RU2468818C2

RU2468818C2 - Способы, фармацевтические композиции и изделия для введения терапевтических клеток в центральную нервную систему животного

Info

Publication number: RU2468818C2
Application number: RU2010113932/15A
Authority: RU
Inventors: ВТОРОЙ Уилльям Г. ФРЕЙ; Лузина ДАНИЛЯН; Кристоф Х. ГЛАЙТЕР
Original assignee: ВТОРОЙ Уилльям Г. ФРЕЙ; Лузина ДАНИЛЯН; Кристоф Х. ГЛАЙТЕР
Priority date: 2007-09-11
Filing date: 2008-09-04
Publication date: 2012-12-10
Also published as: HRP20120560T1; US20160206554A1; KR20150039197A; MX2010002738A; SG184724A1; JP5600294B2; DK2200621T3; EP2200621B1; US8283160B2; IL204371A; EP2200621A1; KR20100094450A; BRPI0816325A2; PL2200621T3; PT2200621E; CN101801397A; EP2200621A4; AU2008299124B2; JP2010539084A; ES2388403T3

Abstract

Изобретение относится к медицине и касается способа транспортирования терапевтических клеток в пораженную, или дегенерирующую, или поврежденную центральную нервную систему животного, где поражения или дегенерация вызваны неврологическим заболеванием или состоянием, которое приводит к утрате или гибели клеток центральной нервной системы, включающего нанесение по меньшей мере одной терапевтической клетки в верхней трети носовой полости млекопитающего. Изобретение обеспечивает доставку терапевтических клеток неинвазивным и высоко направленным образом. 3 н. и 27 з.п. ф-лы, 4 пр.

Description

Перекрестные ссылки на родственные заявки на изобретения

Данная заявка на изобретение испрашивает приоритет предварительной заявки номер 60/971284, поданной 11 сентября 2007 года, озаглавленной "Интраназальная доставка терапевтических клеток к центральной нервной системе", содержание которой включено здесь путем ссылки.

Предшествующий уровень техники

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к способам и фармацевтическим композициям для введения терапевтических клеток в верхнюю треть носовой полости млекопитающего, таким образом давая терапевтическим клеткам возможность обходить гематоэнцефалический барьер, для профилактики и/или лечения пораженной и/или дегенерирующей, и/или поврежденной центральной нервной системы млекопитающих.

Описание области техники

Множество неврологических состояний возникают в результате повреждения или утраты, т.е. гибели некоторых клеточных популяций в центральной нервной системе в процессе старения, заболевания или повреждения. Клетки, пораженные или поврежденные при этих состояниях, не заменяются в природе, таким образом, центральная нервная система повреждается и/или дегенерирует с возникающей в результате утратой функции. Недавние доказательства продемонстрировали, что нейрональная замена и частичное восстановление нейрональной схемы возможно благодаря терапиям путем клеточной трансплантации. В большей части исходных работ в этой области использовались терапии на основе клеток эмбриона. Тем не менее позднее стало очевидно, что развивающаяся нервная система и даже нервная система взрослого млекопитающего содержит популяцию недифференцированных, мультипотентных нервных стволовых клеток, которые демонстрируют пластичные свойства, благоприятные для разработки более эффективной нервной регенеративной стратегии для множества из этих неврологических состояний.

Неврологические состояния, заболевания и/или поражения, приводящие к поражению и/или дегенерации ЦНС, т.е. клеточной гибели, включают болезнь Альцгеймера, умеренное когнитивное нарушение, возрастное нарушение памяти, болезнь Паркинсона, цереброваскулярное заболевание, включая инсульт, болезнь Крейтцфельда-Якоба, семейный боковой амиотрофический склероз, деменцию с тельцами Леви, атеросклероз, шизофрению, аутизм, позднюю дискинезию, рассеянный склероз, эпилептические расстройства, болезнь Вильсона, прогрессирующий супрануклеарный паралич, синдром Галлервордена-Шпатца, мультисистемную атрофию, болезнь Гентингтона, семейную дегенерацию базальных ганглий, синдром Дауна, катаракты, гемохроматоз, талассемию, кровоизлияние в головной мозг, субарахноидальное кровоизлияние, повреждение головы и повреждение спинного мозга. Кроме того, некоторые медицинские процедуры, например аортокоронарное шунтирование (CABG), связаны с неврологическими осложнениями, которые приводят к поражениям и/или дегенерации центральной нервной системы и сопутствующей клеточной гибели. В случае CABG хирургическое вмешательство по всему миру ежегодно проводят более чем на 800000 пациентах. Множество из проводимых процедур CABG связано с неврологическими осложнениями. Эти осложнения простираются от инсульта у вплоть до 16% от общего количества пациентов и до общего уменьшения когнитивной способности у 50% пациентов, страдающих от нарушения после хирургического вмешательства, и с прогрессирующим уменьшением, обнаруживаемым у некоторых пациентов в течение следующих пяти лет. Дополнительно, у некоторых пациентов, перенесших CABG, обнаружено проявление физических и поведенческих нарушений. Newman M.F. et al., N.Eng. J.Med. 344:395-402 (2001); Brillman J., Neurol. Clin. 11:475-495 (1993); и Seines, 0. A., Ann. Thorac. Surg. 67: 1669-1676 (1999) являются полезными в этом отношении.

Показано, что нервная стволовая клетка заменяет утраченные и погибшие клетки и утраченные нервные цепочки в поврежденной и/или дегенерирующей ЦНС при клеточно-заместительной терапии. Например, обработка мышей МРТР, представляющем собой лекарство, которое избирательно разрушает дофаминергические клетки в стволе головного мозга, а затем пересадка популяции нервных стволовых клеток приводили в результате к восстановлению популяции дофаминергических клеток, состоящей из донорных клеток и клеток хозяина. Аналогичные исследования на мышах с использованием модели ишемического повреждения головного мозга вследствие ишемии продемонстрировали, что трансплантация нервных стволовых клеток усиливала восстановление пораженной системы (Park et al. (1999) J.Neurotrauma 16: 675-687 и Park et al. (1997) Soc.Neurosci. Abst. 23:346). У пациентов, страдающих от инсульта, трансплантация клеток человеческой нейрональной клеточной линии продемонстрировала улучшение неврологической функции (Kondziolka D., et al., (2000) "Transplantation of cultured human neuronal cells for patients with stroke". Neurology. 55: 565-9). В модели болезни Альцгеймера у мышей трансплантация нервных стволовых клеток в предлобную и теменную области коры головного мозга значительно уменьшала холинергические дефициты и нарушение кратковременной памяти, связанные с AD (Wang, Q., et al., (2006) "Neural stem cells transplantation in cortex in a mouse model of Alzheimer's disease. J Med Invest., 53: 61-9).

Кроме того, при болезни Паркинсона нейроны, которые подвергаются дегенерации в центральной нервной системе млекопитающего, включают дофаминергические нейроны черной субстанции. Существующие в настоящее время стратегии клеточного замещения для пациентов, страдающих от развившейся болезни Паркинсона, включают трансплантацию в полосатое тело дофаминергических нейронов черной субстанции человеческих эмбрионов в возрасте от 6 до 9 недель. Клинические улучшения развиваются постепенно в течение первых 6-24 месяцев после трансплантации (Olanow et al. (1996) Trends Neurosci. 19: 102-109 и Lindvall et al. (1999) Mov. Disord. 14: 201-205). Показано, что трансплантаты стволовых клеток различного происхождения, например гемопоэтического, эмбрионального, приводят в результате к некоторым клиническим улучшениям у пациентов, страдающих от тяжелой болезни Паркинсона (Freed, CR, et al. (Transplantation of embryonic dopamine neurons for severe Parkinson's disease. N EngI J Med 2001; 344: 710-719).

Аналогичные преимущества реализуются в отношении пациентов, страдающих от прогрессирующего рассеянного склероза (Ni XS, et al., (2006) "Autologous hematopoietic stem cell transplantation for progressive multiple sclerosis: report of efficacy and safety at three yr of follow up in 21 patients" Clin Transplant. 20:485-9) (дополнительное свидетельствуя о том, что лечение должно комбинировать иммуномодуляцию с нейропротективными модуляторами, такими как клеточная терапия, для достижения максимальной клинической пользы).

Дополнительно, первое исследование трансплантации в полосатое тело у людей от эмбриона взрослому человеку провели на трех пациентах, не страдающих от деменции, но с умеренно развившейся болезнью Гентингтона. Оценка при помощи магнитно-резонансной визуализации через 1 год выявила выживание трансплантата и рост без замещения окружающей ткани. У всех пациентов в некоторой степени улучшилась когнитивная функция (Kopyov et al. (1998) J.Exp.Neurol. 149:97-108). Смотри также Date et al. (1997) J.Exp.Neurol. 147: 10-17.

Каждая из известных моделей и способов терапевтической клеточной терапии требует хирургического вмешательства, т.е. трансплантации нервных стволовых клеток с использованием инвазивных способов трансплантации и/или способов системной доставки, которые не нацелены на пораженные области в центральной нервной системе. Было бы желательно предложить способ, фармацевтическую композицию и/или изделие, или набор, которые могли бы доставлять терапевтические клетки, включая нервные стволовые клетки, но не ограничиваясь ими, не инвазивным и высоко направленным образом.

Например, было бы желательно доставлять такие терапевтические клетки в дегенерирующую центральную нервную систему таким путем, чтобы избежать системного воздействия. В настоящее время не существует известных способов или фармацевтических композиций, обеспечивающих такие преимущества. В настоящем изобретении эти преимущества обеспечиваются путем нанесения терапевтических клеток в верхней трети носовой полости, таким образом обеспечивая обхождение гематоэнцефалического барьера, и введения терапевтических клеток и другого соединения непосредственно в центральную нервную систему.

Некоторые воплощения настоящего изобретения включают назальные и/или мукозальные антибиотики для того, чтобы способствовать защите субъекта пациента от миграции бактерий из носовой полости вдоль нервного пути вслед за применяемыми терапевтическими клетками и/или фармацевтическим соединением. Хорошо известно, что такие антибиотики применяются местно, но ни один из них не вводится в качестве предварительной обработки, одновременной обработки и/или последующей обработки системно и/или интраназально в сочетании с интраназальным применением терапевтических клеток и/или фармацевтического соединения.

Например, в одном из исследований мупироцин, намазываемый внутрь носа, уменьшал уровни инфекции вдвое или даже больше в отношении Staphylococcus aureus, который представляет собой широко распространенную бактерию, которая в норме существует в ноздрях у 25-30 процентов всех госпитализируемых пациентов, не причиняя вред. Но эти бактерии могут загрязнять места ран, вызывая тяжелые и часто смертельные инфекции, особенно у людей с ослабленной иммунной системой.

В еще одном исследовании обнаружено, что назально вводимый ксилит, представляющий собой безрецептурное средство, продаваемое в магазинах диетических продуктов, может уменьшать уровень бактерий в носу и их способность удерживаться на и инфицировать клетки слизистой оболочки носа. В еще одном исследовании обнаружили, что дефенсины, представляющие собой естественный антибиотик, обнаруженный в слизистой оболочке человека, могут защищать от бактериальной инфекции и усиливать защитную функцию иммунной системы. Дефенсины млекопитающих представляют собой небольшие катионные антимикробные пептиды, кодируемые хозяином, которые, как считают, представляют собой важные антибиотикоподобные эффекторы врожденного иммунитета. Благодаря хемокиновым рецепторам на дендритных клетках и Т-клетках, дефенсины также могут вносить вклад в регуляцию адаптивного иммунитета хозяина против микробной инвазии. Дефенсины обладают значительной иммунологической адъювантной активностью, и связывание бета-дефенсинов или отобранных хемокинов с идиотипическим антигеном лимфомы позволяет получать сильные противоопухолевые вакцины. Функциональное перекрывание между дефенсинами и хемокинами подтверждается в сообщениях о том, что некоторые хемокины обладают антимикробными активностями. Хотя дефенсины и хемокины демонстрируют сходство в активности и общей третичной структуре, эволюционная взаимосвязь между дефенсинами и хемокинами еще требуется установить (De Yang, et al., Mammalian defensins in immunity: more than just microbicidal. Trends Immunol. 2002 Jun;23 (6): 291-6 12072367).

Кроме того, хорошо известно, что регуляторные агенты, содержащие трофические и ростовые факторы, такие как эритропоэтин (ЕРО), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), фактор роста нервов (NGF), фактор роста фибробластов (FGF) и эпидермальный ростовой фактор (EGF) играют ключевую роль в выживании in vitro и in vivo и дифференцировке стволовых клеток (Erickson et al., Roles of insulin and transferring in neural progenitor survival and proliferation. J Neurosci Res. 2008 Feb 21; Bossolasco et al., Neuro-glial differentiation of human bone marrow stem cells in vitro. Exp Neurol. 2005 Jun; 193 (2): 312-25). Лучшее выживание хирургически трансплантированных клеток продемонстрировано в случае одновременного применения ЕРО (Kanaan et al., Exogenous erythropoietin provides neuroprotection of grafted dopamine neurons in a rodent model of Parkinson's disease. Brain Res. 2006 Jan 12; 1068 (1): 221-9). Тем не менее не известно введение таких регуляторных факторов или агентов в сочетании с интраназальным применением терапевтических клеток и/или их фармацевтических композиций в верхнюю треть носовой полости, таким образом обходя гематоэнцефалический барьер.

Дополнительно, хорошо известно, что регуляторные агенты, содержащие различные факторы роста, включая инсулиноподобный фактор роста-I (IGF-I), фактор роста нервов (NGF) и основной фактор рост фибробластов (bFGF), регулируют выживание и дифференцировку нервных клеток во время развития периферической и центральной нервной системы. Регуляторные агенты, такие как нейротрофины, также требуются для роста нервов во время развития (Tucker et al. (2001) Nature Neurosci. 4:29-37). В зрелой нервной системе эти трофические факторы поддерживают морфологические и нейрохимические характеристики нервных клеток и усиливают функционально активные синаптические соединения. Такие регуляторные факторы обнаруживают применение в усилении способов клеточно-заместительной терапии по настоящему изобретению.

Например, bFGF усиливает выживание и рост нейронов in vitro. Дополнительно bFGF вызывает сильное способствующее росту действие в отношении имплантированных нейронов in vivo, когда имплантированные нейроны генетически сконструированы таким образом, чтобы экспрессировать bFGF (Takayama et al. (1995) Nat. Med. 1:53-8). Дополнительно, имплантация основанных на полимере биологически активных стержней, которые секретируют эпидермальный ростовой фактор и bFGF в трансплантированную вентральную область мезэнцефалической ткани эмбриона, приводит в результате к улучшенным функциональным характеристикам и увеличенной клеточной выживаемости (Tornquvist et al. (2000) Exp.Neurol. 164:130-138).

Также продемонстрировано, что фактор роста нервов (NGF) влияет на трансплантированную ткань в ЦНС. Например, активность холинацетилтрансферазы (ChАТ), представляющая собой показатель, свидетельствующий о холинергической клеточной активности, была значительно повышена в холинергических нейронах, трансплантированных в ткань головного мозга, которая содержала гранулу, высвобождающую NGF, недалеко от трансплантированных клеток (Mahoney et al. (1999) Med. Sci. 96:4536-4539). Также показано, что IGF-I способствует дифференцировке постмитотических нейрональных стволовых клеток ЦНС млекопитающего и влияет на апоптоз человеческих эритроидных клеток предшественников. Смотри, например, Arsenijevic et al. (1998) J.Neurosci. 18:2118-2128; Tanigachi et al. (1997) Blood 90:2244-2252; Reboarcet et al. (1996) J.Biol. Reprod. 55:1119-1125; Muta et al. (1994) J.Clin. Invest. 94:34-43; и, Muta et al. (1993) J.Cell. Phys. 156:264-271. Дополнительно, также продемонстрировано, что некоторые белки, ассоциированные с ростом, такие как GAP-43 и CAP-23, способствуют регенерации поврежденных аксонов и могут поддерживать регенерацию в спинном мозге и ЦНС. Смотри, например, Bomze et al. (2001) Nature Neurosci. 4:38-43 и Woolf et al. (2001) Nature Neurosci. 4:7-9.

