KR102017282B1 - 가공인삼추출물을 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물 - Google Patents
가공인삼추출물을 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 미량의 진세노사이드 성분이 증가된 가공인삼추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로, 상기 가공인삼추출물이 근아세포에서 근육으로의 분화를 촉진하고, 근육 분화 억제인자인 미오스타틴에 의한 근위축 현상을 억제하는 것을 확인함으로써 효과가 우수한 근육 장애 관련 질환의 예방 및 치료용 조성물을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
Description
본 발명은 가공인삼추출물을 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로, 보다 자세하게는 근육 분화 촉진 효과가 있는 미량의 진세노사이드 성분이 증가된 가공인삼추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
근육(muscle)은 인체에서 가장 큰 구성을 차지하는 조직이다. 인체의 적정 근육량을 확보하는 것은 인체의 구조를 유지하고, 인체의 각 기관이 각각의 기능을 수행하게 하고, 각종 질환을 예방하는데 필수적이다.
근육은 크게 평활근(smooth muscle), 심장근(cardiac muscle), 골격근(skeletal muscle)으로 나뉜다. 골격근은 우리 몸 전체에서 상당한 부분을 차지하면서, 골격의 움직임을 촉진시킨다. 이러한 골격근은 분열하지 않고, 다핵체인 근섬유로 이루어져 있으며, 배 형성 과정에서 만들어진다. 배 형성 과정이 끝난 후에는, 출생 후 생장 또는 근육 분화(myogenesis) 과정에 의해 근육이 형성된다. 또한, 근육 분화는 동상이나 염좌, 타박상 등에 의해 근육이 손상될 때에도 일어난다.
근육 분화(myogenesis) 과정은, 먼저 위성세포(satellite cell)가 활성화되고, 활성화 된 위성세포가 근아세포(myoblast)로 분화된다(Morgan, J.E., et al., 2003). 분화된 근아세포는 분열이 일어나고, 근아세포들의 융합(fusion)이 일어나 근관세포(myotube)로 발달하고, 이러한 근관세포들이 모여 근섬유(muscle fiber)를 형성하며, 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다.
근육 분화 과정은 미오디(MyoD), Myf5(myogenic factor 5), 미오게닌(myogenin), MRF4(myogenic regulator factor 4)와 같은 다양한 근육 조절 인자(muscle regulatory factors)에 의해 조절되며, 그 중 미오디(MyoD)는 미오신 H 사슬(myosin heavy chain, MHC), 근크레아틴인산화효소(muscle creatine kinase, MCK)와 같은 근육 특이 유전자의 발현을 개시하게 하고 위성세포가 근아세포로 분화하는 것을 유도하며, 미오디의 활성에 의한 미오게닌(myogenin) 발현의 유도는 근아세포의 융합에 가장 중요한 요소로, 근관세포의 형성에 관여한다(Zanou, N., et al., 2013).
한편, 미오카인(myokine)은 근육 수축의 반응에서 골격근으로부터 발현되거나 합성되는 활성물질로, 자가 분비(autocrine), 주변 분비(paracrine) 또는 내분비(endocrine) 방식으로 역할을 하게 되며, 근육뿐만 아니라 다른 조직의 기능도 조절하는 것으로 알려져 있다(Pedersen, B.K., et al., 2008). 대표적인 미오카인으로는 미오스타틴(myostatin, MSTN), 인터루킨-6(interleukin-6, IL-6), 이리신(irisin) 등이 있다.
미오스타틴은 형질전환성장인자 β(transforming growth factor-β, TGF-β)군에 속하는 유전자로, 근육세포에 직접적으로 작용하여 근육 분화 및 근육세포 분화(differentiation)를 억제하는 단백질이다(Groussard, C., et al., 2000; Huh, J.Y., et al., 2014). 여러 선행연구에서 미오스타틴 유전자가 넉다운(knock-down) 또는 넉아웃(knock-out)된 경우에는 근육의 비대 및 인슐린 저항성이 감소되고(Groussard, C., et al., 2000; Huh, J.Y., et al., 2014), 운동 시 미오스타틴의 발현량이 감소함에 따라 근육의 크기가 증가한다고 알려져 있다(Huh, J.Y., et al., 2012).
또한, 근육 분화에 중요한 근원섬유 단백질 발현에 핵심적인 전사인자인 미오디(MyoD)의 분해 과정은 미오스타틴(MSTN) 액티빈 타입 II 수용체(activin type II receptor, ActRIIB)-Smad2 경로에 의해 활성화되는 UPP(ubiquitin proteasome pathway) 과정에 의해 매개 단백질 분해를 증가시켜 근위축을 유도하는 것으로 알려져 있다.
한편, 노화된 세포나 위성세포에서 근아세포로의 분화, 근아세포의 분열 등과 같은 근육 분화 과정 동안에 문제가 발생하면, 근위축증(muscle atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscle injury), 근이영양증(muscle dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease) 및 신경 손상(nerve injury) 등과 같은 여러 가지 근육 장애 및 질환이 발생할 수 있다(Bonaldo, P., et al., 2013; Wagatsuma, A., et al., 2014)
또한, 상기 근육 분화 과정 동안에 문제가 발생되어 생기는 근육 질환 중 하나인 근육감소증은 악액질(cachexia)로 인해 나타나기도 한다. 악액질은 만성 소모성 복합증후군의 일종이며 암, 결핵, 혈우병 등의 말기에서 볼 수 있는 고도의 전신쇠약 증세를 의미한다. 특히, 악성종양, 만성폐쇄성 폐질환, 만성심부전 등의 만성질환을 동반하여 발생하고, 식욕부진을 동반한 체중감소, 근육량 및 체지방 감소, 염증반응 등이 나타난다.
