KR102129707B1

KR102129707B1 - Emodin 유도체를 주성분으로 하는 대사질환 치료 및 항 비만용 약학조성물 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102129707B1
Application number: KR1020200043686A
Authority: KR
Inventors: 정재준; 강승우; 진선민; 서보승; 최윤표; 이윤제
Original assignee: 주식회사 아리바이오
Priority date: 2020-04-09
Filing date: 2020-04-09
Publication date: 2020-07-03

Abstract

본 발명은 호장근에서 에탄올추출을 통해서 유효성분인 Emodin, Emodin-8-O-β-D-Glucoside의 수득률을 향상시키는 공정으로, 상세하게는 P. cuspidatum (호장근)의 추출 시 Emodin을 비롯한 20 여종의 지표성분을 분리하고, 유효성분인 Resveratrol-3-O-β-D Glucopyranoside, Emodin, Emodin-8-O-β-D-Glucoside의 대사질환 치료 및 항 비만용 약제학적 기능을 제공하는 것이다.

Description

Emodin 유도체를 주성분으로 하는 대사질환 치료 및 항 비만용 약학조성물 및 이의 제조방법{A pharmaceutical composition for the treatment of metabolic disease and Anti-obesity, which mainly contains Emodin derivatives}

호장근 (Polygonium cuspidatum)은 약리학적으로 항 세균효과 및 항 부착효과, 혈관신생억제작용, 거담작용, 혈당강하 (KR 10-2010-0130871호), 신경보호효과 (KR 10-0885073호), 항 비만효과 (KR 10-0974545호) 등을 기술하였으나, 유효성분에 대한 증명은 수행하지 못하였다. 이에 본 발명의 기술은 호장근 에탄올 추출물에 존재하는 주요 지표성분을 규명하고 항 비만 효능 및 발열작용을 통한 신진대사 활성 효능을 나타내는 주요 성분에 대한 효능을 검증하였다.

호장근 에탄올추출물에 대한 항 비만 효능은 2가지 기작으로 나뉠 수 있는데, 첫 번째 기작으로 위장에서 췌장 지방분해 효소 (Pancreatic Lipase) 억제제로서의 지질 소화 및 흡수를 억제하고, 두 번째 기작으로 내장 또는 복부 비만을 유발하는 흰지방 (White Fat)을 생성하는 흰색 지방세포 (White Adipose Cell)에서 지방세포 분화 및 생성에 관련된 인자인 PPARγ (Peroxidase Proliferatoractivated Receptor-γ), C/EBPα (CCAAT/Enhancer-binding Protein α), ADRP (Adipose Differentiation-Related Protein), Perilipin-1의 발현을 억제함으로써 지방세포 분화 억제 및 지방분해 (Lipolysis)를 촉진하는 기작을 가지고 있다.

호장근 에탄올추출물에 대한 항 비만 기작에 대한 배경을 설명하자면 다음과 같다. 지방세포의 형성 과정 (Adipogenesis)은 전사인자인 C/EBPs (CCAAT/Enhancer-binding Proteins), PPARγ, SREBP 1c (Sterol Regulatory Element Binding Protein-1c)의 발현에 의하여 이루어 지고, 또한 지방대사 관련 인자인 ACC (Acetyl-CoA Carboxylase), FAS (Fatty Acid Synthase), ACS (Acyl-CoA Synthase), FABP4 (Fatty Acid Binding Protein 4), FATP1 (Fatty Acid Transport Protein 1), Perillipin 등의 발현이 증가하게 된다. 따라서 지방분화가 유도되면 CREB 전사인자가 인산화되어 C/EBPα, PPARγ 등과 같은 지방세포 분화 인자가 활성화되기 때문에 C/EBPα, PPARγ의 발현을 억제하게 되면 초기에 지방 세포분화를 차단하여 효과적으로 비만을 예방할 수 있다. 또한 현재까지 알려진 지방 분해 기전으로는 Perilipin-1의 인산화 (Phosphorylation)와 Lipid Droplet으로의 HSL(Hormone-Sensitive Lipase)의 Translocation이 중요한 것으로 보고되어 있다. Perilipin-1은 지방세포에서 중성지방 (Triglyceride)에서 지방산 (Fatty Acid)과 글리세롤 (Glycerol)로의 가수분해 (Hydrolysis)를 매개하는 HSL과 같은 지방분해 효소로부터 Lipid Drpolet이 분해되는 것 보호하는 하는 단백질로 지방세포 분화과정 동안에 Perilipin-1과 HSL의 발현을 확인함으로써 지방분해에 대한 효과를 확인할 수 있다. (Journal of Life Science 2013 Vol. 23. No. 4. 510~517., Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2014; 47(1): 1 ~ 11.)