Введение регуляторных агентов в качестве средства улучшения клинического результата у млекопитающего, который подвергся регенерации нервов, т.е. терапевтическая клеточная стратегия тем не менее сталкивается со сложностями. Как правило, эти агенты не могут быть введены системно. Кроме того, многие из этих регуляторных агентов не проникают эффективно через гематоэнцефалический барьер. Интрацеребровентрикулярное введение, хотя возможно и представляет собой эффективный способ доставки регуляторных агентов, является инвазивным способом, который не является предпочтительным в клинической практике. Имплантация полимеров, содержащих регуляторные агенты, также представляет собой инвазивный путь и дополнительно ограничивается относительно небольшим радиусом, окружающим имплантат полимера, в котором регуляторный агент способен вызывать действие. Дополнительно, хотя осуществляют генетическое конструирование трансплантированных клеток для экспрессии регуляторных агентов, тем не менее стабильная трансфекция и выживание клеток после имплантации остаются проблематичными.

В настоящем изобретении среди прочего предложены решения этих проблем.

Краткое изложение сущности изобретения

Учитывая ситуацию, описанную выше, существует потребность в способе эффективной и неинвазивной доставки терапевтических клеток и/или фармацевтических композиций в пораженную и/или дегенерирующую центральную нервную систему.

Настоящее изобретение, среди прочего, относится к профилактике и/или лечению пораженной и/или дегенерирующей центральной нервной системы вследствие заболевания или другого состояния, которое вызывает утрату или гибель клеток ЦНС. Конкретно, в настоящем изобретении предложен способ, фармацевтическая композиция и изделие для транспортировки терапевтически эффективного количества по меньшей мере одной терапевтической клетки в ЦНС путем интраназального нанесения в верхней трети носовой полости, таким образом обходя гематоэнцефалический барьер и избегая нежелательного системного воздействия, а также способов инвазивной доставки.

Различные воплощения по настоящему изобретению включают интраназальную профилактику, предварительную обработку, последующую обработку, а также в качестве компонента фармацевтической композиции, содержащей терапевтические клетки и терапевтически эффективное количество агента(ов), улучающего(их) доставку, для улучшения доставки терапевтической(их) клетки(ок) в ЦНС. Еще одно воплощение включает по меньшей мере один антибиотик, применяемый интраназально и/или системно в качестве предварительной обработки, сопутствующей обработки (либо осуществляемой одновременно, либо в качестве компонента терапевтической композиции, содержащей терапевтические клетки) и/или последующей обработки для защиты пациента во время терапевтической клеточной терапии. Другие воплощения включают введение терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного регуляторного агента в верхнюю треть носовой полости млекопитающего в качестве предварительной обработки, последующей обработки и/или как часть фармацевтической композиции, содержащей терапевтические клетки. Другие воплощения включают по меньшей мере один иммуносупрессор, применяемый интраназально и/или системно в виде предварительной обработки, сопутствующей обработки (либо осуществляемой одновременно, либо в качестве компонента терапевтической композиции, содержащей терапевтические клетки) и/или последующей обработки для усиления жизнеспособности терапевтических клеток in vivo во время терапевтической клеточной терапии. Настоящее изобретение находит применение в улучшении клинического результата у млекопитающего, который подвергся стратегии регенерации нервов, включающей обход гематоэнцефалического барьера терапевтическими клетками, транспортируемыми непосредственно в ЦНС млекопитающего.

Различные воплощения изобретения относятся к способам и фармацевтическим композициям для профилактики и лечения неврологического поражения и дегенерации, т.е. утраты и гибели клеток в ЦНС и возникающих в результате эффектов, включая лечение утраты памяти и улучшение утраты памяти, ишемию головного мозга и/или нейродегенерацию для пацинтов, имеющих риск или диагноз некоторых медицинских состояний, таких как болезнь Альцгеймера, умеренное когнитивное нарушение, возрастное нарушение памяти, болезнь Паркинсона, цереброваскулярное заболевание, включая инсульт, болезнь Крейтцфельда-Якоба, семейный боковой амиотрофический склероз, деменция с тельцами Леви, атеросклероз, шизофрению, аутизм, позднюю дискинезию, рассеянный склероз, эпилептические расстройства, болезнь Вильсона, прогрессирующий супрануклеарный паралич, синдром Галлервордена-Шпатца, мультисистемную атрофию, болезнь Гентингтона, семейную дегенерацию базальных ганглиев, синдром Дауна, катаракты, гемохроматоз, талассемию, кровоизлияние в головной мозг, субарахноидальное кровоизлияние, повреждение головы, повреждение спинного мозга и метаболические расстройства, поражающие ЦНС, но не ограничивающихся ими.

Подробное описание изобретения

Определения

При использовании здесь, "центральная нервная система" (ЦНС) относится к головному мозгу и спинному мозгу, и связанным с ними тканям.

При использовании здесь, "неврологические расстройства и заболевания ЦНС" относится к заболеваниям и состояниям головного мозга, которые включают ишемию, т.е. ишемию головного мозга, ишемию, инсульт, нейродегенерацию, неврологические осложнения, возникающие в результате заболевания, такого как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Вильсона, деменция с тельцами Леви, рассеянный склероз, эпилептические расстройства, мозжечковая атаксия, прогрессирующий супрануклеарный паралич, боковой амиотрофический склероз, аутизм, аффективные расстройства, тревожные расстройства, метаболические расстройства, которые поражают ЦНС, и/или шизофрения; клеточные повреждения; повреждения нерва в результате цереброваскулярных расстройств, таких как инсульт в головном мозге или спинном мозге, в результате инфекций ЦНС, включая менингит и HIV (вирус иммунодефицита человека), в результате опухоли головного мозга и спинного мозга, прионовые заболевания, и расстройства ЦНС, возникающие в результате обычного старения (например, аносмия), повреждение головы и/или головного мозга, или повреждение спинного мозга и любые другие упомянутые здесь медицинские заболевания и состояния с неврологической утратой, поражением и/или дегенерацией клеток.

"Эффективное количество" клеток и/или агента представляет собой количество, достаточное для профилактики, лечения, уменьшения и/или ослабления симптомов и/или первопричин любого из вышеприведенных расстройств или заболеваний. В некоторых случаях "эффективное количество" является достаточным для устранения симптомов этих заболеваний и, возможно, преодоления самого заболевания. Предпочтительно, эффективное количество клеток субъекта в диапазоне доз 50-10⁸ клеток для длительного или разового применения и/или эффективное количество агента в диапазоне доз 0,001-2,0 мг/кг приводит к тканевой концентрации 10-10⁵ клеток на мл ткани и агента в диапазоне от приблизительно 10^-13 моль до приблизительно 10^-5 моль, но концентрации могут быть больше при условии того, что избегают токсичности.

В контексте настоящего изобретения термины "лечение" и "терапия" и т.п. относятся к ослаблению, замедлению прогресса, профилактике, уменьшению или излечению существующего заболевания или состояния, которые должны вызывать или вызывают гибель клеток в ЦНС. Используемый здесь термин "профилактика" относится к отсрочке, откладыванию, замедлению, подавлению или иной остановке, уменьшению или ослаблению начала таких заболеваний или расстройств. Предпочтительно, чтобы достаточно большое количество клеток и/или агента(ов) применяли в нетоксичных уровнях для того, чтобы обеспечить эффективный уровень активности против заболевания. Способ по настоящему изобретению может быть использован в отношении любого животного, такого как млекопитающее или птица, более предпочтительно млекопитающего. Домашняя птица представляет собой предпочтительную птицу. Примеры млекопитающих включают крыс, мышей, кошек, собак, лошадей, коров, овец, свиней и более предпочтительно людей, но не ограничиваются ими.

"Терапевтическая(ие) клетка(и)" определена(ы) здесь таким образом, что включает(ют) по меньшей мере одну клетку или тип клеток, например, без ограничения, нервную стволовую клетку, которая транспортируется при помощи интраназального нанесения в верхней трети носовой полости субъекта и в пораженную и/или дегенерирующую ЦНС субъекта, подвергающегося клеточно-заместительной терапии. Терапевтическая(ие) клетка(ки) могут быть получены из любого источника и могут находиться на различных стадиях развития и дифференцировки, а также терапевтическая(ие) клетка(ки) достаточна(ы) для профилактики или уменьшения морфологических и/или поведенческих неврологических симптомов неврологического расстройства, заболевания и/или состояния, которое лечат при помощи клеточно-заместительной терапии по настоящему изобретению. Кроме того, полагают, что терапевтическая(ие) клетка(ки) может(гут) быть гетерологичной(ими) или аутологической(ими) по отношению к хозяину. Под гетерологичной понимают, что терапевтическая клетка происходит от млекопитающего, отличающегося от пациента-субъекта, тогда как аутологическая терапевтическая клетка происходит из пациента-субъекта, с которой провели манипуляции ex vivo и перенесли назад в ЦНС пациента-субъекта при помощи способов по настоящему изобретению. Терапевтические лимфоциты также могут быть введены в верхнюю треть носовой полости с использованием настоящего изобретения для нацеливания на центральную нервную систему и лимфатическую систему. Лимфоциты действуют как часть защиты организма и включают клетки - естественные киллеры (NK клетки), Т клетки и В клетки. Такие клетки могут быть полезны в лечении опухолей головного мозга и других расстройств ЦНС и лимфатической системы. Дополнительное обсуждение терапевтических клеток приведено ниже, каждый такой аспект включен в определение "терапевтических клеток",

При использовании здесь "регуляторный агент" относится к любой молекуле, обладающей влияющим на рост, пролиферацию, дифференцировку действием или трофическим действием в отношении трансплантируемой донорной клетки по настоящему изобретению. Любой регуляторный агент, который способен регулировать развитие трансплантированной донорной клетки, может быть введен при помощи способов по настоящему изобретению (смотри, например, Mackay-Sim et al. (2000) Prog. Neurobiol. 62:527-559, включенную сюда путем ссылки). Дополнительное обсуждение регуляторного(ых) агента(ов) приведено ниже, каждый такой аспект включен в определение "регуляторного агента".

В контексте настоящего изобретения термины "лечение" и "терапия", и "терапевтический", и т.п. относятся к ослаблению, замедлению прогресса, профилактике, уменьшению или излечению пораженной или дегенерирующей ЦНС, включая утрату или гибель клеток ЦНС. Определение далее включает отсрочку, откладывание, замедление, подавление или иную остановку, уменьшение или ослабление поражения или дегенерации ЦНС, включая утрату или гибель клеток ЦНС. Способ по настоящему изобретению может быть использован в отношении любого животного, такого как млекопитающее или птица, более предпочтительно млекопитающего. Домашняя птица представляет собой предпочтительную птицу. Примеры млекопитающих включают крыс, мышей, кошек, собак, лошадей, коров, овец, свиней и более предпочтительно людей, но не ограничиваются ими.

Используемый здесь термины "дифференцироваться" и "зрелый" относятся к прогрессу клетки со стадии, имеющей потенциал дифференцироваться по меньшей мере в две различные клеточные линии для того, чтобы стать специализированной клеткой. Такие термины могут быть использованы взаимозаменяемо для задач настоящего изобретения. Термин "линия" относится ко всем стадиям развивающихся клеток, с самой ранней клетки-предшественника до полностью зрелой клетки (т.е. специализированной клетки). Соответственно, переносимые терапевтические клетки по настоящему изобретению могут происходить из мультипотентной клеточной линии, предпочтительно линии нервных клеток, и могут находиться на любой стадии дифференцировки. Таким образом, настоящее изобретение включает терапевтические клетки, которые в природе запрограммированы на дифференцировку только в один тип линии. Эти типы клеток могут включать некоторые типы фибробластов или просто дифференцированные клетки астроглии, нейроны, олигодендроциты, микроглии или эндотелиальные клетки, и они могут происходить или быть непосредственно выделены из ткани мертвого донора.

Дополнительные аспекты этих терминов обсуждаются ниже, каждый такой аспект включен в определение терминов.

Используемый здесь термин "мультипотентная стволовая клетка" относится к клетке, способной дифференцироваться в различные линии. Мультипотентные терапевтические, например, стволовые клетки характеризуются их способностью претерпевать непрерывное клеточное деление, регенерировать точные копии самих себя (самообновление), генерировать большое количество регионального клеточного потомства и вырабатывать новые клетки в ответ на повреждение или заболевание. "Мультипотентная популяция клеток" относится к композиции клеток, способных дифференцироваться в количество линий клеток, меньшее чем все, но по меньшей мере в две клеточные линии. Современные исследования продемонстрировали, что мультипотентная стволовая клетка из отличной от нервной области не имеет ограничения линии своего развития, а может приводить к образованию регионспецифических нейронов при воздействии соответствующих раздражителей окружающей среды (Lamga et al. (2001) J.Neurosci. 20:8727-8735).

"Нервная стволовая клетка" определена здесь как мультипотентная клетка, которая является незрелой, и некоммитированная мультипотентная клетка, которая существует в нервной системе (Ourednik et al. (1999) Clinical Genetics 56:267-278). В специфических состояниях нервная стволовая клетка способна продуцировать дочерние клетки, которые могут окончательно дифференцироваться в нейроны и глию (т.е. астроциты (тип I и II) и олигодендроциты). Они существуют в развивающейся нервной системе и в нервной системе взрослого организма. Подробную характеристику свойств нервных стволовых клеток можно найти, например, в McInnes et al. (1999) Clin. Genet. 56: 267-278.

"Нейрональная клетка-предшественник" представляет собой недифференцированную клетку, происходящую из нервной стволовой клетки, и которая перешла на конкретный путь дифференцировки, которая не демонстрирует самоподдержания и в соответствующих состояниях дифференцируется в нейробласты (клетки, образующие нейроны) или фибробласты (клетки, образующие глию). Применение такой мультипотентной нейрональной клеточной линии для трансплантации известно в области техники. Смотри, например Snyder et al. (1992) Cell 68:33, где мультипотентные нейрональные клеточные линии трансплантировали в мозжечок крысы с образованием нейронов и клеток глии. Смотри также Campell et al. (1995) Neuron 15:1259-1273; Fishell et al. (1995) Development 121:803-812; и, Olsson et al. (1995) Eur. J.Neurosci. 10:71-85.

"Ишемия" или ишемический эпизод, или состояние определены здесь таким образом, что включают ишемическое состояние, при котором головной мозг или часть головного мозга не получает притока крови, достаточного для поддержания нормальной функции нервов, и возникают в результате утраты или гибели клеток ЦНС и одновременного поражения и/или дегенерации ЦНС. Различные состояния и/или заболевания могут вызывать ишемию, включая инсульт, но не ограничиваются им. Некоторые из неврологических расстройств и заболеваний ЦНС, определенные и обсуждающиеся здесь, характеризуются некоторым уровнем ишемии. Неврологические расстройства и заболевания ЦНС, определенные и обсуждающиеся здесь, можно лечить при помощи терапевтических стратегий клеточного замещения по настоящему изобретению.

"Эффективное количество" терапевтических клеток и/или компонента(ов) фармацевтической композиции по настоящему изобретению, содержащей терапевтические клетки, представляет собой количество, достаточное для профилактики, лечения, уменьшения и/или ослабления симптомов нейронального поражения и/или первопричин любого из упомянутых расстройств или заболеваний. В некоторых случаях "эффективное количество" достаточно для устранения симптомов этих заболеваний и позволяет преодолеть само заболевание. Исключительно для иллюстративных задач пример схемы лечения, относящейся в общем к терапевтическим агентам, раскрытым здесь, включающей диапазоны доз, объемы и частоты, приведены ниже:

Эффективный диапазон доз для агентов, улучшающих доставку регуляторных агентов, иммуносупрессантов и/или антибиотиков, включает 0,0001-1,0 мг/кг.

Более предпочтительный диапазон доз может составлять 0,005-1,0 мг/кг.

Наиболее предпочтительный диапазон доз может составлять 0,05-1,0 мг/кг.

"Эффективное количество" терапевтических клеток, т.е. эффективный диапазон доз, включает 50 клеток - 10⁸ клеток.

Более предпочтительный диапазон доз для терапевтических клеток включает 10³ клеток - 10⁸ клеток.

Наиболее предпочтительный диапазон доз для терапевтических клеток включает 10⁴ клеток - 10⁸ клеток.

Диапазон объемов доз (применимые к назальным спреям или каплям) может составлять 0,015 мл - 1,0 мл.

Предпочтительный диапазон объемов доз (применимый к назальным спреям или каплям) может составлять 0,03 мл - 0,6 мл.

Концентрации в головном мозге, которые вероятно должны достигаться для приведенных выше диапазонов доз, составляют для разовой дозы: 10-10⁸клеток на мл ткани и 0,1 нМ - 5 мкМ. В течение плана мультидозового лечения максимальная концентрация в головном мозге может составлять 10⁶ клеток на мл ткани и 50 мкМ для агентов, усиливающих доставку, регуляторных агентов, иммуносупрессоров и антибиотиков.

Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы и фармацевтические композиции для улучшения клеточных терапий, используемых для регенерации нервной ткани, которая поражена или претерпевает дегенерацию в результате какого-либо заболевания или расстройства ЦНС, т.е. утрату или гибель клеток ЦНС. Расстройства ЦНС, которые находятся в объеме настоящего изобретения, включают, например повреждение головы, повреждение спинного мозга, инсульт и ишемию. Расстройства ЦНС в объеме настоящего изобретения также включают нейродегенеративные заболевания, такие как заболевания и состояния головного мозга, которые включают ишемию, т.е. ишемию головного мозга, ишемию, инсульт, нейродегенерацию, неврологические осложнения, возникающие в результате заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Вильсона, деменция с тельцами Леви, рассеянный склероз, мозжечковая атаксия, прогрессирующий супрануклеарный паралич, боковой амиотрофический склероз, аффективные расстройства, тревожные расстройства, аутизм и/или шизофрения; повреждения клеток; нервные поражения в результате цереброваскулярного расстройства, такого как инсульт головного мозга или спинного мозга, в результате инфекций ЦНС, включающих менингит и HIV (вирус иммунодефицита человека), в результате опухолей головного мозга и спинного мозга, прионовые заболевания, и расстройства ЦНС, возникающие в результате обычного старения (например, аносмия), повреждения головного мозга, повреждения спинного мозга и/или метаболических расстройств, поражающих ЦНС, но не ограничивающиеся ими.

Соответственно, воплощения по настоящему изобретению применяют для усиления регенерации или восстановления пораженной нервной ткани у животного, претерпевающего нервную регенерацию, т.е. клеточную стратегию, которая включает интраназальное применение через верхнюю треть носовой полости субъекта-животного, посредством чего обходят гематоэнцефалический барьер, по меньшей мере одной терапевтической клеткой в ЦНС млекопитающего для лечения неврологического заболевания или расстройства ЦНС, включая ишемию и/или утрату, или гибель клеток ЦНС.

Нервные регенеративные стратегии, включающие трансплантацию донорных клеток в ЦНС хозяина, известны в области техники. Тем не менее обход гематоэнцефалического барьера терапевтическими клетками, таким образом обеспечивающий транспорт таких клеток непосредственно в пораженную или дегенерирующую ЦНС субъекта-хозяина путем интраназального нанесения в верхней трети носовой полости, не известен. Транспортировке терапевтической клетки может способствовать по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, жизнеспособности может способствовать по меньшей мере один иммуносупрессорный агент, и/или развитие регулируется по меньшей мере одним регуляторным агентом, тогда как пациент может быть защищен от преодоления гематоэнцефалического барьера бактериями со слизистой оболочки путем применения по меньшей мере одного антибиотика, каждый из которых может быть введен при помощи способа по настоящему изобретению и, как будет дополнительно обсуждаться ниже, некоторые из компонентов терапевтического способа могут быть введены системно и/или интраназально.

Транспортный путь для обхода гематоэнцефалического барьера

Обонятельный нерв

Различные способы по настоящему изобретению включают введение терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению в ткань, иннервируемую обонятельным нервом, и которая располагается в верхней трети носовой полости. Терапевтические клетки и/или фармацевтическая(ие) композиция(и) по настоящему изобретению могут быть доставлены в обонятельную область путем нанесения в верхнюю треть носовой полости.

Волокна обонятельного нерва представляют собой немиелинизированные аксоны клеток обонятельного рецептора, которые располагаются в верхней трети слизистой оболочки носа. Клетки обонятельного рецептора представляют собой биполярные нейроны с набуханиями, покрытыми волосоподобными ресничками, которые выступают в носовую полость. На другом конце аксоны этих клеток собираются в агрегаты и проникают в полость черепа со стороны свода носа. Окруженные тонкой трубочкой мозговой оболочки обонятельные нервы пересекают субарахноидальное пространство, содержащее CSF (цереброспинальную жидкость), и проникают в нижние области обонятельных луковиц. После нанесения терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению в верхней трети носовой полости терапевтические клетки и/или фармацевтическая(ие) композиция(и) по настоящему изобретению могут подвергаться транспортировке через слизистую оболочку носа и в обонятельную луковицу и другие области ЦНС, такие как переднее обонятельное ядро, лобная кора, гиппокампальная формация, миндалевидные тела, базальное ядро Мейнерта, гиппокамп, средний мозг, мозжечок, шейный отдел спинного мозга позвоночника и т.п.

Нейрональный транспорт

Воплощения способа по настоящему изобретению включают введение терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению субъекту путем нанесения в верхнюю треть носовой полости субъекта млекопитающего. Нанесение терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению таким образом обеспечивает то, что терапевтические клетки и/или фармацевтическая(ие) композиция(и) транспортируются в ЦНС, головной мозг и/или спинной мозг вдоль нервного пути при уменьшении системных потерь и системного воздействия. Нервный путь включает транспорт внутри или вдоль нейрона, через или при помощи лимфатического тока с нейроном, через или при помощи периваскулярного пространства кровеносного сосуда, преодолеваемого с нейроном, или нервного пути через или благодаря адвентициальной оболочке кровеносного сосуда, преодолеваемой с нейроном, или нервного пути, или через гемангиолимфатическую систему.

Настоящее изобретение включает транспорт терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) скорее при помощи нервного пути, чем через систему кровообращения таким образом, что регуляторный агенты, которые не способы или лишь плохо проникают через гематоэнцефалический барьер из кровотока в головной мозг, могут быть доставлены в лимфатическую систему, ЦНС, головной мозг и/или спинной мозг. Терапевтические клетки и/или фармацевтическая(ие) композиция(и) по настоящему изобретению, находясь по другую сторону гематоэнцефалического барьера и в ЦНС, затем могут доставляться в различные области головного мозга или спинного мозга через лимфатический каналы, через периваскулярное пространство или транспорт через или вдоль нейронов. В одном из воплощений терапевтические клетки мигрируют в область поражения и/или дегенерации в ЦНС.

Использование нервного пути для транспорта регуляторного агента в головной мозг, спинной мозг или другие компоненты центральной нервной системы позволяет преодолевать препятствие, создаваемое гематоэнцефалическим барьером, таким образом, что лекарственные средства, т.е. терапевтические клетки и/или фармацевтические композиции по настоящему изобретению, которые в норме не могут проникать через барьер, могут быть доставлены непосредственно в ЦНС, например в головной мозг и спинной мозг. Дополнительно, настоящее изобретение может обеспечивать доставку более концентрированного уровня терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению в нервную клетку, поскольку терапевтические клетки и/или фармацевтическая(ие) композиция(и) по настоящему изобретению не разбавляются жидкостями, присутствующими в кровотоке. В самом изобретении предложен улучшенный способ доставки терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению в ЦНС, включающую головной мозг и/или спинной мозг.

Обонятельный нервный путь

Одно из воплощений способа по настоящему изобретению включает доставку регуляторного агента субъекту таким образом, что регуляторный агент транспортируется в ЦНС, например головной мозг и/или спинной мозг вдоль обонятельного нервного пути. Типично, такое воплощение включает введение регуляторного агента в ткань, иннервируемую обонятельным нервом, и внутрь носовой полости. Обонятельный нервный путь иннервирует, прежде всего, обонятельный эпителий в верхней трети носовой полости, как описано выше. Нанесение регуляторного агента на ткань, иннервируемую обонятельным нервом, может доставлять регуляторный агент в поврежденные нейроны или клетки ЦНС, головной мозг и/или спинной мозг. Обонятельные нейроны иннервируют эту ткань и могут обеспечивать прямую связь с ЦНС, головным мозгом и/или спинным мозгом благодаря, как полагают, их роли в обонянии.

В доставке через обонятельный нервный путь может использоваться лимфатическая система, которая проникает с обонятельным нервом в различные области головного мозга и оттуда в дуральную лимфатическую систему, ассоциированную с областями ЦНС, такими как спинной мозг. Транспорт вдоль обонятельного нерва может также доставлять регуляторные агенты в обонятельную луковицу. Периваскулярный путь и/или гемангиолимфатический путь, такой как лимфатические каналы, распространяющиеся с адвентициальными оболочками кровеносных сосудов головного мозга, могут обеспечивать дополнительный механизм для транспорта терапевтических регуляторных агентов в головной мозг и спинной мозг из ткани, иннервируемой обонятельным нервом.

Терапевтические клетки и/или их фармацевтические композиции могут быть введены в обонятельный нерв, например, через обонятельный эпителий, располагающийся в верхней трети носовой полости. В таком введении может использоваться внеклеточный или внутриклеточный (например, транснейрональный) антероградный и ретроградный транспорт регуляторного агента, проникающего через обонятельные нервы в головной мозг и его оболочки, в ствол головного мозга или в спинной мозг. После того, как терапевтические клетки и/или их фармацевтические композиции распределяются в или по ткани, иннервируемой обонятельным нервом, терапевтические клетки и/или их фармацевтическая композиция, и/или их компоненты могут транспортироваться через ткань и перемещаться вдоль обонятельных нейронов в области ЦНС, включая ствол головного мозга, мозжечок, спинной мозг, цереброспинальную жидкость, обонятельную луковицу и корковые и подкорковые структуры.

Гематоэнцефалический барьер обходят в настоящем изобретении путем нанесения терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й), содержащей(их) терапевтические клетки, в верхней трети носовой полости. Терапевтические клетки и/или фармацевтическая композиция по изобретению проникают из слизистой оболочки носа через отверстия в решетчатой пластинке решетчатой кости вдоль обонятельного нервного пути и в ЦНС. Смотри пример 1 ниже, в котором приведено экспериментальное свидетельство того, что гематоэнцефалический барьер обходят предполагаемым образом.

Таким образом, введение в носовую полость с использованием нервного пути доставляет терапевтические клетки, включая эукариотические клетки и стволовые клетки, но не ограничивающиеся ими, и/или фармацевтическую композицию, содержащую терапевтические клетки по настоящему изобретению, в лимфатическую систему, ствол головного мозга, мозжечок, спинной мозг и корковые и подкорковые структуры. Терапевтические клетки и/или фармацевтическая композиция по настоящему изобретению сами могут облегчать это проникновение в ЦНС, т.е. головной мозг и/или спинной мозг. Альтернативно, носитель и/или агент(ы), улучшающий(е) доставку, могут способствовать транспорту терапевтических клеток и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в и вдоль нервного пути. Таким образом, введение терапевтических клеток и/или фармацевтической композиции по настоящему изобретению в верхнюю треть носовой полости позволяет обойти гематоэнцефалический барьер при помощи транспортной системы из слизистой оболочки носа и/или эпителия в ЦНС, т.е. головной мозг и спинной мозг.

В различных воплощениях изобретения вводят терапевтические клетки и/или фармацевтическую(ие) композиция(и) по настоящему изобретению в ткань, иннервируемую обонятельными нервами. Такие нервные системы могут обеспечивать прямую связь между окружающей средой и головным мозгом, таким образом обеспечивая благоприятную доставку регуляторного агента в ЦНС, включая головной мозг, ствол головного мозга и/или спинной мозг. Терапевтические клетки и/или фармацевтическая(ие) композиция(и) по настоящему изобретению не способны проникать или не эффективно проникают через гематоэнцефалический барьер из кровотока в головной мозг. Таким образом, способы по настоящему изобретению дают возможность для доставки терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по изобретению скорее при помощи обонятельного нерва, чем через систему кровообращения. Этот способ введения дает возможность для эффективной доставки терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению в ЦНС, головной мозг или спинной мозг без системной потери или системного воздействия.

Иммуносупрессор(ы) и/или антибиотик(и) могут быть доставлены в соответствии с различными воплощениями настоящего изобретения системно или в верхнюю треть носовой полости самостоятельно или в фармацевтической комбинации, содержащей терапевтическую(ие) клетку(и).

Альтернативные пути

Альтернативные пути относительно обонятельного нервного пути, обсуждающегося выше, включают пути вдоль других нервов, которые иннервируют носовую полость, например путь тройничного нерва, хорошо известный специалистам в данной области техники.

Терапевтические клетки

Терапевтическая(ие) клетка(и) по настоящему изобретению может(гут) происходить из любой фетальной ткани или ткани взрослого млекопитающего, включая костный мозг, или нервной ткани, включая ткань гиппокампа, обонятельный эпителий, обонятельную луковицу, подкорковую зону, мозжечок, спинной мозг, кору (т.е. моторную или соматосенсорные зоны коры), полосатое тело, базальные отделы переднего мозга (холинергические нейроны), вентральный отдел среднего мозга (клетки черной субстанции), и голубое пятно (нейроадреналиновые клетки центральной нервной системы). Кроме того, терапевтическая(ие) клетка(и) может(гут) включать нервную и/или мультипотентную стволовую клетку, нервную клетку-предшественника, генетически сконструированные клетки, t-клетки и/или аутологические клетки, но не ограничиваются ими.

Развивающаяся центральная нервная система и центральная нервная система взрослого животного содержит популяцию нервных стволовых клеток и клеток-предшественников, которые представляют особенный интерес для настоящего изобретения в качестве терапевтических клеток. Способы выделения и трансплантации различных нервных клеток-предшественников, происходящих из различных тканей на различных стадиях развития, известны в области техники и включают, например, кору полосатого тела (Winkler et al. (1998) Mol. Cell. Neurosci. 11:99-116; Hammang et al. (1997) Exp.Neurol. 147:84-95); кору (Brustle et al. (1998) Nat. Biotechnol 16:1040-1044 и Sabate et al. (1995) Nat. Genet 9:256-260); конечный мозг человека (Flax et al. (1998) Nature 392:18-24 и Vescovi et al. (1999) Neuron 11:951-966); гиппокамп (Gage et al. (1995) J.Neurobiol. 36:249-266 и Suhonen et al. (1996) Nature 383:624-627); базальный отдел переднего мозга (Minger et al. (1996) Exp.Neurol. 141:12-24); вентральный отдел среднего мозга (Winkler et al. (1998) Mol.Cell.Neurosci. 11:99-116; Svendsen et al. (1996) Exp.Neurol. 137:376-388; Hammang et al. (1997) Exp.Neurol. 147:84-95; Studer et al. (1997) Nat.Neurosci. 1:290-295; Milward et al. (1997) J.Neurosci. Res. 50:862-871); и субвентрикулярную зону (Milward et al. (1997) Milward et al. (1997) J.Neurosci, Res. 50:862-871). Каждый из этих источников включен сюда путем ссылки. Дополнительно, способы выделения потомства нервных стволовых клеток и способ, способствующий их дифференцировке, также можно найти в патенте США №6071889 и патенте США №6103530, оба из которых включены сюда путем ссылки.

Терапевтические клетки по настоящему изобретению также могут иметь паранервное происхождение. Предпочтительный пример такой клетки представляет собой адренальную мозговую хромаффинную клетку. Смотри, например, Bjorklund et al. (1985) Neural Grafting in the Mammalian CMS (Amsterdam: Elsevier), pp.3-11, и Lindvall et al. (1997) Ann. Neurol 22:457-468, которые демонстрируют полезность хромаффинных клеток для лечения болезни Паркинсона.

Терапевтические клетки по настоящему изобретению, которые имеют происхождение, отличное от нервного, но которые изменены таким образом, что продуцируют вещество, представляющее неврологический интерес, также входят в объем изобретения. Предпочтительный тип клеток представляет собой человеческий фибробласт крайней плоти, который легко получить и вырастить (смотри, например, патент США №6060048). Такие клетки предпочтительно генетически изменены с использованием способов, известных в области техники, для экспрессии нейрональных ростовых факторов, нейромедиаторов, нейропептидов или ферментов, вовлеченных в метаболизм в головном мозге. Смотри, например Gage et al. (1987) Neurosci. 23:795-807; Rosenberg et al. (1988) Science 242:1575-1578; Shimohama et al. (1989) Mol.Brain Res. 5:271-278; которые включены сюда путем ссылки. Альтернативно, терапевтические клетки, происходящие не из нейронов, такие как эпидермальные клетки, могут быть превращены или трансдифференцированы в различные типы нейрональных клеток. Смотри, например, патент США №6087168.