이러한 악액질로 인한 근육감소는 골격근량의 지속적인 감소와 기능손상에 의한 복합증후군으로 나타나는 것으로, 점진적이고 서서히 진행되는 근육량 소실이 나타나는 노화 및 근육 분화 장애에 의한 근육 감소 질환과 달리 급성적인 근육감소 증상이 나타난다. 이러한 생리적 특성의 차이는 예방 및 치료에 있어서도 차이를 보인다. 따라서, 근육감소라는 징후가 발생되더라도 그 발생 원인에 따라 악액질, 노화 및 근육 분화 장애 각각의 특성에 맞추어진 치료가 필요하다(류승완, 2017).
한편, 근육 분화 장애 및 질환을 극복하기 위한 방법으로, 근육세포를 재생하는 방법이 최근에 보고되고 있으며, 이러한 근육세포의 재생은 근육세포 바깥부분에 존재하는 위성세포를 자극하여 위성세포가 분열을 일으켜 근육 조직을 형성하는 것으로 알려져 있다. 근육세포의 재생은 손상된 근육의 수리뿐만 아니라 노화에 의한 자연적인 근육 손실에도 적용이 가능한 것으로 보고되기도 하였다(Conboy, I.M., et al., 2003).
또한, 암 악액질 진행과정에서 근육분화 과정에 중요한 근육 조절 인자인 미오디 및 미오게닌의 발현이 감소된다는 연구결과가 보고되고 있고(Blackwell, T.A., et al., 2016), 암 또는 에이즈에 의한 근육소모(악액질) 마우스 모델에서, 근육 분화 과정에 중요한 근육 조절 인자인 미오게닌, 미오신(myosin) 등의 발현이 감소된다는 연구결과도 보고되었다(Ramamoorthy, S., et al., 2009). 또한, 암 악액질이 유발된 마우스 모델에서 미오스타틴의 억제가 근육의 부피와 기능에 영향을 미친다는 연구 결과도 보고되면서(Smith, R.C., et al., 2013), 근육 분화 촉진을 통해 악액질 치료도 가능할 것으로 기대하고 있다.
인삼의 주된 기능성 성분인 진세노사이드(ginsenoside)는 식물계의 여러 사포닌 중 인삼 사포닌만을 특별하게 구분하여 명명하는 것으로, 현재까지 총 150종류 이상의 진세노사이드가 발굴되었다(Christensen, L.P., 2009). 진세노사이드는 항암, 항알레르기, 항염증 외에 중추신경 억제 및 정신안정, 진통, 기억력 개선, 간 상해보고, 단백질 및 지질합성 촉진, 항당뇨, 항스트레스, 항산화 활성물질 생성 촉진, 면역조절, 혈소판 응집억제, 항노화 작용 등의 약리 효능이 있음이 밝혀져 있고, 이는 진세노사이드 종류에 따라 각기 다른 효능을 나타낸다.
진세노사이드 Rg1 및 Rb1은 중추신경계 활동을 향상시키고, 진세노사이드 Re, Rg1 및 파낙산(panaxan) A 및 B는 당뇨병에 좋으며, 진세노사이드 Re 및 Rg1은 혈관 신생을 촉진하고, 진세노사이드 Rg3 및 Rh2는 항암 효능을 보인다고 알려져 있다(Chen, C.F., et al., 2008; Kim, H.S., et al., 2004). 최근 연구에서는 몇몇 인삼 추출물이 악액질, 피로 또는 근육 위축에 효능을 보이는 것으로 밝혀졌다. 0.9~1.4%의 진세노사이드 Rg1와 1.7~3.0%의 진세노사이드 Rb1을 함유하고 있는 GINSELECT®는 항종양제인 시스플라틴(cisplatin)을 처리한 쥐의 체중 감소와 운동 능력 감소를 예방하였고(Lobina, C., et al., 2014), 진세노사이드 Rg1은 단백질 분해 경로를 억제하여 기근으로 인한 근위축을 예방하는 것으로 나타났다(Li, F., et al., 2017).
이에, 본 발명자는 인삼의 진세노사이드 성분을 이용하여 근육분화 촉진 효과를 확인하는 과정에서, 미량의 진세노사이드 성분이 증가된 가공인삼추출물이 근육분화 억제제인 미오스타틴을 억제하고, 근육 분화를 촉진한다는 것을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.
종래선행기술인 한국등록특허 제1771486호는 20(R)(S)-진세노사이드 Rh2, 진세노사이드 Rk2 및 진세노사이드 Rh3로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 화합물을 함유하는 근육세포 증식 활성화를 통한 근육감소증(sarcopenia), 심근경색 및 심혈관계 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물 구성과 작용기전 및 적용 질병의 범위와 차이가 있다. 또한, 한국등록특허 제1595426호에는 진세노사이드 Rh2 및 Rg3의 함량이 증가 된 가공인삼추출물을 포함하는 근육감소증 치료용 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 미오스타틴 억제 및 근육 분화 촉진 효과는 기재 및 암시되어 있지 않다. 한국공개특허 제2017-0094292호에는 미오스타틴 길항제를 포함하는 근육감소증 치료용 조성물이 기재되어 있으나, 본 발명의 진세노사이드 Rh2 및 Rg3의 함량이 증가된 가공인삼추출물의 미오스타틴 억제 효과는 기재 및 암시되어 있지 않다.
