质粒编码病毒粒子蛋白(rev)和/或包膜(env)基因的表达的调节子。包含转基因的外源核酸分子可以被封装到载体内并且递送之接受体细胞内，在该处，该转基因被整合到接受体细胞的基因组内。此外，转基因可以使用分立封装系统封装，如US8642570、DE102009021592、PCT/EP2010/056757和EP2430167中所述。

引入一个或多个载体之后，培养宿主细胞，然后给药至受试者。在一些实施方案中，可通过包括西方印迹法分析、免疫印迹、和免疫荧光在内的免疫分析来检测重组蛋白的表达。可通过该领域中已知的或本文所述的任意方法完成重组蛋白的纯化，例如，涉及提取、沉淀、色谱和电泳的任何传统过程。可用于纯化蛋白的其它纯化过程包括使用结合靶点蛋白的单克隆抗体进行的亲和色谱。通常，令含有重组蛋白的粗制剂穿行通过其上固定有适合的单克隆抗体的柱。蛋白一般经由特异性抗体结合至该柱，而杂质则穿行通过。洗涤该柱后，例如通过改变pH或离子强度将蛋白质从凝胶中洗脱。

药物组合物

本公开设想的组合物包括包含表达神经保护剂的细胞的药物组合物。在一些实施方案中，神经保护剂是ApoE2、Trem2和/或金属硫蛋白。药物组合物可包含自体细胞或同种异体细胞，该细胞经修饰以表达治疗剂。

如本文所述的造血干祖细胞(HSPC)可以作为治疗组合物(例如，作为药物组合物)给药。如本文所述的细胞组合物可以提供为无菌液体制剂，例如，等渗水溶液、悬浮液、乳液、分散液或粘稠组合物，其可以缓冲至选定的pH。液体制剂可能比凝胶(另一种粘稠组合物)和固体组合物更容易制备。此外，液体组合物可能更便于给药(即，通过注射)。另一方面，粘稠组合物可以配制在适当的粘度范围内以提供与具体组织的更长接触时间。液体或粘稠组合物可以包含载体，该载体可以是溶剂或分散介质，包括例如水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、多元醇(例如，甘油、丙二醇、液体聚乙二醇等)、以及其合适的混合物。

无菌可注射溶液可以通过将本文所述的细胞并入足量的适当稀释剂中来制备。此类组合物可以是与合适的载体或赋形剂诸如无菌水、生理盐水、葡萄糖、右旋葡萄糖或其他适用于将活细胞递送至受试者的载体或赋形剂的掺和物。组合物也可以冻干。组合物可以含有佐剂物质诸如润湿剂、分散剂或乳化剂(例如，甲基纤维素)、pH缓冲剂、胶凝或增粘添加剂、防腐剂、芳香剂、着色剂等，取决于所希望的给药途径和制剂。可查询标准教材诸如《雷明顿药物科学(第十七版)》(“Remington's Pharmaceutical Science,”17th edition,1985，通过引用并入本文)来制备合适的制剂而无需过度实验。

可以添加增强细胞组合物的稳定性和无菌性的添加剂，包括抗微生物防腐剂、抗氧化剂、螯合剂和缓冲剂。通过抗细菌剂或抗真菌剂，包括但不限于，对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚和山梨酸，可以确保对于微生物作用的预防。但是，根据本公开，所使用的任何媒介物、稀释剂或添加剂必需与细胞相容。

组合物可以是等渗的，即，它们具有与血液和脑脊液相同的渗透压。本发明组合物的所希望的等渗性可以使用氯化钠或其他药学可接受的剂诸如右旋葡萄糖、硼酸、酒石酸钠、丙二醇或其他无机或有机溶质实施。氯化钠可能适用于含有钠离子的缓冲液。

若必要，可以使用药学可接受的增稠剂将组合物的粘度维持在选定水平。在一些实施方案中，增稠剂是甲基纤维素，其容易获得且便宜并且易于操作。其他合适的增稠剂包括但不限于，黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素和卡波姆。增稠剂的浓度将取决于所选择的剂和所使用的剂的量。合适的载体和其他添加剂可根据给药途径和剂型属性(例如，液体剂型可以配制为溶液、悬浮液、凝胶或另一液体形式，诸如时间释放调配物或液体填充形式)来选择。