Терапевтическая(ие) клетка(и) по настоящему изобретению может(гут) быть генетически изменена(ы) перед трансплантацией хозяину. Используемый здесь термин "генетически изменены" относится к клетке, в которую введена чужеродная нуклеиновая кислота, например ДНК. Чужеродная нуклеиновая кислота может быть введена при помощи различных способов, включающих опосредованную фосфатом кальция трансфекцию, опосредованную DEAE (диэтиламиноэтил) трансфекцию, микроинъекцию, вирусную трансформацию, слияние протопласта и липофекцию, но не ограничивающихся ими. Генетически измененная клетка может экспрессировать чужеродную нуклеиновую кислоту кратковременно или длительное время. В общем, временная экспрессия происходит тогда, когда чужеродная ДНК не встраивается стабильно в хромосомальную ДНК трансфицированной клетки. Наоборот, длительная экспрессия чужеродной ДНК происходит тогда, когда чужеродная ДНК стабильно интегрируется в хромосомальную ДНК трансфицированной клетки.

Такие интересующие гены включают ферменты, синтезирующие нейромедиатор (т.е. тирозингидролаза (ТН) и холинацетилтрансфераза). Такие способы общеизвестны в области техники. Например, выделяют терапевтические донорные клетки из различных областей головного мозга и на различных стадиях развития и иммортализуют путем генетического изменения. Например, обонятельные и мозжечковые клетки иммортализуют с использованием вирусного онкогена myc (v-myc) с получением клеточных линий, имеющих нейрональный и глиальный фенотипы (Ryder et al. (1990) J.Neurobiol. 21:356). Аналогичные исследования, проведенные Snyder et al. ((1992) Cell 68:33), привели в результате к мультипотентным нейрональным клеточным линиям, которые пересаживают в крысиный мозжечок с образованием нейронов и глиальных клеток. В других исследованиях мышиные нейроэпителиальные клетки иммортализовали ретровирусным вектором, содржащим с-myс, и выращивали с ростовыми факторами с образованием дифференцированных клеточных типов, аналогичных астроцитам и нейронам (Barlett et al. (1988) Proc.Natl.Acad. Sci. USA 85:3255).

Кроме того, интраназально доставленные терапевтические генетически-сконструированные клетки по настоящему изобретению могут содержать биологические факторы, которые могут проникать в ЦНС и высвобождать вещества, содержание которых мало или которые отсутствуют в ЦНС пациентов. Например при заболеваниях, сопровождающихся накоплением липидов, и врожденных метаболических расстройствах, таких как фенилкетонурия (PKU), болезнь Вильсона, Тея-Сакса, лизосомные болезни накопления или болезнь Ниманна-Пика, может происходить утрата фермента в головном мозге с момента рождения. Терапевтические клетки по настоящему изобретению могут содержать этот специфический подвергающийся утрате фермент. Такие генетически-сконструированные терапевтические клетки затем могут быть доставлены в верхнюю треть носовой полости, где клетки обходят гематоэнцефалический барьер и проникают в головной мозг, неся утраченную метаболическую функцию. В общем, генетически-сконструированные терапевтические клетки по настоящему изобретению могут действовать в качестве мини-биологических фабрик, которые продуцируют и высвобождают один или более чем один из следующих: фермент, ростовой фактор, противовоспалительный агент, нейромедиатор, нейромодулятор, антиоксидант и т.д, которые могут приносить пользу субъекту, нуждающемуся в ней.

Альтернативно, терапевтические генетически-сконструированные клетки по настоящему изобретению могут содержать генетически-сконструированные высвобождающие гормон гонадотропин секретирующие клетки для увеличения фертильности у субъектов, нуждающихся в таком увеличении.

Агенты, улучшающие доставку

Некоторые соединения, т.е. агенты, улучшающие доставку, могут быть использованы в соответствии с настоящим изобретением для того, чтобы способствовать доставке терапевтических клеток в центральную нервную систему и ее пораженные области. Предпочтительный агент, улучшающий доставку, содержит гиалуронидазу, которая, как обнаружено, весьма значительно увеличивает доставку терапевтических клеток в ЦНС, при нанесении в верхней трети носовой полости либо в качестве предварительной обработки, вводимой в эффективном количестве перед нанесением терапевтических клеток по настоящему изобретению, либо в виде компонента фармацевтической композиции, содержащей терапевтические клетки по настоящему изобретению, или в виде соединения, вводимого отдельно интраназально в верхнюю треть носовой полости по существу одновременно с терапевтическими клетками и/или фармацевтической композицией. Полагают, что гиалуронидаза действует на гиалуроновую кислоту во внеклеточном матриксе для улучшения доставки терапевтических клеток и/или фармацевтических композиций, содержащих терапевтические клетки, в ЦНС. Пример 2 ниже иллюстрирует увеличение эффективности при помощи такого агента, усиливающего доставку, в отношении доставки терапевтических клеток в ЦНС.

Альтернативные агенты, улучшающие доставку, содержат нейрегулин, активный агент, индуцирующий миграцию, и фактор, ингибирующий лейкемию. Эти агенты, усиливающие доставку, например гиалуронидаза, липофильные агенты, нейрегулин, активный агент, индуцирующий миграцию, и фактор, ингибирующий лейкемию, могут быть использованы индивидуально или в любой комбинации для улучшения доставки терапевтических клеток в ЦНС в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, может быть использован в качестве предварительной обработки для транспортирования терапевтических клеток и/или фармацевтической композиции, и/или в виде компонента фармацевтической композиции, содержащей терапевтические клетки.

Альтернативные агенты, улучшающие доставку, которые дополнительно улучшают доставку терапевтических клеток и/или фармацевтической композиции, содержащей терапевтические клетки по настоящему изобретению, через слизистую оболочку, содержат ингибитор фермента, в частности ингибиторы протеазы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Ингибиторы протеазы могут включать антипаин, арфаменин А и В, бензамидина HCl, AEBSF, СА-074, кальпаиновый ингибитор I и II, кальпептин, пепстатин А, актинонин, амастатин, бестатин, боролейцин, каптоприл, хлорацетил-НOLеu-Аlа-Gly-NН2, DAPT, дипротин А и В, эбелактон А и В, фороксимитин, лейпептин, пепстатин А, фосфорамидон, апротинин, пуромицин, ВВ1, ингибитор трипсина сои, фенилметилсульфонилфторид, Е-64, химостатин, 1,10-фенантролин, EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота) и EGTA (этиленгликольтетрауксусная кислота), но ограничены ими.

Еще дополнительные альтернативные агенты, улучшающие доставку, могут включать поверхностно-активные вещества, соли желчных кислот, дигидрофузидаты, биоадгезивные агенты, фосфолипидные добавки, смешанные мицеллы, липосомы или носители, спирты, энамины, катионные полимеры, NO донорные соединения, длинноцепочечные амфипатические молекулы, небольшие гидрофобные усилители проницаемости; натриевые производные или производные салициловой кислоты, сложные эфиры глицерина и ацетоуксусной кислоты, циклодекстриновые или бета-циклодекстриновые производные, жирные кислоты со средней длинной цепи, хелатообразующие агенты, аминокислоты или их соли, N-ацетиламинокислоты или их соли, муколитические агенты, ферменты, направленные на выбранный мембранный компонент, ингибиторы синтеза жирных кислот и ингибиторы синтеза холестерина, но не ограничиваются ими. В настоящем изобретении рассматривается применение одного или более чем одного, т.е. по меньшей мере одного из вышеприведенных агентов, усиливающих доставку, самостоятельно или в комбинации с терапевтическими клетками в качестве фармацевтического соединения в эффективном количестве.

Регуляторные агенты

Некоторые регуляторные агенты для регуляции, среди прочего, роста и дифференцировки доставляемых терапевтических клеток в ЦНС находятся в объеме настоящего изобретения и включают, например, эффективное количество регуляторных агентов, которые способствуют выживанию донорных клеток путем модуляции иммунного и воспалительного ответа. Такие регуляторные агенты включают, например, циклоспорин и различные другие иммуномодуляторы, включая интерлейкины (т.е. IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10); факторы некроза опухоли (т.е. TNF-альфа и TNF-бета); и, интерфероны (т.е. IFN-альфа, IFN-бета, IFN-гамма, IFN-омега и IFN-тау); и любые их биологически активные варианты. Дополнительную подробную информацию, относящуюся к введению этих иммуномодулирующих агентов при помощи способов по настоящему изобретению, можно найти в патенте США №09/733168, озаглавленном "Methods for Administering a Cytokine to the Central Nervous System and the Lymphatic System," поданном 9 декабря 2000 года, включенном здесь путем ссылки.

Дополнительные регуляторные агенты, которые могут применяться в способах по изобретению, включают САР23, главный кортикальный ассоциированный с цитоскелетом и связывающий кальмодулин белок, и GAP43, белок, ассоциированный с ростом нервов. Смотри, например, Frey et al. (2000) J.Cell.Biol. 7:1443-1453. Дополнительные интересующие агенты включают остеогенный белок-1 (ОР-1), который представляет собой морфогенный белок, который стимулирует рост, дифференцировку и поддерживает дифференцировку (патент США №6153583); sonic hedgehog, полипептид, который, как показано, способствует выживанию дофаминергических нейронов (Miao et al. (1996) Cell Transplant 55:2-17); различные другие глиальные ростовые факторы (патенты США №5716930; 6147190; и 5530109); и их любые биологически активные варианты. Все эти ссылки включены сюда путем ссылки.

Другие представляющие интерес и входящие в объем настоящего изобретения регуляторные агенты содержат ростовые факторы. При использовании здесь "ростовой фактор" относится к полипептиду, способному регулировать развитие трансплантированной донорной клетки. Ростовые факторы, полезные в способах по настоящему изобретению, включают члены нейротрофинового семейства (т.е. фактор роста нервов (NGF), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF), нейтротрофин-3 (NT-3) и нейротрофин-4 (NT-4, также известный как NT-4/5 или NT-5); фактор роста фибробластов (FGF, т.е. основной фактор роста фибробластов); семейство эпидермальных факторов роста (т.е. EGF, TGF-альфа, амфирегулин, связывающий гепарин EGF-подобный ростовой фактор (HB-EGF), батацеллуин (ВТС) и нейрегулиновая группа); тромбоцитарный фактор роста; инсулин; инсулиноподобные факторы роста (т.е. IGF-I и IGF-2); цилиарный нейротрофический фактор (CNTF), семейство нейротрофических факторов, производных линии глиальных клеток (GDNF) (т.е. GDNF и нейртурин (NTN), персефин (PSP), и артемин (ART)); трансформирующий ростовой фактор бета, суперсемейство (т.е. подсемейства включают TGF бета 1, TGF бета 2, TGF бета 3, TGF бета 4, TGF бета 5, активин, ингибин, decapentaplegic); факторы роста и дифференцировки (GDF) (т.е. GDF1, GDF2, GDF3, GDF5, GDF6, GDF7, GDF8, GDF9, GDF9B, GDF10, GDF11 и GDF15); глиальный нексин; зависимый от активности нейротрофический фактор (ADNF); глиальный ростовой фактор (GGF); и т.п, но не ограничиваются ими. Дополнительно полагают, что любой биологически активный вариант этих факторов роста также полезен в способах по настоящему изобретению.

Регуляторный агент по настоящему изобретению может быть получен из любых видов животных, включая грызунов, птиц, собак, коров, свиней, лошадей и предпочтительно человека, но не ограничивающихся ими. Предпочтительно регуляторный вводимый агент происходит из того же вида, что и животное, которое подвергается лечению.

Биологически активные варианты регуляторных полипептидов (т.е. ростовые факторы, такие как IGF-I, NGF и основные FGF, цитокины и т.д.) также охвачены различными способами и фармацевтическими композициями по настоящему изобретению. Такие варианты должны сохранять биологическую активность регуляторного агента, в частности способность регулировать развитие донорных клеток (т.е. способствовать выживанию, поддержанию желаемого фенотипа и/или регуляции факторов развития, продуцируемых донорной клеткой). Например, когда регуляторный полипептид представляет собой ростовой фактор, такой как IGF-I, NGF-I или член семейства FGF, тогда способность связываться с их соответствующими рецепторными сайтами будет поддерживаться. Такая активность связывания с рецептором может быть измерена с использованием стандартных биоанализов.

Один из таких регуляторных агентов, фактор роста, который полезен в настоящем изобретении, представляет собой IGF-I. Использованный здесь термин "IGF-I" относится к инсулиноподобному фактору роста I (IGF-I), представляющему собой одноцепочечный пептид, имеющий 70 аминокислот, и молекулярную массу приблизительно 7600 дальтон. Инсулиноподобный фактор роста I стимулирует митоз и ростовые процессы, ассоциирующиеся с клеточным развитием. Аминокислотная и нуклеотидная последовательность IGF-I известна в области техники. Смотри, например патент США №5324639, в котором раскрыта последовательность человеческого IGF-I; Genbank Accession No. Х15726, в котором раскрыта последовательность бычьего IGF-I; и Genbank Accession No. X06043, в котором раскрыта последовательность крысиного IGF-I. Каждый из этих источников включен сюда путем ссылки.

В еще одном воплощении настоящего изобретения регуляторный агент может содержать член семейства факторов роста FGF и/или их биологически активные варианты. Семейство факторов роста фибробластов охватывает группу структурно родственных белков, которые связываются с гепарином с высокой аффиностью. Семейство членов FGF обладает митогенной активностью и индуцирует пролиферацию широкого разнообразия типов клеток. Семейство членов FGF также участвует в ангиогенезе, дифференцировке, миграции клеток, эмбриональном развитии и нейрональном поддержании/выживании. Использованный здесь термин "FGF" относится к члену семейства факторов роста фибробластов, включающему, например FGF-1 (кислый FGF), FGF-2 (основный FGF), FGF-3, FGF-4, FGF-5, FGF-6, FGF-8, FGF-9, FGF-98, или биологически активный фрагмент,или его вариант. Аминокислотная последовательность и способы получения множества членов семейства FGF хорошо известны в области техники.

В еще одном воплощении настоящего изобретения регуляторный агент может представлять собой фактор роста нервов (NGF) или его биологически активный вариант. NGF был первоначально выделен в виде комплекса, имеющего молекулярную массу 130 кДа и коэффициент осаждения 7S. Этот комплекс 7S включает три типа субъединиц, причем субъединица "бета" несет все биологические активности NGF. Фактор роста нервов стимулирует митоз и ростовые процессы в клетках, в частности в нервных клетках, и регулирует развитие (т.е. влияет на восстановление, выживание и дифференцировку). Предпочтительная аминокислотная последовательность для человеческого пре-про-NGF и человеческого зрелого NGF предложены в патенте США №5288622, который включен сюда путем ссылки.

NGF, использованный в настоящем изобретении, может находиться в своей по существу очищенной, нативной, рекомбинантно продуцированной форме или в химически синтезированной форме. Например, NGF может быть выделен непосредственно из клеток, естественным образом экспрессирующих NGF. NGF также может быть продуцирован рекомбинантно в эукариотических или прокариотических клеточных системах экспрессии, как описано в Edwards et al. (1988) Mol.Cell.Biol. 8:2456; патенте США №5986070; и патенте США №6005081; все из которых включены здесь путем ссылки. Альтернативно, регуляторный агент по настоящему изобретению может содержать эритропоэтин (ЕРО), нейротрофический фактор головного мозга (BDNF) и эпидермальный ростовой фактор (EGF). Каждый из описанных здесь регуляторных агентов играет критическую роль в выживании и дифференцировке in vivo терапевтических клеток в соответствии со способами по настоящему изобретению и фармацевтическими композициями.

Введение эффективного количества по меньшей мере одного регуляторного агента при помощи способов по настоящему изобретению, т.е. интраназально в верхнюю треть носовой полости, самостоятельно и/или в комбинации с терапевтическими клетками регулирует развитие терапевтических клеток, транспортированных в ЦНС. Здесь предполагается, что фраза "регулирует развитие" среди прочего означает, что регуляторный агент усиливает выживание, дифференцировку, аксональное развитие, дендритное развитие и/или пролиферацию транспортированных терапевтических клеток; улучшает адгезию транспортированных терапевтических клеток к окружающим тканям (т.е. включение в паренхимальную ткань); улучшает способность транспортируемых терапевтических клеток устанавливать синаптическую связь с нейронами хозяина (т.е. усиливает образование нервного волокна в донорных клетках; увеличивает дистанции разрастания нервного волокна донорными клетками; или улучшает судьбу нервного волокна из донорных клеток); и/или предписывает транспортируемой терапевтической клетке превращение в специфическую нервную линию (т.е. принимать метаболический путь нейрональных (ГАМК-эргических нейронов, дофаминергических нейронов, холинергических нейронов, гиппокампальных нейронов и т.п.), астроцитарных или олигодендритных клеток). Дополнительно полагают, что регуляторный агент может усиливать выживание трансплантированной донорной клетки путем модуляции иммунного ответа у субъекта. Под "модуляцией" подразумевают понижающую регуляцию иммунного или воспалительного ответа (т.е. влияние на системную иммунную функцию, презентацию антигена, продукцию цитокина, пролиферацию лимфоцитов, и проникновение лимфоцитов и макрофагов в ЦНС).