류승완, 근감소증과 악액질의 임상적 특성, J. Clin. Nutr., 9(1), 2-6, 2017.
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본 발명의 목적은 가공인삼추출물을 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물을 제공하는 데 있다.
또한, 본 발명의 목적은 상기 근육 분화 촉진용 조성물을 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 개선용 건강기능식품을 제공하는 데 있다.
본 발명은 가공인삼추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
상기 가공인삼추출물은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 인삼 분말 및 밀기울로 구성된 배지에 접종하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 균을 배양하는 단계; (c) 상기 단계 (b)배양물을 한외여과막(ultrafilteration)으로 정제하는 단계; (d) 상기 단계 (c)정제물로부터 효소를 분리하는 단계; (e) 인삼 분말, 홍삼 분말, 인삼추출물 또는 홍삼추출물에 상기 단계 (d)효소를 첨가하는 단계; (f) 상기 단계 (e)첨가물을 발효하는 단계; (g) 상기 단계 (f)발효물을 분리하는 단계; (h) 상기 단계 (g)상등액을 농축하는 단계; (i) 상기 단계 (h)농축물을 아세트산, 젖산, 구연산, 사과산 및 주석산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기산으로 반응하는 단계; 및 (j) 상기 단계 (i)반응물을 중화 및 여과, 정제, 농축, 건조하는 단계; 로 제조된 것일 수 있다.
상기 조성물은 진세노사이드 Rh2 및 Rg3를 각각 0.5~30중량%를 함유할 수 있다.
상기 조성물은 근관세포(myotube) 분화를 촉진할 수 있다.
상기 조성물은 미오스타틴(myostatin)을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 근육 분화 촉진용 조성물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, 상기 근육 분화 촉진용 조성물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 근육 질환의 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 근육 질환은 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 피부근육염(dermatomyositis), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 신경 손상(nerve injury), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 악액질(cachexia) 및 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 악액질은 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS), 복강질환(celiac disease), 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rhematoide arthritis), 만성심부전증(chronic heart failure), 선천성 심부전증(congestive heart heart failure), 요독증(uremia), 결핵(tuberculous), 크론병(crohn's disease), 치료되지 않거나 심각한 제1형 당뇨, 신경성 식욕부진 및 호르몬 부족에 의한 악액질일 수 있다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명은 가공인삼추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물에 관한 것이다.
상기 가공인삼추출물은 한국등록특허 제0992800호 및 제1595426호의 제조방법으로 제조된 사포닌 분해효소를 제조한 후 제조된 사포닌 분해효소와 유기산에 의한 가수분해를 이용하여 미량의 진세노사이드 성분이 증가된 가공인삼분말 또는 가공인삼추출물이다.
상기 가공인삼추출물은 (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 인삼 분말 및 밀기울로 구성된 배지에 접종하는 단계; (b) 상기 단계 (a)의 균을 배양하는 단계; (c) 상기 단계 (b)배양물을 한외여과막(ultrafilteration)으로 정제하는 단계; (d) 상기 단계 (c)정제물로부터 효소를 분리하는 단계; (e) 인삼 분말, 홍삼 분말, 인삼추출물 또는 홍삼추출물에 상기 단계 (d)효소를 첨가하는 단계; (f) 상기 단계 (e)첨가물을 발효하는 단계; (g) 상기 단계 (f)발효물을 분리하는 단계; (h) 상기 단계 (g)상등액을 농축하는 단계; (i) 상기 단계 (h)농축물을 아세트산, 젖산, 구연산, 사과산 및 주석산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기산으로 반응하는 단계; 및 (j) 상기 단계 (i)반응물을 중화 및 여과, 정제, 농축, 건조하는 단계; 로 제조된 미량의 진세노사이드 성분이 증가된 가공인삼분말 또는 가공인삼추출물이다.
상기 미량의 진세노사이드는 근육 분화 촉진 효과가 있는 진세노사이드일 수 있으며, 바람직하게는 진세노사이드 Rh2 및 Rg3이다.
상기 근육 분화 촉진용 조성물은 진세노사이드 Rh2 및 Rg3를 함유하는 것으로, 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3가 단독으로 함유된 조성물보다 진세노사이드 Rh2 및 Rg3의 혼합 조성물이 근육 분화 촉진 효과가 우수하다.
상기 진세노사이드 Rh2 및 Rg3의 함량은 각각 0.2~30중량%일 수 있으며, 바람직하게는 0.5~30중량%이고, 더 바람직하게는 1~20중량%이다.
상기 "근육 분화"는 위성세포(satellite cell)가 활성화되어 근아세포(myoblast)로 분화하고, 근아세포들의 융합이 일어나 근관세포(myotube)가 형성된 후, 근관세포가 근섬유(muscle fiber)를 이루고, 근섬유가 다발을 이루어 근육을 형성하는 것으로, 미오디(MyoD), Myf5(myogenic factor 5), 미오게닌(mygenin), MRF4(muscle regulatory factor 4)와 같은 다양한 근육 조절 인자들과 미오신 H 사슬(myosin heavy chain, MHC), 근크레아틴인산화효소(muscle creatine kinase, MCK)와 같은 근육 특이성 인자들이 관여하고 있다.