待给药的细胞的有效量可根据被治疗的受试者而变。在一种实施方案中，将约10⁴至约10⁸之间的细胞给药至受试者，在另一种实施方案中，将约10⁵至约10⁷之间的细胞给药至受试者。

技术人员可以容易地确定待给药的组合物中细胞和任选的添加剂、媒介物和/或载体的量。在一种实施方案中，任何添加剂(除了细胞之外)以约0.001％至约50％(重量)溶液的量存在于磷酸盐缓冲盐水中，并且活性成分以微克至毫克的数量级存在，诸如约0.0001％至约5wt％。在另一种实施方案中，活性成分以约0.0001％至约1wt％存在。在又一种实施方案中，活性成分以约0.0001％至约0.05wt％存在。在再一种实施方案中，活性成分以约0.001％至约20wt％存在。在一些实施方案中，活性成分以约0.01％至约10wt％存在。在另一种实施方案中，活性成分以约0.05％至约5wt％存在。对于待给药至动物或人的任何组合物，并且对于任何特定给药方法，可以通过在合适的动物模型例如啮齿动物诸如小鼠中测量致死剂量(LD)和LD₅₀来确定毒性。也可以确定组合物的剂量、组合物中组分的浓度和引起合适应答的给药组合物的时机。鉴于本领域技术人员的知识、本公开和本文所引的文献，此类确定不需要过度实验。依次给药的时间也可以无需过度实验而确定。

治疗方法

通过评估受试者体内的神经退行性疾病的一种或多种症状，专业医护人员可将受试者专断为患有神经退行性疾病。受试者的神经退行性疾病的非限制性症状包括，难以抬起脚和脚趾的前部；臂、腿、足或踝的虚弱；手的虚弱或动作笨拙；言语不清；吞咽困难；肌肉痉挛；臂、肩和舌的颤搐；咀嚼困难；呼吸困难；肌肉麻痹；视力的部分或完全丧失；重影；身体部分的刺痛或疼痛；随着头部移动而出现的触电感；震颤；步态不稳；疲劳；头晕；记忆力丧失；迷失方向；曲解空间关系；读写困难；难以集中注意力和思考；难以做出判断和决定；难以计划和执行熟悉的任务；抑郁；焦虑；社交退缩；情绪波动；易怒；攻击性；睡眠习惯改变；神志恍惚；痴呆；自主行动能力丧失；姿态和平衡力受损；肌肉僵硬；运动迟缓；眼部移动缓慢或不正常；不由自主地抽搐或扭动(舞蹈病)；不由自主地持续的肌肉收缩(肌张力障碍)；缺乏柔韧性；缺乏冲动控制；和食欲的改变。专业医护人员也可部分地基于受试者的神经退行性疾病家族病史而作出诊断。当受试者情况呈现给卫生保健设施(如，诊所或医院)时，专业医护人员可将患者诊断为患有神经退行性疾病。在一些情况下，当受试者被辅助保健设施接纳时，专业医护人员可将该受试者诊断为患有神经退行性疾病。典型地，医师在一种或多种症状呈现之后诊断受试者的神经退行性疾病。

本公开提供治疗阿尔兹海默症或其症状的方法，该方法包括向受试者(例如，哺乳动物诸如人)给药治疗有效量的包含细胞的药物组合物，该细胞表达神经保护剂，诸如ApoE2、Trem2、MT1G、或其组合。在一些实施方案中，细胞是造血干祖细胞。在一些实施方案中，细胞是小神经胶质祖细胞。因此，在一些实施方案中，该方法包括向受试者给药治疗有效量的本文所述细胞，该量在阿尔兹海默症被治疗的条件下足以治疗阿尔兹海默症。

本文的方法包括对该受试者(包括被证实需要此治疗的受试者)给药有效量的本文所述的细胞或本文所述的包含此类细胞的组合物以产生此效果。此治疗将被适当地给予苦于、患有、易患阿尔兹海默症或其症状或处于该疾病或其症状风险下的受试者，尤其是人。在一些实施方案中，本文的方法包括对受试者(包括被证实需要此治疗的受试者)给药有效量的本文所述的化合物或本文所述的组合物以产生此效果。

