CN115038454A - 包含牛乳外泌体的用于诱导棕色脂肪化的组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及包含牛乳外泌体的用于诱导棕色脂肪化的组合物、用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物及用于改善代谢疾病的食品组合物。并且，本发明涉及通过处理上述牛乳外泌体来诱导从白色脂肪细胞分化为米色脂肪细胞或棕色脂肪细胞的方法及通过给药上述牛乳外泌体来治疗肥胖或代谢疾病的方法。
Description
技术领域
本发明涉及包含牛乳外泌体的用于诱导棕色脂肪化的组合物、用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物及用于改善代谢疾病的食品组合物。并且，涉及通过处理上述牛乳外泌体来诱导从白色脂肪细胞分化为米色脂肪细胞或棕色脂肪细胞的方法及通过给药上述牛乳外泌体来治疗肥胖或代谢疾病的方法。
背景技术
近来，随着肥胖问题的日益严重，肥胖本身是一种疾病的观念正在蔓延。判断是否为肥胖时，主要通过是否超重来判断，具体地，可由特定部位的体脂增加(例如，腹部肥胖等)判断。据报道，在分类为肥胖的情况下，即，肥胖者的发病率和死亡率高于其他疾病，与正常体重的人相比，糖尿病疾病的病死率高4倍、肝病病死率高2倍、脑血管疾病的病死率高1.6倍及冠状动脉疾病的病死率高1.8倍。
肥胖为脂肪的过度堆积为特征的具有各种原因的严重慢性综合征。肥胖的治疗主要有两个目标，一是燃烧过量的脂肪来减少体重，二是改善代谢失衡。腹部肥胖患者常伴有如X-综合征(胰岛素抵抗、2型糖尿病、高血压及脂质代谢异常)的病理状态，是早发型动脉硬化、缺血性心脏病及脑血管疾病的强危险因素。
随着肥胖、脂肪堆积引起的代谢疾病的增加，更加需要研究调节因脂肪细胞而积累的额外能量的技术。
发明内容
技术问题
本发明的目的在于，提供一种用于诱导棕色脂肪化的组合物，其包含牛乳外泌体。
本发明的再一目的在于，提供一种用于预防或治疗肥胖或代谢疾病的药物组合物，其包含牛乳外泌体。
本发明的另一目的在于，提供一种肥胖或代谢疾病的治疗方法，其包括向个体给药牛乳外泌体的步骤。
本发明的还有一目的在于，提供一种用于改善肥胖或代谢疾病的食品组合物，其包含牛乳外泌体。
本发明的又一目的在于，提供一种从白色脂肪细胞到米色脂肪细胞或棕色脂肪细胞的分化诱导方法，其包括在白色脂肪细胞处理牛乳外泌体的步骤。
技术方案
用于实现如上所述的目的的本发明的一方面涉及一种用于诱导棕色脂肪化的组合物，其包含牛乳外泌体。
本发明中，“牛乳外泌体”是指源自牛乳的脂质双层的囊泡。上述外泌体包含源自牛乳的特有蛋白质及核酸等，是大小为30nm～200nm的生物纳米颗粒，在内部包含由DNA、RNA、肽等组成的信息。外泌体从体液内分解酶等安全地运输内部的物质来向相邻细胞或远处的细胞传递信息，从而影响细胞周围的微环境。尤其，具有如下的优点：源自牛乳的牛乳外泌体不仅可作为食品使用，而且可提取大量的外泌体，并长时间稳定保存。
脂肪细胞为身体功能是储存身体所需的能量的细胞，必要时，通过分解中性脂肪(甘油三酯(triacylglyceride))来使用。众所周知，脂肪组织不仅执行能量储存功能，还起到执行作为内分泌器官调节包括脂肪代谢、糖代谢的体内能量代谢的功能的作用。并且，脂肪细胞在间充质前体细胞(mesenchymal precursor cell)经过前脂肪细胞(preadipocyte)分化为脂肪细胞，在分化过程中，通过形态变化、生物化学变化储存体内脂肪，脂肪组织的大小增加并从新的前脂肪细胞分化。
这种脂肪细胞的大小通常可通过饮食控制来实现，饮食控制对于新的前体脂肪细胞分化为脂肪细胞的过程没有效果，因此，为了肥胖的根本治疗或抑制，调节脂肪细胞的分化过程是重要的。
体内有白色脂肪、米色脂肪、棕色脂肪，白色脂肪为将通过食物摄入的葡萄糖和脂肪酸用作能量来源后堆积在细胞的脂肪。主要在紧急情况下作为身体的能量来源并起到吸收物理冲击的作用，但过量会导致肥胖、糖尿病等。
“棕色脂肪”是指将白色脂肪燃烧为能量并在燃烧的过程中产生热量来维持体温的带有棕色的脂肪。但是，棕色脂肪具有只有一部分成人所具有的局限。
难以制造体内不存在的棕色脂肪，但可通过激活米色脂肪来诱导其示出与棕色脂肪相同的功能。米色脂肪为大部分成人所具有的脂肪，可通过诱导棕色脂肪化来示出堆积的白色脂肪的燃烧，从而可诱导肥胖、糖尿病等的代谢疾病的治疗及改善。
本发明中，“棕色脂肪化”包括通过诱导白色脂肪的棕色脂肪化来诱导作为新形式的脂肪细胞的米色脂肪细胞和/或棕色脂肪细胞，并增大其代谢活性。并且，包括可通过对白色脂肪进行棕色脂肪化来产生通过解偶联蛋白1的脂肪燃烧效果。
在本发明的一实施例中，经确认，在处理牛乳外泌体的情况下，示出棕色脂肪化诱导效果，脂肪细胞分化为米色脂肪细胞来表达米色脂肪细胞特异性基因(图5)。并且，经确认，在对脂肪前体细胞及脂肪来源的干细胞处理牛乳外泌体的情况下，C/EBPβ和PRDM16的表达得以增加(图23)，在作为脂肪组织的腹股沟白色脂肪组织(inguinal white adiposetissue，iWAT)中也处理牛乳外泌体的情况下，增加C/EBPβ和PRDM16的表达，从而诱导白色脂肪的棕色脂肪化(图25B)。
具体地，上述牛乳外泌体可以包含选自由miR-11987、miR-122及miR-11980组成的组中的一种以上的miRNA。
更具体地，上述miR-11987可由序列编号(SEQ ID NO.)35的碱基序列组成，上述miR-122可由序列编号36的碱基序列组成，上述miR-11980可由序列编号37的碱基序列组成。
并且，具体地，上述牛乳外泌体可来源于牛。
在本发明的一实施例中，确认存在于牛乳外泌体中的microRNA，尤其，经确认，在过表达miR-11987、miR-122和/或miR-11980的情况下，解偶联蛋白1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的表达增加(图16)。由此，可通过包含选自由miR-11987、miR-122及miR-11980组成的组中的一种以上的miRNA的牛乳外泌体诱导棕色脂肪化。
并且，具体地，上述牛乳外泌体增加解偶联蛋白1(uncoupling protein-1，UCP-1)或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(Peroxisome proliferator-activatedreceptor gamma coactivator 1-alpha，PGC-1α)的表达。
上述解偶联蛋白1在棕色脂肪中被激活以增加生热作用(thermogenesis)，在作为诱发生热作用的其他器官的肌肉中，参与通过增加脂肪酸化率来促进能量消耗。
上述过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α通过与过氧化物酶体增殖物激活受体-α(PPAR-α)及过氧化物酶体增殖物激活受体-β(PPAR-β)结合来增加与脂肪酸氧化相关的基因的表达，通过与作为核受体的雌激素受体相关受体(estrogen receptorrelated receptor，ERR)结合来减少葡萄糖氧化。并且，通过与作为转录因子的核呼吸因子-1(nuclear respiratory factor 1，NRF-1)结合来增加氧化磷酸化(OXPHOS)相关基因的转录，通过促进线粒体增殖和DNA的转录来增加线粒体的生成。
在本发明的一实施例中，当处理牛乳外泌体时，在脂肪前体细胞及脂肪来源的干细胞中确认参与生热作用的解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的蛋白质表达增加(图6)，当在诱导肥胖的小鼠内的脂肪组织处理牛乳外泌体时，确认了解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的蛋白质表达增加(图8A)。
即，本发明的牛乳外泌体通过诱导棕色脂肪化来增加解偶联蛋白1的表达，从而促进生热作用，并激活体内代谢来使堆积的脂肪燃烧。
本发明的再一方面涉及一种用于预防或治疗肥胖或代谢疾病的药物组合物，其包含牛乳外泌体。
本发明中，“肥胖”是指大部分摄取的热量中消耗后剩余部分转化为脂肪细胞(adipocyte)来堆积在体内的皮下组织和腹腔内。脂肪细胞的大小是有限制的，因此，在摄取过多的能量的情况下，脂肪细胞的数量增加，由于这样堆积的脂肪细胞，激素、生长因子、细胞因子等生物调节因子受到影响而导致代谢障碍、代谢疾病等。
作为现有的抗肥胖剂具有抑制糖生成的噻唑烷二酮(thiazolidinediones，TZDs)、抑制脂肪吸收的西布曲明(sibutramine)等，但这些本来是抗抑郁剂，据报道，其导致心血管系统、中枢神经系统、肝脏、肾脏等紊乱而引起副作用。本发明的牛乳外泌体不仅可示出抗肥胖效果，还作为天然来源的材料，其副作用及毒性降低。
