KR102559516B1 - 우유 엑소좀을 포함하는 갈색지방화 유도용 조성물 - Google Patents

우유 엑소좀을 포함하는 갈색지방화 유도용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 우유 엑소좀을 포함하는 갈색지방화 유도용 조성물, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 대사성 질환 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 우유 엑소좀을 처리하여 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포로의 분화를 유도할 수 있다.

Description

우유 엑소좀을 포함하는 갈색지방화 유도용 조성물{COMPOSITION COMPRISING MILK EXOSOMES FOR INDUCING BROWNING OF WHITE ADIPOSE TISSUE}
본 발명은 우유 엑소좀을 포함하는 갈색지방화 유도용 조성물, 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 대사성 질환 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 또한, 상기 우유 엑소좀을 처리하여 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포로의 분화를 유도할 수 있다.
최근 비만 문제가 심각해짐에 따라 비만 자체가 곧 질병이라는 인식이 확산되고 있다. 비만 진행 여부의 판단은 대표적으로 과체중 여부로 판단할 수 있으며, 구체적으로 특정 부위에서의 체지방의 증가(예를 들어, 복부 비만 등)로 판단할 수 있다. 비만으로 분류된 경우 즉, 비만자는 다른 질병에 비해 유병률과 사망률이 높고 정상체중을 가진 사람과 비교하여 당뇨병 질환으로 인한 사망률은 4배, 간병경증 질환으로 인한 사망률은 2배, 뇌혈관질환으로 인한 사망률은 1.6배 및 관상동맥질환으로 인한 사망률은 1.8배 정도 높은 것으로 보고되고 있다.
비만은 지방의 과다 축적으로 특징 지워지는 다양한 원인을 가진 심각한 만성 증후군이다. 비만 치료의 목표는 크게 두 가지로서, 첫 번째는 과량의 지방을 연소시켜 체중을 감소시키는 것이며, 두 번째는 대사성 불균형을 개선시키는 것이다. 복부 비만을 보이는 환자는 흔히 X-증후군(인슐린 저항성, 제 2형 당뇨병, 고혈압 및 지질 대사 이상)과 같은 병적인 상태와 관련되어 있으며, 조기 동맥경화, 허혈성 심질환 및 뇌혈관 질환의 강력한 위험인자로 작용한다.
비만, 지방축적으로 인한 대사성 질환이 증가하면서 지방세포에 의해 축적되는 여분의 에너지를 조절하는 것에 대한 연구 개발이 더욱 요구되고 있다.
한국공개특허 제10-2020-0012713호
본 발명의 목적은 우유 엑소좀을 포함하는, 갈색지방화 유도용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 우유 엑소좀을 포함하는, 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 우유 엑소좀을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 비만 또는 대사성 질환의 치료방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 우유 엑소좀을 포함하는, 비만 또는 대사성 질환 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 우유 엑소좀을 백색 지방세포에 처리하는 단계를 포함하는, 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포로의 분화 유도방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 측면은 우유 엑소좀을 포함하는, 갈색지방화 유도용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, "우유 엑소좀"은 우유 유래의 지질 이중충의 소낭을 말한다. 상기 엑소좀은 우유 유래의 고유의 단백질 및 핵산 등을 포함하고 있으며 30~200 nm 크기의 생체 나노입자로, 내부에 DNA, RNA, 펩타이드 등으로 이루어진 정보가 담겨있다. 엑소좀은 내부의 물질을 체액 내 분해 효소 등으로부터 안전하게 운반하여 인접 세포 또는 원거리 세포에 정보 전달을 하여 세포 주변의 미세 환경에 영향을 미친다. 특히, 우유 유래의 우유 엑소좀은 식품으로도 접할 수 있을 뿐만 아니라 많은 양의 엑소좀이 추출되며, 긴 시간 동안 안정한 상태로 보관할 수 있다는 장점이 있다.
지방세포의 체내기능은 몸에 필요한 에너지를 축적하는 세포로, 필요시 중성지방(triacylglyceride)을 분해시켜 이용한다. 지방조직은 에너지 축적의 기능뿐만 아니라, 내분비 기관으로 지방대사, 당 대사를 포함한 체내 에너지대사를 조절하는 기능을 수행하는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 또한, 지방세포는 중간엽 전구 세포(mesenchymal precursor cell)에서 지방선구세포(preadipocyte)를 거쳐 지방세포로 분화되며, 분화과정 동안 형태적, 생화학적 변화를 통하여 체내 지방을 축적하며, 지방조직은 크기의 증가, 새로운 지방선구세포로부터 분화된다.
이러한 지방세포의 크기는 일반적으로 식사 조절로 가능하지만 새로운 전구지방세포가 지방세포로 분화되는 과정은 식사 조절로 효과가 없기 때문에 비만의 근본적 치료 또는 억제를 제어하기 위해서는 지방세포의 분화과정을 조절하는 것이 중요하다.
체내에는 백색 지방, 베이지색 지방, 갈색 지방이 있으며, 백색 지방은 음식을 통해 섭취한 포도당과 지방산이 에너지원으로 쓰이고 남아서 세포에 쌓이게 된 지방이다. 주로 비상 상황에서 몸의 에너지원이 되고 물리적 충격을 흡수하는 역할을 하지만 지나치게 많으면 비만, 당뇨병 등을 유발한다.
'갈색 지방'은 백색 지방을 에너지로 연소시키고, 연소시키는 과정에서 열을 발생시켜 체온을 유지시키는 갈색을 띈 지방을 말한다. 다만 갈색 지방은 일부 성인만 가지고 있다는 한계가 있다.
체내에 없는 갈색 지방을 만들기는 어려우나, 베이지색 지방을 활성화하여 갈색 지방과 같은 기능이 나타나도록 유도할 수 있다. 베이지색 지방은 성인 대부분이 가지고 있는 지방으로 갈색지방화를 유도함으로써 축적된 백색 지방의 연소가 나타나도록 하여 비만, 당뇨병 등의 대사성 질환의 치료 및 개선을 유도할 수 있다.
본 발명에서, '갈색지방화'는 백색지방의 갈색지방화를 유도하여 새로운 형태의 지방세포인 베이지 지방세포 및/또는 갈색 지방세포를 유도하고, 그 대사 활성을 증대시키는 것을 모두 포함한다. 또한 백색 지방을 갈색 지방화하여 UCP1에 의한 지방 연소 효과를 발생시키는 것을 포함한다.
본 발명 일 실시예에서는 우유 엑소좀을 처리한 경우 갈색지방화 유도 효과를 나타내어 지방세포가 베이지 지방세포로 분화되어 베이지 지방세포 특이적 유전자가 발현되는 것을 확인하였다(도 5). 또한 지방전구세포 및 지방유래줄기세포 모두에서 우유 엑소좀을 처리한 경우 C/EBPβ와 PRDM16의 발현이 증가되었으며(도 23), 지방조직인 iWAT(inguinal white adipose tissue)에서도 우유 엑소좀을 처리한 경우 C/EBPβ와 PRDM16의 발현을 증가시킴으로써 백색지방의 갈색지방화가 유도됨을 확인하였다(도 25B).
구체적으로, 상기 우유 엑소좀은 miR-11987, miR-122 및 miR-11980으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 포함하는 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 miR-11987은 서열번호 49의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-122는 서열번호 50의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-11980은 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
또한 구체적으로 상기 우유 엑소좀은 소 유래인 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 우유 엑소좀에 존재하는 microRNA를 확인하였으며, 특히 miR-11987, miR-122 및/또는 miR-11980이 과발현 된 경우 UCP1과 PGC-1α의 발현이 증가됨을 확인하였다(도 16). 이에 따라, miR-11987, miR-122 및 miR-11980으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 포함하는 우유 엑소좀을 통해 갈색지방화를 유도할 수 있다.