在一些实施方案中，以靶向方式将该细胞或包含该细胞的组合物给药至受试者。例如，在一些实施方案中，直接将包含表达ApoE2、Tream2或金属硫蛋白或其组合的细胞的组合物给药至受试者脑部。在一些实施方案中，通过脑室内给药将该组合物直接递送至脑部。在一些实施方案中，以这一方式将该组合物递送至受试者脑部的侧脑室。可用于本公开中的给药方法例如在国际申请号PCT/US2020/045106中有所描述，该国际申请通过引用以其整体并入。

作为另一种选择，诸如通过静脉内给药将该组合物进行全身递送。以该方式给药的细胞在植入受试者脑内之前必须跨越血脑屏障。其他给药模式(肠胃外、黏膜、植入、腹膜内、皮内、透皮、肌肉内、脑室内注射，静脉内给药包括输液和/或快速推注，以及皮下给药)是本领域中通常所知的。在一些实施方案中，细胞在适用于注射的介质诸如磷酸盐缓冲盐水中给药至受试者。因为被正在给药至受试者的细胞旨在再群体化小神经胶质细胞，脑室内给药可能优于其他需要跨越血脑屏障的给药途径。

将所移植的细胞植入到受试者脑内提供了表达治疗剂的细胞群。但因为移植的细胞意在替换内源细胞(即，小神经胶质细胞)，在某些实施方案中，治疗患有、易患阿尔兹海默症或处于发展出该疾病风险下单受试者进一步包括在给药表达治疗剂的HSPC之前，给药用于将内源小神经胶质细胞消融的剂。在一些实施方案中，该剂是烷基化剂。特别是，烷基化剂的纳米颗粒递送可能在创建对于移植的HSPC的植入有效的合适环境，如国际申请号PCT/US2017/056774中所述，其内容通过引用以其整体并入本文。

试剂盒

本公开设想了用于治疗或预防阿尔兹海默症的试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包含一种组合物，该组合物包含表达神经保护剂的经修饰的HSPC。在一些实施方案中，神经保护蛋白是ApoE2、Trem2和金属硫蛋白或其组合。试剂盒可以包含关于治疗方案、试剂、设备(试管、反应容器、针头、注射器等)的使用说明，以及用于校准或实施治疗方案的标准。根据本公开的试剂盒中提供的使用说明可以涉及合适的操作参数，其形式为可检测的标签或独立的插页。任选地，试剂盒可以进一步包含标准或对照信息，因此可将测试样品与对照信息标准进行比较以确定是否实现了一致的结果。在一些实施方案中，该试剂盒包括用于内源小神经胶质细胞的消融预处理的纳米颗粒。

在一些实施方案中，该试剂盒包含含有治疗性或预防性细胞组合物的无菌容器；此类容器可为盒、安瓿、瓶、小瓶、管、袋、包、或其他该领域中已知的适合的容器形式。此类容器可由塑料、玻璃、层压纸、金属箔或其他适用于容纳药物的材料制作。

若需要，本发明的剂可与将该剂给药至患有神经疾病或中枢神经系统病变或处于发展出该疾病或病变风险下的受试者的使用说明书一起提供。使用说明书通常将包括关于使用该组合物治疗或预防疾病或病变的信息。在其他实施方案中，使用说明书包括下列的至少一种：对治疗剂的说明；治疗或预防神经疾病或其症状的给药方案和方式；预防措施；警告信息；适应症；禁忌说明；过量信息；副作用；动物药理；临床研究；和/或参考文献。使用说明书可直接印在容器(当存在时)上，或作为用于该容器的标签，或作为独立的页、册、卡或折叠式印刷品提供在给容器内或与该容器一起提供。

除非明确指定，否则本发明的实践采用传统的分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学技术，这些技术处于该领域技术人员的知识范围内。此类技术在文献中完整地诠释，如，《分子克隆：实验室手册(第二版)》(MolecularCloning:A Laboratory Manual,second edition,(Sambrook,1989))；《寡核苷酸合成》(Oligonucleotide Synthesis(Gait,1984))；《动物细胞培养》(Animal Cell Culture(Freshney,1987))；《实验免疫学手册》的《酶学方法》(Methods in Enzymology Handbookof Experimental Immunology(Weir,1996))；《用于哺乳动物细胞的转基因载体》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells(Miller and Calos,1987))；和《分子生物学现代方法》(Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987))；《PCR：聚合酶链反应》(PCR:The Polymerase Chain Reaction,(Mullis,1994))；《免疫学现代方法》(Current Protocols in Immunology(Coligan,1991))。这些技术可用来生产本发明的多核苷酸和多肽，且因此可在作成并实践本发明中考虑这些技术。尤其可用于特定实施方式的技术将在下文中讨论。