상기 근육 분화 촉진용 조성물은 근아세포로부터 근관세포로의 분화를 촉진시킬 수 있으며, 근관세포의 너비를 증가시킬 수 있다.
상기 근육 분화 촉진용 조성물은 근관세포의 위축을 억제할 수 있다.
상기 근육 분화 촉진용 조성물은 미오디와 같은 근육 조절 인자의 발현을 증가시킬 수 있다.
상기 근육 분화 촉진용 조성물은 미오스타틴을 억제할 수 있다.
상기 "미오스타틴(myostatin)"은 근육세포에 직접적으로 작용하여 근육 분화 및 근육세포 분화(differentiation)를 억제하는 단백질이다. 미오스타틴은 노화, 근이영양증, 근위축성 측삭 경화증, 만성폐쇄성 폐질환, 만성심부전증(chronic heart failure), 에이즈, 암악액질, 신부전(renal failure), 요독증(uremia), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis) 등과 같은 다양한 질병에서 과발현되는 것으로 알려져 있다.
또한, 본 발명은 상기 근육 분화 촉진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 약학적 조성물은 근육세포로의 분화를 촉진시킴으로써 근육 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 미오스타틴을 억제함으로써 근육 질환을 예방 또는 치료할 수 있다.
상기 근육 질환은 근육세포의 결핍, 비정상적인 감소 또는 근육 세포의 기능 장애로 인해 발생할 수 있는 질병이다. 바람직하게는 근육세포의 결핍 또는 비정상적인 감소로 인한 것이다.
상기 근육 질환은 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 피부근육염(dermatomyositis), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 신경 손상(nerve injury), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 악액질(cachexia), 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases) 등 일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.
상기 악액질은 소모증후군(wasting syndrome)이라고도 하며, 식욕부진을 동반한 체중감소, 근육량 및 체지방 감소, 염증반응 등을 특징으로 한다. 이러한 악액질은 암, 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS), 복강질환(celiac disease), 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rhematoide arthritis), 만성심부전증(chronic heart failure), 선천성 심부전증(congestive heart heart failure), 요독증(uremia), 결핵(tuberculous), 크론병(crohn's disease), 치료되지 않거나 심각한 제1형 당뇨, 신경성 식욕부진, 호르몬 부족 등에 의해 나타날 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 바람직하게는 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS), 복강질환(celiac disease), 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rhematoide arthritis), 만성심부전증(chronic heart failure), 선천성 심부전증(congestive heart failure), 요독증(uremia), 결핵(tuberculous), 크론병(crohn's disease), 치료되지 않거나 심각한 제1형 당뇨, 신경성 식욕부진 및 호르몬 부족에 의한 악액질이고, 더 바람직하게는 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS) 및 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)에 의한 악액질이다.
상기 퇴행성 근육질환은 근육이 지속적으로 파괴되는 것으로, 뒤시엔느 근위축증(Duchenne muscular dystrophy), 베이커 근위축증(Becker's muscular dystrophy), 지대형 근위축증(Limb-girdle muscular dystrophy), 선천성 근위축증(congential muscular dystrophy), 얼굴어깨윗판 근위축증(facioscapulohumeral muscular dystrophy), 근긴장성 위축증(myotonic dystrophy), 안구인두근위축증(oculopharyngeal muscular atrophy), 말단 근위축증(distal muscular dystrophy), 애머리-드레이푸스 근위축증(emery-dreifuss muscular dystrophy) 등 일 수 있다.
상기 약학적 조성물은 상기 근육 분화 촉진용 조성물 및 부형제를 포함하는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 근육 분화 촉진용 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween)-61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사 및 피부 도포에 의해 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 근육 분화 촉진용 조성물을 유효성분으로 포함하는 근육 질환의 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.
상기 건강기능식품은 상기 근육 분화 촉진용 조성물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 근육 질환의 개선용 건강기능식품이다.
상기 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.
본 발명은 사포닌 분해효소를 제조한 후 제조된 사포닌 분해효소와 유기산에 의한 가수분해물을 이용한 미량의 진세노사이드 성분이 증가 된 가공인삼추출물을 유효성분으로 포함하는 근육 분화 촉진용 조성물에 관한 것으로, 상기 가공인삼추출물이 근아세포의 근육으로의 분화를 촉진하고, 근육 분화 억제인자인 미오스타틴을 억제하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가공인삼추출물을 이용하여 효과가 우수한 근육 질환의 예방 및 치료용 조성물을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 근아세포인 C2C12 세포의 근관세포로의 분화 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 본 발명의 가공인삼추출물의 세포 독성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 가공인삼추출물 처리 농도 및 시간에 따른 근관세포 분화 효과를 확인한 결과로, (A)는 근관세포의 세포 이미지를, (B)는 분화된 근관세포의 수를, (C)는 분화된 근관세포의 세포핵 수를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명의 가공인삼추출물 처리 농도에 따른 근관세포의 너비 증가를 확인한 결과로, (A)는 근관세포의 이미지를, (B)는 근관세포의 너비를 측정하여 수치화한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 미오스타틴(MSTN) 처리 농도에 따른 근관세포의 위축 정도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 본 발명의 가공인삼추출물의 미오스타틴에 의한 근관세포 위축을 억제하는 효과를 확인한 결과로, (A)는 근관세포의 이미지를, (B)는 근관세포의 너비를 측정하여 수치화한 결과를 보여주고 있다.