또한 구체적으로, 상기 우유 엑소좀은 UCP-1(uncoupling protein-1) 또는 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 UCP-1(uncoupling protein-1)은 갈색지방에서 활성화되면서 열발생(thermogenesis)을 증가시키며, 열발생을 유발하는 또 다른 장기인 근육에서 지방산화율을 증가시켜 에너지 소비를 촉진시키는 것에 관여한다.
상기 PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha)는 PPAR-α 및 PPAR-β와 결합하여 지방산 산화와 관련된 유전자의 발현을 증가시키고, 핵수용체인 ERR(estrogen receptor related receptor)과 결합하여 포도당 산화를 감소시킨다. 또한 전사인자 NRF-1(nuclear respiratory factor 1)과 결합하여 OXPHOS 관련 유전자의 전사를 증가시키고 미토콘드리아 증식과 DNA의 전사를 촉진하여 미토콘드리아 생성을 증가시킨다
본 발명 일 실시예에서는 우유 엑소좀 처리시 지방전구세포 및 지방유래줄기세포에서 열발생에 관여하는 의한 UCP1 및 PGC-1α 단백질 발현을 증가시킴을 통해 확인하였으며(도 6), 비만이 유도된 마우스 내 지방조직에서도 우유 엑소좀 처리시 UCP1 및 PGC-1α 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다(도 8A).
즉, 본 발명의 우유 엑소좀은 갈색 지방화를 유도하면서 UCP1의 발현을 증가시킴으로써 열발생을 촉진시키고 체내 대사를 활성화하여 축적된 지방이 연소되도록 할 수 있다.
본 발명의 다른 일 측면은 우유 엑소좀을 포함하는, 비만 또는 대사성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서, "비만"은 대부분 섭취한 열량 중에서 소모되고 남는 부분이 지방세포(adipocyte)로 전환되어 체내의 피하조직과 복강 내에 축적되는 것을 말한다. 지방세포의 크기에는 한계가 있어 과잉 에너지를 섭취한 경우 지방세포의 수가 증가하게 되고, 이렇게 축적된 지방세포에 의해 호르몬, 성장인자, 사이토카인 등 생체조절자들이 영향을 받아 대사 장애, 대사성 질환 등이 발생된다.
기존 항비만제로 당 생성을 저해하는 티아졸리디네디온(thiazolidinediones, TZDs), 지방 흡수를 억제하는 시부트라민(sibutramine) 등이 있으나, 이들은 본래 항우울제로서 심혈관계, 중추신경계, 간장, 신장 등에 장애를 일으켜 부작용을 발생시키는 것으로 보고되었다. 본 발명의 우유 엑소좀은 항비만 효과를 나타낼 수 있으면서도 천연 유래 물질로서 부작용 및 독성이 감소된 것이다.
본 발명에서, "대사성 질환"은 대사 증후군, 대사성 증후군이라고도 한다. 생활환경, 과도한 영향 섭취 및 부족한 에너지 소모 등으로 인하여 대사 장애가 유발되고, 체내 에너지 및/또는 지방이 축적되면서 발생된 비만이 원인이 된다.
구체적으로 상기 대사성 질환은 당뇨병, 고지혈증, 고콜레스테롤증, 동맥경화증 및 지방간으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 또한 지방축적으로 인해 발생된 대사 장애 역시 모두 포함될 수 있다.
상기 대사성 질환은 체내 대사를 원활히 하고, 체내 축적된 지방을 연소시킴써 개선될 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 우유 엑소좀을 처리한 경우 미토콘드리아 활성이 촉진됨을 확인하였으며, 구체적으로 전자전달계 관련 단백질인 NDUFB8(NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B8), SDHB (Succinate Dehydrogenase Complex Iron Sulfur Subunit B), UQCRC2((Ubiquinol-Cytochrome C Reductase Core Protein 2), COX IV(cytochrome c oxidase subunit IV) 및 ATP5A(ATP synthase F1 subunit alpha, mitochondrial)의 발현 증가(도 9), 산소 소비율의 증가를 확인하였다(도 10).
또한, 우유 엑소좀을 처리한 경우, 지방세포 및 근육세포 모두에서 세포 내로 혈당 흡수가 증가됨을 확인하였으며(도 11A 및 11B), 일차 간세포(primary hepatocytes)에서 혈당 생성이 감소됨을 확인하였다(도 11C). 아울러, 우유 엑소좀을 처리한 경우 혈청 인슐린이 감소함을 확인하였는 바(도 11D), 본 발명의 우유 엑소좀은 인슐린 대사를 개선시킬 수 있다.
또한, 비만 모델 마우스에 우유 엑소좀을 처리한 경우 염증 인자의 발현 감소 및 항염증 인자의 발현 증가를 확인하였으며(도 12), 지방간의 표지인자인 ALT 수준이 감소하고(도 13), 중성지방(도 15A), 유리지방산(도 15B), 및 LDL(도 15D)가 유의하게 감소되고 HDL(도 15C)이 유의하게 증가함을 확인하였다.
상기와 같이 본 발명의 우유 엑소좀은 미토콘드리아 활성 효과, 인슐린 저항성 개선 효과 및 비만에 의한 대사 기능 이상 개선 효과를 나타냄을 확인하였는 바, 비만 및/또는 대사성 질환의 치료용도로 사용될 수 있다.
구체적으로, 상기 우유 엑소좀은 miR-11987, miR-122 및 miR-11980으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 포함하는 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 miR-11987은 서열번호 49의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-122는 서열번호 50의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-11980은 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위하여, 상기 본 발명의 우유 엑소좀 외에 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 약학적 조성물은 어떠한 제형으로도 적용가능하며, 보다 구체적으로 비경구용 제형일 수 있다. 비경구용 제형으로는 주사용, 도포용, 에어로졸 등의 스프레이 형일 수 있다. 더욱 구체적으로는 주사제 형태일 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 우유 엑소좀을 치료를 필요로 하는 개체에 약학적으로 유효한 양으로 투여하는 단계를 포함하는 비만 또는 대사성 질환의 치료방법에 관한 것이다. '비만', '대사성 질환'은 상기 설명한 바와 같다.
본 발명에서 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자의 성병, 연령, 질병의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 약학적 조성물은 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 용어 "개체"는 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 증상이 호전될 수 있는 대사성 질환을 가진 동물 또는 인간을 포함한다. 본 발명에 따른 치료용 조성물을 개체에게 투여함으로써, 대사성 질환을 효과적으로 예방 및 치료할 수 있다.
본 발명의 용어 "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 인간 또는 동물에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 본 발명에 따른 치료용 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 치료용 조성물은 유효성분이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 우유 엑소좀을 포함하는, 비만 또는 대사성 질환 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 본 발명의 우유 엑소좀을 첨가할 수 있는 식품은 소세지, 육류, 빵, 초콜릿류, 스넥류, 캔디류, 과자류, 라면, 피자, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있다. 음료수로 제형화할 경우에 본 발명의 우유 엑소좀 외에 첨가되는 액체 성분으로는 이에 한정되지는 않으나, 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예, 포도당, 과당 등), 디사카라이드(예, 말토오스, 수크로오스 등) 및 폴리사카라이드(예, 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당), 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당 알코올일 수 있다.
상기 식품의 종류는 구체적으로 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 점증제, pH 조절제, 안정화제, 보존제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능 식품은 과일 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다.
상기 건강기능식품은 식품의 생체 조절 기능을 강조한 식품으로 물리적, 생화학적, 생물공학적인 방법을 이용하여 특정 목적에 작용 및 발현하도록 부가가치를 부여한 식품이다. 이러한 건강기능 식품의 성분은 생체 방어와 신체 리듬의 조절, 질환의 방지 및 회복에 관계하는 신체 조절 기능을 생체에 대하여 충분히 발휘하도록 설계하여 가공하게 되며, 식품으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제, 감미료 또는 기능성 원료를 함유할 수 있다.