本发明中，“代谢疾病”还称为代谢综合征、代谢性综合征。由于生活环境、摄入过多的营养及能量消耗不足等诱发代谢障碍，体内能量和/或脂肪堆积而诱发的肥胖为原因。
具体地，上述代谢疾病可以为选自由糖尿病、高脂血症、高胆固醇血症、动脉硬化及脂肪肝组成的组中的一种以上，但并不局限于此。并且，还可包括因脂肪堆积而诱发的代谢障碍。
上述代谢疾病可通过促进体内代谢并燃烧体内堆积的脂肪来改善。
在本发明的一实施例中，确认在处理牛乳外泌体的情况下，促进线粒体活性，具体地，确认了作为电子传递链相关蛋白的泛醌氧化还原酶亚基B8(NADH:ubiquinoneoxidoreductase subunit B8，NDUFB8)、琥珀酸脱氢酶复合物铁硫亚基B(SuccinateDehydrogenase Complex Iron Sulfur Subunit B，SDHB)、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2(Ubiquinol-Cytochrome C Reductase Core Protein 2，UQCRC2)、细胞色素c氧化酶亚基IV(cytochrome c oxidase subunit IV，COX IV)及ATP合酶F1亚基α(ATP synthase F1subunit alpha，ATP5A；mitochondrial)的表达增加(图9)、耗氧率的增加(图10)。
并且，确认在处理牛乳外泌体的情况下，脂肪细胞及肌肉细胞中均增加细胞内的血糖吸收(图11A及图11B)，原代肝细胞(primary hepatocytes)中的血糖生成减少(图11C)。同时，经确认，在处理牛乳外泌体的情况下，血清胰岛素减少(图11D)，本发明的牛乳外泌体可改善胰岛素代谢。
并且，确认了，在对肥胖模型小鼠处理牛乳外泌体的情况下，炎症因子的表达减少及抗炎因子的表达增加(图12)，作为脂肪肝的标志物的谷丙转氨酶(ALT)水平减少(图13)，中性脂肪(图15A)、游离脂肪酸(图15B)及低密度脂蛋白(LDL)(图15D)显著减少，高密度脂蛋白(HDL)(图15C)显著增加。
如上所述，确认本发明的牛乳外泌体示出线粒体激活效果、胰岛素阻抗改善效果及肥胖引起的代谢功能异常改善效果，还可用作肥胖和/或代谢疾病的治疗用途。
具体地，上述牛乳外泌体可包含选自由miR-11987、miR-122及miR-11980组成的组中的一种以上的miRNA。
更具体地，上述miR-11987可由序列编号49的碱基序列组成，上述miR-122可由序列编号50的碱基序列组成，上述miR-11980可由序列编号51的碱基序列组成。
为了给药，除了上述本发明的牛乳外泌体之外，本发明的药物组合物可包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。上述载体、赋形剂及稀释剂可例举乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
并且，本发明的药物组合物能够以任何剂型应用，更具体地，可以为用于肠胃外给药的剂型。用于肠胃外给药的剂型可以为注射用、涂敷用、气溶胶等的喷雾型。更具体地，可以为注射剂形式。
用于肠胃外给药的制剂包括灭菌水溶液、非水溶剂、悬浮剂、乳液、冷冻干燥制剂或栓剂。作为非水溶剂和悬浮剂，可使用丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇、橄榄油等植物油、油酸乙酯等可注射酯等。
本发明的另一方面涉及肥胖或代谢疾病的治疗方法，其包括以药学有效量向需要治疗的个体给药牛乳外泌体的步骤。“肥胖”、“代谢疾病”与上述说明相同。
在本发明中，“药学有效量”是指足以治疗疾病的量，以使用于任何医疗的合理利益/风险比率，有效量水平可根据患者的性别、年龄、疾病的种类、疾病的严重程度、药物的活性、对药物的敏感性、给药时间、给药途径、排泄率、治疗持续时间、一同使用的药物以及医学领域已知的其他因素来确定。
可将本发明的药物组合物作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂联合给药，可与现有的治疗剂连续(serially)给药或同时给药。并且，可将本发明的药物组合物单次给药或多次给药。考虑到所有因素，重要的是，以能够以最小的量获得最大效果而没有副作用的量给药，普通技术人员可容易确定其量。
本发明的术语“个体”为患有可通过给药本发明的药物组合物来缓解症状的代谢疾病的动物或人。可通过将本发明的用于治疗的组合物给药至个体来有效预防及治疗代谢疾病。
本发明的术语“给药”是指通过任何适当的方法将规定物质提供给人或动物，对于本发明的用于治疗的组合物的给药途径，只要可到达目标组织，可通过任何常规途径口服给药或肠胃外给药。并且，本发明的用于治疗的组合物可通过可使有效成分移动至靶细胞的任何装置给药。
本发明的药物组合物的优选给药量根据患者的状态及体重、疾病的程度、药物形式、给药途径及给药持续时间不同，可被普通技术人员适当选择。
本发明的还有一方面涉及一种用于改善肥胖或代谢疾病的食品组合物，其包含牛乳外泌体。
上述食品的种类没有特别限制。可添加本发明的牛乳外泌体的食品有香肠、肉、面包、巧克力、零食、糖果、糖果糕点、拉面、比萨、其他面条、口香糖、乳制品(包括冰淇淋)、各种汤、饮料、茶、保健饮料、酒精饮料、维生素复合物等。在剂型化为饮料的情况下，除了本发明的牛乳外泌体外，作为所添加的液体成分虽并不限定于此，如通常的饮料可包含各种调味剂或天然碳水化合物等作为附加成分。上述的天然碳水化合物可以为单糖(例如，葡萄糖、果糖等)、二糖(例如，麦芽糖、蔗糖等)及多糖(例如，常规糖如糊精、环糊精等)以及糖醇，例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓糖醇等。
上述食品的种类具体可以为保健功能食品。上述保健功能食品可包含各种营养素、维生素、矿物质(电解质)、调味剂(例如合成调味剂、天然调味剂等)、着色剂和增强剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、有机酸、保护性胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇、碳酸饮料中使用的碳酸化剂等。此外，本发明的保健功能食品可包含果肉以用于制备基于水果和蔬菜饮料。这些成分可以单独使用或组合使用。
上述保健功能食品为强调食品的身体调节功能的食品，为通过物理、生物化学或生物工程方法而赋予附加价值以出于特定目的而工作和表达的食品。这种保健功能食品的成分经过设计和加工，以在体内充分发挥身体的调节功能，例如保护生物体、调节身体节律、预防疾病和从疾病中恢复，并且可以包含作为食品可接受的食品补充添加剂、甜味剂或功能性原料。
在将本发明的牛乳外泌体用作保健功能食品(或保健功能饮料添加物)的情况下，直接添加上述牛乳外泌体或者与其他食品或食品成分一同使用，可根据常规方法适当使用。上述牛乳外泌体的混合量可根据其使用目的(预防、保健或改善、治疗处置)适当确定。
本发明的又一方面涉及一种从白色脂肪细胞到米色脂肪细胞或棕色脂肪细胞的分化诱导方法，其包括将牛乳外泌体处理在白色脂肪细胞的步骤。
具体地，上述牛乳外泌体可包含选自由miR-11987、miR-122及miR-11980组成的组中的一种以上的miRNA。
更具体地，上述miR-11987可由序列编号49的碱基序列组成，上述miR-122可由序列编号50的碱基序列组成，上述miR-11980可由序列编号51的碱基序列组成。
在本发明的一实施例中，确认在处理牛乳外泌体的情况下，示出棕色脂肪化诱导效果(图5、图23及图25)，可通过利用本发明的牛乳外泌体促进棕色脂肪化，由此，可诱导将白色脂肪分化为米色脂肪或棕色脂肪。
发明的效果
本发明的包含牛乳外泌体的组合物诱导白色脂肪细胞的棕色脂肪化，来促进体内生热作用，从而可增加能量消耗来增加脂肪细胞的热量消耗。
并且，本发明的牛乳外泌体为天然材料、无毒性，且具有优秀的生物相容性，可广泛用于肥胖或代谢疾病的治疗。
本发明的效果并不限定于上述的效果，应理解为包括可从本发明的详细说明或发明要求保护范围中记载的发明的结构推论的所有效果。
附图说明
图1为确认牛乳外泌体的大小的结果。
图2为确认牛乳外泌体标记蛋白TSG101、CD9及HSP70的表达的结果。
图3为利用电子显微镜确认牛乳外泌体的形状及大小的结果。
图4为确认牛乳外泌体的细胞内吸收的结果。
图5为确认牛乳外泌体的棕色脂肪化诱导效果引起的米色脂肪细胞分化效果的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图6为确认借助牛乳外泌体的解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α蛋白质表达的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图7为确认高脂饮食肥胖小鼠模型中的牛乳外泌体的肥胖治疗效果的结果(A：确认体重增加率减少效果，B：确认食物摄入没有显著变化，C：确认体型减少效果)。