도 7은 본 발명의 가공인삼추출물의 미오스타틴에 의한 근관세포 위축 관련 신호전달 인자인 Smad2의 인산화 억제 효과를 확인한 결과로, (A)는 인산화 된 Smad2(pSmad2)의 발현을 확인한 밴드를, (B)는 발현 밴드의 밀도를 수치화한 결과를 보여주고 있다.
도 8은 본 발명의 가공인삼추출물의 근원섬유 단백질 발현에 핵심적인 전사인자인 미오디(MyoD) 및 이를 분해하는 효소인 MAFbx의 발현 조절 효과를 확인한 결과로, (A)는 미오디, MAFbx, 및 GAPDH의 단백질 발현을 확인한 밴드를, (B)는 미오스타틴 및 본 발명의 가공인삼추출물의 유무 조건에서 GAPDH 대비 MAFbx의 발현을 수치화한 결과이며, (C)는 미오스타틴 및 본 발명의 가공인삼추출물의 유무 조건에서 GAPDH 대비 미오디의 발현을 수치화한 결과를 보여주고 있다.
도 2는 본 발명의 가공인삼추출물의 세포 독성을 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 가공인삼추출물 처리 농도 및 시간에 따른 근관세포 분화 효과를 확인한 결과로, (A)는 근관세포의 세포 이미지를, (B)는 분화된 근관세포의 수를, (C)는 분화된 근관세포의 세포핵 수를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명의 가공인삼추출물 처리 농도에 따른 근관세포의 너비 증가를 확인한 결과로, (A)는 근관세포의 이미지를, (B)는 근관세포의 너비를 측정하여 수치화한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 미오스타틴(MSTN) 처리 농도에 따른 근관세포의 위축 정도를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 본 발명의 가공인삼추출물의 미오스타틴에 의한 근관세포 위축을 억제하는 효과를 확인한 결과로, (A)는 근관세포의 이미지를, (B)는 근관세포의 너비를 측정하여 수치화한 결과를 보여주고 있다.
도 7은 본 발명의 가공인삼추출물의 미오스타틴에 의한 근관세포 위축 관련 신호전달 인자인 Smad2의 인산화 억제 효과를 확인한 결과로, (A)는 인산화 된 Smad2(pSmad2)의 발현을 확인한 밴드를, (B)는 발현 밴드의 밀도를 수치화한 결과를 보여주고 있다.
도 8은 본 발명의 가공인삼추출물의 근원섬유 단백질 발현에 핵심적인 전사인자인 미오디(MyoD) 및 이를 분해하는 효소인 MAFbx의 발현 조절 효과를 확인한 결과로, (A)는 미오디, MAFbx, 및 GAPDH의 단백질 발현을 확인한 밴드를, (B)는 미오스타틴 및 본 발명의 가공인삼추출물의 유무 조건에서 GAPDH 대비 MAFbx의 발현을 수치화한 결과이며, (C)는 미오스타틴 및 본 발명의 가공인삼추출물의 유무 조건에서 GAPDH 대비 미오디의 발현을 수치화한 결과를 보여주고 있다.
이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.
본 발명의 가공인삼추출물은 한국등록특허 제0992800호 및 제1595426호에 개시된 방법으로 제조하였다.
<비교예 1. 인삼 분말의 제조>
6년근 인삼 200g을 열풍건조 한 후 분쇄하여 60g의 인삼분말을 얻었다.
<비교예 2. 인삼농축액의 제조>
6년근 인삼 200g을 열풍건조 한 후 1L의 70% 주정을 첨가하여 70℃에서 8시간 교반한 후 추출, 여과, 및 농축하여 50g의 인삼농축액을 얻었다.
<비교예 3. 인삼농축액분말의 제조>
6년근 인삼 200g을 열풍건조 한 후 1L의 70% 주정을 첨가하여 70℃에서 8시간 교반한 후 추출, 여과, 농축, 및 건조하여 30g의 인삼농축액분말을 얻었다.
<비교예 4. 홍삼 분말의 제조>
6년근 인삼 200g을 98℃에서 1시간 증기로 쪄서 말린 후 분쇄하여 40g의 홍삼분말을 얻었다.
<비교예 5. 홍삼농축액의 제조>
6년근 인삼 200g을 98℃에서 1시간 증기로 쪄서 말린 후 1L의 70% 주정을 첨가하여 70℃에서 8시간 교반한 후 추출, 여과, 및 농축하여 30g의 홍삼농축액을 얻었다.
<비교예 6. 홍삼농축액분말의 제조>
6년근 인삼 200g을 98℃에서 1시간 증기로 쪄서 말린 후 1L의 70% 주정을 첨가하여 70℃에서 8시간 교반한 후 추출, 여과, 농축, 및 건조하여 25g의 홍삼농축액분말을 얻었다.
<비교예 7. 인삼 분말 + Rh2 0.3% + Rg3 0.3% 제조>
비교예 1의 인삼 분말 99.4g에 진세노사이드 Rh2 0.3g과 Rg3 0.3g을 혼합하였다.
<비교예 8. 홍삼 분말 + Rh2 0.3% + Rg3 0.3% 제조>
비교예 4의 홍삼 분말 99.4g에 진세노사이드 Rh2 0.3g과 Rg3 0.3g을 혼합하였다.
<비교예 9. 홍삼 분말 + Rh2 1% 제조>
비교예 4의 홍삼 분말 99g에 진세노사이드 Rh2 1g을 혼합하였다.