한편, 본 발명에서는 호장근 에탄올추출물은 PDE3B 억제를 통해 cyclic AMP의 증가를 유도하고 이는 PKA활성을 증가시켜 발열작용을 통한 신진대사 활성을 촉진한다는 것을 확인하였다(Journal of Life Science 2013 Vol. 23. No. 4. 510~517., Journal of Nutrition and Health (J Nutr Health) 2014; 47(1): 1 ~ 11.).

대한민국 공개특허 (KR 10-2010-0130871호) 대한민국 등록특허 (KR 10-2009-0885073호) 대한민국 등록특허 (KR 10-2010-0974545호) 대한민국 등록특허 (KR 10-2017-1764786호)

본 발명에서는 호장근 에탄올 추출물에 존재하는 주요 지표성분을 규명하고, 주성분으로 이루어진 Emodin 유도체들이 항 비만 효능으로 췌장 지방분해 효소억제제로서의 기능하고 지방세포 분화 억제 및 지방분해를 촉진함을 확인하였다.

또한, 본 발명에서는 Emodin 유도체들이 발열작용을 통한 신진대사 활성 효능이 있고, 지방간의 감소 등의 대사질환 치료 및 예방 효과를 기대할 수 있다.

본 발명의 목적은 30% 에탄올 수용액을 사용하고 가온 교반 및 정치 추출을 통해 호장근에서 비만활성 및 신진대사 활성을 가지는 Emodin 및 그 유도체의 수득률을 크게 향상할 수 있는 추출방법을 제공하는 것이다.

이러한 본 발명의 목적을 달성하기 위한 수단으로서, 본 발명에 따른 호장근에서 Emodin 및 그 유도체의 수득률을 높이기 위한 추출방법은 호장근을 30±5%(v/v) 농도의 에탄올 수용액에 함침하는 S1단계와; 상기 호장근이 함침된 에탄올 수용액을 50~80℃에서 6~12시간 동안 교반하는 S2단계와; 상기 S2단계를 수행한 에탄올 수용액을 24~36시간 동안 정치하고 전기자극을 주는 S3단계와; 상기 S3단계를 수행한 에탄올 수용액을 여과하여 감압농축한 후 동결건조하여 에탄올추출물을 수득하는 S4단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 호장근 에탄올 추출물은 약제학적 유효량 및/또는 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학조성물로 이용될 수 있다.

본 발명의 약학조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 약학조성물은 인간을 포함하는 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여 방식은 통상적으로 사용되는 모든 방식일 수 있으며, 예컨대, 경구, 피부, 정맥, 근육, 피하 등의 경로로 투여될 수 있으며, 바람직하게는 경구로 투여될 수 있다.

본 발명의 약학조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 환자의 연령, 체중, 성별, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 약학조성물의 1일 투여량은 100 내지 400 mg/kg이다.

본 발명의 약학조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 캅셀제 또는 젤(예컨대, 하이드로젤) 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

한편, 호장근 에탄올 추출물에 존재하는 주요 지표성분을 규명하고, 주 성분으로 이루어진 Emodin 유도체들이 항 비만 효능으로 췌장 지방분해 효소억제제로서의 기능하고 지방세포 분화 억제 및 지방분해를 촉진함을 확인하였다.

(1) 호장근 30% 에탄올 추출물의 췌장 지방분해 효소에 대한 활성 억제효과

호장근 30% 에탄올 추출물의 췌장 지방분해 효소에 대한 활성 억제 효과를 검증하기 위해서 96 Well Plate에 호장근 30% 에탄올 추출물 (7.81, 15.63, 31.25, 62.5, 125, 250, 500 μg/ml) 25 μl에 250 U/ml의 Lipase Solution (Sigma-Aldrich) 25 μl와 0.1 mM 4-Methylumbelliferyl (Sigma-Aldrich) 50 μl를 넣고 25℃에서 30분간 Incubating 시켜준 후 0.1 M Sodium Citrate 100 μl을 넣어준다. 이후 반응물을 Varioskan™LUX Multimode Microplate Reader기를 이용하여 Excitation/Emission=355/460 nm에서 형광을 측정한다.

도 1을 참조하면 췌장 지방분해 효소에 대한 실험 결과, 양상대조군인 Orlistat (Xenical)의 IC₅₀ (Half Maximal Inhibitory Concentration)은 0.25 μg/ml로 측정되었고 호장근 30% 에탄올 추출물의 IC₅₀은 29.37 μg/ml로 측정되어 췌장 지방분해 효소를 직접적으로 억제하는 효과가 있음을 확인하였다.