图8A为确认牛乳外泌体的腹股沟白色脂肪组织内解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α蛋白质表达的结果。
图8B为确认牛乳外泌体的脂肪分解相关基因的表达的结果。
图8C为确认通过牛乳外泌体的棕色脂肪化而示出的米色脂肪细胞特异性基因的表达的结果。
图9为确认牛乳外泌体的电子传递链相关蛋白质表达增加的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图10为确认牛乳外泌体的耗氧率增加的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图11为确认牛乳外泌体的胰岛素阻抗性改善效果的结果(A：3T3-L1细胞中的血糖吸收能力确认，B：C2C12细胞中的血糖吸收能力确认，C：原代肝细胞中的血糖生成确认，D：血清胰岛素减少确认)。
图12为确认牛乳外泌体的炎症因子及抗炎因子的mRNA表达的结果(A：F4/80，B：TNF alpha，C：MCP1，D：IL-6，E：IL-10)。
图13为确认牛乳外泌体的谷丙转氨酶水平的减少效果的结果。
图14为确认给药牛乳外泌体后的脂肪球的结果。
图15示出分析给药牛乳外泌体后的血液的结果(A：中性脂肪，B：游离脂肪酸，C：高密度脂蛋白，D：低密度脂蛋白)。
图16为确认牛乳外泌体内的miRNA过表达引起的解偶联蛋白1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的表达变化的结果(A：mRNA表达确认，B：蛋白质表达确认)。
图17为确认miR-11987过表达引起的电子传递链相关蛋白质表达增加的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图18为确认miR-11987过表达引起的耗氧率增加的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图19为示出与miR-11987的Runx1t1结合的位点的示意图。
图20为示出miR-11987引起的Runx1t1表达减少的结果。
图21为通过处理miR-11987抑制剂而确认因牛乳外泌体而减少的Runx1t1的蛋白质表达的再次增加的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图22为示出确认Runx1t1 siRNA引入引起的C/EBPβ及PRDM16蛋白质表达增加的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图23为确认牛乳外泌体引起的C/EBPβ及PRDM16蛋白质表达增加的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图24为确认miR-11987过表达引起的C/EBPβ及PRDM16蛋白质表达增加的结果(A：3T3-L1细胞，B：hADSC细胞)。
图25为确认腹股沟白色脂肪组织内的牛乳外泌体引起的Runx1t1、C/EBPβ及PRDM16的蛋白质表达的结果(A：Runx1t1，B：C/EBPβ及PRDM16)。
最优实施方式
以下，通过实施例详细说明本发明。但，下述实施例仅用于例示本发明，本发明并不限定于下述实施例。
实施例1.制备牛乳外泌体(milk exosome)
利用离心机从来源于牛的牛乳中提取外泌体。更具体地，将牛乳接种在管中，并分别以2000g和10000g离心分离10分钟来收集上清液。利用0.45μm、0.2μm的过滤器过滤上清液后，混合磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)。之后，将外泌体沉淀液(Exoquick exosome precipitation solution)(System Biosciences)与磷酸盐缓冲液混合并添加后，静置30分钟，以10000g再次离心分离10分钟。去除上清液并将外泌体颗粒溶解在磷酸盐缓冲液后，再次以1000g离心分离1分钟后，将上清液用于实验。
实验例1.确认牛乳外泌体的特性
1-1.测量牛乳外泌体的大小
为了确认牛乳外泌体的大小，通过动态光散射(dynamic light scattering，DLS)测量外泌体的大小，由此确认示出200nm以内的大小(图1)。
1-2.确认TSG101、CD9及HSP70蛋白质表达
利用蛋白免疫印迹确认是否表达作为牛乳外泌体标记蛋白的TSG101、CD9及HSP70。
在牛乳外泌体中，利用10％的十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质。将分离的上述蛋白质移至硝酸纤维素膜(GE Health care)后，为了防止抗体的非特异性结合，在5％的脱脂奶粉中反应1小时。将TSG101(Abcam)、CD63(Abcam)及HSP70(Invitrogen)的一抗分别以1∶1000的比例稀释，并在4℃的温度下与膜结合12小时～18小时。之后，与HRP标记的抗兔(HRP-tagged anti-rabbit)(KPL)抗体结合来在常温条件下反应30分钟。通过使用ECL试剂盒(Advansta Inc)观察了蛋白带。
结果如图2所示，确认在外泌体中明显观察到作为外泌体标记蛋白的TSG101、CD9及HSP70蛋白质，除外泌体之外，在上清液中未表达。
1-3.确认外泌体的形状及大小
利用电子显微镜观察了从上述实施例1中提取的牛乳外泌体的形状及大小。结果如图3所示，确认外泌体在200nm的大小内以圆形纳米粒子形式存在。
1-4.确认外泌体的细胞内吸收
为了确认从牛乳提取的外泌体是否吸收至细胞内，将外泌体利用PKH26染色液处理5分钟，并将染色在3T3-L1脂肪前体细胞、脂肪来源的干细胞(Adipose derivedmesenchymal stem cell，ADSC)及C2C12肌肉细胞的外泌体反应3小时后，观察了荧光。
具体地，向外泌体颗粒添加1ml的稀释液C(Diluent C)，并将1ml的稀释液C与4μl的PKH26(Sigma)混合来制备染色溶液(stain solution)。将上述染色溶液与添加稀释液C的外泌体混合并反应5分钟，并添加1％的牛血清白蛋白(bovine serum albumin)来停止反应。使用外泌体沉淀液(System Biosciences)并根据制造商的方案提取利用PKH26标记的外泌体。之后，利用荧光显微镜(CELENA S digital imaging system，Logos Biosystems)观察。
结果，如图4所示，确认染色的外泌体进入至3T3-L1脂肪细胞、脂肪来源的干细胞(hADSC)及C2C12肌肉细胞内。由此，从牛乳提取外泌体，并确认示出所提取的外泌体的细胞内吸收。
实验例2.确认牛乳外泌体的白色脂肪的棕色脂肪化诱导效果
向6孔板接种3T3-L1细胞和脂肪来源的干细胞以成为3×105cells/ml，在37℃、5％的CO2条件的培养箱中培养。若3T3-L1细胞饱和，则在包含10％的胎牛血清、1μM的地塞米松、10μg/ml的胰岛素及0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的细胞分化诱导培养基中培养。两天后，将10％的胎牛血清、10μg/ml的胰岛素处理48小时。之后，在包含10％的胎牛血清的培养基中培养两天。
并且，若脂肪来源的干细胞饱和，则每两天一次更换包含10％的胎牛血清、1μM的地塞米松、10μg/ml的胰岛素、0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及100uM的吲哚美辛的细胞分化诱导培养基来进行培养，培养持续14天。
之后，利用实时聚合酶链式反应及蛋白免疫印迹与脂肪分化培养基一同处理20μg/ml、50μg/ml的乳外泌体。即，在脂肪分化诱导过程中，每两天一次处理牛乳外泌体。之后，通过确认米色脂肪细胞特异性基因的表达来确认了白色脂肪的棕色脂肪化诱导效果。
2-1.确认米色脂肪细胞特异性基因的表达
为了确认牛乳外泌体是否影响白色脂肪的棕色脂肪化，通过实时聚合酶链式反应(real-time PCR)确认作为通过白色脂肪的棕色脂肪化而示出的米色脂肪细胞特异性基因的CBP/P300结合转化激活因子含GLU/ASP丰富羧基末端域1(Cbp/P300 InteractingTransactivator With Glu/Asp Rich Carboxy-Terminal Domain 1，CITED1)、小热休克蛋白7(Heat Shock Protein Family B(Small)Member 7，HSPB7)、肿瘤坏死因子受体超家族成员9(TNF Receptor Superfamily Member 9，TNFRSF9)、EAR2(COUP TF-gamma，ERBAL2；NR2F6)、CD40、EBF3(EBF Transcription Factor 3)、EVA1A(eva-1homolog A)及丙酮酸脱氢酶激酶4(Pyruvate Dehydrogenase Kinase 4，PDK4)基因的表达。