본 발명의 우유 엑소좀을 건강기능식품(또는 건강기능 음료 첨가물)으로 사용할 경우, 상기 우유 엑소좀을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 상기 우유 엑소좀의 혼합량은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 개선, 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 우유 엑소좀을 백색 지방세포에 처리하는 단계를 포함하는, 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포로의 분화 유도방법에 관한 것이다.
구체적으로, 상기 우유 엑소좀은 miR-11987, miR-122 및 miR-11980으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 포함하는 것일 수 있다.
더욱 구체적으로, 상기 miR-11987은 서열번호 49의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-122는 서열번호 50의 염기서열로 이루어지고, 상기 miR-11980은 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.
본 발명 일 실시예에서는 우유 엑소좀을 처리한 경우 갈색지방화 유도 효과를 나타냄을 확인하였는 바(도 5, 도 23 및 도 25), 본 발명의 우유 엑소좀을 이용하여 갈색지방화를 촉진함으로써 백색 지방을 베이지색 지방 또는 갈색 지방으로의 분화를 유도할 수 있다.
본 발명의 우유 엑소좀을 포함하는 조성물은 백색 지방세포의 갈색지방화를 유도하면서 체내 열발생을 촉진시킴으로써 에너지 소비를 증가시켜 지방세포의 열량 소모를 증가시킨다.
또한, 본 발명의 우유 엑소좀은 천연 소재로서 생체 독성이 없어 생체 적합성이 우수하여 비만 또는 대사성 질환 치료에 널리 활용될 수 있다.
본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 우유 엑소좀의 크기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 우유 엑소좀 표지 단백질 TSG101, CD9 및 HSP70의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 전자현미경을 이용하여 우유 엑소좀의 형태 및 크기를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 우유 엑소좀의 세포 내 흡수를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 우유 엑소좀의 갈색지방화 유도 효과에 의한 베이지 지방세포 분화 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 6은 우유 엑소좀에 의한 UCP1 및 PGC-1α 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 7은 고지방식이 비만 마우스 모델에서 우유 엑소좀에 의한 비만 치료 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 체중 증가율 감소 효과 확인, B: 음식 섭취 유의미한 변화 없음 확인, C: 체형 감소 효과 확인).
도 8A는 우유 엑소좀에 의한 iWAT 내 UCP1및 PGC-1α 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8B는 우유 엑소좀에 의한 지방분해 관련 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8C는 우유 엑소좀에 의한 갈색지방화를 통해 나타나는 베이지 지방세포 특이적 유전자의 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 우유 엑소좀에 의한 전자전달계 관련 단백질 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 10은 우유 엑소좀에 의한 산소 소비율 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 11은 우유 엑소좀에 의한 인슐린 저항성 개선 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포에서의 혈당 흡수능 확인, B: C2C12 세포에서의 혈당 흡수능 확인, C: 일차 간세포에서의 혈당 생성 확인, D: 혈청 인슐린 감소 확인).
도 12는 우유 엑소좀에 의한 염증 인자 및 항염증 인자의 mRNA 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: F4/80, B: TNF alpha, C: MCP1, D: IL-6, E: IL-10).
도 13은 우유 엑소좀에 의한 ALT 수준의 감소 효과를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 우유 엑소좀 투여 후 지방구를 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 15는 우유 엑소좀 투여 후 혈액을 분석한 결과를 나타낸 것이다(A: 중성지방, B: 유리지방산, C: HDL, D: LDL).
도 16은 우유 엑소좀 내의 miRNA 과발현에 따른 UCP1과 PGC-1α의 발현 변화를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: mRNA 발현 확인, B: 단백질 발현 확인).
도 17은 miR-11987 과발현에 의한 전자전달계 관련 단백질 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 18은 miR-11987 과발현에 의한 산소 소비율 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 19는 miR-11987의 Runx1t1에 결합하는 부위에 관한 모식도를 나타낸 것이다.
도 20은 miR-11987에 의한 Runx1t1 발현 감소를 확인한 결과를 나타내 것이다.
도 21은 miR-11987 억제제 처리에 의해 우유 엑소좀에 의해 감소하였던 Runx1t1의 단백질 발현의 재증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 22는 Runx1t1 siRNA 도입에 따른 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 23은 우유 엑소좀에 의한 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 24는 miR-11987 과발현에 의한 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현 증가를 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: 3T3-L1 세포, B: hADSC 세포).
도 25는 iWAT 내의 우유 엑소좀에 의한 Runx1t1, C/EBPβ 및 PRDM16의 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 것이다(A: Runx1t1, B: C/EBPβ 및 PRDM16).
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 우유 엑소좀(milk exosome) 제조
원심분리기를 이용하여 소 유래 우유에서 엑소좀을 추출하였다. 보다 구체적으로는, 우유를 튜브에 분주하여, 2,000 g와 10,000 g에서 각각 10분 동안 원심분리하여 상층액을 수거하였다. 수거한 상층액을 0.45 μm, 0.2 μm 필터로 여과한 다음, phosphate buffered saline (PBS)를 혼합하였다. 이후, Exoquick exosome precipitation solution (System Biosciences)을 PBS와 혼합하여 넣어 준 후, 30분 동안 휴지시키고, 10,000 g에서 10분간 다시 원심분리하였다. 상층액을 제거하고 엑소좀 펠렛을 PBS에 용해시켜 이후 다시 1,000g에서 1분 원심분리 후 상층액을 실험에 이용하였다.
실험예 1. 우유 엑소좀의 특성 확인
1-1. 우유 엑소좀의 크기 측정
우유 엑소좀의 크기를 확인하기 위해 동적 광산란 측정(dynamic light scattering, DLS)을 통해 엑소좀의 크기를 측정하였으며, 200 nm 이내의 크기를 나타냄을 확인하였다(도 1).
1-2. TSG101, CD9 및 HSP70 단백질 발현 확인
우유 엑소좀 표지 단백질인 TSG101, CD9 및 HSP70 발현 여부를 웨스턴블롯을 이용하여 확인하였다.
우유 엑소좀에서 10% SDS 폴리아크릴마이드 젤을 이용하여 단백질을 분리하였다. 상기 분리한 단백질은 니트로셀룰로오스막(GE Health care)으로 옮긴 후, 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 1시간 동안 5 % 탈지분유에 반응하였다. TSG101(Abcam), CD63(Abcam) 및 HSP70(Invitrogen) 각각의 1차 항체를 1:1000의 비율로 희석하여 4 ℃에서 12 ~ 18시간 동안 막에 결합시켰다. 이후, HRP-tagged anti-rabbit(KPL) 항체와 결합시켜 상온에서 30분 동안 반응시켰다. ECL kit(Advansta Inc)를 사용하여 단백질 밴드를 관찰하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 엑소좀 표지 단백질인 TSG101, CD9 및 HSP70 단백질이 엑소좀에서는 뚜렷이 관찰되었으며, 엑소좀 외에 상층액에서는 발현되지 않음을 확인하였다.
1-3. 엑소좀의 형태 및 크기 확인
상기 실시예 1에서 추출한 우유 엑소좀의 형태 및 크기를 전자현미경을 이용하여 관찰하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 엑소좀이 200 nm 크기 내에서 둥근 나노입자 형태로 존재하는 것을 확인하였다.
1-4. 엑소좀의 세포 내 흡수 확인
우유에서 추출한 엑소좀이 세포 내로 흡수되는지 확인하기 위하여, 엑소좀을 PKH26 염색액으로 5분 동안 처리하고, 3T3-L1 지방전구세포, 지방유래줄기세포(Adipose derived mesenchymal stem cell, ADSC) 및 C2C12 근육세포에 염색한 엑소좀을 3시간 반응시킨 후 형광을 관찰하였다.