以下实施例向本领域技术人员提供对如何制作和使用本攻克的组合物和治疗性方法的完全说明，而不试图限制发明人所认为的他们的发明的范畴。

实施例

实施例1：慢病毒载体生成和表征

生成包含在人PGK启动子的转录控制下编码人ApoE2(hApoE2)和Trem2(hTrem2)的核酸的慢病毒载体，并测试靶标分子在BV-2细胞红的表达(图1和图2A至图2C)。Trem2是脑内的免疫受体，其表达在细胞膜上，使得其N端暴露于细胞外空间中。

采用Trem2和ApoE2载体进行对于BV-2小神经胶质细胞的体外实验。通过针对经Trem2转导的BV-2细胞的流式细胞术证实正确的细胞表面表达(未显示)。

使用荧光成像系统评估经虚拟治疗的以及经Trem2_LV和APoE2-LV转导的BV2细胞对于淀粉样蛋白β(Aβ)的吞噬能力。使用经适当处理的5-FAM标记淀粉样蛋白β(Aβ)单体(150μM，在1X PBS中)和寡聚体(150μM，在1XPBS中，在37℃孵育72小时)来治疗经稳定转导的和对照BV2细胞，然后使用荧光微量板读取系统读出(图2D)。如预期的，与对照293T细胞相比，BV-2小神经胶质细胞大量地吞噬淀粉样蛋白β(Aβ)寡聚体(图2E)。有趣的是，与未经转导的对照BV-2相比，经Trem2转导的BV-2细胞对淀粉样蛋白β(Aβ)寡聚体的吞噬增加(图2E)。

实施例2：5xFAD小鼠中的造血干细胞基因疗法

设计一项实验，探索使用过表达ApoE2和Trem2+/-金属硫蛋白(MT)的慢病毒载体(LV)进行的造血干细胞(HSC)基因疗法在可靠的阿尔兹海默症(AD)动物模型即5XFAD小鼠中的用途。由于阿尔兹海默症(AD)仅影响中枢神经系统(CNS)，采用一种创新性移植方案，该方案基于将经转导的造血干祖细胞(HSPC)递送至接受者小鼠的侧脑室中，与未经转导的造血细胞关联，支持从白消安去髓预处理中拯救。本研究的总体目标是评估脑内基因疗法的功效，该疗法基于移植经编码人ApoE2或Trem2基因的cDNA联合金属硫蛋白(MT)的慢病毒载体(LV)转导的鼠造血干祖细胞(HSPC)，并选择最具前景的转录物用于未来发展。

在过去几年里生成了许多阿尔兹海默症(AD)的转基因小鼠模型，以表征根本性的病理和行为改变。5xFAD转基因小鼠具备5个突变且这些突变导致Aβ42的过度产生，并且该小鼠表现出类似于见于阿尔兹海默症(AD)中的淀粉样蛋白斑块病理，而其余转基因模型的斑块发展缓慢。5XFAD脑内的神经元内Aβ42蓄积在6周龄时开始。这些小鼠在大约6周龄时发展出AD病的早期发作。据报导，5xFAD小鼠的存活率在10个月后下降。

从供体小鼠(5XFAD)的骨髓纯化谱系阴性细胞(Lin-)，然后用下列载体中的一者：APOE2/TREM2或其与MT1G的组合，根据标准化转导方案以75至100的感染复数(MOI)转导。在全部样品的制备中均获得了良好且相当的转导效率，其中在体外液体培养物上测得了约10的载体拷贝数(图3A)。通过西方印迹法，在经转导的细胞的液体培养物后裔中证实了hApoE2和Trem2的表达(图3B)。