具体地，将3T3-L1及hADSC细胞株分别以3×105cells/well接种在6孔板后，与分化培养基一同处理牛乳外泌体，将3T3-L1分化诱导6天后收集细胞，将ADSC分化诱导14天后收集细胞。在收集的上述细胞反应Tri试剂(Bioline)来分离total RNA。为了实施逆转录反应，向1μg的RNA添加dNTP、M-MLV逆转录酶(Promega)后，在37℃的温度下反应1小时来合成cDNA。为了检测CITED1、HSPB7、TNFRSF9、EAR2、CD40、EBF3、EVA1A及PDK4 mRNA的表达，利用SYBR Green PCR Master mix(Bioline)执行实时聚合酶链式反应。用于扩增特定基因的PCR条件如下。在95℃的温度下反应10分钟后，以95℃且5秒、60℃且10秒、72℃且15秒为一个周期来扩增40个循环(cycles)。利用对于肌动蛋白(actin)表达量的相对表达量校正靶基因mRNA的表达量。所使用的引物如下述表1所示。
表1
结果，如图5A所示，确认在向作为肪前体细胞的3T3-L1细胞处理牛乳外泌体的情况下，作为通过棕色脂肪化而示出的米色脂肪细胞特异性基因的CITED1、HSPB7、TNFRSF9、EAR2、CD40、EBF3、EVA1A及PDK4的表达均显著增加。
并且，如图5B所示，确认在向脂肪来源的干细胞(hADSC)中也处理牛乳外泌体的情况下，作为通过棕色脂肪化而示出的米色脂肪细胞特异性基因的TNFRSF9、EAR2、CD40、EBF3及EVA1A的表达增加。
确认在通过如上所述的基因表达变化处理牛乳外泌体的情况下，诱导棕色脂肪化来分化为米色脂肪细胞，进而，确认随着牛乳外泌体的浓度的增加，棕色脂肪化的诱导增加。
2-2.确认解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α蛋白质
表达
为了确认牛乳外泌体是否影响作为发热基因的解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的表达，确认解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的蛋白质表达程度。
将3T3-L1及hADSC细胞株分别以3×105cells/well接种在6孔板后，与分化培养基一同处理牛乳外泌体，将3T3-L1分化诱导6天后收集，将ADSC分化诱导14天后收集。将收集的细胞在16500g中离心分离15分钟来提取上清液后，利用BSA试剂盒(Bio-rad)定量蛋白质浓度。
对于所提取的蛋白质，利用10％的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白质。将分离的上述蛋白质移动至硝酸纤维素膜(GE Health care)后，为了防止抗体的非特异性结合，在5％的脱脂奶粉反应1小时。将解偶联蛋白1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α及β-肌动蛋白(Sigma)的一抗以1:1000的比例稀释，在4℃的温度下与硝酸纤维素膜反应12小时至18小时。之后，利用磷酸盐缓冲液洗涤后，添加HRP标记的抗兔(KPL)抗体来在常温条件下反应30分钟。使用ECL试剂盒(Santa Cruz Inc.)观察蛋白带。
结果，如图6所示，在处理牛乳外泌体的情况下，确认在作为脂肪前体细胞的3T3-L1细胞(图6A)及作为脂肪来源的干细胞的hADSC(图6B)中，解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的蛋白质表达均增加，确认随着处理的牛乳外泌体的浓度的增加，蛋白质表达进一步增加。如上所述的结果表示本发明的牛乳外泌体诱导棕色脂肪化。
实验例3.确认高脂饮食肥胖小鼠模型中的肥胖治疗效果
3-1.观察体重及外观
为了确认牛乳外泌体的肥胖治疗效果，对C57BL6/J小鼠(雄性，8周龄，Raonbio)喂食14周的高脂饮食(high fat diet，HFD)并口服给药牛乳外泌体(0ug/ml(对照(Control))：4只，50ug/ml的外泌体(exosomes)：3只，100ug/ml的外泌体：3只，300ug/ml的外泌体：3只)。
具体地，将上述外泌体以50μg/ml、150μg/ml、300μg/ml的浓度给药14周后，测量体重变化，阴性对照组使用不包含外泌体的磷酸盐缓冲液。14周后，为了确认肥胖治疗效果，观察了体重变化及外观。
结果，如图7A所示，在给药牛乳外泌体的情况下，体重增加率减少，但如图7B所示，根据给药牛乳外泌体的食物摄取没有差异。尤其，随着牛乳外泌体的给药浓度的增加，体重增加率进一步减少，从图7A及图7B确认牛乳外泌体的给药在并未减少食物摄取的情况下也可示出减少体重增加率的效果。
并且，如图7C所示，确认在给药牛乳外泌体的情况下，体型也减少，从而使体型显得小。
3-2.确认蛋白质表达
将上述高脂饮食肥胖小鼠模型安乐死后，剖腹并分离作为腹股沟区脂肪组织的腹股沟白色脂肪组织。
之后，通过蛋白免疫印迹确认上述腹股沟白色脂肪组织内的解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的蛋白质表达程度。蛋白免疫印迹方法如在上述2-2中记载。
图8A内的各泳道数与摘取腹股沟白色脂肪组织的小鼠的数量相同(0ug/ml的外泌体(对照)：4只，摄入50ug/ml的外泌体的小鼠：3只，摄入100ug/ml的外泌体的小鼠：3只，摄入300ug/ml的外泌体的小鼠：3只)。
结果，如图8A所示，确认作为发热基因的解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的蛋白质表达在给药牛乳外泌体的情况下增加，并确认随着所给药的牛乳外泌体的浓度的增加，解偶联蛋白1及过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的蛋白质表达增加。
3-3.确认基因表达
利用实时聚合酶链式反应确认所分离的腹股沟白色脂肪组织中的脂肪分解相关基因、米色脂肪细胞特异性基因的表达。实时聚合酶链式反应如在上述2-1中所记载，对于脂肪分解相关基因利用的引物序列如下述表2中所整理。
表2
结果，如图8B所示，确认在给药牛乳外泌体的情况下，作为脂肪分解酶的激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive lipase，HSL)及作为中性脂肪分解酶的脂肪甘油三酯脂肪酶(adipose triglyceride lipase，ATGL)的表达增加。尤其，确认随着牛乳外泌体的给药浓度的增加，激素敏感性脂肪酶及脂肪甘油三酯脂肪酶的表达进一步增加。
并且，如图8C所示，确认在给药牛乳外泌体的情况下，通过棕色脂肪化示出的作为米色脂肪细胞特异性基因的CITED1、HSPB7、TNFRSF9、EAR2、CD40、EBF3、EVA1A及PDK4的表达均显著增加，进而，确认随着牛乳外泌体的浓度的增加，棕色脂肪化的诱导增加。
如上所述的结果教示可通过给药本发明的牛乳外泌体来示出对于肥胖的治疗效果以及通过肥胖治疗示出的对于因肥胖而发生的代谢疾病的治疗效果。
实验例4.确认牛乳外泌体的线粒体活性效果
为了确认牛乳外泌体对于线粒体活性的影响，确认了电子传递链相关蛋白的表达及耗氧率。
4-1.确认电子传递链相关蛋白的表达增加
利用电子传递链相关蛋白确认泛醌氧化还原酶亚基B8、琥珀酸脱氢酶复合物铁硫亚基B、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2、细胞色素c氧化酶亚基IV及ATP合酶F1亚基α的表达变化。
将3T3-L1及hADSC细胞株分别以3×105cells/well接种在6孔板后，与分化培养基一同处理牛乳外泌体，将3T3-L1分化诱导6天，将ADSC分化诱导14天。之后，收集细胞来执行蛋白免疫印迹，蛋白免疫印迹方法如在上述2-2中所记载。本蛋白免疫印迹中的一抗利用对于泛醌氧化还原酶亚基B8(Invitrogen)、琥珀酸脱氢酶复合物铁硫亚基B(Invitrogen)、泛醇-细胞色素C还原酶核心蛋白2(Abcam)、COXIV(Abcam)及ATP合酶F1亚基α(Invitrogen)的抗体。
结果，如图9所示，确认在3T3-L1细胞及hADSC细胞中均处理牛乳外泌体的情况下，参与线粒体内电子传递链活性的蛋白质的表达增加(图9A及图9B)。
并且，从上述肥胖模型小鼠获取作为脂肪组织的腹股沟白色脂肪组织，并以相同蛋白免疫印迹方法确认了在腹股沟白色脂肪组织内表达的蛋白质(图9C)。图9C内的各泳道数与摘取腹股沟白色脂肪组织的小鼠的数量相同(对照：4只，摄入50ug/ml的外泌体的小鼠：3只，摄入100ug/ml的外泌体的小鼠：3只，摄入300ug/ml的外泌体的小鼠：3只)。