<비교예 10. 홍삼 분말 + Rg3 1% 제조>
비교예 4의 홍삼 분말 99g에 진세노사이드 Rg3 1g을 혼합하였다.
<비교예 11. 홍삼 분말 + Rh2 0.5% + Rg3 0.5% 제조>
비교예 4의 홍삼 분말 99g에 진세노사이드 Rh2 0.5g과 Rg3 0.5g을 혼합하였다.
<실시예 1. 인삼 분말을 이용한 가공인삼분말의 제조>
인삼 분말 250g, 밀기울 750g을 넣고 121℃, 1.5기압 하에서 고압증기 멸균기로 멸균한다. 멸균된 배지에 멸균수 2L을 넣고 혼합한 다음 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 현탁액(5×105 포자/배지무게 g)을 28℃에서 7일간 배양한다. 배양이 완료되면, 0.02M 초산나트륨 완충용액을 첨가하고 혼합한 후 배지를 여과한다. 여과된 배양액을 한외여과막(100kDa 이상)을 사용 여과 및 농축하여 효소액 60g을 얻는다. 비교예 1의 인삼 분말 200g에 효소액 30g을 첨가하여 28℃에서 18시간 배양한 후 주정을 첨가하여 효소를 침전, 상등액을 농축한다. 상기 농축물 200g에 2L의 정제수를 가한 후 구연산 250g을 첨가하고 50℃에서 18시간 동안 교반 하였다. 반응이 완료되면 70% 주정을 첨가하고 여과, 농축하여 200g의 가공인삼분말을 얻었다.
<실시예 2. 인삼농축액을 이용한 가공인삼농축액의 제조>
인삼 분말 250g, 밀기울 750g을 넣고 121℃, 1.5기압 하에서 고압증기 멸균기로 멸균한다. 멸균된 배지에 멸균수 2L을 넣고 혼합한 다음 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 현탁액(5×105 포자/배지무게 g)을 접종하고 28℃에서 7일간 배양한다. 배양이 완료되면, 0.02M 초산나트륨 완충용액을 첨가하고 혼합한 후 배지를 여과한다. 여과된 배양액을 한외여과막(100kDa 이상)을 사용하여 여과 농축하여 효소액 60g을 얻는다. 비교예 2의 인삼농축액 200g에 효소액 30g을 첨가하여 28℃에서 18시간 배양한 후 주정을 첨가하여 효소를 침전, 상등액을 농축한다. 상기 농축물 200g에 2L의 정제수 첨가 후 구연산 250g을 첨가하고 50℃에서 18시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면 70% 주정을 첨가하고 여과, 농축하여 190g의 가공인삼농축액을 얻었다.
<실시예 3. 인삼농축액분말을 이용한 가공인삼농축액분말의 제조>
인삼 분말 250g, 밀기울 750g을 넣고 121℃, 1.5기압 하에서 고압증기 멸균기로 멸균한다. 멸균된 배지에 멸균수 2L을 넣고 혼합한 다음 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 현탁액(5×105 포자/배지무게 g)을 접종하고 28℃에서 7일간 배양한다. 배양이 완료되면, 0.02M 초산나트륨 완충용액을 첨가하고 혼합한 후 배지를 여과한다. 여과된 배양액을 한외여과막(100kDa 이상)을 사용하여 여과 농축하여 효소액 60g을 얻는다. 비교예 3의 인삼농축액분말 200g에 효소액 30g을 첨가하여 28℃에서 18시간 배양한 후 주정을 첨가하여 효소를 침전, 상등액을 농축한다. 상기 농축물 200g에 정제수 2L를 첨가하고 초산 250g을 첨가하고 50℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면 70% 주정을 첨가하고 여과, 농축, 건조하여 195g의 가공인삼농축액분말을 얻었다.
<실시예 4. 홍삼 분말을 이용한 가공홍삼분말의 제조>
인삼 분말 250g, 밀기울 750g을 넣고 121℃, 1.5기압 하에서 고압증기 멸균기로 멸균한다. 멸균된 배지에 멸균수 2L을 넣고 혼합한 다음 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 현탁액(5×105 포자/배지무게 g)을 접종하고 28℃에서 7일간 배양한다. 배양이 완료되면, 0.02M 초산나트륨 완충용액을 첨가하고 혼합한 후 배지를 여과한다. 여과된 배양액을 한외여과막(100kDa 이상)을 사용하여 여과 농축하여 효소액 60g을 얻는다. 비교예 4의 홍삼 분말 200g에 효소액 30g을 첨가하여 28℃에서 18시간 배양한 후 주정을 첨가하여 효소를 침전, 상등액을 농축한다. 상기 농축물 200g에 정제수 2L를 가하고 초산 250g을 첨가하고 50℃에서 8시간 동안 교반하였다. 반응이 완료되면 70% 주정을 첨가하고 여과, 농축, 건조하여 195g의 가공홍삼분말을 얻었다.