通过脑室内(ICV)注射，将这些经转导的细胞(0.3X 10e6至0.5X 10e6慢病毒载体(LV)转导的Lin-细胞)注射至经白消安去髓的5XFAD接受者小鼠的脑内。在移植后3至5天，给予骨髓支持以拯救外周血细胞发生(2.0X 10e6总骨髓细胞，其可以经或不经含有报告基因如绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体(LV)转导或保留不经转导)。每个治疗队列中包括10至15只动物。对照包括保留不经转导的或使用未经转导的/GFP-转导的5xFAD lin-细胞进行移植的5xFAD小鼠，以及保留未经治疗的或使用未经转导的/GFP-转导的野生型lin-细胞进行移植的动物，全部与经治疗的动物年龄匹配。将安定在饮用水中给药9天作为癫痫发作预防。接着，以口服溶液给予拜有利(Baytril)两周，然后给予新诺明(Sulfatrim)作为抗生素预防。在移植后，收集临床体征对小鼠进行监控，以进行对中间发生的死亡(ICD)的早期鉴别，直至计划的终末评估。

除了交替认为中的工作记忆缺陷和如高架十字迷宫任务中显露的焦虑水平降低以外，5XFAD小鼠模型还发展出了年龄依赖性运动表型。对于表型评估，从4月龄直到12月龄，每个月进行行为测试(新物体识别、开放场测试和高架十字迷宫)，以进行表型变动监控并评估基因疗法在经移植的小鼠中的有益效果，但Morris水迷宫(MWM)测试除外，该测试用于记录在12月龄即研究终点时的认知缺陷。在所进行的测试中，高架十字迷宫表明对照动物(移植绿色荧光蛋白(GFP)的和未经治疗的5xFAD小鼠)中出现阿尔兹海默症(AD)的明显表型进展，而其他测试(新物体识别、开放场测试)在实验环境下没有有用信息(图4A至图4F)。Morris水迷宫(MWM)显示了一种病理表型，即在多次试验中到达隐藏和反向平台的能力下降且在目标象限(NW)中移动的距离很短(探针试验)(图4A至图4F)。

这些测试也用来评估经治疗的小鼠表型。有趣的是，用于评估焦虑的高架十字迷宫显示，在12个月时间点，与对照影响的小鼠相比，经Trem2移植的动物在开放臂中耗费的时间更短，并且在相同年龄的对照组中观察到了对病理表型的阻止(图5A)。在Morris水迷宫(MWM)测试中观察到了类似结果(图5B至图5D)。在探针试验中，全部5XFAD对照小鼠均显示在目标象限(NW)中移动的距离显著缩短，而野生型及经Trem2治疗的动物移动更长距离，指出与5xFAD对照相比，它们保持记忆或回忆的能力改善。此外，经Trem2移植的动物显示，在5次试验后找到隐藏平台的延迟期得到明显改善。此外，通过移植经Trem2转导的细胞预防了在Morris水迷宫(MWM)任务的反向学习期间在5xFAD中观察到的认知灵活性缺陷。事实上，与5xFAD对照小鼠相比，经Trem2治疗的动物到达平台的平均延迟期显著降低，表明与在野生型动物中观察到的一样好的更佳认知灵活性。在行为测试中，经ApoE2治疗的动物反而与5xFAD对照没有显著差异。除了编码Trem2或ApoE2的载体之外，还使用MT1G慢病毒载体(LV)转导所移植的细胞，不影响相应队列中行为测试的结果(数据未显示)。

在行为测试后，经治疗的和对照动物经历终末评估，包括全面尸检，在经心脏灌注生理盐水并收集组织进行分子和组织学评估。针对经移植的动物的脑部进行的数字微滴式(ddPCR)记录了经转导的细胞的植入(针对液体培养物后裔测量的其载体拷贝数(VCN)显示在图3A中)，其中载体拷贝数(VCN)值在每小鼠基因组0.5至1.5个LV拷贝范围内，且最高载体拷贝数(VCN)在APoE2+MT1G队列中测得。ddPCR没有显示经转导的细胞在骨髓中的植入(未显示)。