(2) 지방 전구세포 3T3-L1을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물의 지방축적 억제 결과

1) 지방 전구세포 3T3-L1의 배양 및 흰색 지방세포로의 분화

항비만 효과 측정을 위한 실험에 사용된 3T3-L1은 American Type Culture Collection (ATCC)로부터 구입하였으며 10% Calf Serum (BCS) 및 Penicillin/Streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 이후 분화를 위해 96 Well Plate, 100 mm Dish 에 3T3-L1 전구세포를 각각 3 x 10³/Well, 3 x 10⁵/Well의 농도가 되도록 하여 배양한다. 100% Confluency가 된 후 48시간이 지난 후 지방전구세포에서 흰색 지방세포로 분화시키기 위해서 10% FBS (Fetal Bovine Serum)을 함유하는 DMEM/F12 (1:1) 배지에 1 μg/ml Insulin, 1 μM Dexamethasone 및 0.5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX)를 넣은 분화 배지로 교환하여 3일간 배양한다. 그 후 2일 동안 1 μg/ml Insulin이 포함된 배지로 배양한 이후 Maintenance 배지 (DMEM/F12 (1:1), FBS 10%, P/S 1%)로 2일 마다 교체해 준다. 지방세포 분화에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 30% 에탄올 추출물 5 μg/ml, 10 μg/ml, 25 μg/ml과 양성 대조군으로 Hydroxycitric Acid 50 μg/ml를 총 8일간의 분화 배지를 교환할 때 마다 첨가하였다.

2) Oil Red O Staining을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물의 지방축적 억제 결과

8일간 분화하는 과정을 거친 후에 Oil Red O Staining을 진행하여 세포 내 지방 축적량을 비교한다. 분화가 완료된 Cell을 PBS로 두 번 세척한 후 10% Formalin으로 1시간동안 고정한다. 증류수로 두 번 세척한 이후 60% Iso-Propanol에 5분간 처리한다. 증류수로 두 번 세척한 이후 Oil Red O Solution을 30분간 실온에서 염색한다. 증류수를 이용하여 4번 이상 세척하고 도립 현미경 (Inverted Microscopy)을 통해 관찰한다. 이후 지방 축정량을 측정하기 위해 60% Iso-Propanol을 이용하여 2번 이상 세척해준 뒤 100% Iso-Propanol 100 μl에 30분간 추출한다. Varioskan™LUX Multimode Microplate Reader기를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정한다.

도 2를 참조하면 Oil Red O Staining 실험결과에서 양성대조군 (Positive Control)인 Hydroxycitric Acid (HCA)가 정상 대조군 (Control) 대비 약 40%의 지방세포 분화억제효과 (P<0.01)를 보였고 호장근 30% 에탄올 추출물의 경우 25 μg/ml 처리대군에서 양성대조군인 HCA와 유사한 약 40%의 지방세포 분화 억제효과 (P<0.01)를 보였다.

(3) RT-PCR을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물에 의한 지방분화 유도 인자에 대한 발현 억제와 지방분해 억제 인자에 대한 발현 감소 결과

8일간 분화한 세포를 수확하기 위해 전체 RNA를 Easy-BLUE™Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 분리하였고, RNA 2 μg을 PrimeScript™II 1^stStrand cDNA Synthesis Kit (TAKARA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 각 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인 하기 위하여 합성된 cDNA에 각 유전자의 Primer (표 1)와 Emerald Amp®PCR Master Mix (TAKARA)를 첨가하여 25-33 Cycle로 PCR 반응 시킨 다음 1% Agarose Gel에 전기영동 하였고, ImageJ Software (National Institutes of Health & University of Wisconsin)를 이용하여 정량 분석하였다. 표 1은 RT-PCR을 위한 Primer Sequence를 나타낸 표이다.

표 1 및 도 3을 참조하면 및 RT-PCR 실험 결과, 지방세포 분화에서 결정적인 역할을 하는 중요한 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα를 농도 의존적으로 감소 시켰으며, 특히 PPARγ에서는 양성대조군 (Positive Control)인 Hydroxycitric Acid (HCA)가 정상 대조군 (Control) 대비 약 50%의 mRNA 발현 수준을 보였고 호장근 30% 에탄올 추출물은 양성대조군인 HCA와 유사한 약 50%의 mRNA 발현 수준을 보였다. 또한 지방 축적과 관련된 단백질인 ADRP, Perilipin-1을 농도 의존적으로 감소시키는 것을 확인하였다.

Gene	FORWARD PRIMER (5' -> 3')	REVERSED PRIMER (5' -> 3')
PPAR-γ	GGG GAT GTC TCA CAA TGC CA	GAT GGC CAC CTC TTT GCT CT
C/EBP-α	GAA CAG CAA CGA GTA CCG GGT A	CCC ATG GCC TTG ACC AAG GAG
Perilipin-1	GCC AAA CCA AGC CTT GTG AG	GTT CCG GAG AGT GTT CTG CA
ADRP	GAC AAC TTG AAG GCC TCC GA	CTC CCC TCC CCC ACA TTC TA

(4) In live DEXA Image를 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물에 의한 고지방식 유도 비만마우스 (45% HFD: High Fat Diet-Supplied Mouse)에서의 복부지방 감소 결과

호장근 30% 에탄올 추출물의 복부지방 감소 효과를 확인하기 위해 고지방식 유도 비만마우스 (45% HFD: High Fat Diet-Supplied Mouse)에 호장근 30% 에탄올 추출물 400, 200, 100 mg/kg, 대조약으로 Metformin 250 mg/kg, 위약으로 증류수 (DW: Distilled Water), 정상식이 마우스 (Normal Fat Diet Mouse)를 실험군을 선정하여 84일동안 경구투여하고, 항비만 효과를 위해 복부지방량 In live DEXA Image를 사용하여 체지방 및 복부지방 변화를 관찰하였다.