<실시예 5. 홍삼농축액을 이용한 가공홍삼농축액의 제조>
인삼 분말 250g, 밀기울 750g을 넣고 121℃, 1.5기압 하에서 고압증기 멸균기로 멸균한다. 멸균된 배지에 멸균수 2L을 넣고 혼합한 다음 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 현탁액(5×105 포자/배지무게 g)을 접종하고 28℃에서 7일간 배양한다. 배양이 완료되면, 0.02M 초산나트륨 완충용액을 첨가하고 혼합한 후 배지를 여과한다. 여과된 배양액을 한외여과막(100kDa 이상)을 사용하여 여과 농축하여 효소액 60g을 얻는다. 비교예 5의 홍삼농축액 200g에 효소액 30g을 첨가하여 28℃에서 18시간 배양한 후 주정을 첨가하여 효소를 침전, 상등액을 농축한다. 상기 농축물 200g에 정제수 2L를 가하고 구연산 250g을 첨가하고 50℃에서 18시간 동안 교반 하였다. 반응이 완료되면 70% 주정을 첨가하고 여과, 농축하여 190g의 가공홍삼농축액을 얻었다.
<실시예 6. 홍삼농축액분말을 이용한 가공홍삼농축액분말의 제조>
인삼 분말 250g, 밀기울 750g을 넣고 121℃, 1.5기압하에서 고압증기 멸균기로 멸균한다. 멸균된 배지에 멸균수 2L을 넣고 혼합한 다음 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger) 현탁액 (5×105 포자/배지무게 g)을 접종하고 28℃에서 7일간 배양한다. 배양이 완료되면, 0.02M 초산나트륨 완충용액을 첨가하고 혼합한 후 배지를 여과한다. 여과된 배양액을 한외여과막(100kDa 이상)을 사용 여과농축하여 효소액 60g을 얻는다. 비교예 6의 홍삼농축액분말 200g에 효소액 30g을 첨가하여 28℃에서 18시간 배양한 후 주정을 첨가하여 효소를 침전, 상등액을 농축한다. 상기 농축물 200g에 정제수 2L를 가하고 초산 250g을 첨가하고 50℃에서 8시간 동안 교반 하였다. 반응이 완료되면 70% 주정을 첨가하고 여과, 농축, 건조하여 195g의 가공홍삼농축액분말을 얻었다.
하기 표 1은 한국등록특허 제992800호의 개시된 방법으로 분석하여 본 발명의 실시예 및 비교예 제조물에 함유된 진세노사이드 Rh2와 Rg3 함량을 나타낸 것이다. 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 6에 해당되는 인삼 분말 및 홍삼 분말에 대한 사포닌 분해효소를 제조한 후 제조된 사포닌 분해효소와 유기산에 의한 가수분해를 이용하여 미량의 진세노사이드 성분이 증가된 가공인삼분말 또는 가공인삼추출물이 이들의 반응 대상물질인 인삼 분말 및 홍삼 분말에 비해 진세노사이드 Rh2 및 Rg3가 증가되어 다량 함유되는 것을 확인하였다. 비교예 7 내지 비교예 11은 본 발명의 실시예와 같이 사포닌 분해효소와 유기산 가수분해 처리를 하지 않은 인삼 분말과 홍삼 분말에 단순히 진세노사이드 Rh2와 Rg3를 첨가하여 본 발명의 실시예와 같은 진세노사이드 Rh2와 Rg3 함량이 되도록 하여 이로부터 근육 분화 촉진 효과를 비교하기 위해 제조하였다.
| 진세노사이드 Rg3 및 Rh2함량 | ||
| 분류 | 함량(중량%) | |
| Rh2 | Rg3 | |
| 실시예 1(가공인삼분말) | 0.2 | 0.3 |
| 실시예 2(가공인삼농축액) | 3 | 3 |
| 실시예 3(가공인삼농축액분말) | 12 | 18 |
| 실시예 4(가공홍삼분말) | 0.6 | 0.8 |
| 실시예 5(가공홍삼농축액) | 1 | 3 |
| 실시예 6(가공홍삼농축액분말) | 5 | 10 |
| 비교예 1(인삼분말) | <0.01 | <0.01 |
| 비교예 2(인삼농축액) | <0.5 | <0.5 |
| 비교예 3(인삼농축액분말) | <0.5 | <0.01 |
| 비교예 4(홍삼분말) | <0.01 | <0.01 |
| 비교예 5(홍삼농축액) | <0.5 | <0.5 |
| 비교예 6(홍삼농축액분말) | <0.01 | <0.01 |
| 비교예 7(인삼분말 99.5g+Rh20.2g+Rg3 0.3g) | 0.2 | 0.3 |
| 비교예 8(홍삼분말 99.5g+Rh2 0.2g+Rg3 0.3g) | 0.2 | 0.3 |
| 비교예 9(홍삼분말 99g+Rh2 1g) | 1 | <0.01 |
| 비교예 10(홍삼분말 99g+Rg3 1g) | <0.01 | 1 |
| 비교예 11(홍삼분말 99g+Rh2 0.5g+Rg3 0.5g) | 0.5 | 0.5 |
<
실험예
1. 동물세포 배양 및
근관세포
분화 유도>
근육 분화 과정에서 근아세포의 분열이 일어나고, 근아세포들 간의 융합이 일어나 근관세포로 발달하여 최종적으로 근육을 형성한다. 따라서, 본 발명의 조성물의 근육 분화에의 영향을 확인하기 위해 근관세포로의 분화 활성을 확인하였다.
근관세포로의 분화 촉진 활성을 확인하기 위해 마우스 근아세포(myoblast)인 C2C12(C2C12 ATCC ® CRL-1772) 세포를 이용하였다. C2C12 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100U/㎖의 페니실린(penicillin) 및 100U/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Gibco) 배지를 넣고 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다.