Кроме того, известно, что введение регуляторного агента "регулирует развитие" инвазивно трансплантируемой донорной клетки путем влияния на факторы развития, высвобождаемые трансплантированными донорными клетками (т.е. способствует высвобождению донорной клеткой нейромедиаторов,таких как дофамин, ацетилхолин, ГАМК или других нейропротективных факторов). Сама функция и восстановление (т.е. усиленное образование нервного волокна, дистанции разрастания нервного волокна и/или плотность нервного волокна) окружающей ткани хозяина может быть усилено при помощи неинвазивных способов по настоящему изобретению.

Доставка эффективного количества одного или более чем одного, т.е. по меньшей мере одного регуляторного агента в ЦНС млекопитающего, может быть осуществлена путем введения фармацевтической композиции, содержащей терапевтически эффективную дозу этого агента. Альтернативно, эффективное количество по меньшей мере одного регуляторного агента может быть доставлено интраназально в верхнюю треть носовой полости и/или системно в качестве предварительной обработки, одновременной обработки и/или обработки после нанесения фармацевтической композиции и/или терапевтической(их) клетки(ок) по настоящему изобретению. Под "эффективным количеством" среди прочего понимают концентрацию регуляторного агента, которая достаточна для достижения желаемого терапевтического действия в отношении регуляции развития донорной клети, как здесь описано. Соответственно, эффективное количество регуляторного агента усиливает клинический исход клеточно-заместительной терапии по сравнению с животными, которых лечат только при помощи стратегии клеточного замещения. Сама терапевтически эффективная доза может быть оценена по уменьшению нервных дефицитов, ассоциированных с расстройством ЦНС, которое лечат, и следовательно, характеризуется улучшением клинических симптомов.

Способы для количественной оценки степени неврологических поражений и для определения того, какое расстройство ЦНС лечат, хорошо известны специалистам в данной области техники. Такие способы включают гистологические способы, анализы молекулярных маркеров и функциональный/поведенческий анализ, но не ограничиваются ими. Например, улучшенная функциональная интеграция донорных клеток и/или усиленная функция и восстановление окружающей нейрональной ткани могут быть оценены путем измерения восстановления различных функций, включающих когнитивную, сенсорную, двигательную и эндокринную. Двигательные тесты включают тесты, которые количественно оценивают вращательное движение от стороны головного мозга, подвергшейся дегенерации, и тесты, в которых измеряется баланс, координация, замедление движения, ригидность и тремор. Когнитивные тесты включают тесты памяти и пространственное обучение. Специфические анализы, используемые для определения лечения неврологического заболевания, варьируют в зависимости от расстройства.

Желаемые биологические активности, благоприятные для регуляции развития транспортируемых терапевтических клеток, включают, например, увеличение выживаемости и/или пролиферации транспортируемых терапевтических клеток; улучшение способности транспортируемых терапевтических клеток устанавливать синаптическую связь с нейронами хозяина; и/или предписывание транспортируемой терапевтической клетке превращение в специфическую нервную линию. Способы анализа таких явлений хорошо известны в области техники. Например, улучшение выживания транспортируемых терапевтических клеток после введения регуляторного агента может быть проанализировано с использованием различных неинвазивных сканов, таких как компьютерная осевая томография (CAT скан или СТ скан), ядерный магнитный резонанс или магнитно-резонансная визуализация (NMR или MRS) или сканирование при помощи позитронно-эмиссионной томографии (PET). Альтернативно, выживание транспортируемой терапевтической клетки может быть оценено после смерти при помощи микроскопического исследования области трансплантции терапевтических клеток. Область транспортируемых терапевтических клеток может быть идентифицирована, например, путем анализа молекулярных маркеров, специфических в отношении транспортируемых терапевтических клеток или альтернативно, путем предшествующего включения визуализирующих красителей. Такие красители включают, например, микросферы, меченые родамином или флуоресцеином, быстрый голубой или вводимые с ретровирусом гистохимические маркеры.

Эффективное количество зависит от множества факторов, включая, например, расстройство ЦНС, которое лечат, тип донорной клетки, трансплантируемой в млекопитающее, и реакции субъекта, в отношении которого осуществляется лечение. Дополнительно полагают, что терапевтически эффективное количество зависит от желаемого типа регуляции развития транспортируемых терапевтических клеток (т.е. усиление выживания и/или пролиферации транспортируемых терапевтических клеток; улучшение способности транспортируемых терапевтических клеток образовывать синаптическую связь с нейронами хозяина; регуляция факторов развития, высвобождаемых транспортируемыми терапевтическими клетками; или улучшенная функция и восстановление окружающей нервной ткани). Способы определения эффективности и дозы известны специалистам в данной области техники.

Например, при болезни Паркинсона нейроны, которые дегенерируют, представляют собой дофаминергические нейроны черной субстанции. Клеточно-заместительные стратегии для пациентов, страдающих от развившейся болезни Паркинсона, известны и включают, например, трансплантацию в полосатое тело дофаминергических нейронов черной субстанции из 6-9-недельных человеческих эмбрионов (Olanow et al. (1996) Trends Neurosci. 19:102-109 и Lindvall et al. (1999) Mov. Disord. 14:201-205). Доставка фармакологически активных регуляторных агентов в области головного мозга, пораженного болезнью Паркинсона (т.е. средний мозг и черная субстанция), известна в области техники, однако не в комбинации с интраназальной доставкой терапевтических клеток таким образом, чтобы обеспечить обход гематоэнцефалического барьера.

При использовании здесь "эффективное количество" регуляторного агента в комбинации с транспортируемыми терапевтическими клетками и/или фармацевтическими композициями, содержащими терапевтические клетки по настоящему изобретению, для лечения болезни Паркинсона с использованием способа введения по настоящему изобретению будет достаточным для уменьшения или ослабления клинических симптомов болезни Паркинсона. Само по себе эффективное количество регуляторного агента (т.е. фактора роста), вводимого при помощи способов по настоящему изобретению, усиливает клеточно-заместительные стратегии, осуществляемые в соответствии с настоящим изобретением для лечения болезни Паркинсона. Соответственно, способы по изобретению усиливают выживание и/или улучшают клиническое состояние обрабатываемых животных по сравнению с животными, которых обрабатывают в соответствии только с клеточно-заместительной стратегией. Улучшение клинического состояния при болезни Паркинсона включает, например, улучшение эффективности вентральной мезэнцефалической трансплантации с точки зрения вызванного апоморфином уменьшения вращения, увеличение плотности реиннервации в полосатом теле и усиление выживания нейронов (Tornqvist et al. (2000) Exp.Neurol. 164:130-138).

Болезнь Гентингтона характеризуется прогрессирующей нейродегенерацией, в частности в полосатом теле и коре головного мозга, которая вызывает тяжелые нарушения моторной и когнитивной функций. Существующие в настоящее время клеточно-заместительные терапии заменяют ингибиторные связи из полосатого тела в другие структуры, такие как бледный шар, путем имплантации клеток предшественников полосатого тела. Доставка фармакологически активных регуляторных агентов в области головного мозга, которые поражены болезнью Гентингтона (т.е. скорлупа хвостатого ядра, таламус, промежуточный мозг, мозжечок и кору лобной доли), известна в области техники, хотя никогда в связи с терапевтическими клетками и/или фармацевтическими композициями, содержащими терапевтические клетки по настоящему изобретению, где обходят гематоэнцефалический барьер.

При использовании здесь, "эффективное количество" регуляторного агента для лечения болезни Гентингтона с использованием способа введения по настоящему изобретению достаточно для уменьшения или ослабления клинических симптомов болезни Гентингтона. Таким образом, эффективное количество регуляторного агента (т.е. фактора роста), вводимого при помощи способов по настоящему изобретению, усиливает клеточно-заместительные стратегии, обычно осуществляемые в настоящем изобретении для лечения болезни Гентингтона. Сами способы по изобретению увеличивают выживание и/или улучшают клиническое состояние обрабатываемых животных по сравнению с животными, которых обрабатывают в соответствии только с клеточно-заместительной стратегией. Улучшение клинического состояния включает, например, растормаживание паллидумального выхода (pallidal output), уменьшение локомоторной гиперактивности, восстановление сложного двигательного и когнитивного поведения и восстановление новых систем обучения обычному поведению в пораженном полосатом теле. Смотри, например, Bjorklund et al. (1994) Functional Neural Transplantation (Raven, N.Y.), pp.157-195; Dunnett et al. (1995) Behav. Brain Res. 66:133-142; Kendall et al. (1998) Nat. Med. 4:727-729; Palfi et al. (1998) Nat. Med. 4:963-966; Brasted et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:10524-10529; и Wictorin et al. (1992) Prog. Neurobiol. 38:611-639; все из которых включены сюда путем ссылки. Введение регуляторных агентов при помощи способов по настоящему изобретению достаточно для улучшения клинического исхода клеточно-заместительной терапии. Такие анализы могут быть легко использованы специалистом в данной области техники для определения диапазона доз и/или соответствующего выбираемого регуляторного агента для эффективного лечения болезни Гентингтона.

Ишемическое поражения ЦНС (и возникающая в результате утрата и гибель клеток) могут возникать в результате, например, остановки сердца или закупорки коронарной артерии, или закупорки мозговой артерии, или инсульта. Нервные цепочки в ЦНС, поврежденной после ишемического события, восстанавливают с использованием различных клеточно-заместительных стратегий. Например, при явлениях фокальной ишемии осуществляли имплантацию эмбрионального полосатого тела в пораженное полосатое тело (Hodges et al. (1994) Functional Neural Transplantation (Raven, N.Y.), pp.347-386) и имплантацию нейронов, происходящих из человеческой тератокарциномной клеточной линии (Borlongan et al. (1998) Exp.Neurol. 149:310-321 и Borlongan et al. (1998) Neuroreport 9:3703-3709). Смотри также, например Hodges et al. (1996) Neurosci. 72:959-988, Sorensen et al. (1996) Exp.Neurol. 138:227-235, и Sinden et al. (1997) Neurosci. 81:599-608.

При использовании здесь "эффективное количество" регуляторного агента для лечения ишемического повреждения является достаточным для уменьшения или ослабления клинических симптомов ишемического явления. Само эффективное количество регуляторного агента, вводимого при помощи способов по настоящему изобретению, усиливает клеточно-заместительные стратегии, обычно осуществляемые в соответствии с настоящим изобретением для лечения ишемического повреждения. Улучшение клинического состояния включает, например, уменьшение размера инфаркта, отека и/или неврологических дефицитов (т.е. улучшение восстановления моторной, сенсорной, вестибулярной и/или сомато-сенсорной функции). Улучшения дополнительно охватывают уменьшение нервных дефицитов, и следовательно, улучшение восстановления моторной, сенсорной, вестибулярной и/или соматосенсорной функции.

Способы определения того, осуществляется ли лечение ишемического явления, в особенности в отношении уменьшения ишемического поражения, включающего размер инфаркта, отек и развитие нервных дефицитов, хорошо известны специалистам в данной области техники. Например, после ишемического повреждение происходит значительное увеличение плотности сайтов связывания омега 3 (бензодиазепин периферического типа) (Benazodes et al. (1990) Brain Res. 522:275-289). Способы определения сайтов омега 3 известны и могут быть использованы для определения степени ишемического поражения. Смотри, например, Gotti et al. (1990) Brain Res. 522:290-307 и цитированные в нем ссылки. Альтернативно, ассоциированный с ростом белок-43 (GAP-43) может быть использован в качестве маркера для нового аксонального роста после ишемического явления. Смотри, например, Stroemer et al. (1995) Stroke 26:2135-2144, и Vaudano et al. (1995) J.Neurosci 15:3594-3611. Терапевтическое действие также может быть измерено по улучшению моторных навыков, когнитивной функции, сенсорного восприятия, речи и/или уменьшения предрасположенности к эпилептическому припадку у млекопитающего, претерпевающего лечение. Такие функциональные/поведенческие тесты использовали для оценки сенсорно-моторной и рефлекторной функций, как описано, например, в Bederson et al. (1986) Stroke 17:472-476, DeRyck et al. (1992) Brain Res. 573:44-60, Markgraf et al. (1992) Brain Res. 575:238-246, Alexis et al. (1995) Stroke 26:2338-2346. Усиление нейронального выживания также может быть измерено с использованием скандинавской шкалы инсульта (SSS) или индекса Бартела. Такие анализы могут быть легко использованы специалистом в области техники для определения диапазона доз и/или подходящего регуляторного агента, выбираемого для эффективного лечения ишемического явления.

Для задач регуляции развития терапевтической(их) клетки(ок) по настоящему изобретению после интраназального транспорта в ЦНС с обходом гематоэнцефалического барьера у млекопитающего терапевтически эффективное количество или доза регуляторного агента могут составлять приблизительно от 0,002 мг/кг до приблизительно 2,0 мг/кг массы тела или от приблизительно 0,03 мг/кг до приблизительно 0,6 мг/кг массы тела. Альтернативно, регуляторный агент может быть введен в дозе 0,0004, 0,001, 0,005, 0,007, 0,009, 0,01, 0,04, 0,06, 0,08, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1,0, 1,2, 1,4, 1,6, 1,8 или 2,0 мг/кг массы организма. Дополнительно считают, что меньший диапазон доз некоторых регуляторных агентов (т.е. ADNF) может быть предпочтительным. В этих воплощениях регуляторный агент может быть введен в концентрации от приблизительно 0,1 нг/кг до приблизительно 20 нг/кг. Альтернативно, регуляторный агент может быть введен в концентрации 0,2, 0,4, 0,6, 0,8, 1, 2, 4, 8, 12, 15, 18 и 19 нг/кг массы тела.

Антибиотические агенты

Различные воплощения настоящего изобретения могут дополнительно включать эффективное количество по меньшей мере одного антибиотика или альтернативно можно использовать предварительную обработку по меньшей мере одним антибиотиком, вводимым перед нанесением фармацевтической композиции в верхней трети носовой полости, или любая их комбинация для защиты пациента, подвергающегося терапевтической клеточной терапии. Дополнительно антибиотик(и) может(гут) быть доставлен(ы) в качестве предварительной обработки, одновременной обработки и/или последующей обработки системно и/или путем нанесения в верхней трети носовой полости. Польза от такого антибиотического элемента в настоящем изобретении заключается в уменьшении риска того, что бактерии, обнаруживаемые в носовой полости, могут проникать в носовые ткани в верхней трети носовой полости во время нанесения терапевтической(их) клетки(ок) и/или фармацевтической композиции, проходить гематоэнцефалический барьер и инфицировать другие ткани в ЦНС. Конкретные рассматриваемые ткани включают головной мозг, мозговые оболочки, кровь, спинной мозг и другие периферические ткани, но не ограничиваются ими. Предпочтительное воплощение заключается в предварительной обработке и/или одновременной обработке пациента антибиотиком(ами), когда агент(ы), улучшающий(ие) доставку, например гиалуронидазу, наносят в верхней трети носовой полости.

Примеры антибиотиков для применения в настоящем изобретении включают мупироцин, дефенсин, гентамицин, генетицин, цефминоксим, пенициллин, стрептомицин, ксилит или другой антибиотик, самостоятельно или в комбинации для того, чтобы способствовать защите пациента, которому вводят терапевтическую(ие) клетку(ки) и/или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Применение таких антибиотиков для назальной обработки широко представлено в литературе и легко понятно специалистам в данной области техники, тем не менее не сообщали ни о какой подобной назальной обработке в связи с интраназальным нанесением терапевтических клеток и/или фармацевтических композиций, содержащих терапевтические клетки, в верхней трети носовой полости, благодаря чему осуществляется обход гематоэнцефалического барьера.

Иммуносупрессоры

Альтернативные воплощения настоящего изобретения могут дополнительно содержать эффективное количество по меньшей мере одного иммуносупрессора для улучшения жизнеспособности терапевтической(их) клетки(ок) благодаря защите от воспалительного ответа и/или активации иммунокомпетентных клеток хозяина. Иммуносупрессорный(ые) агент(ы) может(гут) быть доставлен(ы) в качестве предварительной обработки, одновременно с терапевтической(ими) клеткой(ами) и/или фармацевтической композицией, и/или последующей обработки терапевтической(их) клетки(ок) и/или фармацевтической композиции. Такая иммуносупрессорная терапия в комбинации с терапевтической(ими) клеткой(ами) и/или фармацевтической композицией, наносимой в верхней трети носовой полости, улучшает выживание таких клеток.