도 4를 참조하면, 실험결과 정상식이 마우스 (Normal Fat Diet Mouse)에 비해 84일간 고지방식을 섭취한 고지방식 유도 비만마우스에서 복부지방이 증가되었으며, 고지방식 유도 비만마우스에 대조약 Metformin 250 mg/kg 처리군에서 체지방 및 복부축적 지방량이 감소함을 확인하였다. 그리고 고지방식 유도 비만마우스에 호장근 30% 에탄올추출 400, 200, 100 mg/kg 투여군들에서 용량 의존적으로 체지방 및 복부축적 지방량이 감소함을 확인하였다.

(5) Full Scan HRMS (High Resolution Mass Spectrometry)를 기반으로 한 호장근 30% 에탄올 추출물에서의 규명되지 않은 지표물질 (Unspecified Analytical Markers)에 대한 Chromatographic Fingerprint 결과

표 2는 호장근 에탄올 추출물의 지표성분을 나타낸 표이다.

표 2 및 도 5를 참조하면, 30% 에탄올추출물에서도 항비만 활성 및 신진대사 활성에 대한 유효성분을 규명을 위해 Full Scan HRMS (High Resolution Mass Spectrometry)를 기반으로 ID된 PCR의 규명되지 않은 지표물질 (Unspecified Analytical Markers)를 UV 290 nm Chromatographic Fingerprint 한 결과를 나타낸 것이다.

번호	성 분 명	효 능
1	Resveratrol 3-O-β-D-Glucopyranoside 5-O-Sulfate	PoCu에만 특이적임, 기작 안 알려짐
2	Resveratrol 4-O-β-D-Glucoside	항산화, 항염, 항암
3	Resveratrol-4'-sulfate and Resveratrol-3'-Sulfate	-
4	Resveratrol 3-O-β-D-Glucoside	항혈전
5	Resveratrol	항산화, 항염
6	Sulfemodin 8-O-β-D-Glucoside	항산화
7	Emodin-1-Glucoside	항산화, 항염, 항암
8	Torachrysone-8-O-Glucoside	항염
9	Hydropiperoside	항산화
10	Emodin-8-Glucoside	신경보호, 골형성촉진
11	Emodin-3-O-Sulphate	-
12	Physcion-1-Glucoside	항산화
13	5-Hydroxyl Aloe Emodin	항산화
14	Physcion-8-Glucoside	-
15	Emodin-6-Glucsodie	항염 (HMGB1)
16	Emodin	항염
17	Physcion	항암

호장근 에탄올추출물에서 나타나는 지표성분들은 표 2에 나타난 바와 같이 총 17종의 물질들이 규명이 되었고, 이 중 Emodin 유도체들은 5종이고, Resveratrol 유도체들은 5종 그리고 3종의 Physcion 유도체들이었다.

호장근 에탄올추출물에서 나타나는 지표성분들은 표 2에 나타난 바와 같이 총 20종의 물질들이 규명이 되었고, 이 중 Emodin 유도체들은 5종이고, Resveratrol 유도체들은 5종 그리고 3종의 Physcion 유도체들이나, 비만효능 및 신진대사 효능을 가지는 물질들은 Emodin과 Emodin-8-O-β-D-Glucoside로 알려져 있다.

호장근에 함유된 Emodin과 Emodin-8-O-β-D-Glucoside의 함량은 추출법에 따라 매우 상이하게 달라짐을 비교예와 실시예로 확인하였다.

이상과 같은 구성의 본 발명에 따른 추출방법에 의하면, 호장근에서 비만활성을 가지는 Emodin 및 그 유도체의 수득률을 크게 높일 수 있는 효과가 있다.

본 발명의 약(제)학적 조성물은 항 비만 효능 및 발열작용을 통한 신진대사 활성을 제공하고 항 비만, 지방간의 감소와 같은 대사질환 치료 및 예방 효과를 제공하는 Emodin 및 그 유도체를 추출방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 효과는 이상에서 언급된 것들에 한정되지 않으며, 언급되지 아니한 다른 효과들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해되어 질 수 있을 것이다.