구체적으로, 엑소좀 펠렛을 1ml Diluent C를 첨가하고, 따로 1 ml의 Diluent C는 4 μl의 PKH26(Sigma)으로 혼합시켜 염색용액(stain solution)을 만들었다. 상기 stain solution을 Diluent C를 첨가한 엑소좀과 혼합하여 5분 동안 반응시켰고, 1% bovine serum albumin이 더해지면서 반응을 멈추었다. PKH26으로 표지된 엑소좀은 Exoquick exosome precipitation solution(System Biosciences)을 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 추출하였다. 이후 형광 현미경(CELENA S digital imaging system, Logos Biosystems)을 이용하여 관찰하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 3T3-L1 지방세포, 지방유래줄기세포(hADSC) 및 C2C12 근육세포 내에 염색된 엑소좀이 들어간 것을 확인하였다. 이를 통해 우유에서 엑소좀이 추출되었으며, 추출된 엑소좀의 세포 내 흡수가 나타남을 확인하였다.
실험예 2. 우유 엑소좀의 백색지방의 갈색지방화 유도 효과 확인
6 웰 플레이트에 3T3-L1 세포와 지방유래줄기세포를 3x105 cells/ml이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 3T3-L1 세포가 포화되면 10 % 소 태아 혈청, 1 μM 덱타메타손, 10 μg/ml 인슐린 및 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴이 포함된 세포 분화유도배지에서 배양하였다. 이틀 후, 10 % 소 태아 혈청, 10 μg/ml 인슐린을 48 시간 동안 처리하였다. 그 후, 10 % 소 태아 혈청이 포함한 배지에 이틀 동안 배양하였다.
또한, 지방유래줄기세포가 포화되면 14일 동안 이틀에 한번씩 10% 소 태아 혈청, 1 μM 덱타메타손, 10 μg/ml 인슐린, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴 및 100 uM 인도메타신이 포함된 세포 분화유도배지를 교체하면서 배양하였다.
이후 실시간 중합효소 연쇄반응 및 웨스턴블롯을 이용하여 지방 분화 배지와 함께 우유 엑소좀 20 μg/ml, 50 μg/ml 처리하였다. 즉, 지방 분화 유도 동안 이틀에 한 번씩 우유 엑소좀을 처리하였다. 이후 베이지 지방세포 특이적인 유전자들의 발현을 확인함으로써 백색 지방의 갈색지방화 유도 효과를 확인하였다.
2-1. 베이지 지방세포 특이적 유전자 발현 확인
우유 엑소좀이 백색지방의 갈색지방화에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 실시간 중합효소 연쇄반응(real-time PCR)을 통해 백색지방의 갈색지방화를 통해 나타나는 베이지 지방세포 특이적 유전자인 CITED1(Cbp/P300 Interacting Transactivator With Glu/Asp Rich Carboxy-Terminal Domain 1), HSPB7(Heat Shock Protein Family B (Small) Member 7), TNFRSF9(TNF Receptor Superfamily Member 9), EAR2(COUP TF-gamma, ERBAL2; NR2F6), CD40, EBF3(EBF Transcription Factor 3), EVA1A(eva-1 homolog A) 및 PDK4(Pyruvate Dehydrogenase Kinase 4) 유전자의 발현을 확인하였다.
구체적으로, 3T3-L1 및 hADSC 세포주를 각각 3Х105 cells/well로 6 웰 플레이트에 분주한 후, 분화배지와 함께 우유 엑소좀을 처리하고 3T3-L1은 6일 동안, ADSC는 14 일 동안 분화 유도 후 세포를 수거하였다. 상기 수거한 세포에 Tri 시약(Bioline)을 반응시켜 total RNA를 분리하였다. 역전사 반응을 실시하기 위하여 1 μg RNA에 dNTP, M-MLV 역전사효소(Promega)를 첨가한 다음 37 ℃에서 1 시간 반응시켜 cDNA를 합성하였다. CITED1, HSPB7, TNFRSF9, EAR2, CD40, EBF3, EVA1A 및 PDK4 mRNA 발현을 측정하기 위해 SYBR Green PCR Master mix(Bioline)를 이용하여 실시간 중합효소 연쇄반응을 수행하였다. 특정 유전자를 증폭하기 위한 PCR 조건은 다음과 같이 시행하였다. 95 ℃에서 10 분간 반응시킨 다음, 95 ℃ 5 초, 60 ℃ 10초, 72 ℃ 15 초를 한 주기로 하여 40 cycles 동안 증폭하였다. 표적 유전자 mRNA 발현량은 actin 발현량에 대한 상대적인 발현량으로 보정하였다. 사용된 프라이머는 하기 표 1에 나타난 바와 같다.
그 결과, 도 5A에 나타난 바와 같이 지방전구세포인 3T3-L1 세포에 우유 엑소좀을 처리한 경우, 갈색지방화를 통해 나타나는 베이지 지방세포 특이적 유전자인 CITED1, HSPB7, TNFRSF9, EAR2, CD40, EBF3, EVA1A 및 PDK4의 발현이 모두 현저히 증가함을 확인하였다.
또한, 도 5B에 나타난 바와 같이 지방유래줄기세포(hADSC)에서도 우유 엑소좀을 처리한 경우 갈색지방화를 통해 나타나는 베이지 지방세포 특이적 유전자인 TNFRSF9, EAR2, CD40, EBF3 및 EVA1A의 발현이 증가함을 확인하였다.
상기와 같은 유전자 발현 변화를 통해 우유 엑소좀을 처리할 경우 갈색지방화가 유도되어 베이지 지방세포로 분화되는 것을 확인하였으며, 나아가 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 갈색지방화가 유도되는 것이 증가함을 확인하였다.
2-2. UCP1 및 PGC-1α 단백질 발현 확인
우유 엑소좀이 발열성 유전자인 UCP1 및 PGC-1α 발현에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 UCP1및 PGC-1α의 단백질 발현 정도를 확인하였다.
3T3-L1 및 hADSC 세포주를 각각 3Х105 cells/well로 6 웰 플레이트에 분주한 후, 분화배지와 함께 우유 엑소좀을 처리하고 3T3-L1은 6 일 동안, ADSC는 14 일 동안 분화 유도 후 수거하였다. 수거한 세포를 16,500 g에서 15 분간 원심 분리하여 상등액을 취한 후, 단백질 농도를 BSA 키트(Bio-rad)로 정량하였다.
추출한 단백질은 10% SDS 폴리아크릴마이드 젤을 이용하여 단백질을 분리하였다. 상기 분리한 단백질은 니트로셀룰로오스막(GE Health care)으로 옮긴 후, 항체의 비특이적 결합을 방지하기 위하여 1 시간 동안 5 % 탈지분유에 반응하였다. UCP1(uncoupling protein 1; Abcam), PGC-1α(Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha; Boster Bio) 및 β-actin(Sigma)의 1차 항체를 1:1000의 비율로 희석하여 4 ℃에서 12 - 18시간 니트로셀룰로오스막과 반응시켰다. 이후, PBS로 세척한 다음 HRP-tagged anti-rabbit(KPL) 항체를 첨가하여 상온에서 30 분 동안 반응시켰다. ECL 키트(Santa Cruz Inc.)를 사용하여 단백질 밴드를 관찰하였다.
그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 처리한 경우 지방전구세포인 3T3-L1 세포(도 6A) 및 지방유래줄기세포인 hADSC(도 6B) 모두에서 UCP1및 PGC-1α의 단백질 발현이 모두 증가됨을 확인하였으며, 처리된 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 단백질 발현이 더욱 증가함을 확인하였다. 상기와 같은 결과는 본 발명의 우유 엑소좀이 갈색지방화를 유도함을 나타내는 것이다.