如图9C所示，确认在腹股沟白色脂肪组织中处理牛乳外泌体的情况下，表达增加(图9C)。
4-2.确认耗氧率增加
将3T3-L1及hADSC细胞株分别以5×104cells/well接种在24多孔板(SeahorseBioscience)后，与分化培养基一同处理牛乳外泌体，将3T3-L1分化诱导6天，将ADSC分化诱导14天。之后，依次处理1.5μM的寡霉素、0.75μM的羰基氰对三氟甲氧基苯腙(Carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone，FCCP)、1μM的鱼藤酮及抗霉素后，使用XF分析仪(Seahorse)测量细胞的耗氧量。
结果，确认在3T3-L1细胞(图10A)及hADSC(图10B)均处理牛乳外泌体的情况下，耗氧率增加。
实验例5.确认牛乳外泌体的胰岛素阻抗性改善效果
为了确认牛乳外泌体是否改善胰岛素阻抗性，在3T3-L1脂肪细胞及C2C12肌肉细胞处理牛乳外泌体后观察血糖吸收能力。
将3T3-L1及C2C12细胞株分别以3×105cells/well接种在6孔板后，与分化培养基一同处理牛乳外泌体，将3T3-L1脂肪分化诱导6天。C2C12细胞饱和后，每两天一次更换包含2％的马血清(horse serum)(Gibco)的培养基，并进行肌肉分化6天。在细胞处理1μM的胰岛素和1mM的2-脱氧葡萄糖后，使用2-脱氧葡萄糖吸收测量试剂盒(Cosmo bio)测量葡萄糖吸收率。
结果，如图11A及图11B所示，确认在3T3-L1脂肪细胞及C2C12肌肉细胞中均处理牛乳外泌体的情况下，向细胞内的血糖吸收增加。
并且，利用原代肝细胞(primary hepatocytes)确认了血糖生成。
具体地，在I型胶原蛋白的6孔板中，在包含5％的胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin(100μg/ml))的培养基199(Medium 199)(gibco)中培养从小鼠中提取的肝24小时。在缺乏胎牛血清的培养基199中培养16小时～18小时后，利用磷酸盐缓冲液洗涤。之后，处理0.1mm的pCPT-cAMP，并在37℃的培养箱中培养6小时后，使用比色葡萄糖测定试剂盒(colorimetric glucose assay kit)(biovision)进行测量。
结果，如图11C所示，确认在原代肝细胞处理牛乳外泌体的情况下，血糖生成减少。
并且，确认胰岛素代谢。具体地，从正常饮食的小鼠和高脂饮食的小鼠中采集血液。将血液充分混合后放置，30分钟后，以3000rpm离心分离20分钟来分离血清。利用血清并使用小鼠胰岛素酶联免疫吸附测定试剂盒(mouse insulin ELISA kit)(Alpco)进行测量。
结果，如图11D所示，确认在处理牛乳外泌体的情况下，血清胰岛素减少。
如上所述的结果示出本发明的牛乳外泌体改善胰岛素代谢。
实验例6.牛乳外泌体的肥胖引起的代谢功能异常改善效果
6-1.确认炎症及抗炎相关基因表达减少
为了确认牛乳外泌体的肥胖治疗效果，对C57BL6/J小鼠(雄性，8周龄，Raonbio)喂食14周的高脂饮食(high fat diet，HFD)并口服给药牛乳外泌体(0ug/ml的(对照)：4只，50ug/ml的外泌体：3只，100ug/ml的外泌体：3只，300ug/ml的外泌体：3只)。
具体地，将上述牛乳外泌体以50μg/ml、150μg/ml、300μg/ml的浓度给药14周后，将小鼠安乐死后，剖腹并分离作为附睾脂肪组织的附睾白色脂肪组织(epididymal whiteadipose tissue，eWAT)，并确认炎症及抗炎相关因子的mRNA表达。
确认作为炎症相关因子的F4/80、TNF alpha、MCP1、IL-6的mRNA表达，确认作为抗炎相关因子的IL-10的基因表达。利用实时聚合酶链式反应确认。实时聚合酶链式反应如在上述2-1中所记载，所利用的引物序列如在下述表3中所整理。
表3
| 序列编号 | 引物种类 | 序列(5'-3') |
| 35 | F4/80正向 | 5'-CCC CAG TGT CCT TAC AGA GTG-3' |
| 36 | F4/80反向 | 5'-GTG CCC AGA GTG GAT GTC T-3' |
| 37 | TNF-alpha正向 | 5'-GAC GTG GAA CTG GCA GAA GAG-3' |
| 38 | TNF-alpha反向 | 5'-TTG GTG GTT TGT GAG TGT TGA G-3' |
| 39 | MCP1正向 | 5'-AGG TGT CCC AAA GAA GCT GT-3' |
| 40 | MCP1反向 | 5'-AAG ACC TTA GGG CAG ATG CAG-3' |
| 41 | IL-6正向 | 5'-ACA AGT CCG GAG AGG AGA CT-3' |
| 42 | IL-6反向 | 5'-TGT GAC TCC AGC TTA TCT CTT GG-3' |
| 43 | IL-10正向 | 5'-GCT CTT GCA CTA CCA AAG CC-3' |
| 44 | IL-10反向 | 5'-CTG CTG ATC CTC ATG CCA GT-3' |
结果，如图12所示，确认在给药牛乳外泌体的情况下，作为炎症因子的F4/80、TNFalpha、MCP1、IL-6的mRNA表达减少，作为抗炎因子的IL-10的mRNA表达增加。
6-2.确认谷丙转氨酶减少
从喂食高脂饮食的小鼠中采集血液。将血液充分混合后放置，30分钟后，以3000rpm离心分离20分钟来分离血清。使用谷丙转氨酶检测试剂盒(ALT assay kit)(cusabio)测量血清。
结果，如图13所示，确认在给药牛乳外泌体的情况下，小鼠血清中的作为脂肪肝的标志物的谷丙转氨酶水平减少。尤其，在150μg/ml以上的浓度中，谷丙转氨酶水平减少。
6-3.确认脂肪球
从喂食高脂饮食的小鼠中摘取肝后，通过切片包埋石蜡的肝的样品来制备5μm的切片。对于切片，利用脱蜡溶液进行脱蜡后，加入至裂解缓冲液，并使用苏木精及伊红染色。
结果，如图14所示，与未给药牛乳外泌体的肝相比，给药牛乳外泌体的小鼠的肝中的脂肪球更小且更少，可知牛乳外泌体使肝中出现的脂肪更少。
6-4.血液分析
从喂食高脂饮食的小鼠中采集血液。将血液充分混合后放置，30分钟后，以3000rpm离心分离20分钟并分离血清。使用游离脂肪酸检测试剂盒(free fatty acidassay kit)(abcam)、胆固醇检测试剂盒(cholesterol assay kit)(abcam)、甘油三酯定量检测试剂盒(triglyceride quantification assay kit)(abcam)测量血清。
结果，如图15所示，确认在给药牛乳外泌体的情况下，中性脂肪(图15A)、游离脂肪酸(图15B)以及低密度脂蛋白(图15D)显著减少，高密度脂蛋白(图15C)显著增加。
实验例7.确认牛乳外泌体内的miRNA(microRNA)
为了确认存在于牛乳外泌体中的microRNA，实施RNA-seq，在这些基因中筛选read-count 2000以上的miR-11987、miR-122、miR-11980、miR-21、miR-1777b、miR-2478、miR-92a、miR-1777a及miR-2430。
为了确认所筛选的上述9个microRNA的白色脂肪是否棕色脂肪化，在3T3-L1脂肪细胞过表达9个microRNA后，比较解偶联蛋白1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的mRNA表达。
在6孔板接种3T3-L1细胞以成为3×105cells/ml，在37℃、5％的CO2条件的培养箱中培养。使用脂质体2000(lipofectamine 2000)在3T3-L1细胞过表达9个microRNA。之后，在包含10％的胎牛血清、1μM的地塞米松、10μg/ml的胰岛素、0.5mM的3-异丁基-1-甲基黄嘌呤的细胞分化诱导培养基中进行培养。两天后，利用10％的胎牛血清、10μg/ml的胰岛素处理48小时。之后，在包含10％的胎牛血清的培养基培养两天后，收集细胞。
利用实时聚合酶链式反应确认解偶联蛋白1(UCP1)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α(PGC-1α)的基因表达测量。实时聚合酶链式反应如在上述2-1中所记载，利用引物序列的如下述表4中整理。
表4
并且，利用蛋白免疫印迹确认解偶联蛋白1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的蛋白质表达，蛋白免疫印迹方法如在上述实验2-2中所记载。