病理性神经炎症与神经退化相关，并且主要由小神经胶质细胞介导，而小神经胶质细胞是中枢神经系统的常驻型免疫细胞。小神经胶质细胞在感测环境变化、对有害刺激产生应答、以及吞噬碎片和凋亡的神经元方面具有关键功能。通过使用小神经胶质细胞活化的特异性标记物(Iba1)和星形细胞应答的特异性标记物(GFAP)评估神经炎症(图6A至图6D)。如预期的，与野生型动物相比，Iba1和GFAP的表达在5xFAD中更高。这些标记物的表达水平在经治疗的小鼠中非常不均等，似乎是由于经转导的细胞/其后裔的植入方面的差异。特别是，与在对照5xFAD对照组中测量的信号相比，经治疗的小鼠脑(皮层和海马体)内的Iba1和GFAP信号减少了4％至70％；但是，仅在皮层区域中的Iba1信号的情况下在整个队列的比较中实现了显著性。淀粉样蛋白β(Aβ)聚集体出发了一系列反应，包括神经元细胞死亡、神经炎症和神经胶质增生，以及最终的认知受损。对照组5xFAD脑部的组织学分析显示了含有Aβ沉积物的斑块的细胞内蓄积(图6E至图6H)。有趣的是，经治疗的动物显示了皮层和海马体中Aβ水平的剂量依赖性减少：在显示脑组织内载体拷贝数(VCN)>0.5(研究队列的平均值)的动物中观察到了较高例的淀粉样蛋白β(Aβ)减少率。与经ApoE2治疗的动物相比，这些针对神经炎症和淀粉样蛋白β(Aβ)沉积的效果在经Trem2治疗的动物中更为明显，并且不受除了使用编码Trem2或APoE2的者外还使用MT1G载体的影响。

在大多数所研究的疾病动物模型(5xFAD小鼠)中测试了用于阿尔兹海默症的造血干细胞(HSC)基因疗法策略。该基因疗法策略基于，慢病毒载体(LV)介导造血干细胞(HSC)工程化改造以在小神经胶质细胞样组织后裔中表达i)Trem2或ii)ApoE2。在两种环境下，测试了MT1G表达与两种治疗性构建体的潜在协同效应。

开发了新的慢病毒载体，用于在阿尔兹海默症(AD)中枢神经系统(CNS)中表达潜在的治疗性转录物，以影响疾病的关键分子机制。特别地，Trem2和ApoE2被表达。这些载体以水泡性口炎病毒G(VSV-G)假型慢病毒载体(LV)的形式产生，用于小神经胶质细胞系和造血干祖细胞(HSPC)的转导。用编码Trem2的慢病毒载体(LV)对BV-2细胞进行体外转导，表明对淀粉样蛋白β(Aβ)寡聚物的吞噬增强，支持选择该转基因。

这些载体用于在5xFAD小鼠中的体内CNS(中枢神经系统)内造血干细胞(HSC)基因疗法研究，旨在评估这两种策略中的任一者是否对疾病进展具有任何影响。用两种治疗性慢病毒载体(LV)转导5xFAD造血干细胞(HSC)，经脑室内(ICV)移植而植入经去髓的5xFAD小鼠的脑内。相较于经虚拟治疗的对照，对这些小鼠的行为和组织学分析指出，构建体，尤其是Trem2，似乎对该疾病的发作和早期阶段具有积极影响。观察到行为改善、神经炎症减轻和淀粉样蛋白β(Aβ)沉积物的LV剂量依赖性减少。对于全部评估，存在一些与技术问题有关的变异性，这些技术问题通常在全部队列中造成中枢神经系统(CNS)中的经转导的细胞的植入低于目标。

经Trem2治疗的动物显示有前景的结果，因为治疗减轻了疾病临床表现(如根据行为学研究确定)和疾病相关的组织学异常。

其他实施方案

从前述说明书可知，可对本文所述的发明作出改变和修改以令其适应各种用途和条件。此类实施方案也处于所附权利要求书的范畴内。

本文中，对任何变量定义中一系列元件的描述包括该变量作为任何单一元件或作为所列元件的组合(或亚组合)的定义。对本文中实施方案的描述包括该实施方案作为任何单一实施方案或作为与任何其他实施方案或其部分的组合。

本说明书中提及的全部专利和出版物通过引用并入本文，其并入程度与各独立的专利和出版物具体且独立地指明以待通过引用并入相同。本申请可以与PCT/US2020/045106和PCT/US2017/05677、以及各自在2020年10月1日提交的名为“MICROGLIA SPECIFICPROMOTERS AND METHODS OF USE THEREFORE”和“COMPOSITIONS AND METHODS FORTREATING AMYOTROPHIC LATERAL SCLEROSIS”的PCT申请相关，这些PCT申请相应地主张以下临时申请的优先权：62/908,966和62/908,942，这些申请全部通过引用并入本文。