실험예 3. 고지방식이 비만 마우스 모델에서의 비만 치료 효과 확인
3-1. 체중 및 외관 관찰
우유 엑소좀의 비만 치료 효과를 확인하기 위하여 C57BL6/J 마우스(웅성, 8주령, 라온바이오)에 14 주 동안 고지방식이(high fat diet, HFD)를 하면서 우유 엑소좀을 경구 투여하였다(0 ug/ml (Control): 4 마리, 50 ug/ml exosomes: 3마리, 100 ug/ml exosomes: 3 마리, 300 ug/ml exosomes: 3 마리).
구체적으로, 14 주 동안 상기 엑소좀을 50, 150, 300 μg/ml의 농도로 투여한 뒤 체중 변화를 측정하였으며, 음성대조군은 엑소좀이 포함되지 않은 PBS를 사용하였다. 14 주 후 비만 치료 효과를 확인하기 위하여 체중 변화 및 외관을 관찰하였다.
그 결과, 도 7A에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 투여한 경우 체중 증가율이 감소하였으나, 도 7B에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀 투여에 따른 음식 섭취는 차이가 나타나지 않았다. 특히 우유 엑소좀의 투여 농도가 증가할수록 체중 증가율은 더욱 감소하였으며, 도 7A 및 도 7B로부터 우유 엑소좀의 투여는 음식 섭취 감소 없이도 체중 증가율을 감소시키는 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
또한 도 7C에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 투여한 경우 체구 역시 감소하여 몸의 크기가 작게 나타남을 확인하였다.
3-2. 단백질 발현 확인
상기 고지방식이 비만 마우스 모델을 안락사시킨 후 개복하여 서혜부 지방조직인 iWAT(inguinal white adipose tissue)를 분리하였다.
이후 상기 iWAT 내의 UCP1및 PGC-1α의 단백질 발현 정도를 웨스턴블롯을 통해 확인하였다. 웨스턴블롯 방법은 상기 2-2에 기재된 바와 같다.
도 8A 내의 각 레인 수는 iWAT 조직을 채취한 마우스의 마릿수와 같다(0 ug/ml exosomes(Control): 4 마리, 50 ug/ml exosomes을 섭취한 쥐: 3 마리, 100 ug/ml exosomes을섭취한 쥐: 3 마리, 300 ug/ml exosomes을 섭취한 쥐: 3 마리).
그 결과, 도 8A에 나타난 바와 같이 발열성 유전자인 UCP1및 PGC-1α의 단백질 발현이 우유 엑소좀을 투여한 경우 증가되는 것을 확인하였으며, 투여되는 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 UCP1및 PGC-1α의 단백질 발현이 증가됨을 확인하였다.
3-3. 유전자 발현 확인
분리된 iWAT 에서의 지방분해 관련 유전자, 베이지 지방세포 특이적 유전자의 발현을 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 확인하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 상기 2-1에 기재된 바와 같으며, 지방분해 관련 유전자에 대해 이용한 프라이머 서열은 하기 표 2에 정리된 바와 같다.
그 결과, 도 8B에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 투여한 경우 지방분해효소인 HSL(hormone-sensitive lipase) 및 중성지방분해효소인 ATGL(adipose triglyceride lipase)의 발현이 증가됨을 확인하였다. 특히 우유 엑소좀의 투여 농도가 증가할수록 HSL 및 ATGL의 발현이 더욱 증가함을 확인하였다.
또한, 도 8C에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 투여한 경우 갈색지방화를 통해 나타나는 베이지 지방세포 특이적 유전자인 CITED1, HSPB7, TNFRSF9, EAR2, CD40, EBF3, EVA1A 및 PDK4의 발현이 모두 현저히 증가함을 확인하였으며, 나아가 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 갈색지방화가 유도되는 것이 증가함을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 우유 엑소좀을 투여함으로써 비만에 대한 치료 효과 및 비만 치료를 통해 비만에 의해 발생된 대사성 질환들에 대한 치료 효과를 나타낼 수 있음을 시사하는 것이다.
실험예 4. 우유 엑소좀의 미토콘드리아 활성 효과 확인
우유 엑소좀이 미토콘드리아 활성에 미치는 영향을 확인하기 위하여 전자전달계 관련 단백질의 발현 및 산소 소비율을 확인하였다.
4-1. 전자전달계 관련 단백질 발현 증가 확인
전자전달계 관련 단백질로 NDUFB8(NADH:ubiquinone oxidoreductase subunit B8), SDHB (Succinate Dehydrogenase Complex Iron Sulfur Subunit B), UQCRC2((Ubiquinol-Cytochrome C Reductase Core Protein 2), COX IV(cytochrome c oxidase subunit IV) 및 ATP5A(ATP synthase F1 subunit alpha, mitochondrial)의 발현 변화를 확인하였다.
3T3-L1 및 hADSC 세포주를 각각 3Х105 cells/well로 6 웰 플레이트에 분주한 후, 분화배지와 함께 우유 엑소좀을 처리하고 3T3-L1은 6일 동안, ADSC는 14 일 동안 분화 유도하였다. 이후 세포를 수거하여 웨스턴블롯을 수행하였으며, 웨스턴블롯 방법은 상기 2-2에 기재된 바와 같다. 본 웨스턴블롯에서의 1차 항체는 NDUFB8(Invitrogen), SDHB(Invitrogen), UQCRC2(Abcam), COXIV(Abcam) 및 ATP5A (Invitrogen)에 대한 항체를 이용하였다.
그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 3T3-L1 세포 및 hADSC 세포 모두에서 우유 엑소좀을 처리한 경우 미토콘드리아 내 전자전달계 활성에 관여하는 단백질들의 발현이 증가함을 확인하였다(도 9A 및 도 9B).
또한, 상기 비만 모델 마우스로부터 지방조직인 iWAT를 수득하여 동일 웨스턴 블롯 방법으로 iWAT 조직 내에서 발현된 단백질들을 확인하였다(도 9C). 도 9C 내의 각 레인 수는 iWAT 조직을 채취한 마우스의 마릿수와 같다(Control: 4마리, 50 ug/ml exosomes을 섭취한 쥐: 3마리, 100 ug/ml exosomes을섭취한 쥐: 3마리, 300 ug/ml exosomes을 섭취한 쥐: 3마리).
도 9C에 나타난 바와 같이 iWAT조직에서도 우유 엑소좀을 처리한 경우 발현이 증가함을 확인하였다(도 9C).
4-2. 산소 소비율 증가 확인
3T3-L1 및 hADSC 세포주를 각각 5Х104 cells/well로 24 multi 웰 플레이트(Seahorse Bioscience)에 분주한 후, 분화배지와 함께 우유 엑소좀을 처리하고 3T3-L1은 6일 동안, ADSC는 14일 동안 분화 유도하였다. 그 후, 1.5 μM 올리고마이신, 0.75 μM FCCP(Carbonyl cyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone), 1 μM 로테논 및 안티마이신을 순차적으로 처리한 후 세포의 산소 소비량을 XF 분석기(Seahorse)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 3T3-L1 세포(도 10A) 및 hADSC(도 10B) 모두에서 우유 엑소좀을 처리한 경우 산소 소비율이 증가됨을 확인하였다.
실험예 5. 우유 엑소좀의 인슐린 저항성 개선 효과 확인
우유 엑소좀이 인슐린 저항성을 개선시키는지 확인하기 위하여 3T3-L1 지방세포 및 C2C12 근육세포에 우유 엑소좀을 처리 후 혈당 흡수능을 관찰하였다.