结果，如图16所示，确认在处理9个microRNA中的miR-11987、miR-122、miR-11980的情况下，解偶联蛋白1和过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的mRNA(图16A)和蛋白质(图16B)的表达量均增加。上述miR-11987、miR-122及miR-11980的序列如在下述表5中所整理。
表5
| 序列编号 | miRNA | 序列(5'-3') |
| 49 | miR-11987 | cga gga auc ucu ggu gga ggu |
| 50 | miR-122 | ugg agu gug aca aug gug uuu g |
| 51 | miR-11980 | agg caa cgg gcu ugg cgg ag |
实验例8.确认miR-11987的线粒体活性效果
在3T3-L1细胞及hADSC细胞分别过表达miR-11987后，利用与上述实验例4相同的方法确认线粒体活性。miR-11987的过表达方法与在上述实验例7中记载的方法相同。
8-1.确认电子传递链相关蛋白的表达增加
利用与上述4-1相同的方法确认电子传递链相关蛋白的表达。
结果，如图17所示，确认在3T3-L1细胞及hADSC细胞中均处理牛乳外泌体的情况下，参与线粒体内电子传递链活性的蛋白质的表达增加(图17A及图17B)。
8-2.确认耗氧率的增加
利用与上述4-2相同的方法确认耗氧率。
结果，确认在过表达miR-11987的情况下，在3T3-L1细胞(图18A)及hADSC(图18B)均通过处理牛乳外泌体而使耗氧率增加。
实验例9.确认miR-11987的靶基因
9-1.确认作为miR-11987的靶基因的Runx1t1结合位点
研究受到miR-11987的影响的细胞内的基因。具体地，利用作为可预测与microRNA的靶基因的结合位点的程序的miRDB研究与miR-11987结合的鼠和人中存在的基因，结果，筛选Runx1t1(RUNX1 Partner Transcriptional Co-Repressor 1)。
在Runx1t1基因中，保存有与miR-11987反应的位点不同种，并抑制作为诱导棕色/米色脂肪细胞的调节因子的C/EBPβ和PRDM16的表达。为了了解miR-11987是否直接调节Runx1t1基因，首先，研究了miR-11987在Runx1t1中反应的位点，并制备了使反应的位点突变的质粒。
具体地，将包含与miR-11987结合的位点的Runx1t1片段插入至psiCHECK2载体来构建重组载体(psiCHECK2-Runx1t1-wt)。之后，利用QuickChange site-directedmutagenesis kit(Stratagene)使与miR-11987结合的Runx1t1位点突变来进行突变(psiCHECK2-Runx1t1-mut)。
与miR-11987的Runx1t1结合的位点的示意图如图19所示。
9-2.确认关于Runx1t1的miR-11987的表达调节
为了研究是否通过miR-11987调节Runx1t1，实施荧光素酶报告分析。
将Cos7细胞株以3×104cells/well接种来在24孔板培养24小时。通过使用脂质体2000(lipofectamine 2000，Invitrogen)将所构建的psiCHECK2-Runx1t1(50ng)和miR-11987mimic(50nM)(Genepharm)注入至细胞来诱导转化。将转化细胞培养2天后，通过使用TD-20/20光度计(Luminometer)(Turner Biosystems)并利用双荧光素酶活性检测试剂盒(dual luciferase assay kit)(promega)测量荧光素酶活性。
结果，如图20所示，确认在引入miR-11987的细胞中，Runx1t1显著降低荧光素酶活性约48％，在使对miR-11987进行反应的Runx1t1突变的质粒中与对照组没有差异。
并且，利用超声波仪(sonicator)将NC-抑制剂(inhibitor)(genepharma catalognumber B04003)和miR-11987抑制剂(genepharma catalog number B03001)分别以50nM的浓度添加至引入miR-11987的3T3-L1细胞及hADSC细胞后，与分化培养基一同处理来培养6天。当miR-11987被抑制时，确认Runx1t1的蛋白质表达。利用对照实际处理NC-抑制剂。
结果，如图21所示，在处理miR-11987抑制剂的情况下，在3T3-L1细胞(图21A)及hADSC细胞(图21B)中均确认因牛乳外泌体而减少的Runx1t1的蛋白质表达再次增加。由此确认miR-11987直接抑制Runx1t1基因。
实验例10.确认C/EBPβ及PRDM16的表达增加
10-1.Runx1t1
siRNA的制备及确认
从gepharma公司购入Runx1t1及阴性对照(Negative control，NC)siRNA，Runx1t1siRNA(si-Runx1t1)及NC siRNA(si-NC)的序列如下述表6中所整理。根据gepharma公司的说明书执行siRNA的细胞内引入。
表6
10-2.确认根据引入Runx1t1 siRNA的C/EBPβ及PRDM16蛋白质的表达增加
将在上述10-1中制备的Runx1t1 siRNA(si-Runx1t1)分别引入至3T3-L1细胞及hADSC细胞后，通过蛋白免疫印迹确认C/EBPβ及PRDM16的表达是否增加。
具体地，将3T3-L1细胞及hADSC分别以3×105cells/ml向6孔板接种，利用脂质体2000将si-Runx1t1注入至细胞。之后，利用脂肪分化培养基培养6天。之后，收集细胞并执行蛋白免疫印迹，蛋白免疫印迹方法如在上述2-2中所记载。本蛋白免疫印迹中的一抗利用对于C/EBPβ(Abcam)及PRDM16(R&D systems)的抗体。
结果，如图22所示，当在3T3-L1细胞(图22A)及hADSC细胞(图22B)均引入Runx1t1siRNA时，确认C/EBPβ及PRDM16的蛋白质表达增加。
10-3.确认根据处理牛乳外泌体的C/EBPβ及PRDM16蛋白质的表达增加
将3T3-L1及hADSC细胞株分别以3×105cells/well接种在6孔板后，与分化培养基一同处理牛乳外泌体，将3T3-L1分化诱导6天后收集，将ADSC分化诱导14天后收集。在收集的细胞中确认C/EBPβ及PRDM16的蛋白质表达。
结果，如图23所示，确认在处理牛乳外泌体的情况下，在3T3-L1细胞(图23A)及hADSC细胞(图23B)中C/EBPβ及PRDM16的蛋白质表达增加，随着牛乳外泌体的浓度的增加，C/EBPβ及PRDM16的蛋白质表达进一步增加。
10-4.确认根据过表达miR-11987的C/EBPβ及PRDM16的表达增加
通过与上述实验例7相同的方法在3T3-L1细胞及hADSC细胞分别过表达miR-11987后，确认C/EBPβ及PRDM16的蛋白质表达。
结果，如图24所示，确认在miR-11987过表达的情况下，3T3-L1细胞(图24A)及hADSC细胞(图24B)中的C/EBPβ及PRDM16的蛋白质表达增加。
实验例12.确认牛乳外泌体引起的Runx1t1表达减少
对C57BL6/J小鼠(雄性，8周龄，Raonbio)，每3天一次口服给药牛乳外泌体，共给药14周，将小鼠安乐死后，进行剖腹，从腹股沟区分离作为脂肪组织的腹股沟白色脂肪组织。
以50μg/ml、150μg/ml、300μg/ml的浓度给药牛乳外泌体(0ug/ml(对照)：4只，50ug/ml的外泌体：3只，100ug/ml的外泌体：3只，300ug/ml的外泌体：3只)。
之后，通过蛋白免疫印迹确认通过上述腹股沟白色脂肪组织内的牛乳外泌体的Runx1t1(Proteintech)、C/EBPβ及PRDM16的蛋白质表达程度。蛋白免疫印迹方法如在上述10-2中所记载。
结果，如图25所示，确认在小鼠的脂肪组织中，Runx1t1的表达因牛乳外泌体而减少(图25A)，相反，C/EBPβ和PRDM16的表达量增加(图25B)，
如上所述的结果示出牛乳外泌体通过增加C/EBPβ和PRDM16的表达来诱导白色脂肪的棕色脂肪化。
前述的本发明的说明仅用于例示，本发明所属技术领域的普通技术人员可理解的是，可在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下容易变形为其它具体实施方式。因此，应理解的是，以上所记述的实施例在所有方面仅为例示，并不是限定性的。例如，以单一型说明的各组件可分散实施，相同地，以分散型说明的组件也能够以结合的形式实施。
本发明的范围由发明要求保护范围而示出，应发明要求保护范围的含义及范围以及其等同概念导出的所有变更或变形形式解释为均包括在本发明的范围内。
<110> 庆熙大学校产学协力团
<120> 包含牛乳外泌体的用于诱导棕色脂肪化的组合物
<130> 21OP30552PCT
<160> 59