도 1은 호장근 30% 에탄올 추출물의 췌장 지방분해 효소에 대한 활성 억제효과를 나타낸 것, (A) 췌장 지방분해 효소에 대한 양성대조군인 Orlistat (Xenical)의 효소 활성 억제율 (%) (실험군/정상대조군). (B) 췌장 지방분해 효소에 대한 호장근 30% 에탄올 추출물의 효소 활성 억제율 (%) (실험군/정상대조군).
도 2는 Oil Red O Staining을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물의 지방축적 억제 결과를 나타낸 것, (A) Oil Red O Staining 후 도립현미경을 이용하여 관찰한 세포 이미지 (100X Magnification). (B) Oil Red O Staining 후 Varioskan™ LUX Multimode Microplate Reader를 이용하여 500 nm 흡광도를 측정한 결과에 대한 상대 비율 (%) (실험군/정상대조군), (*P<0.05 VS. Control).
도 3은 RT-PCR을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물에 의한 지방분화 유도 인자의 발현 억제와 지방분해 억제 인자 발현 감소 결과를 나타낸 것, (A) 지방분화 유도 인자인 PPARγC/EBP 와 지방분화 관련 단백질인 ADRP, Perilipin-1에 대한 RT-PCR Product에 대한 1% Agarose Gel 이미지. (B) RT-PCR 결과에 대한 상대적인 변화량 분석 (Fold Change, 표적분자/GAPDH Housekeeping Gene).
도 4는 In live DEXA Image를 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물에 의한 고지방식 유도 비만마우스(High-Fat Diet-Fed Mouse)에서의 복부지방 감소 결과를 나타낸 것, (A) 정상식이 마우스 (Normal Fat Diet Mouse) 정상군. (B) 고지방식 유도 비만마우스(High-Fat Diet-Fed Mouse)에 DW 10 ml/kg 처리군. (C) 고지방식 유도 비만마우스에 대조약 Metformin 250 mg/kg 처리군. (D) 고지방식 유도 비만마우스에 호장근 30% 에탄올 추출물 400 mg/kg 처리군. (E) 고지방식 유도 비만마우스에 호장근 30% 에탄올 추출물 200 mg/kg 처리군. (F) 고지방식 유도 비만마우스에 호장근 30% 에탄올 추출물 100 mg/kg 처리군.
도 5는 Full Scan HRMS를 기반으로 ID된 호장근 30% 에탄올 추출물에서의 지표성분에 대한 UV 290 nm Chromatographic Fingerprint한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 호장근 30% 에탄올 추출물의 지표물질인 Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside, Emodin, Emodin-8-O-β의 췌장 지방분해 효소에 대한 활성 억제효과를 나타낸 것, (A) 췌장 지방분해 효소에 대한 양성대조군인 Orlistat의 효소 활성 억제율 (%) (실험군/정상대조군), (B) 췌장 지방분해 효소에 대한 호장근 30% 에탄올 추출물의 지표물질 3 종류 (Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside, Emodin, Emodin-8-O-β의 효소 활성 억제율 (%) (실험군/정상대조군).
도 7은 Oil Red O Staining을 이용한 지표성분 3종 (Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside, Emodin, Emodin-8-O-β)의 지방축적 억제 결과를 나타낸 것, (A) Oil Red O Staining 후 도립현미경을 이용하여 관찰한 세포 이미지 (100X Magnification). (B) Oil Red O Staining 후 Varioskan™LUX Multimode Microplate Reader를 이용하여 500 nm 흡광도를 측정한 결과에 대한 상대 비율 (%) (실험군/정상대조군), (*P<0.05, **P<0.005, ***P>0.0005 VS. Control).
도 8은 RT-PCR을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물의 지표물질 3종에에 의한 지방분화 유도 인자의 발현 억제와 지방분해 억제 인자 발현 감소 결과를 나타낸 것, (A) 지방분화 유도 인자인 PPARγC/EBP 와 지방분화 관련 단백질인 ADRP, Perilipin-1에 대한 RT-PCR Product에 대한 1% Agarose Gel 이미지. (B) RT-PCR 결과에 대한 상대적인 변화량 분석 (Fold Change, 표적분자/GAPDH Housekeeping Gene), (* P<0.05, **P<0.005 VS. Control).
도 9는 본 발명의 호장근 에탄올추출물이 PDE3B 억제를 통해 cyclic AMP의 증가를 유도하고 이는 PKA활성을 증가시켜 발열작용을 통한 신진대사 활성을 촉진하는 과정을 개략적으로 설명한 도면이다.
도 10은 호장근 30% 에탄올 추출물의 PDE3B (Phosphodiesterase 3B)에 대한 활성 억제 실험을 나타낸 것이다.
도 11은 호장근 30% 에탄올 추출물에 의한 PKA 활성 증가를 나타낸 것이다.
도 12는 호장근 30% 에탄올 추출물에 의한 간지방증 (liver steatosis) 효능을 나타낸 것이다.