Claims (65)

1.一种治疗患有阿尔兹海默症或具有发展阿尔兹海默症的倾向的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的包含表达载体或表达盒的细胞，所述表达载体或表达盒包含编码ApoE2多肽和Trem2多肽的一种或多种多核苷酸。

2.一种表达载体或表达盒，其包含编码ApoE2和金属硫蛋白1G、TREM2和金属硫蛋白1G、ApoE2和TREM2、或者ApoE2、TREM2和金属硫蛋白1G(MT1G)的多核苷酸。

3.一种表达载体或表达盒，其包含编码TREM2多肽和ApoE2多肽或其片段的多核苷酸。

4.根据权利要求1所述的方法或根据权利要求2或权利要求3所述的表达载体或表达盒，其中所述表达载体或表达盒包含金属硫蛋白的两个或更多个拷贝。

5.根据权利要求1或权利要求4所述的方法或根据权利要求2至4中任一项所述的表达载体或表达盒，其中所述载体包含编码MT1G的至少四个拷贝的多核苷酸。

6.根据权利要求1和权利要求4至5中任一项所述的方法或根据权利要求2至5中任一项所述的表达载体或表达盒，其中所述载体包含驱动所述多核苷酸的表达的启动子。

7.根据权利要求6所述的方法或根据权利要求6所述的表达载体或表达盒，其中所述启动子是人磷酸甘油酸激酶启动子。

8.根据权利要求6所述的方法或根据权利要求6所述的表达载体或表达盒，其中所述启动子是小神经胶质细胞特异性启动子。

9.根据权利要求8所述的方法或根据权利要求8所述的表达载体或表达盒，其中所述启动子是TSPO、II类MHC、或CX3CR1启动子。

10.一种表达载体，其包含根据权利要求2至9中任一项所述的表达盒。

11.根据权利要求1和权利要求4至9中任一项所述的方法，或根据权利要求1至9中任一项所述的表达载体或表达盒，或根据权利要求10所述的载体，其中所述载体是慢病毒载体。

12.一种慢病毒载体，其包含驱动编码TREM2多肽和ApoE2多肽或其片段的多核苷酸的表达的磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。

13.一种慢病毒载体，其包含驱动编码TREM2多肽和ApoE2多肽或其片段的多核苷酸的表达的小神经胶质细胞特异性启动子。

14.根据权利要求12或13所述的慢病毒载体，其进一步包含编码金属硫蛋白的多核苷酸的一个或多个拷贝。

15.一种细胞，其包含根据权利要求2至14中任一项所述的载体或根据权利要求2至9和权利要求11中任一项所述的盒。

16.根据权利要求15所述的细胞，其中所述盒插入在CX3CR1或TSPO基因座。

17.根据权利要求15或权利要求16所述的细胞，其中所述细胞是小神经胶质细胞或其前体、造血干细胞、造血干祖细胞(HSPC)、或起源于造血干细胞或造血干祖细胞的细胞。

18.根据权利要求17所述的细胞，其中所述HSPC是CD34⁺和/或CD38^-和/或CD90⁺。

19.根据权利要求15至18中任一项所述的细胞，其中所述细胞对于CX3CR1基因是半合子的。

20.一种降低细胞或组织中的淀粉样蛋白β水平的方法，所述方法包括使所述细胞与编码ApoE2多肽、Trem2多肽和金属硫蛋白多肽、或其片段中的两者或更多者的多核苷酸接触。

21.一种增加细胞对β淀粉样蛋白的吞噬的方法，所述方法包括使所述细胞与编码ApoE2多肽、Trem2多肽和金属硫蛋白多肽、或其片段中的两者或更多者的多核苷酸接触。

22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述多核苷酸包含在表达载体中。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒载体。

24.根据权利要求20至23中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含表达盒。

25.根据权利要求20至24中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码ApoE2和TREM2、ApoE2和金属硫蛋白1G、TREM2和金属硫蛋白1G、或者ApoE2、TREM2和金属硫蛋白1G(MT1G)。

26.根据权利要求20至25中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码金属硫蛋白的一个或多个拷贝。