3T3-L1 및 C2C12 세포주를 각각 3Х105 cells/well로 6 웰 플레이트에 분주한 후, 분화배지와 함께 우유 엑소좀을 처리하고 3T3-L1은 6일 동안 지방분화 유도하였다. C2C12 세포 포화 후, 이틀에 한번씩 2% horse serum (Gibco)이 포함된 배지를 교체하면서6일 동안 근육 분화하였다. 포도당 흡수율은 세포에 1 μM 인슐린과 1mM 2-데옥시글루코스를 처리한 후 2-데옥시글루코스 흡수 측정 키트(Cosmo bio)를 사용하여 측정하였다.
그 결과 도 11A 및 도 11B에 나타난 바와 같이 3T3-L1 지방세포 및 C2C12 근육세포 모두에서 우유 엑소좀을 처리한 경우 세포 내로의 혈당 흡수가 증가됨을 확인하였다.
또한, 일차 간세포(primary hepatocytes)를 이용하여 혈당 생성을 확인하였다.
구체적으로, 쥐에서 추출한 간을 콜라겐 I 6 웰 플레이트에 5% FBS (fetal bovine serum) 와 페니실린/스트렙토마이신(penicillin/streptomycin(100 μg/ml))을 포함한 Medium 199(gibco)에서 24 시간 동안 배양하였다. FBS가 결핍된 Medium 199 배지에 16~18시간 배양 후, PBS를 이용하여 세척하였다. 그 후, 0.1 mm pCPT-cAMP를 처리하여 37℃ 인큐베이터에서 6 시간 동안 배양 후, colorimetric glucose assay kit(biovision)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 11C에 나타난 바와 같이 일차 간세포에 우유 엑소좀을 처리한 경우, 혈당 생성이 감소함을 확인하였다.
또한, 인슐린 대사를 확인하였다. 구체적으로, 정상 식이를 한 쥐와 고지방 식이를 한 쥐에서 혈액을 채취하였다. 혈액을 잘 혼합하여 방치한 후 30 분이 경과하면 3,000 rpm에서 20 분 동안 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청을 이용하여 mouse insulin ELISA kit(Alpco)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 11D에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 처리한 경우 혈청 인슐린이 감소함을 확인하였다.
상기와 같은 결과는 본 발명의 우유 엑소좀이 인슐린 대사를 개선시킴을 나타내는 것이다.
실험예 6. 우유 엑소좀의 비만에 의한 대사 기능 이상 개선 효과
6-1. 염증 및 항염증 관련 유전자 발현 감소 확인
우유 엑소좀의 비만 치료 효과를 확인하기 위하여 C57BL6/J 마우스(웅성, 8주령, 라온바이오)에 14주 동안 고지방식이(high fat diet, HFD)를 하면서 우유 엑소좀을 경구 투여하였다(0 ug/ml (Control): 4 마리, 50 ug/ml exosomes: 3 마리, 100 ug/ml exosomes: 3 마리, 300 ug/ml exosomes: 3 마리).
구체적으로, 14 주 동안 상기 우유 엑소좀을 50, 150, 300 μg/ml의 농도로 투여한 뒤 쥐를 안락사시킨 후 개복하여 부고환 지방조직인 eWAT(epididymal white adipose tissue) 조직을 분리하여 염증 및 항염증 관련 인자의 mRNA 발현을 확인하였다.
염증 관련 인자로 F4/80, TNF alpha, MCP1, IL-6의 mRNA 발현을 확인하였으며, 항염증 관련 인자로 IL-10의 유전자 발현을 확인하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 확인하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 상기 2-1에 기재된 바와 같으며, 이용한 프라이머 서열은 하기 표 3에 정리된 바와 같다.
그 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 투여한 경우 염증 인자인 F4/80, TNF alpha, MCP1, IL-6의 mRNA 발현이 감소하였으며, 항염증 인자인 IL-10의 mRNA 발현은 증가함을 확인하였다.
6-2. ALT 감소 확인
고지방식이를 한 쥐에서 혈액을 채취하였다. 혈액을 잘 혼합하여 방치한 후 30분이 경과하면 3,000 rpm에서 20분 정도 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청을 ALT assay kit(cusabio)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 지방간의 표지인자인 ALT 수준이 우유 엑소좀을 투여한 경우 마우스 혈청에서 감소됨을 확인하였다. 특히 150 μg/ml 이상의 농도에서 ALT 수준이 감소되었다.
6-3. 지방구 확인
고지방식이를 한 쥐에서 간을 채취한 후, 파라핀 포매된 간의 샘플을 슬라이스하여 5 μm 절편을 만들었다. 절편을 탈파라핀 용액으로 탈파라핀 시킨 다음, 용해 완충액을 투입한 후, 헤마톡실린과 에오신을 사용하여 염색하였다.
그 결과, 도 14에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 투여한 쥐의 간에서 우유 엑소좀을 투여하지 않은 간에서보다 지방구가 작고 적은 수로 나타나는 것으로 우유 엑소좀에 의해 간에서 지방이 적게 나타나는 것을 알 수 있었다.
6-4. 혈액 분석
고지방 식이를 한 쥐에서 혈액을 채취하였다. 혈액을 잘 혼합하여 방치한 후 30분이 경과하면 3,000 rpm에서 20분 정도 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 혈청을 free fatty acid assay kit(abcam), cholesterol assay kit(abcam), triglyceride quantification assay kit(abcam)를 사용하여 측정하였다.
그 결과, 도 15에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 투여한 경우 중성지방(도 15A), 유리지방산(도 15B), 및 LDL(도 15D)가 유의하게 감소되고 HDL(도 15C)이 유의하게 증가함을 확인하였다.
실험예 7. 우유 엑소좀 내의 miRNA(microRNA) 확인
우유 엑소좀에 존재하는 microRNA를 확인하기 위해 RNA-seq을 실시하였으며 이들 유전자 중에서 read-count 2000 이상인 miR-11987, miR-122, miR-11980, miR-21, miR-1777b miR-2478, miR-92a, miR-1777a 및 miR-2430을 선발하였다.
상기 선발된 9개의 microRNA의 백색지방의 갈색지방화 여부를 확인하기 위하여 3T3-L1 지방세포에 9개의 microRNA를 과발현 시킨 후, UCP1과 PGC-1α의 mRNA 발현을 비교하였다.
6 웰 플레이트에 3T3-L1 세포를 3x105 cells/ml이 되도록 분주하고 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 배양하였다. 3T3-L1 세포에 9개의 microRNA를 lipofectamine 2000을 사용하여 과발현시켰다. 그 후, 10 % 소 태아 혈청, 1 μM 덱타메타손, 10 μg/ml 인슐린, 0.5 mM 3-이소부틸-1-메틸잔틴이 포함된 세포 분화유도배지에서 배양하였다. 이틀 후, 10% 소 태아 혈청, 10 μg/ml 인슐린를 48시간 동안 처리하였다. 그 후, 10 % 소 태아 혈청이 포함한 배지에 이틀 동안 배양한 후, 세포를 수거하였다.
UCP1과 PGC-1α의 유전자 발현 측정은 실시간 중합효소 연쇄반응을 이용하여 확인하였다. 실시간 중합효소 연쇄반응은 상기 2-1에 기재된 바와 같으며, 이용한 프라이머 서열은 하기 표 4에 정리된 바와 같다.
또한, UCP1과 PGC-1α의 단백질 발현을 웨스턴블롯을 이용하여 확인하였으며 웨스턴블롯 방법은 상기 실험에 2-2에 기재된 바와 같다.
그 결과, 도 16에 나타난 바와 같이 9개의 microRNA 중 miR-11987, miR-122, miR-11980을 처리한 경우 UCP1과 PGC-1α의 mRNA(도 16A)와 단백질(도 16B) 발현량이 모두 증가되었음을 확인하였다.
상기 miR-11987, miR-122 및 miR-11980의 서열은 하기 표 5에 정리된 바와 같다.