이하, 첨부 도면을 참조하여 본 발명의 실시 예를 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명은 생략한다. 또한, 후술되는 용어들은 본 발명에서의 기능을 고려하여 정의된 용어들로서 이는 사용자의 의도 또는 판례 등에 따라 달라질 수 있다. 그러므로 그 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다.

호장근에 함유된 Emodin과 Emodin-8-O-β의 함량은 추출법에 따라 매우 상이하게 달라짐을 비교예와 실시예로 확인하였다.

호장근 에탄올추출물의 제조

호장근 100g을 정확히 달아 30% 에탄올 수용액을 첨가하고 60℃에서 8시간 동안 교반추출한 후, 30시간 동안 정치하고, 여과하여 감압농축 후 동결건조하여 호장근 30%(v/v) 에탄올 추출물을 수득하였다.

[비교예 1]

호장근 부탄올추출물의 제조

상온에서 호장근을 30% 부탄올 수용액을 추출물을 제조하였다. 1차 추출농축한 잔사에 부탄올을 첨가하여 추출을 한 다음, 감압농축하고 동결건조한다.

[비교예 2]

실시예 1에서 30% 에탄올 수용액을 사용하되, 60℃에서 8시간 동안 가온하지 않고 상온(20℃)에서 추출을 진행하고 30시간 동안 정치하는 과정을 생략한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 호장근 30%(v/v) 에탄올 추출물을 수득하였다.

[비교예 3]

실시예 1에서 30% 에탄올 수용액 대신 50 % 에탄올 수용액을 사용한 것을 제외하고 실시예 1과 동일한 방법으로 호장근 30%(v/v) 에탄올 추출물을 수득하였다.

아래 표 3은 실시예 1, 비교예 1 내지 3의 추출물에 대한 수율을 비교한 표로서, 표 3을 참조하면 비교예 1의 부탄올추출물은 실시예 1의 추출물에 비하여 Emodin, Emodin-8-O-β 및 총 추출량이 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.

그리고 비교예 2에서 실시예 1의 가온 교반 공정과, 가온 교반한 에탄올 수용액을 정치하는 공정을 생략한 경우에는 실시예 1과 대비할 때 Emodin 함량은 대략 20% 감소하고, Emodin-8-O-β 함량은 35% 감소한다는 것을 확인할 수 있었다.

그리고 비교예 3에서 50 % 에탄올 수용액을 사용한 경우에는 가온 교반 공정과, 정치 공정을 수행하더라도 실시예 1과 대비할 때 Emodin 함량은 대략 10% 감소하고, Emodin-8-O-β 함량은 25% 감소한다는 것을 확인할 수 있었다.

정리하면, 30% 에탄올 수용액을 사용하고, 가온 교반 공정과, 가온 교반한 에탄올 수용액을 정치하는 공정을 수행할 때 Emodin과 그 유도체인 Emodin-8-O-β 및 총 수율이 크게 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.

성분	실시예 1	비교예 1	비교예 2	비교예 3
Emodin(mg)	300	20	241	267
Emodin-8-O-β-D-글루코사이드(mg)	1,092	95.6	709	828
Total(mg)	20.822	2,733	15,250	16,472

[실험예 1]

30% 에탄올 추출물의 지표물질인 Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside, Emodin, Emodin-8-O-β의 췌장 지방분해 효소에 대한 활성 억제효과

30% 에탄올 추출물의 지표물질인 Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside, Emodin, Emodin-8-O-β의 췌장 지방분해 효소에 대한 활성 억제효과를 검증하기 위해서 96 Well Plate에 호장근 30% 에탄올 추출물의 지표물질 3종류 (Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside, Emodin, Emodin-8-O-β) 25 μl에 250 U/ml의 Lipase Solution (Sigma-Aldrich) 25 μl와 0.1 mM 4-Methylumbelliferyl (Sigma-Aldrich) 50 μl를 넣고 25 ℃에서 30분간 Incubating 시켜준 후 0.1 M Sodium Citrate 100 μl을 넣어준다. 이후 반응물을 Varioskan™LUX Multimode Microplate Reader기를 이용하여 Excitation/Emission=355/460 nm에서 형광을 측정한다.

도 6을 참조하면, 췌장 지방분해 효소에 대한 실험 결과, 양상대조군인 Orlistat (Xenical)의 IC₅₀ (Half Maximal Inhibitory Concentration)은 0.25 μg/ml로 측정되었고 호장근 30% 에탄올 추출물의 지표물질 3종류 중 Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside는 효과가 없는 것으로 나타났으며, Emodin과 Emodin-8-O-β의 IC₅₀은 각각 80.64 μg/ml과 72.96 μg/ml로 측정되어 췌장 지방분해 효소 활성을 직접적으로 억제하는 것으로 확인되었다.