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CITED1正向引物(小鼠)
<400> 1
aaccttggag tgaaggatcg c 21
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CITED1反向引物(小鼠)
<400> 2
gtaggagagc ctattggaga tgt 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSPB7正向引物(小鼠)
<400> 3
gagcatgttt tcagacgact ttg 23
<210> 4
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> HSPB7反向引物(小鼠)
<400> 4
ccgagggtct tgatgtttcc tt 22
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFRSF9正向引物(小鼠)
<400> 5
cgtgcagaac tcctgtgata ac 22
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFRSF9反向引物(小鼠)
<400> 6
gtccacctat gctggagaag g 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFRSF9正向引物(人)
<400> 7
ggcaggtgta gctgaggtt 19
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNFRSF9反向引物(人)
<400> 8
ggacagggac tgcaaatctg at 22
<210> 9
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EAR2正向引物(小鼠)
<400> 9
gaggacgatt cggcgtcac 19
<210> 10
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EAR2反向引物(小鼠)
<400> 10
gtaatgcttt ccactggact tgt 23
<210> 11
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EAR2正向引物(人)
<400> 11
gagcggcaag cattacggt 19
<210> 12
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EAR2反向引物(人)
<400> 12
ggcaggtgta gctgaggtt 19
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40正向引物(小鼠)
<400> 13
tgtcatctgt gaaaaggtgg tc 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40反向引物(小鼠)
<400> 14
actggagcag cggtgttatg 20
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40正向引物(人)
<400> 15
actgaaacgg aatgccttcc t 21
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40反向引物(人)
<400> 16
cctcactcgt acagtgcca 19
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EBF3正向引物(小鼠)
<400> 17
tcaccctccc ttcaaactgt a 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EBF3反向引物(小鼠)
<400> 18
gtttcactgc ggagatgaca t 21
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EBF3正向引物(人)
<400> 19
aacaggccat cgtctacgag 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EBF3反向引物(人)
<400> 20
ggcgtttcgt ttctattgcc a 21
<210> 21
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EVA1A正向引物(小鼠)
<400> 21
ggggagaccg aaggaaatga ga 22
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EVA1A反向引物(小鼠)
<400> 22
ctccagccct gcacactcta 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EVA1A正向引物(人）
<400> 23
gcaagacgcg aaacctgaac 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EVA1A反向引物(人)
<400> 24
ttcaaatctg ggctcgtccc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDK4正向引物(小鼠)
<400> 25
agggaggtcg agctgttctc 20
<210> 26
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PDK4反向引物(小鼠)
<400> 26
ggagtgttca ctaagcggtc a 21
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白正向引物(小鼠)
<400> 27
gtgacgttga catccgtaaa ga 22
<210> 28
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白反向引物(小鼠)
<400> 28
gccggactca tcgtactcc 19
<210> 29
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白正向引物(人)
<400> 29
catgtacgtt gctatccagg c 21
<210> 30
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β-肌动蛋白反向引物(人)
<400> 30
ctccttaatg tcacgcacga t 21
<210> 31
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 激素敏感性脂肪酶正向引物
<400> 31
atggatttac gcacgatgac a 21
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 激素敏感性脂肪酶反向引物
<400> 32
tagcgtgaca tactcttgca g 21
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂肪甘油三酯脂肪酶正向引物
<400> 33
caacgccact cacatctacg g 21
<210> 34
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 脂肪甘油三酯脂肪酶反向引物
<400> 34
ggacacctca ataatgttgg cac 23
<210> 35
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F4/80正向引物
<400> 35
ccccagtgtc cttacagagt g 21
<210> 36
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> F4/80反向引物
<400> 36
gtgcccagag tggatgtct 19
<210> 37
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-alpha正向引物
<400> 37
gacgtggaac tggcagaaga g 21
<210> 38
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> TNF-alpha反向引物