Когда иммунокомпетентные клетки хозяина в ЦНС, слизистой оболочке носа и нервном пути между слизистой оболочкой носа и ЦНС обнаруживают нанесенные терапевтические клетки по настоящему изобретению, в результате может формироваться воспалительный ответ и/или происходить активация иммунокомпетентных клеток хозяина. Эти серии событий уменьшают выживание терапевтической(их) клетки(ок). Таким образом, иммуносупрессор(ы) может(гут) быть использован(ы) перед, во время и/или после нанесения терапевтической клетки(ок) в верхней трети носовой полости, играя решающую роль в выживании и жизнеспособности терапевтических клеток. Иммуносупрессор(ы) может(гут) применяться интраназально в верхней трети носовой полости и/или системно. Обычные и хорошо известные иммуносупрессоры, которые могут быть использованы самостоятельно или в комбинации в настоящем изобретении, включают циклоспорин А, такролимус, преднизолон, азатиоприн, метилпреднизолон, микофенилат мофетил и сиролимус. Еще один иммуносупрессор включает применение генетически сконструированных клеток, экспрессирующих лиганд Fas.

Фармацевтическая композиция

Дополнительно к эффективному количеству по меньшей мере одной терапевтической клетки, вводимой в верхнюю треть носовой полости млекопитающего, фармацевтическая композиция может быть нанесена или введена в верхнюю треть носовой полости. Такая фармацевтическая композиция может содержать дополнительно к эффективному количеству по меньшей мере одной терапевтической клетки, например, композиция может содержать по меньшей мере один регуляторный агент, описанный выше, по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, как описано выше, по меньшей мере один антибиотик и/или по меньшей мере один иммуносупрессор, как описано выше и дополнительно обсуждается ниже. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно комбинировать с предварительной, сопутствующей и последующей обработкой при помощи любой комбинации системного применения и/или нанесения в верхней трети носовой полости с по меньшей мере одним регуляторным агентом, агентом, улучшающим доставку, антибиотиком и/или иммуносупрессором.

Среди альтернатив, которые могут быть комбинированы с терапевтическими клетками в фармацевтической композиции, находятся агенты, улучшающие доставку, такие как липофильные агенты, которые могут улучшать абсорбцию регуляторного агента через слизистую оболочку или эпителий носовой полости для того, чтобы достичь поврежденные и/или дегенерирующие клетки в ЦНС. Регуляторный агент может быть смешан с липофильным агентом или адъювантом самостоятельно или в комбинация с носителем, или может быть комбинирован с одним или несколькими типами мицелл или липосомальных веществ. Среди предпочтительных липофильных веществ находятся катионные липосомы, включающие один или более чем один из фосфатидилхолина, липофектина, DOTAP или т.п.

Предпочтительный агент, улучшающий доставку, включает гиалуронидазу, которая, как обнаружено, весьма значительно увеличивает доставку терапевтических клеток в ЦНС при нанесении в верхней трети носовой полости в качестве либо предварительной обработки перед нанесением терапевтических клеток по настоящему изобретению, либо в качестве компонента фармацевтической композиции, содержащей терапевтические клетки по настоящему изобретению. Альтернативные агенты, улучшающие доставку, содержат нейрегулин и активный агент, индуцирующий миграцию. Эти агенты, усиливающие доставку, например гиалуронидаза, липофильные агенты, нейрегулин и активный агент, индуцирующий миграцию, могут быть использованы индивидуально или в любой комбинации для улучшения доставки терапевтических клеток в ЦНС в соответствии с настоящим изобретением. Таким образом, по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, может быть использован в виде предварительной обработки для транспорта терапевтических клеток и/или фармацевтической композиции, и/или в качестве компонента фармацевтической композиции, содержащей терапевтические клетки.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению дополнительно может содержать по меньшей мере один антибиотик, или альтернативно можно использовать предварительное лечение антибиотиком перед нанесением фармацевтической композиции в верхней трети носовой полости, или любую их комбинацию, для защиты пациента, подвергающегося терапевтической клеточной терапии. Дополнительно, антибиотик может быть доставлен в виде предварительной обработки, одновременной обработки и/или последующей обработки, проводимого интраназально и/или системно. Польза от такого антибиотического элемента в настоящем изобретении заключается в уменьшении риска того, что бактерии, обнаруживаемые в носовой полости, могут проникать в носовые ткани в верхней трети носовой полости во время нанесения терапевтической(их) клетки(ок) и/или фармацевтической композиции, проходить через гематоэнцефалический барьер и инфицировать другие ткани в ЦНС. Конкретные рассматриваемые ткани включают головной мозг, мозговые оболочки, кровь, спинной мозг и другие периферические ткани, но не ограничиваются ими. Предпочтительное воплощение заключается в предварительной обработке и/или одновременной обработке пациента антибиотиком, когда агент, улучшающий доставку, такой как гиалуронидаза, наносят самостоятельно или в фармацевтической композиции в верхней трети носовой полости.

Примеры антибиотиков для применения в настоящем изобретении включают мупироцин, дефенсин, гентамицин, генетицин, цефминоксим, пенициллин, стрептомицин, ксилит или другой антибиотик самостоятельно или в комбинации для того, чтобы способствовать защите пациента, получающего терапевтическую(ие) клетку(ки) и/или фармацевтическую композицию по настоящему изобретению. Применение таких антибиотиков для назальной обработки широко представлено в литературе и легко понятно специалистам в данной области техники.

Настоящее изобретение может дополнительное включать по меньшей мере один иммуносупрессор, доставляемый либо в качестве предварительной обработки, одновременно с терапевтической(ими) клеткой(ами) и/или фармацевтической композицией, и/или последующим лечением терапевтической(их) клетки(ок) и/или фармацевтической композиции. Такая иммуносупрессорная терапия в комбинации с терапевтической(ими) клеткой(ами) и/или фармацевтической композицией, которые наносят в верхней трети носовой полости, улучшает выживание таких клеток. Когда иммунокомпетентные клетки хозяина в ЦНС, слизистой оболочке носа и нервном пути между слизистой оболочкой носа и ЦНС обнаруживают наносимые терапевтические клетки по настоящему изобретению, в результате может формироваться воспалительный ответ и/или происходить активация иммунокомпетентных клеток хозяина. Эти серии событий уменьшают выживание терапевтической(их) клетки(ок). Таким образом, иммуносупрессор(ы) может(гут) быть использован(ы) перед, во время и/или после нанесения терапевтической клетки(ок) в верхней трети носовой полости, играя решающую роль в выживании и жизнеспособности терапевтических клеток. Иммуносупрессор(ы) можно наносить интраназально в верхней трети носовой полости и/или системно. Обычные и хорошо известные иммуносупрессоры, которые могут быть использованы самостоятельно или в комбинации в настоящем изобретении, включают циклоспорин А, такролимус, преднизолон, азатиоприн, метилпреднизолон, микофенилат мофетил и сиролимус. В качестве еще одного иммуносупрессора можно наносить генетически сконструированные клетки, экспрессирующие лиганд Fas.

Дополнительно, фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может содержать любую фармацевтически приемлемую добавку, носитель и/или адъювант, который может способствовать переносу этого агента в или через ткань, иннервируемую тройничным нервом или обонятельным нервом, или вдоль нервного пути или через нервный путь.

Под "фармацевтически приемлемым носителем" подразумевают носитель, который обычным образом используют в области техники, чтобы способствовать хранению, введению и/или биологической активности терапевтической(их) клетки(ок), регуляторного(ых) агента(ов), агента(ов), улучшающего(их) доставку, антибиотика(ов) и/или иммуносупрессора в фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Носитель также может уменьшать какие-либо нежелательные побочные действия компонентов такой фармацевтической композиции. Подходящий носитель должен быть стабильным, т.е. неспособным вступать во взаимодействие с другими ингредиентами в препарате. Он не должен вызывать значительное местное или системное неблагоприятное действие у реципиентов в дозах и концентрациях, используемых для лечения. Такие носители в общем известны в области техники.

Подходящие носители для различных воплощений настоящего изобретения включают обычно используемые для больших стабильных макромолекул, таких как альбумин, желатин, коллаген, полисахарид, моносахариды, поливинилпирролидон, полимолочная кислота, полигликолевая кислота, полимерные аминокислоты, жирные масла, этилолеат, липосомы, глюкозу, сахарозу, лактозу, маннозу, декстрозу, декстран, целлюлозу, маннит, сорбит, полиэтиленгликоль (PEG) и т.п. Дополнительная фармацевтическая композиция может содержать микрочастицы, органические и неорганические соединения, служащие в качестве адгезивного материала для клетки(ок) и клеточных конгломератов, которые могут быть транспортированы в ЦНС в различных воплощениях по настоящему изобретению, таким образом уменьшая утрату клеток, транспортируемых из слизистой оболочки носа в ЦНС. Эти соединения могут включать несколько типов адгезивных молекул, гели (служащие в качестве инкапсулирующего/заключающего материала для клеток), компоненты внеклеточного матрикса или матрицы и органические и/или неорганические частицы, такие как фибриновые или фибронектиновые углеродные- или глинистые- и декстрановые частицы и их композицию.

Вода, физиологический раствор, водная декстроза и гликоли представляют собой предпочтительные жидкие носители, в особенности (когда являются изотоническими) для растворов. Носитель может быть выбран из различных масел, включающих минеральное масло, масла животной, растительной или синтетической природы, например арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Подходящие фармацевтические эксципиенты включают крахмал, целлюлозу, тальк, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат магния, стеарат натрия, глицеринмоностеарат, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропиленгликоль, воду, этанол и т.п. Композиции могут быть подвергнуты воздействию обычных фармацевтических способов, таких как стерилизация, и могут содержать обычные фармацевтические добавки, такие как консерванты, стабилизаторы, увлажнители или эмульгаторы, соли для регуляции осмотического давления, буферы и т.п. Когда носитель представляет собой жидкость, предпочтительно, чтобы носитель был гипотоническим или изотоническим жидкостям организма и имел рН в диапазоне 4,5-8,5.

Другие приемлемые компоненты в фармацевтической композиции включают агенты, регулирующие изотоничность, такие как вода, физиологический раствор, и буферы, включая фосфат, цитрат, сукцинат, уксусную кислоту и другие органические кислоты или их соли, но не ограничиваются ими. Типично, фармацевтически приемлемый носитель также включает один или более чем один стабилизатор, восстановитель, антиоксидант и/или антиоксидантный хелатообразующий агент. Применение буферов, стабилизаторов, восстановителей, антиоксидантов и хелатообразующих агентов в изготовлении белковых композиций, в частности фармацевтических композиций, хорошо известно в области техники. Смотри Wang et al. (1980) J.Parent. Drug Assn. 34(6):452-462; Wang et al.(1988) J.Parent. Sci. Tech. 42:S4-S26 (Supplement); Lachman et al.(1968) Drug and Cosmetic Industry 102(1):36-38, 40, и 146-148; Akers (1988) J.Parent. Sci. Tech. 36(5):222-228; и Methods in Enzymology, Vol.XXV, ed. Colowick and Kaplan, "Reduction of Disulfide Bonds in Proteins with Dithiothreitol," by Konigsberg, pp.185-188.

Различные воплощения фармацевтической композиции по настоящему изобретению включают подходящие буферы, такие как ацетат, адипат, бензоат, цитрат, лактат, малеат, фосфат, тартрат, борат, три (гидроксиметиламинометан), сукцинат, глицин, гистидин, соли различных аминокислот и т.п. или их комбинации. Смотри Wang (1980) выше, стр.455. Подходящие соли и агенты, придающие изотоничность, включают хлорид натрия, декстрозу, маннит, сахарозу, трегалозу и т.п.

Различные воплощения фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать подходящие востановители, которые поддерживают восстановленное состояние цистеинов, включая дитиотреитол (DTT, также известный как реагент Клеланда) или дитиоэритритол в количестве от 0,01% до 0,1 мас.%/мас.; ацетилцистеин или цистеин в концентрации от 0,1% до 0,5% (рН 2-3); и тиоглицерин в концентрации от 0,1% до 0,5% (рН 3,5-7,0) и глутатион. Подходящие антиоксиданты включают бисульфит натрия, сульфит натрия, метабисульфит натрия, тиосульфат натрия, натрий формальдегид сульфоксилат и аскорбиновую кислоту. Подходящие хелатообразователи, которые хелатируют металлические микроэлементы для профилактики катализируемого металлическими микроэлементами окисления восстановленных цистеинов, включают цитрат, тартрат, этилендиаминтетрауксусную кислоту (EDTA) в ее двунатриевой, тетранатриевой, и кальциевой двунатриевой солях, и диэтилентриаминпентауксусную кислоту (DTPA). Смотри, например Wang (1980) выше на стр.457-458 и 460-461, и Akers (1988) выше на стр.224-227.

Различные воплощения фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать один или более чем один консервант, такой как фенол, крезол, пара-аминобензойная кислота, BDSA (бензидин 2:2 дисульфоновая кислота), сорбитрат, хлоргексидин, бензалконий хлорид и т.п. Подходящие стабилизаторы включают углеводороды, такие как трегалоза или глицерин. Композиция может включать стабилизатор, такой как один или более чем один из микрокристаллической целлюлозы, стеарата магния, маннита или сахарозы для стабилизации, например, физической формы композиции; и один или более чем один из глицина, аргинина, гидролизованного коллагена или ингибиторов протеаз для стабилизации, например, химической структуры композиции.

Различные воплощения фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут также включать подходящие суспендирующие агенты, такие как карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гиалуроновая кислота, альгинат, хондроитин сульфат, декстран, мальтодекстрин, декстрансульфат и т.п. Композиция может включать эмульгатор, такой как полисорбат 20, полисорбат 80, плюроник, триолеин, соевое масло, лецитины, сквален и скваланы, сорбитан триолеат и т.п.

Фармацевтическая композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать по меньшей мере один антимикробный агент, такой как фенилэтиловый спирт, фенол, крезол, бензалконий хлорид, феноксиэтанол, хлоргексидин, тимеросол и т.п. Подходящие загустители включают природные полисахариды, такие как маннаны, арабинаны, альгинат, гиалуроновую кислоту, декстрозу и т.п.; и синтетические загустители, такие как PEG (полиэтиленгликоль) гидрогели, имеющие низкую молекулярную массу; и вышеупомянутые суспендирующие агенты могут быть включены в фармацевтическую композицию по настоящему изобретению.

Фармацевтическая композиция по изобретению может дополнительно содержать адъювант, такой как цетилтриметиламмоний бромид, BDSA, холат, дезоксихолат, полисорбат 20 и 80, фузидовую кислоту и т.п. Подходящие сахара включают глицерин, треозу, глюкозу, галактозу, маннит и сорбит.

Различные воплощения фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут дополнительно содержать одну или более чем одну добавку, увеличивающую растворимость, предпочтительно циклодекстрин; гидрофильную добавку, предпочтительно моносахарид или олигосахарид; добавку, способствующую абсорбции, предпочтительно холат, дезоксихолат, фузидовую кислоту или хитозан; катионное поверхностно-активное вещество, предпочтительно цетилтриметиламмоний бромид; добавку, улучшающую вязкость, предпочтительно способствующую времени пребывания композиции в области введения, предпочтительно карбоксиметилцеллюлозу, мальтодекстрин, альгиновую кислоту, гиалуроновую кислоту, или хондроитинсульфат; или матрицу с длительным высвобождением, предпочтительно полиангидрид, полиортоэфир, гидрогель, систему-депо с медленным высвобождением на основе частиц, предпочтительно полилактидные когликолиды (PLG), пену-депо, микросферы крахмала или трансбуккальную систему на основе целлюлозы; липидный носитель, предпочтительно эмульсию, липосому, ниосому или мицеллу. Композиция может включать добавку, дестабилизрующую двойной слой, предпочтительно фосфатидилэтаноламин; фузогенную добавку, предпочтительно холестерин гемисукцинат.