[실험예 2]

지방 전구세포 3T3-L1을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물의 지방축적 억제 결과

- 지방 전구세포 3T3-L1의 배양 및 지방세포로의 분화

항비만 효과 측정을 위한 실험에 사용된 3T3-L1은 American Type Culture Collection (ATCC, USA)로부터 구입하였으며 10% Calf Serum (BCS) 및 Penicillin/Streptomycin이 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 이후 분화를 위해 24 Well Plate, 100 mm Dish에 3T3-L1 전구세포를 각각 2 x 10⁴/well, 3 x 10⁵/well의 농도가 되도록 하여 배양한다. 100% Confluency가 된 후 48시간이 지난 후 지방전구세포에서 흰색 지방세포로 분화시키기 위해서 10% FBS (Fetal Bovine Serum)을 함유하는 DMEM/F12 (1:1) 배지에 1 μg/ml Insulin, 1 μM Dexamethasone 및 0.5 mM 3-Isobutyl-1-Methylxanthin (IBMX)를 넣은 분화 배지로 교환하여 3일간 배양한다. 그 후 2일 동안 1 μg/ml Insulin이 포함된 배지로 배양한 이후 Maintenance 배지 (DMEM/F12 (1:1), FBS 10%, P/S 1%)로 2일 마다 교체해 준다. 지방세포 분화에 대한 억제효과를 확인하기 위하여 Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside, Emodin과 Emodin-8-O-β을 0.5 μg/ml, 1 μg/ml, 2 μg/ml과 양성 대조군으로 Hydroxycitric Acid 50 μg/ml를 총 8일간의 분화 배지를 교환할 때 마다 첨가하였다.

- Oil Red O Staining을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물의 지표물질인 Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside, Emodin, Emodin-8-O-β에 대한 지방축적 억제 결과

본 발명에 사용된 분화 방법에 따라 8일간 분화하는 과정을 거친 후에 Oil Red O Staining을 진행하여 세포 내 지방 축적량을 비교한다. 분화가 완료된 Cell을 PBS로 두 번 세척한 후 10% formalin으로 1시간동안 고정한다. 증류수로 두 번 세척한 이후 60% Iso-Propanol에 5분간 처리한다. 증류수로 두 번 세척한 이후 Oil Red O Solution을 30분간 실온에서 염색한다. 증류수를 이용하여 4번 이상 세척하고 도립 현미경 (Inverted Microscopy)을 통해 관찰한다. 이후 지방 축정량을 측정하기 위해 60% Iso-Propanol을 이용하여 2번 이상 세척해준 뒤 100% Iso-Propanol 100 μl에 30분간 추출한다. Varioskan™LUX Multimode Microplate Reader기를 이용하여 500 nm에서 흡광도를 측정한다.

도 7을 참조하면, Oil Red O Staining 실험결과에서 양성대조군 (Positive Control)인 Hydroxycitric Acid (HCA)가 정상 대조군 (Control) 대비 약 60%의 지방세포 분화억제 효과를 보였고 Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside (R3G)에서는 최고 40% 감소시켰으며, Emodin-8-Glucoside (E8G)과 Emodin 은 최고 60%의 억제효과를 나타내었다.

[실험예 3]

RT-PCR을 이용한 호장근 30% 에탄올 추출물의 지표물질인 Resveratrol-3-O-βGluco pyranoside, Emodin과 Emodin-8-O-β에 대한 지방분화 유도 인자에 대한 발현 억제와 지방분해 억제 인자에 대한 발현 감소 결과

8일간 분화한 세포를 수확하기 위해 전체 RNA를 Easy-BLUE™Total RNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology)를 사용하여 분리하였고, RNA 2 μg을 PrimeScript™II 1^stStrand cDNA Synthesis Kit (TAKARA)를 이용하여 cDNA로 합성하였다. 각 유전자의 mRNA 발현 수준을 확인 하기 위하여 합성된 cDNA에 각 유전자의 Primer (표 1)와 Emerald Amp®PCR Master Mix (TAKARA)를 첨가하여 25-33 Cycle로 PCR 반응 시킨 다음 1% Agarose Gel에 전기영동 하였고, ImageJ Software (National Institutes of Health & University of Wisconsin)를 이용하여 정량 분석하였다.

도 8을 참조하면, RT-PCR 실험 결과 Emodin과 Emodin-8-O-β은 지방세포 분화에서 결정적인 역할을 하는 중요한 전사인자인 PPARγ와 C/EBPα, 지방과 관계 되있는 단백질인 ADRP, Perilipin-1을 농도 의존적으로 감소 시켰으며 양성대조군 (Positive Control)인 Hydroxycitric Acid (HCA) 50 μg/ml와 유사하거나 더 높은 효과를 나타내었다. Resveratrol-3-O-βGlucopyranoside은 PPARγ, C/EBPα, ADRP, Perilipin-1모두 농도 의존적으로 감소 시켰지만 ADRP를 제외한 PPARγ, C/EBPα, Perilipin-1에서는 Positive Control인 Hydroxycitirc Acid (HCA) 50 μg/ml에 비해 적은 억제 효과를 나타내었다.