27.如权利要求26所述的方法，其中所述多核苷酸编码MT1G的至少四个拷贝。

28.根据权利要求20至27中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含启动子。

29.如权利要求28所述的方法，其中所述启动子是磷酸甘油酸激酶启动子。

30.如权利要求28所述的方法，其中所述启动子是小神经胶质细胞特异性启动子。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述启动子是TSPO、II类MHC、或CX3CR1启动子。

32.根据权利要求20至31中任一项所述的方法，其中所述细胞是小神经胶质细胞、造血干细胞、造血干祖细胞(HSPC)、或自其起源的细胞。

33.根据权利要求20至32中任一项所述的方法，其中所述方法在体外或体内进行。

34.一种治疗患有阿尔兹海默症或具有发展阿尔兹海默症的倾向的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的细胞，所述细胞包含编码ApoE2多肽、和Trem2多肽和金属硫蛋白多肽、或其片段中的两者或更多者的多核苷酸。

35.一种治疗患有神经炎症或具有发展神经炎症的倾向的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者给药有效量的细胞，所述细胞包含编码ApoE2多肽、Trem2多肽和金属硫蛋白多肽、或其片段中的两者或更多者的多核苷酸。

36.根据权利要求34或35所述的方法，其中所述多核苷酸包含在表达载体中。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述表达载体是慢病毒载体。

38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含表达盒。

39.根据权利要求34至38中任一项所述的方法，其中所述细胞经脑室内、静脉内或鞘内给药。

40.根据权利要求34至39中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码ApoE2和TREM2、ApoE2和金属硫蛋白1G、TREM2和金属硫蛋白1G、或者ApoE2、TREM2和金属硫蛋白1G(MT1G)。

41.根据权利要求34至40中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸编码TREM2多肽和ApoE2多肽或其片段。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述多核苷酸进一步编码MT1G的一个或多个拷贝。

43.根据权利要求34至42中任一项所述的方法，其中所述多核苷酸包含启动子。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述启动子是人磷酸甘油酸激酶启动子。

45.如权利要求43所述的方法，其中所述启动子是小胶质细胞特异性启动子。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述启动子是TSPO、II类MHC、或CX3CR1启动子。

47.根据权利要求34至46中任一项所述的方法，其中所述细胞是小神经胶质细胞或其祖细胞、造血干细胞、造血干祖细胞(HSPC)、或自其起源的细胞。

48.根据权利要求47所述的方法，其中所述细胞是造血干祖细胞(HSPC)。

49.根据权利要求48所述的方法，其中所述HSPC是Lin^-、CD34⁺、CD38^-和/或CD90⁺。

50.根据权利要求47至49中任一项所述的方法，其中所述HSPC在移植时在功能上等效于小神经胶质祖细胞。

51.根据权利要求47至50中任一项所述的方法，其中所述HSPC植入在脑内。

52.根据权利要求51所述的方法，其中所植入的HSPC在功能上等效于小神经胶质祖细胞或表达小神经胶质祖细胞的特征标记物。

53.根据权利要求34至52中任一项所述的方法，其中所述受试者在所述方法之前经历消融预处理。

54.根据权利要求53所述的方法，其中所述消融预处理包括向所述受试者给药烷基化剂。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述烷基化剂是白消安。

56.根据权利要求53所述的方法，其中所述预处理包括给药CSF-1R抑制剂。

57.根据权利要求56所述的方法，其中所述抑制剂是PLX3397、PLX5622或氯膦酸二钠脂质体。

58.根据权利要求47至52中任一项所述的方法，其中所述HSPC是同种异体细胞或自体细胞。

59.根据权利要求34至58中任一项所述的方法，其中所述细胞对于CX3CR1基因是半合子的。

60.根据权利要求34所述的方法，其中所述阿尔兹海默症是家族性或早发性阿尔兹海默症。

61.根据权利要求34至60中任一项所述的方法，其中所述方法减轻焦虑，增加认知能力，或增加短期工作记忆。

62.根据权利要求34至61中任一项所述的方法，其中所述方法减少小神经胶质细胞活化和/或星形细胞应答。

63.根据权利要求34至62中任一项所述的方法，其中所述方法降低Iba1和/或GFAP的水平。

64.一种药物组合物，其包含根据权利要求17或权利要求18所述的HSPC。

65.一种试剂盒，其包含根据权利要求17或权利要求18所述的HSPC和关于将其递送至受试者的操作指南。

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