실험예 8. miR-11987의 미토콘드리아 활성 효과 확인
3T3-L1 세포 및hADSC세포 각각에 miR-11987을 과발현시킨 후, 상기 실험예 4와 동일한 방법을 이용하여 미토콘드리아 활성을 확인하였다. miR-11987의 과발현 방법은 상기 실험예 7에 기재된 방법과 동일하다.
8-1. 전자전달계 관련 단백질 발현 증가 확인
상기 4-1과 동일한 방법을 이용하여 전자전달계 관련 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 17에 나타난 바와 같이 3T3-L1 세포 및 hADSC 세포 모두에서 우유 엑소좀을 처리한 경우 미토콘드리아 내 전자전달계 활성에 관여하는 단백질들의 발현이 증가함을 확인하였다(도 17A 및 도 17B).
8-2. 산소 소비율 증가 확인
상기 4-2와 동일한 방법을 이용하여 산소 소비율을 확인하였다.
그 결과, miR-11987이 과발현 된 경우, 3T3-L1 세포(도 18A) 및 hADSC(도 18B) 모두에서 우유 엑소좀을 처리에 의해 산소 소비율이 증가됨을 확인하였다.
실험예 9. miR-11987의 표적 유전자 확인
9-1. miR-11987의 표적 유전자인 Runx1t1 결합 부위 확인
miR-11987에 의해 영향을 받는 세포 내의 유전자를 조사하였다. 구체적으로, microRNA의 표적 유전자와 결합 부위를 예측할 수 있는 프로그램인 miRDB를 이용하여 miR-11987에 결합하는 쥐와 인간에 존재하는 유전자를 조사하였으며, 그 결과 Runx1t1(RUNX1 Partner Transcriptional Co-Repressor 1)을 선발하였다.
Runx1t1 유전자는 miR-11987과 반응하는 부위가 다른 종들과 보존되어 있으며, 갈색/베이지 지방세포를 유도하는 조절자인 C/EBPβ와 PRDM16의 발현을 억제시킨다. miR-11987이 Runx1t1 유전자를 직접적으로 조절하는지 알아보기 위하여 먼저 miR-11987이 Runx1t1에 반응하는 부위를 조사하였으며, 반응하는 부위를 돌연변이 시킨 플라스미드를 제작하였다.
구체적으로, miR-11987이 결합하는 부위를 함유한 Runx1t1 단편을 psiCHECK2 벡터에 삽입하여 재조합 벡터(psiCHECK2-Runx1t1-wt)를 구축하였다. 이후 QuickChange site-directed mutagenesis kit(Stratagene)을 활용하여 miR-11987에 결합하는 Runx1t1 부위를 돌연변이 시켜 돌연변이시켰다(psiCHECK2-Runx1t1-mut).
miR-11987의 Runx1t1에 결합하는 부위에 관한 모식도는 도 19에 나타난 바와 같다.
9-2. Runx1t1에 대한 miR-11987의 발현 조절 확인
miR-11987에 의한 Runx1t1 조절 여부를 조사하기 위해 루시퍼라제 리포터 분석을 실시하였다.
Cos7 세포주를 3x104 cells/well로 분주하여 24 웰 플레이트에서 24시간 배양하였다. 구축한 psiCHECK2-Runx1t1(50 ng)와 miR-11987 mimic(50nM) (Genepharm)를 리포펙타민 2000(lipofectamine 2000, Invitrogen)을 사용하여 세포에 주입하여 형질전환을 유도하였다. 형질전환 세포는 2일간 배양한 후 TD-20/20 Luminometer (Turner Biosystems)를 사용하여 dual luciferase assay kit(promega)로 루시퍼라제 활성을 측정하였다.
그 결과, 도 20에 나타난 바와 같이 miR-11987을 도입한 세포에서 Runx1t1이 약 48 %로 유의하게 루시퍼라아제 활성이 감소하였고, miR-11987에 반응하는 Runx1t1을 돌연변이시킨 플라스미드에서는 대조군과 차이가 없는 것을 확인하였다.
또한, miR-11987을 도입한 3T3-L1 세포 및hADSC세포 각각에 우유 엑소좀 50 μg/ml에 NC-inhibitor(genepharma catalog number B04003)와 miR-11987 억제제(genepharma catalog number B03001)를 각각 50 nM농도로 sonicator를 이용하여 넣은 후, 분화 배지와 함께 같이 처리하여 6 일 동안 배양하였다. miR-11987이 억제되었을 때 Runx1t1의 단백질 발현을 확인하였다. 대조 시약으로 NC-억제제를 처리하였다.
그 결과, 도 21에 나타난 바와 같이 miR-11987 억제제를 처리한 경우 3T3-L1 세포(도 21A) 및 hADSC세포(도 21B) 모두에서 우유 엑소좀에 의해 감소하였던 Runx1t1의 단백질 발현이 다시 증가함을 확인하였다. 이로부터 miR-11987이 Runx1t1 유전자를 직접적으로 억제함을 확인하였다.
실험예 10. C/EBPβ 및 PRDM16 발현 증가 확인
10-1. Runx1t1 siRNA의 제작 및 확인
Runx1t1 및 NC(Negative control) siRNA는 gepharma 사에서 구입하였으며, Runx1t1 siRNA(si-Runx1t1) 및 NC siRNA(si-NC)의 서열은 하기 표 6에 정리된 바와 같다. siRNA의 세포 내 도입은 gepharma사의 설명서에 따라 수행하였다.
10-2. Runx1t1 siRNA 도입에 따른 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현 증가 확인
상기 10-1에서 제작된 Runx1t1 siRNA(si-Runx1t1)을 3T3-L1 세포 및 hADSC 세포 각각에 도입한 후 웨스턴블롯을 통해 C/EBPβ 및 PRDM16 발현이 증가되는지 확인하였다.
구체적으로, 3T3-L1 세포 및 hADSC를 각각 3x105 cells/ml 로 6 웰 플레이트에 분주하고, si-Runx1t1을 리포펙타민 2000을 이용하여 세포를 주입하였다. 그 후, 지방 분화 배지를 이용하여 6 일 동안 배양하였다. 이후 세포를 수거하여 웨스턴블롯을 수행하였으며, 웨스턴블롯 방법은 상기 2-2에 기재된 바와 같다. 본 웨스턴블롯에서의 1차 항체는 C/EBPβ(Abcam) 및 PRDM16(R&D systems)에 대한 항체를 이용하였다.
그 결과, 도 22에 나타난 바와 같이 3T3-L1 세포(도 22A) 및 hADSC세포(도 22B) 모두에서 Runx1t1 siRNA를 도입한 경우 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현이 중가하는 것을 확인하였다.
10-3. 우유 엑소좀 처리에 따른 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현 증가 확인
3T3-L1 및 hADSC 세포주를 각각 3Х105 cells/well로 6 웰 플레이트에 분주한 후, 분화배지와 함께 우유 엑소좀을 처리하고 3T3-L1은 6일 동안, ADSC는 14일 동안 분화 유도 후 수거하였다. 수건한 세포에서C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 23에 나타난 바와 같이 우유 엑소좀을 처리한 경우 3T3-L1 세포(도 23A) 및 hADSC세포(도 23B) 모두에서 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현이 증가하였으며, 우유 엑소좀의 농도가 증가할수록 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현이 더욱 증가함을 확인하였다.
10-4. miR-11987 과발현에 따른 C/EBPβ 및 PRDM16 발현 증가 확인
3T3-L1 세포 및 hADSC 세포 각각에 상기 실험예 7과 동일한 방법으로 miR-11987을 과발현시킨 후 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현을 확인하였다.
그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이 miR-11987이 과발현 된 경우 3T3-L1 세포(도 24A) 및 hADSC세포(도 24B) 모두에서 C/EBPβ 및 PRDM16 단백질 발현이 증가한 것을 확인하였다.