이하에서는 항 비만 효능 및 발열작용을 통한 신진대사 활성 효능을 나타내는 주요 성분(Emodin, Emodin-8-O-β)의 수득율을 높이기 위해 전기자극을 주는 실시예 2를 살펴보도록 한다.

여기서, 전기자극은 1~20KV/cm의 전압으로 1~3분 동안 10~60초 간격으로 50~150회 수행하는 것이 바람직하다.

호장근 100 g을 정확히 달아 30% 에탄올 수용액을 첨가하고 60℃에서 8시간 동안 교반추출한 후, 30시간 동안 정치하여 추출조 내부에 양극 전극을 연결하고, 10~15kV/cm, 30초 간격으로 1분간 100회 전기자극을 하고 여과하여 감압농축 후 동결건조하여 호장근 30%(v/v) 에탄올 추출물을 수득하였다. 아래 표 4를 살펴보면 실시예 2의 추출 방법에 따르면 앞서 살펴본 실시예 1에 비해 Eodin 및 Emodin-8-O-β-D-글루코사이드의 함량이 크게 증가한다는 것을 확인할 수 있었다.

아래 표 4를 참조하면, 호장근 추출물의 총 중량을 기준으로 Emodin의 함량 비율을 살펴보면, 실시예 1에서는 1.44%인 반면 실시예 2에서는 2.83%로 2배 가까이 증가하였다. 그리고 호장근 추출물의 총 중량을 기준으로 Emodin-8-O-β-D-글루코사이드의 함량 비율을 살펴보면, 실시예 1에서는 5.24%인 반면 실시예 2에서는 7.48%로 약 1.3배 증가하였다.

성분	실시예 1	실시예 2
Emodin(mg)	300(1.44)	611(2.83)
Emodin-8-O-β-D-글루코사이드(mg)	1,092(5.24)	1,612(7.48)
Total(mg)	20.822	21,548

* 표 4에서 괄호 안의 수치는 함량 비율(중량%)을 나타낸 것이다.

함량 비율(%) = 각 성분의 함량(mg)/총 함량(mg)*100

[실험예 4]

PDE3B Assay Kit (BPS Bioscience, Cat# 60383)

실시예 2에 따른 호장근 30% 에탄올 추출물에 대한 PDE3B (Phosphodiesterase 3B)에 대한 활성 억제 실험 결과, 도 9에서와 같이 양성 대조물질인 Cilostamide의 IC50는 0.12 μM로 측정되었다. 호장근 30% 에탄올 추출물의 IC50은 각각 10.91 μg/ml로 측정되어 PDE3B 활성을 직접적으로 억제하는 것으로 확인하였다.

[실험예 5]

Phospho-PKA Substrate (RRXS*/T*) Antibody를 이용한 Western Blot Analysis

실시예 2에 따른 호장근 30% 에탄올 추출물에 의한 PKA 활성 증가를 확인하기 위하여 Phospho-PKA Substrate (RRXS*/T*) Antibody를 이용하여 Western Blot Analysis를 수행한 결과, 도 10에서와 같이 양성 대조군인 HCA (Hydroxycitric Acid)와 IBMX (3-Isobutyl-1-Methylxanthine; Pan-Specific Inhibitor of Phosphodiesterases, IC50=2-50μM)처리군 모두에서 PKA Substrate (RRXS*/T*) 인산화를 확인하였으며, 호장근 30% 에탄올 추출물 (AR1008) 처리군에서도 PKA Substrate (RRXS*/T*) 인산화가 확인되었다.

본 발명은 상기의 상세한 설명에서 언급되는 형태로만 한정되는 것은 아님을 잘 이해할 수 있을 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의해 정해져야 할 것이다. 또한, 본 발명은 첨부된 청구범위에 의해 정의되는 본 발명의 정신 그 범위 내에 있는 모든 변형물과 균등물 및 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

Claims

호장근을 30±5%(v/v) 농도의 에탄올 수용액에 함침하는 S1단계와;
상기 호장근이 함침된 에탄올 수용액을 50~80℃에서 6~12시간 동안 교반하는 S2단계와;
상기 S2단계를 수행한 에탄올 수용액을 24~36시간 동안 정치하고 전기자극을 주는 S3단계와;
추출조 내부에 전극을 연결하고, 1~20KV/cm의 전기자극을 10~60초 간격으로 1~3분간 50~150회 수행하는 S3단계와;
상기 S3단계를 수행한 에탄올 수용액을 여과하여 감압농축한 후 동결건조하여 에탄올추출물을 수득하는 S4단계;
를 포함하는 것을 특징으로 하는 호장근에서 에모딘 및 에모딘-8-O-β-D-글루코사이드의 수득률을 높이기 위한 추출방법.
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