Фармацевтическая композиция может дополнительно включать солюбилизирующее соединение для улучшения стабильности регуляторного агента или его биологически активного варианта. Для IGF-I предпочтительный солюбилизирующий агент включает гуанидиниевую группу, которая способна усиливать его растворимость. Примеры таких солюбилизирующих соединений включают аминокислоту аргинин, а также аминокислотные аналоги аргинина, которые сохраняют способность усиливать растворимость IGF-I или его биологически активного варианта при рН 5,5 или больше. Такие аналоги включают дипептиды и трипептиды, которые содержат аргинин, но не ограничиваются ими. Под "улучшением растворимости" понимают увеличение количества ростового фактора или его биологически активного варианта, который может быть растворен в растворе при рН 5,5 или больше в присутствии содержащего гуанидиний соединения по сравнению с количеством этого белка, который может быть растворен при рН 5,5 или больше в растворе с теми же компонентами, но лишен содержащего гуанидиний соединения. Способность содержащего гуанидиний соединения улучшать растворимость ростового фактора или его биологически активного варианта можно определить с использованием способов, хорошо известных в области техники. В общем, известно, что необходимо обеспечивать концентрацию солюбилизирующего соединения, представленного в композиции, в диапазоне от приблизительно 10 мМ до приблизительно 1 М, и например, в случае соединения аргинина в диапазоне концентраций от приблизительно 20 мМ до приблизительно 200 мМ.

Эти перечни носителей и добавок не являются полными, и специалист в данной области техники может выбрать эксципиенты из списка химических реагентов GRAS (в общем рассматриваемые как безопасные), допускаемые в фармацевтических препаратах, и тех, которые в настоящее время допустимы для местных и парентеральных препаратов.

Кроме того, способ изготовления фармацевтической композиции в общем известен в области техники. Подробное обсуждение препарата и выбор фармацевтически приемлемых носителей, стабилизаторов и изомолитов можно найти в Remington's Pharmaceutical Sciences (18.sup.th ed.; Mack Publishing Company, Eaton, Pa., 1990), включенном сюда путем ссылки.

Для задач данного изобретения описанная здесь фармацевтическая композиция может быть изготовлена в виде единичной дозы в форме, такой как раствор, суспензия или эмульсия для нанесения в верхней трети носовой полости. Фармацевтическая композиция, наносимая и вводимая в верхней трети носовой полости в ткань, иннервируемую обонятельными нейронами, может находиться в форме порошка, гранулы, раствора, спрея (например, аэрозоля), мази, инфузии, капель или композиции с длительным высвобождением, такой как полимерный диск. Другие формы композиций для введения включают суспензию частиц, такую как эмульсия, липосома, вставка, которая медленно высвобождает фармацевтическую композицию и т.п. Порошкообразные формы или гранулярные формы фармацевтической композиции могут быть комбинированы с раствором и с разбавляющим, диспергирующим или поверхностно-активным регуляторным агентом. Композиция также может находиться в форме лиофилизированного порошка, который может быть превращен в раствор, суспензию или эмульсию перед введением. Фармацевтическую композицию, содержащую по меньшей мере один регуляторный агент, предпочтительно стерилизуют путем мембранной фильтрации и хранят в контейнерах, содержащих единичную дозу или множество доз, таких как запаянные виалы или амулы.

Введение терапевтических клеток и/или Фармацевтических соединений

Введение терапевтических клеток в соответствии со способами по изобретению может включать нанесение самих терапевтических клеток или приготовление терапевтических клеток с одним или более чем одним вышеописанным соединением в виде фармацевтических композиций и введение фармацевтических композиций субъекту-животному или хозяину, включая пациента-человека, интраназально в верхнюю треть носовой полости. Терапевтические клетки и/другие компоненты их фармацевтической композиции, например агент, улучшающий доставку, регуляторный агент, антибиотик и/или иммуносупрессор, могут быть введены в одной из множества доз, достаточной для обеспечения эффективного количества в желаемой области действия терапевтической клетки и/или компонента фармацевтической композиции. Дозы для людей и других млекопитающих могут находиться в диапазоне от приблизительно 0,001 мг/кг до приблизительно 100 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,01 мг/кг до приблизительно 10 мг/кг, предпочтительно от приблизительно 0,1 мг/кг до приблизительно 1-10 мг/кг. Как указано, агент(ы), улучшающий(е) доставку, регуляторный(е) агент(ы), антибиотик(и) и/или иммуносупрессор(ы) могут быть доставлены в виде предварительной обработки, одновременной обработки и/или последующей обработки терапевтической(ими) клеткой(ами) и/или фармацевтической композицией самостоятельно или в качестве компонента фармацевтической композиции, и когда они не содержатся в фармацевтической композиции, тогда могут быть доставлены системно или в верхнюю треть носовой полости.

Для нанесения в верхней трети носовой полости в виде суспензий, аэрозолей, спреев или капель терапевтическая(ие) клетка(ки) и/или фармацевтическая(ие) композиция(и) может(гут) быть изготовлена(ы) в соответствии со способами, хорошо известными в области в фармацевтического препарата. Композиции могут быть изготовлены в виде суспензий клеток в растворах, которые могут содержать соли, такие как физиологический раствор, компоненты, такие как ортофосфатные, сукцинатные или цитратные буферы для поддержания рН, осморегуляторные и осмотические агенты, такие кактаурин, и подходящие консерванты, агенты, способствующие абсорбции для усиления биологической доступности, фторуглероды или другие солюбилизирующие или диспергирующие агенты, известные в области техники. Способы интраназального нанесения фармацевтической композиции в верхней трети носовой полости могут быть осуществлены в различных формах, таких как порошок, спрей, гель или капли в нос.

Другие формы композиций для введения терапевтических клеток и/или фармацевтических композиций, или их элементов включают суспензию частиц, такую как эмульсия, липосома, или форму с длительным высвобождением для пролонгирования нахождения фармацевтически активного агента в организме индивида. Порошкообразные или гранулярные формы фармацевтической композиции могут быть комбинированы с раствором и с разбавителем, диспергирующим или поверхностно-активным агентом. Дополнительные композиции для введения включают биоадгезивное вещество для удержания агента в области введения в верхней трети носовой полости, например спрея, красителя или тампона, наносимого на слизистую оболочку. Биоадгезивное вещество может относиться к гидрофильным полимерам, природным или синтетическим, которые благодаря гидрофильному характеру могут быть растворимыми в воде или быть проглатываемыми и которые совместимы с фармацевтической композицией. Такие адгезивные вещества действуют для прилипания препаратов к слизистым тканям в верхней трети носовой полости. Такие адгезивные вещества могут включать гидроксипропилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, этилцеллюлозу, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, гуаровую камедь, поливинилпирролидон, пектины, крахмалы, желатин, казеин, полимеры акриловой кислоты, полимеры сложных эфиров акриловой кислоты, сополимеры акриловой кислоты, виниловые полимеры, виниловые сополимеры, полимеры виниловых спиртов, алкоксиполимеры, полимеры полиэтиленоксида, полиэфиры и их комбинации, но не ограничиваются ими. Композиция также может находиться в форме лиофилизированного порошка, который может быть превращен в раствор, суспензию или эмульсию перед введением. Фармацевтическую композицию предпочтительно стерилизуют путем мембранной фильтрации и хранят в однодозовых или мультидозовых контейнерах, таких как запаянные виалы или ампулы.

Фармацевтическая композиция может быть приготовлена в форме с длительным высвобождением для пролонгирования нахождения активного агента в организме индивидуума, которого лечат. Множество способов изготовления препарата с длительным высвобождением известно в области техники и раскрыто в Remington's Pharmaceutical Sciences. Как правило, терапевтические клетки, фармацевтическая композиция и/или компоненты фармацевтической композиции, т.е. агент, улучшающий доставку, регуляторный агент, антибиотик и/или иммуносупрессор, может быть заключен в полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров. Матрицы могут иметь форму пленок или микрокапсул. Матрицы могут включать полиэфиры, сополимеры L-глутаминовую кислоту и гамма-этил-L-глутамат, полилактиды, полилактат полигликолят, гидрогели, неразлагаемый этилен-винилацетат, разлагаемые сополимеры молочной кислоты-гликолевой кислоты, гели гиалуроновой кислоты и суспензии альгиновой кислоты, но не ограничиваются ими. Подходящие микрокапсулы также могут включать гидрокиметилцеллюлозу или желатин и полиметилметакрилат. Также могут быть использованы микроэмульсии или коллоидные системы доставки лекарства, такие как липосомы и альбуминовые микросферы.

Системы доставки

Терапевтические клетки и/или фармацевтическая композиция, содержащая терапевтические клетки, и/или компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению могут дополнительно быть распределены и нанесены интраназально в верхней трети носовой полости в виде порошкообразного или жидкого назального спрея, суспензии, капель в нос, геля, пленки или мази, через трубку или катетер, при помощи шприца, при помощи тампона (packtail), при помощи компресса (небольшой плоской абсорбирующей подушечки), при помощи назального тампона или при помощи инфузии под слизистые оболочки. В некоторых аспектах настоящего изобретения способы включают введение индивидууму терапевтических клеток и/или их фармацевтической композиции в верхнюю треть носовой полости при помощи устройства для доставки. Назальная доставка лекарства может быть осуществлена с использованием устройств, включая однодозовые контейнеры, спреи под давлением, капельницы, сжимаемые бутылки-пульверизаторы, безвоздушные и не содержащие консервантов спреи, небулайзеры (устройства, использованные для замены жидкой лекарственной терапии на аэрозольную форму в виде частиц), ингаляторы с отмеренной дозой и ингаляторы с отмеренной дозой под давлением, но не ограничивающихся ими. В некоторых аспектах точная эффективная доза содержится в биоадгезивном пластыре, который располагается непосредственно в и на верхнюю треть носовой полости.

Терапевтические клетки и/или фармацевтическая композиция, содержащая терапевтические клетки, и/или компоненты терапевтической композиции по настоящему изобретению могут быть для удобства доставлены в верхнюю треть носовой полости в форме аэрозольного спрея с использованием контейнера под давлением или распылителя и подходящего пропеллента, включая дихлордифторметан, трихлорфторметан, дихлортетрафторэтан, углеводороды, сжатый воздух, азот или диоксид углерода, но не ограничиваются ими. Для аэрозольной системы требуется пропеллент, который является инертным в отношении терапевтических клеток и/или фармацевтической композиции, что хорошо понятно специалисту в данной области техники. В случае аэрозоля под давлением стандартную дозу можно контролировать при помощи клапана для доставки точного отмеренного количества.

Средства для доставки терапевтических клеток или фармацевтической композиции, содержащие терапевтические клетки и/или компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению, в верхнюю треть носовой полости в виде порошка могут находиться в форме, такой как микросферы, доставляемые при помощи назального инсуффляторного устройства (устройства для вдувания газа, порошка или пара в полость организма) или аэрозольного контейнера под давлением. Инсуффлятор выпускает тонкодисперсный туман сухого порошка или микросфер. Инсуффлятор может быть оснащен средствами для обеспечения введения по существу отмеренного количества фармацевтической композиции. Порошок или микросферы должны вводиться в сухой распыляемой в воздухе форме. Порошок или микросферы могут быть использованы непосредственно в инсуффляторе, который содержит флакон или контейнер для порошка или микросфер. Альтернативно, порошок или микросферы могут быть заполнены в капсулу, такую как желатиновая капсула, или другое устройство, содержащее разовую дозу, приспособленное для назального введения. Инсуффлятор может иметь устройства, такие как игла для прокалывания капсулы или другое устройство для формирования отверстий, через которые потоки порошкообразной композиции могут быть доставлены в верхнюю треть носовой полости. В этом воплощении терапевтические клетки могут быть дегидратированы и/или лиофилизированы с последующей регидратацией в слизистой оболочке носа.

Периодическое и циклическое введение дозы

В различных воплощениях изобретения терапевтические клетки и/или фармацевтическая композиция, содержащая эффективное количество терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции, могут быть введены в виде разовой и однократной дозы, или альтернативно, терапевтические клетки и/или компоненты фармацевтической композиции могут быть введены более чем один раз и периодически. Под "периодическим введением" подразумевают введение эффективного количества терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции, а затем период перерыва, за которым затем следует еще одно введение эффективного количества и т.д. Введение эффективного количества терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции можно осуществить непрерывным образом, таким как, например, при помощи препарата с длительным высвобождением, или оно может быть осуществлено в соответствии с желаемой схемой введения суточной дозы, такой как, например, при помощи одного, двух, трех или более чем трех введений в сутки. Под "периодом перерыва" подразумевают прекращение непрерывного длительного высвобождения или суточного введения терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции. Период перерыва может быть длиннее или короче, чем период непрерывного высвобождения или суточного введения. Во время периода перерыва уровень терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции в соответствующей ткани по существу ниже максимального уровня, достигаемого во время лечения. Предпочтительная длительность периода перерыва зависит от концентрации эффективной дозы и формы используемых терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции. Период перерыва может составлять по меньшей мере 2 суток, предпочтительно по меньшей мере 4 суток, более предпочтительно по меньшей мере 1 неделю и, как правило, не превосходит период 4 недель. Когда используют препарат с длительным высвобождением, тогда период перерыва должен быть увеличен для того, чтобы удовлетворять большему времени пребывания регуляторного агента в области повреждения. Альтернативно, частота введения эффективной дозы препарата с длительным высвобождением может быть соответственно уменьшена. Периодическая схема введения терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции может продолжаться до достижения желаемого терапевтического действия и в конечном итоге излечения заболевания или расстройства.

В еще одном воплощении периодическое введение эффективного(ых) количеств(а) терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции является циклическим. Под "циклическим" подразумевают периодическое введение, сопровождающееся перерывами во введении, с циклами, находящимися в диапазоне от приблизительно 1 месяца до приблизительно 2, 3, 4, 5 или 6 месяцев. Например, схема введения может представлять собой периодическое введение эффективной дозы терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции, где разовую краткосрочную дозу вводят один раз в неделю в течение 4 недель, а затем с перерывом в периодическом введении на 3 месяца, а затем периодическим введением разовой краткосрочной дозы, вводимой один раз в неделю в течение 4 недель, а затем с перерывом в периодическом введении на 3 месяца и т.д. В качестве еще одного примера разовую краткосрочную дозу можно вводить один раз в неделю в течение 2 недель, а затем с перерывом в периодическом введении на период 1 месяц, а затем введение разовой краткосрочной дозы, водимой один раз в 2 недели, а затем с перерывом в периодическом введении на период 1 месяц и т.д. Циклическая периодическая схема введения терапевтических клеток и/или компонентов фармацевтической композиции субъекту может продолжаться до достижения желаемого терапевтического действия и в конечном итоге лечения расстройства или заболевания.

Для задач регуляции развития терапевтических клеток и таким образом уменьшения или предотвращения клинического проявления неврологического расстройства, которое лечат, интраназальное введение одной или более чем одной терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного регуляторного агента может осуществляться в течение минут, часов, суток или даже недель относительно исходного применения терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению. Например, исходная терапевтическая доза по меньшей мере одного регуляторного агента может быть введена в течение приблизительно от 2 до 4 часов, в течение приблизительно от 2 до 6 часов, в течение приблизительно 8 часов, в течение приблизительно 10 часов, приблизительно 15 часов, приблизительно 24 часов, в течение приблизительно 36 часов, 48 часов, 72 часов или приблизительно 96 часов, или больше, а затем применение терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению. Одна или более чем одна дополнительная доза регуляторного агента может быть введена в течение часов, суток или недель после начальной дозы. Дополнительно, животному, подвергающемуся клеточно-заместительной регенерационной терапии в соответствии с воплощениями по настоящему изобретению, могут быть введены дополнительные регуляторные агенты и/или терапевтические клетки, и/или фармацевтические композиции периодически в течение времени в соответствии со стратегией лечения пациента. Таким образом, например животному, подвергающемуся клеточно-заместительной терапии, можно вводить одну или более чем одну терапевтически эффективную дозу регуляторного(ых) агента(ов), терапевтических клеток и/или их фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению перед, во время или после исходного применения. Аналогично, агент, усиливающий доставку, иммуносупрессор(ы) и/или антибиотик(и) могут быть введены перед, во время или после первоначального нанесения терапевтических клеток и/или фармацевтической(их) композиции(й) по настоящему изобретению. Приведенные здесь схемы периодического и циклического введения представляют собой только пример, и не предполагается, что они каким-либо образом ограничивают соединение. Специалисту в данной области техники понятны различные схемы/частоты введения для индивидуальных случаев, причем каждая такая схема/частота введения находится в объеме настоящего изобретения.