실험예 12. 우유 엑소좀에 의한 Runx1t1발현 감소 확인
C57BL6/J 마우스(웅성, 8주령, 라온바이오)에 마우스에 14주 동안 3일에 한번씩 우유 엑소좀을 경구투여하고, 쥐를 안락사 시킨 후 개복하여 서혜부에서 지방조직인 iWAT를 분리하였다.
우유 엑소좀은 50, 150, 300 μg/ml의 농도로 투여하였다(0 ug/ml (Control): 4 마리, 50 ug/ml exosomes: 3 마리, 100 ug/ml exosomes: 3 마리, 300 ug/ml exosomes: 3 마리).
이후 상기 iWAT 내의 우유 엑소좀에 의한 Runx1t1(Proteintech), C/EBPβ 및 PRDM16의 단백질 발현 정도를 웨스턴블롯을 통해 확인하였다. 웨스턴블롯 방법은 상기 10-2에 기재된 바와 같다.
그 결과, 도 25에 나타난 바와 같이 마우스의 지방 조직에서도 우유 엑소좀에 의해 Runx1t1의 발현은 감소하고(도 25A), 반대로 C/EBPβ와 PRDM16의 발현량은 증가함을 확인하였다(도 25B).
상기와 같은 결과는 우유 엑소좀이 C/EBPβ와 PRDM16의 발현을 증가시킴으로써 백색지방의 갈색지방화를 유도함을 나타내는 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> University-Industry Cooperation Group of Kyung Hee University <120> COMPOSITION COMPRISING MILK EXOSOMES FOR INDUCING BROWNING OF WHITE ADIPOSE TISSUE <130> 20PP30485 <160> 59 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CITED1 Forward primer(mouse) <400> 1 aaccttggag tgaaggatcg c 21 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CITED1 Reverse primer(mouse) <400> 2 gtaggagagc ctattggaga tgt 23 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPB7 Forward primer(mouse) <400> 3 gagcatgttt tcagacgact ttg 23 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSPB7 Reverse primer(mouse) <400> 4 ccgagggtct tgatgtttcc tt 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF9 Forward primer(mouse) <400> 5 cgtgcagaac tcctgtgata ac 22 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF9 Reverse primer(mouse) <400> 6 gtccacctat gctggagaag g 21 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF9 Forward primer(human) <400> 7 ggcaggtgta gctgaggtt 19 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNFRSF9 Reverse primer(human) <400> 8 ggacagggac tgcaaatctg at 22 <210> 9 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAR2 Forward primer(mouse) <400> 9 gaggacgatt cggcgtcac 19 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAR2 Reverse primer(mouse) <400> 10 gtaatgcttt ccactggact tgt 23 <210> 11 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAR2 Forward primer(human) <400> 11 gagcggcaag cattacggt 19 <210> 12 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EAR2 Reverse primer(human) <400> 12 ggcaggtgta gctgaggtt 19 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 Forward primer(mouse) <400> 13 tgtcatctgt gaaaaggtgg tc 22 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 Reverse primer(mouse) <400> 14 actggagcag cggtgttatg 20 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 Forward primer(human) <400> 15 actgaaacgg aatgccttcc t 21 <210> 16 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CD40 Reverse primer(human) <400> 16 cctcactcgt acagtgcca 19 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBF3 Forward primer(mouse) <400> 17 tcaccctccc ttcaaactgt a 21 <210> 18 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBF3 Reverse primer(mouse) <400> 18 gtttcactgc ggagatgaca t 21 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBF3 Forward primer(human) <400> 19 aacaggccat cgtctacgag 20 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EBF3 Reverse primer(human) <400> 20 ggcgtttcgt ttctattgcc a 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EVA1A Forward primer(mouse) <400> 21 ggggagaccg aaggaaatga ga 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EVA1A Reverse primer(mouse) <400> 22 ctccagccct gcacactcta 20 <210> 23 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EVA1A Forward primer(human) <400> 23 gcaagacgcg aaacctgaac 20 <210> 24 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EVA1A Reverse primer(human) <400> 24 ttcaaatctg ggctcgtccc 20 <210> 25 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDK4 Forward primer(mouse) <400> 25 agggaggtcg agctgttctc 20 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PDK4 Reverse primer(mouse) <400> 26 ggagtgttca ctaagcggtc a 21 <210> 27 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Forward primer(mouse) <400> 27 gtgacgttga catccgtaaa ga 22 <210> 28 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Reverse primer(mouse) <400> 28 gccggactca tcgtactcc 19 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Forward primer(human) <400> 29 catgtacgtt gctatccagg c 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin Reverse primer(human) <400> 30 ctccttaatg tcacgcacga t 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSL Forward primer <400> 31 atggatttac gcacgatgac a 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HSL Reverse primer <400> 32 tagcgtgaca tactcttgca g 21 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGL Forward primer <400> 33 caacgccact cacatctacg g 21 <210> 34 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATGL Reverse primer <400> 34 ggacacctca ataatgttgg cac 23 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4/80 Forward primer <400> 35 ccccagtgtc cttacagagt g 21 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4/80 Reverse primer <400> 36 gtgcccagag tggatgtct 19 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha Forward primer <400> 37 gacgtggaac tggcagaaga g 21 <210> 38 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TNF-alpha Reverse primer <400> 38 ttggtggttt gtgagtgtga g 21 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP1 Forward primer <400> 39 aggtgtccca aagaagctgt 20 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MCP1 Reverse primer <400> 40 aagaccttag ggcagatgca g 21 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 Forward primer <400> 41 acaagtccgg agaggagact 20 <210> 42 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-6 Reverse primer <400> 42 tgtgactcca gcttatctct tgg 23 <210> 43 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 Forward primer <400> 43 tgtgactcca gcttatctct tgg 23 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-10 Reverse primer <400> 44 ctgctgatcc tcatgccagt 20 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP1 Forward primer <400> 45 aggcttccag taccattagg t 21 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> UCP1 Reverse primer <400> 46 ctgagtgagg caaagctgat tt 22 <210> 47 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGC-1alpha Forward primer <400> 47 tatggagtga catagagtgt gct 23 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PGC-1alpha Reverse primer <400> 48 ccacttcaat ccacccagaa ag 22 <210> 49 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-11987 <400> 49 cgaggaaucu cugguggagg u 21 <210> 50 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-122 <400> 50 uggaguguga caaugguguu ug 22 <210> 51 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miR-11980 <400> 51 aggcaacggg cuuggcggag 20 <210> 52 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx1t1 siRNA(sense, mouse) <400> 52 guggaaacau cucgaucauc u 21 <210> 53 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx1t1 siRNA(Antisense, mouse) <400> 53 agaugaucga gauguuucca c 21 <210> 54 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx1t1 siRNA(sense, human) <400> 54 ggcgaucucu caccguacua a 21 <210> 55 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Runx1t1 siRNA(Antisense, human) <400> 55 uuaguacggu gagagaucgc c 21 <210> 56 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC siRNA(sense, mouse) <400> 56 uuuuccgaac gugucacgut t 21 <210> 57 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC siRNA(Antisense, mouse) <400> 57 acgugacacg uucggagaat t 21 <210> 58 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC siRNA(sense, human) <400> 58 uuuuccgaac gugucacgut t 21 <210> 59 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NC siRNA(Antisense, human) <400> 59 acgugacacg uucggagaat t 21

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  11. 우유 엑소좀을 인간을 제외한 백색 지방세포에 처리하는 단계를 포함하는, 백색 지방세포로부터 베이지 지방세포 또는 갈색 지방세포로의 분화 유도방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 우유 엑소좀은 miR-11987, miR-122 및 miR-11980으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 miRNA를 포함하는 것인, 분화 유도방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 miR-11987은 서열번호 49의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-122는 서열번호 50의 염기서열로 이루어지고,
    상기 miR-11980은 서열번호 51의 염기서열로 이루어진 것인, 분화 유도방법.
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