<400> 38
ttggtggttt gtgagtgtga g 21
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCP1正向引物
<400> 39
aggtgtccca aagaagctgt 20
<210> 40
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MCP1反向引物
<400> 40
aagaccttag ggcagatgca g 21
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6正向引物
<400> 41
acaagtccgg agaggagact 20
<210> 42
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-6反向引物
<400> 42
tgtgactcca gcttatctct tgg 23
<210> 43
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10正向引物
<400> 43
tgtgactcca gcttatctct tgg 23
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IL-10反向引物
<400> 44
ctgctgatcc tcatgccagt 20
<210> 45
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UCP1正向引物
<400> 45
aggcttccag taccattagg t 21
<210> 46
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> UCP1反向引物
<400> 46
ctgagtgagg caaagctgat tt 22
<210> 47
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PGC-1α正向引物
<400> 47
tatggagtga catagagtgt gct 23
<210> 48
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PGC-1α反向引物
<400> 48
ccacttcaat ccacccagaa ag 22
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-11987
<400> 49
cgaggaaucu cugguggagg u 21
<210> 50
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-122
<400> 50
uggaguguga caaugguguu ug 22
<210> 51
<211> 20
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> miR-11980
<400> 51
aggcaacggg cuuggcggag 20
<210> 52
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Runx1t1 siRNA(正义, 小鼠)
<400> 52
guggaaacau cucgaucauc u 21
<210> 53
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Runx1t1 siRNA(反义, 小鼠)
<400> 53
agaugaucga gauguuucca c 21
<210> 54
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Runx1t1 siRNA(正义, 人)
<400> 54
ggcgaucucu caccguacua a 21
<210> 55
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Runx1t1 siRNA(反义, 人)
<400> 55
uuaguacggu gagagaucgc c 21
<210> 56
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阴性对照siRNA(正义, 小鼠)
<400> 56
uuuuccgaac gugucacgut t 21
<210> 57
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阴性对照siRNA(反义, 小鼠)
<400> 57
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 58
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阴性对照siRNA(正义, 人)
<400> 58
uuuuccgaac gugucacgut t 21
<210> 59
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 阴性对照siRNA(反义, 人)
<400> 59
acgugacacg uucggagaat t 21
Claims (17)
1.一种用于诱导棕色脂肪化的组合物，其特征在于，包含牛乳外泌体。
2.根据权利要求1所述的用于诱导棕色脂肪化的组合物，其特征在于，上述牛乳外泌体包含选自由miR-11987、miR-122及miR-11980组成的组中的一种以上的miRNA。
3.根据权利要求2所述的用于诱导棕色脂肪化的组合物，其特征在于，
上述miR-11987由序列编号49的碱基序列组成，
上述miR-122由序列编号50的碱基序列组成，
上述miR-11980由序列编号51的碱基序列组成。
4.根据权利要求1所述的用于诱导棕色脂肪化的组合物，其特征在于，上述牛乳外泌体来源于牛。
5.根据权利要求1所述的用于诱导棕色脂肪化的组合物，其特征在于，上述牛乳外泌体增加解偶联蛋白1或过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子-1α的表达。
6.一种用于预防或治疗肥胖或代谢疾病的药物组合物，其特征在于，包含牛乳外泌体。
7.根据权利要求6所述的用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物，其特征在于，上述牛乳外泌体包含选自由miR-11987、miR-122及miR-11980组成的组中的一种以上的miRNA。
8.根据权利要求7所述的用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物，其特征在于，
上述miR-11987由序列编号49的碱基序列组成，
上述miR-122由序列编号50的碱基序列组成，
上述miR-11980由序列编号51的碱基序列组成。
9.根据权利要求6所述的用于预防或治疗代谢疾病的药物组合物，其特征在于，上述代谢疾病为选自由糖尿病、高脂血症、高胆固醇血症、动脉硬化及脂肪肝组成的组中的一种以上。
10.一种用于改善肥胖或代谢疾病的食品组合物，其特征在于，包含牛乳外泌体。
11.一种从白色脂肪细胞到米色脂肪细胞或棕色脂肪细胞的分化诱导方法，其特征在于，包括在白色脂肪细胞处理牛乳外泌体的步骤。
12.根据权利要求11所述的分化诱导方法，其特征在于，上述牛乳外泌体包含选自由miR-11987、miR-122及miR-11980组成的组中的一种以上的miRNA。
13.根据权利要求12所述的分化诱导方法，其特征在于，
上述miR-11987由序列编号49的碱基序列组成，
上述miR-122由序列编号50的碱基序列组成，
上述miR-11980由序列编号51的碱基序列组成。
14.一种肥胖或代谢疾病的治疗方法，其特征在于，包括向个体给药牛乳外泌体的步骤。
15.根据权利要求14所述的肥胖或代谢疾病的治疗方法，其特征在于，上述牛乳外泌体包含选自由miR-11987、miR-122及miR-11980组成的组中的一种以上的miRNA。
16.根据权利要求15所述的肥胖或代谢疾病的治疗方法，其特征在于，
上述miR-11987由序列编号49的碱基序列组成，
上述miR-122由序列编号50的碱基序列组成，
上述miR-11980由序列编号51的碱基序列组成。
17.根据权利要求14所述的肥胖或代谢疾病的治疗方法，其特征在于，上述代谢疾病为选自由糖尿病、高脂血症、高胆固醇血症、动脉硬化及脂肪肝组成的组中的一种以上。
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