Изделия и способы изготовления

Настоящее изобретение также включает изделие, обеспечивающее интраназальное введение терапевтических клеток и/или фармацевтической композиции, содержащей терапевтические клетки и/или компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению, в верхнюю треть носовой полости и последующий обход гематоэнцефалического барьера и транспорт в ЦНС. Изделие может включать виалу или другой контейнер, который содержит композицию, подходящую для способа по настоящему изобретению, вместе с каким-либо носителем, находящимся в высушенной или в жидкой форме. Изделие дополнительно включает указания в форме этикетки на контейнере и/или в форме вкладыша в коробку, в которую упакован контейнер, для осуществления способа по изобретению. Указания также могут быть напечатаны на коробке, в которую упакована виала. Указания содержат информацию, такую как достаточная доза, и информацию по введению, которая дает субъекту или специалисту в данной области возможность вводить терапевтические клетки и/или фармацевтическую композицию, содержащую терапевтические клетки, и/или компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Предполагается, что специалист в данной области техники подразумевает любого врача, медицинскую сестру, технического специалиста, супруга или другого лица, управляющего лечением, который может вводить терапевтические клетки и/или фармацевтическую композицию, содержащую терапевтические клетки, и/или компоненты фармацевтической композиции по настоящему изобретению. Терапевтические клетки и/или компоненты фармацевтической композиции также могут быть введены самим субъектом.

Настоящее изобретение может быть более хорошо понято со ссылкой на следующие примеры. Предполагается, что эти примеры представляют собой специфические воплощения изобретения, и не предполагается, что они ограничивают объем изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1 - Обход терапевтическими клетками гематоэнцефалического барьера после интраназального нанесения в верхней трети носовой полости в крысиной модели болезни Паркинсона

Гипотезу о том, что терапевтические клетки действительно могут обходить гематоэнцефалический барьер, авторы изобретения проверяли на здоровых грызунах (мышах и крысах) и на крысах, обработанных 6-OHDA (6-гидроксидофамином) для формирования модели болезни Паркинсона. В этом примере мезенхимальные стволовые клетки, т.е. эукариотические клетки, интраназально вводили в верхнюю треть носовой полости взрослых здоровых мышей и обработанных 6-гидроксидофамином (6-OHDA) крыс с односторонним поражением для моделирования пораженной и/или дегенерирующей ЦНС пациентов, страдающих от болезни Паркинсона. Дополнительно, клетки глиомы интраназально вводили в верхнюю треть носовой полости молодых здоровых крыс. В течение одного (1) часа введения/нанесения оба типа клеток достигали обонятельную луковицу, кору головного мозга, гиппокамп, полосатое тело и мозжечок здоровых животных. В индуцируемой 6-OHDA крысиной модели болезни Паркинсона клетки обнаруживали через 4 часа после введения. Вероятно, что клетки возможно достигли головного мозга в обоих случаях менее чем за один час. После того, как клетки пересекали решетчатую пластинку, наблюдали два пути миграции: (1) миграция в обонятельную луковицу и также в другие отделы головного мозга, включая кору головного мозга и полосатое тело; и (2) проникновение в спинномозговую жидкость с движением вдоль поверхности коры головного мозга, а затем проникновение в паренхиму головного мозга.

Пример 2 - Действие агента, улучшающего доставку, на транспорт терапевтических клеток после интраназального нанесения в верхней трети носовой полости

Оценивали эффективность интраназальной доставки терапевтических клеток в головной мозг после интраназального нанесения крысиных мезенхимальных стволовых клеток (MSC), меченых CFDA (карбоксифлуоресцеин диацетат) или красителем Hoechst, в верхней трети носовой полости семинедельных мышей С57 b1/6, таким образом обходя гематоэнцефалический барьер при введении и нанесении и транспорте терапевтических клеток.

В начале животных делили на три группы (n=5 в каждой группе): 1) группа А получала только терапевтические клетки интраназально; 2) группа В получала интраназально агент, улучшающий доставку, представляющий собой гиалуронидазу, за 30 минут до интраназального нанесения клеток; 3) группа С получала носитель интраназально (24 мкл PBS (забуференного фосфатом физиологического раствора)). Через один час после нанесения клеток животных умерщвляли под анестезией, головы замораживали при -80°С и позже готовили сагиттальные или горизонтальные срезы (20 мкм), погруженные в среду, содержащую DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндол) или PI (пропидий йодид), и анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии.

Клетки, меченые красителем Hoechst, появлялись во всех слоях обонятельной луковицы, полосатого тела, коры головного мозга, в стенке и окружении латерального желудочка, и мозжечке животных в группе А, которым интраназально доставляли только терапевтические клетки. В обонятельной луковице клетки распределялись во всех слоях у животных групп А и В. Интраназальное введение гиалуронидазы (100 Е/животное в группе В) увеличивало количество MSC в головном мозге, в особенности в обонятельной луковице по сравнению с животными группы А.

Распределение MSC в различных слоях коры головного мозга в группах А и В свидетельствует о миграции терапевтических клеток с поверхности в паренхиму. Множество клеток располагалось в субарахноидальном пространстве в ближайшей области относительно MSC, которые уже достигли верхнего слоя коры головного мозга. В некоторых из этих клеток происходят процессы, свидетельствующие о прохождении ими дифференцировки. Большое количество интраназально-применяемых меченых CFDA MSC оставалось в верхней части носовой полости (стрелки на Фиг.2D) через 1 ч после нанесения, что свидетельствует о том, что миграция терапевтических клеток из слизистой оболочки носа через решетчатую пластинку в головной мозг может продолжаться в течение нескольких часов и возможно даже суток.

Пошаговую миграцию клеток с поверхности коры головного мозга в более глубокие слои обнаруживали после того, как некоторая плотность клеток располагалась в один слой; агрегаты клеток в более глубоких слоях проявляются только в окружении клеточных рядов, располагающихся ближе к поверхности коры головного мозга.

Пример 3 - Направленная миграция терапевтических клеток в область поражения в ЦНС после интраназального нанесения в верхнюю треть носовой полости

Поскольку результаты, полученные и описанные выше в примере 2, демонстрируют то, что помимо коры головного мозга, обонятельной луковицы и мозжечка интраназально наносимые терапевтические клетки появляются также в области полосатого тела, авторы изобретения решили исследовать, может ли нейродегенерация направить миграцию наносимых клеток в область поражения при использовании модели с односторонним поражением у взрослых крыс, обработанных 6-OHDA.

Поражения в полосатом теле вызывали у взрослых крыс путем односторонней инъекции (левое полушарие) нейротоксина 6-гидроксидофамина (6-OHDA) для индукции модели паркинсонического типа. Клетки применяли в двух группах животных (n=5 в каждой): 1) без или 2) с интраназальной обработкой гиалуронидазой (200 Е/животное) за 30 минут до интраназального введения клеток через три дня после поражения. Образцы головного мозга животных отбирали через 4 ч после применения клеток и замораживали при -80°С. Для того чтобы продемонстрировать дегенеративные изменения в левой части (пораженной) полосатого тела после вызванного 6-OHDA поражения, 10 горизонтальных срезов, полученные у каждого животного из области от 5 мм до 8 мм из брегмы, окрашивали на тирозингидроксилазу (ТН).

В противоположность сильному окрашиванию почти всего полосатого тела на ТН в непораженной области, экспрессия ТН в пораженной области очевидно уменьшалась. Скрининг срезов головного мозга при помощи флуоресцентной микроскопии выявил явную разницу в количестве клеток между пораженной и противоположной половинами: большая часть меченых CFDA MSC обнаружена в обонятельной луковице (О В), коре головного мозга на уровне поражения и в пораженном полосатом теле, тогда как только небольшое количество клеток обнаружено в полосатом теле, коре головного мозга и О В противоположного полушария. Некоторые MSC периодически обнаруживали в срезах, окрашенных на ТН. Интересно то, что очень мало MSC, которые обнаружены в ОВ, экспрессировали ТН, тогда как большинство клеток, расположенных в коре головного мозга в окружении поражения, являются ТН-положительными.

Эти результаты подтверждают нацеленную преимущественную миграцию стволовых клеток в сайт поражения у грызунов с поражением, вызванным 6-OHDA. Кроме того, более хорошая доставка стволовых клеток костного мозга в головной мозг продемонстрирована в пораженном полушарии по сравнению с доставкой в непораженную область с использованием воплощения по настоящему изобретению.

Пример 4 - Обход терапевтическими клетками, содержащими опухолевые клетки, гематоэнцефалического барьера после интраназального нанесения в верхней трети носовой полости в модели болезни Паркинсона

В этом исследовании изучается, могут ли не только терапевтические стволовые клетки, но и опухолевые клетки быть доставлены в головной мозг после интраназального введения или нет. Осуществляли интраназальное введение человеческих меченых Phi-Yellow и CFDA клеток глиомы Т406 в верхнюю треть носовой полости 10-суточных крыс (n=5). Через один час после введения животных умерщвляли. Сагиттальные срезы (20 мкм) всей головы животных (включая череп и головной мозг) анализировали при помощи флуоресцентной микроскопии. Меченые CFDA клетки глиомы идентифицировали в носовой полости, решетчатой пластинке, обонятельной луковице, лобной доле коры головного мозга и области гиппокампа.

В этом исследовании продемонстрировали интраназальную доставку эукариотических клеток (стволовых клеток, а также опухолевых клеток) в интактный и пораженный головной мозг крыс. Опухоли головного мозга состоят из внутричерепных опухолей, возникающих в результате аномального или неконтролируемого клеточного деления. Последнее может происходить в головном мозге, мозговых оболочках, черепных нервах или в кровеносных сосудах, или лимфатических сосудах центральной нервной системы. Прежде всего опухоли головного мозга возникают в задней черепной ямке у детей (т.е. глиома ствола головного мозга) и в передней области мозговых полушарий у взрослых. Опухоли головного мозга у детей составляют приблизительно одну четверть от всех случаев рака у детей. Приблизительно более чем 10000 человек умирает в год в Соединенных Штатах Америки от опухолей головного мозга. Прежде всего опухоли головного мозга происходят из глиальных клеток в центральной нервной системе. Тем не менее вторичные опухоли головного мозга, которые развиваются в результате рака в других частях организма и метастазируют в головной мозг, еще более распространены. Опухоли могут метастазировать в головной мозг из легких, кожи, почки, молочной железы, прямой кишки и других органов.

Опухоли головного мозга сложно лечить, поскольку большая часть химиотерапевтических агентов не проникает легко через гематоэнцефалический барьер, и невозможно безопасно и успешно удалять некоторые типы опухолей головного мозга, например глиомы ствола головного мозга, вследствие их близкого расположения к областям головного мозга, которые контролируют ключевые автономные функции, такие как дыхание, сердечная функция и т.д.

В настоящее время исследователи разрабатывают и тестируют новые способы лечения опухолей головного мозга, необходимые для хирургической имплантации опухолевых клеток в головной мозг животного для разработки модели опухоли головного мозга у животных, которая может быть использована для тестирования новых лекарств. Авторы изобретения демонстрируют здесь, что опухолевые клетки могут быть введены неинвазивно в головной мозг путем их введения в верхнюю треть носовой полости, и что гиалуронидаза и другие агенты могут быть использованы для облегчения этого процесса. Таким образом, этот пример демонстрирует, что модель опухоли головного мозга может быть получена неинвазивно без проблем, ассоциированных с нейрохирургией, и путем прямой имплантации опухолевых клеток с использованием воплощений по настоящему изобретению.

Изобретение описано со ссылкой на различные специфические и предпочтительные воплощения и способы. Тем не менее понятно, что множество вариаций и модификаций может быть осуществлено, не выходя за пределы сущности и объема изобретения.

Claims

1. Способ транспортирования терапевтических клеток в пораженную, или дегенерирующую, или поврежденную центральную нервную систему животного, где поражения или дегенерация вызваны неврологическим заболеванием или состоянием, которое приводит к утрате или гибели клеток центральной нервной системы, включающий:
нанесение по меньшей мере одной терапевтической клетки в верхней трети носовой полости млекопитающего.

2. Способ по п.1, дополнительно включающий введение по меньшей мере одной терапевтической клетки в ткань, иннервируемую обонятельным нервом, где по меньшей мере одна терапевтическая клетка обходит гематоэнцефалический барьер для того, чтобы достичь пораженную центральную нервную систему; и
минимизацию системной доставки терапевтических клеток за пределы центральной нервной системы.

3. Способ по п.2, дополнительно включающий обход гематоэнцефалического барьера по меньшей мере одной терапевтической клеткой путем миграции вдоль нервного пути в пораженную центральную нервную систему.

4. Способ по п.3, дополнительно включающий предпочтительное мигрирование по меньшей мере одной терапевтической клетки в область поражения в центральной нервной системе.

5. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение гиалуронидазы в эффективном количестве интраназально в верхней трети носовой полости животного.

6. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение гиалуронидазы в эффективном количестве перед нанесением по меньшей мере одной терапевтической клетки в верхней трети носовой полости животного.

7. Способ по п.1, дополнительно включающий предоставление фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну терапевтическую клетку и эффективное количество гиалуронидазы; и нанесение эффективного количества фармацевтической композиции в верхней трети носовой полости животного.

8. Способ по п.1, где терапевтические клетки включают эукариотические клетки.

9. Способ по п.1, где терапевтические клетки включают стволовые клетки, имеющие происхождение из фетальных тканей или тканей взрослого животного, за исключением человеческой эмбриональной ткани.

10. Способ по п.1, где терапевтические клетки включают опухолевые клетки, способные к терапевтическому действию.

11. Способ по п.1, дополнительно включающий нанесение по меньшей мере одной терапевтической клетки в физиологически эффективном количестве в верхней трети носовой полости животного для обеспечения терапевтического действия, включающего замену утраченных и/или погибающих клеток в пораженной центральной нервной системе.

12. Способ по п.7, дополнительно включающий нанесение фармацевтической композиции в физиологически эффективном количестве в верхней трети носовой полости животного для обеспечения терапевтического действия, включающего замену утраченных и/или погибающих клеток в пораженной центральной нервной системе.

13. Способ по п.1, где неврологическое заболевание или состояние включает болезнь Паркинсона.

14. Способ по п.1, где неврологическое заболевание или состояние включает болезнь Альцгеймера.

15. Способ по п.1, где неврологическое заболевание или состояние включает ишемию.

16. Способ транспортирования терапевтических клеток в пораженную или дегенерирующую центральную нервную систему животного, где поражение или дегенерация вызваны неврологическим заболеванием или состоянием, которое приводит к утрате или гибели клеток центральной нервной системы, включающий:
предоставление фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одну терапевтическую клетку и по меньшей мере один агент, улучшающий доставку; и
нанесение фармацевтической композиции в верхней трети носовой полости млекопитающего.

17. Способ по п.16, где по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, содержит гиалуронидазу.

18. Способ по п.17, где по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, дополнительно содержит одно из группы, состоящей из гиалуронидазы, активного агента, индуцирующего миграцию, и нейрегулина.

19. Способ по п.17, дополнительно включающий предварительную обработку верхней трети носовой полости по меньшей мере одним антибиотиком в эффективном количестве перед нанесением фармацевтической композиции.

20. Способ по п.17, дополнительно включающий предоставление по меньшей мере одного антибиотика в эффективном количестве в фармацевтической композиции.

21. Способ по п.20, дополнительно включающий предварительную обработку верхней трети носовой полости по меньшей мере одним антибиотиком в эффективном количестве перед нанесением фармацевтической композиции.

22. Способ по п.20, дополнительно включающий предоставление по меньшей мере одного агента, способного регулировать развитие трансплантированной донорной клетки, в эффективном количестве в фармацевтической композиции.

23. Способ по п.20, дополнительно включающий предоставление по меньшей мере одного иммуносупрессора в эффективном количестве в фармацевтической композиции.

24. Интраназально доставляемая фармацевтическая композиция для лечения пораженной, или дегенерирующей, или поврежденной центральной нервной системы млекопитающего, содержащая:
по меньшей мере одну терапевтическую клетку; и
по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, способствующий прохождению гематоэнцефалического барьера по меньшей мере одной терапевтической клеткой, где фармацевтическую композицию вводят в верхнюю треть носовой полости млекопитающего.

25. Фармацевтическая композиция по п.24, где по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, включает гиалуронидазу.

26. Фармацевтическая композиция по п.25, где по меньшей мере один агент, улучшающий доставку, дополнительно включает нейрегулин и активный агент, индуцирующий миграцию.

27. Фармацевтическая композиция по п.25, дополнительно содержащая по меньшей мере один антибиотик.

28. Фармацевтическая композиция по п.27, дополнительно содержащая по меньшей мере один иммуносупрессор.

29. Фармацевтическая композиция по п.24, дополнительно содержащая по меньшей мере один агент, способный регулировать развитие трансплантированной донорной клетки.

30. Фармацевтическая композиция по п.28, дополнительно содержащая по меньшей мере один агент, способный регулировать развитие трансплантированной донорной клетки.