상기에서 배양한 C2C12 세포를 플레이트에 분주하고 세포가 80~90% 정도 찰 때까지 배양하였다. 배양액을 제거하고 2% 말 혈청(horse serum, Gibco)이 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 배양하여 근관세포로의 분화를 유도시킨 후, 형성된 근관세포를 현미경을 통해 확인하였고, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1에서 보여주듯이, (A)의 분화 전과 달리, (B)의 분화를 유도한 후에는 여러 개의 근아세포들이 융합되어 관 형태의 근관세포를 형성하는 것을 확인하였다.
이를 통해, C2C12 세포에 말 혈청을 처리함으로서 근육 분화를 유도할 수 있음을 알 수 있었다.
<실험예 2. 가공인삼추출물의 세포 독성 확인>
본 발명의 가공인삼추출물의 세포 독성 여부를 확인하기 위해, 상기 실험예 1에서 분화시킨 근관세포를 이용하였다.
상기 실험예 1의 근관세포를 96웰 플레이트에 분주하여 24시간 동안 배양 한 후, 상기 본 발명의 가공인삼추출물을 0~100㎍/㎖이 되도록 처리하고 다시 24시간 동안 배양하였다. 배양 후 Promega사의 CellTiter-Glo Luminescent cell viability assay 키트 및 제조사에서 제공하는 매뉴얼을 이용하여 세포 내 ATP 농도를 측정하여 세포 생존율을 측정하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 보여주듯이, 상기 조성물 중 실시예 2의 가공인삼추출물 농도 30㎍/㎖까지의 세포 생존율의 감소는 미미하나, 50㎍/㎖ 및 100㎍/㎖에서 가공인삼추출물을 처리하지 않은 정상 세포 대비 세포 생존율이 7~12% 정도 감소하였다. 즉, 실시예 2의 가공인삼추출물 농도가 50㎍/㎖ 이상일 경우에는 세포 독성이 나타날 수 있음을 예측할 수 있었다.
이러한 결과는 다른 실시예의 가공인삼추출물을 처리한 경우에도 유사한 결과를 얻을 수 있었다.
이를 통해, 본 발명의 가공인삼추출물의 최고 처리 농도가 30㎍/㎖ 임을 알 수 있었다.
<실험예 3. 가공인삼추출물의 근관세포 형성 촉진 확인>
근육 분화 과정에서 근아세포의 분열이 일어나고, 근아세포들 간의 융합이 일어나 근관세포로 발달하여 최종적으로 근육을 형성한다. 따라서, 본 발명의 가공인삼추출물의 근육 분화에의 영향을 확인하기 위해 근관세포 형성 유도 활성을 확인하였다.
상기 실험예 1의 근관세포 형성 유도 실험 방법과 동일하게 실험을 진행하였다. 이때, 말 혈청 처리 후, 상기 실시예 2의 가공인삼추출물을 0, 10, 30㎍/㎖이 되도록 처리한 후, 6일 동안 배양하였다. 배양 0일, 2일, 4일, 6일차에 해당되는 세포를 고정(fixing)하고, Diff Quick kit(시스맥스, ZS0003, 일본) 및 제조사에서 제공하는 매뉴얼에 따라 세포핵 및 세포질을 염색한 한 후, 현미경을 이용하여 이미지를 촬영하였고, 근관세포의 수 및 세포핵의 수를 분석하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 보여주듯이, 실시예 2의 가공인삼추출물을 처리한 경우, 처리 시간 및 농도에 따라 근관세포가 늘어나는 것을 세포 이미지(A), 근관세포의 수(B) 및 세포핵 수(C)를 통해 확인하였다.
또한, 상기 실험방법과 동일한 방법으로 상기 실시예 1 내지 실시예 6 및 비교예 1 내지 비교예 11의 가공인삼추출물을 10㎍/㎖이 되도록 처리한 후 4일 동안 배양하고, 근관세포의 수를 분석하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
| 분류 | 시야 당 근관세포 수 |
| 대조군(말 혈청만 처리) | 25 |
| 실시예 1(가공인삼분말) | 31 |
| 실시예 2(가공인삼농축액) | 37 |
| 실시예 3(가공인삼농축액분말) | 41 |
| 실시예 4(가공홍삼분말) | 33 |
| 실시예 5(가공홍삼농축액) | 34 |
| 실시예 6(가공홍삼농축액분말) | 40 |
| 비교예 1(인삼분말) | 25 |
| 비교예 2(인삼농축액) | 26 |
| 비교예 3(인삼농축액분말) | 27 |
| 비교예 4(홍삼분말) | 26 |
| 비교예 5(홍삼농축액) | 26 |
| 비교예 6(홍삼농축액분말) | 26 |
| 비교예 7(인삼분말 99.5g+Rh2 0.3g+Rg3 0.3g) | 30 |
| 비교예 8(홍삼분말 99.5g+Rh2 0.3g+Rg3 0.3g) | 31 |
| 비교예 9(홍삼분말 99g+Rh2 1g) | 29 |
| 비교예 10(홍삼분말 99g+Rg3 1g) | 29 |
| 비교예 11(홍삼분말 99g+Rh2 0.5g+Rg3 0.5g) | 32 |
상기 표 2를 통해 알 수 있듯이, 비교예 1 내지 비교예 6의 가공인삼추출물을 처리한 경우의 근관세포 수는 말 혈청만 처리한 대조군과 유사하게 나타나는 반면에, 실시예 1 내지 실시예 6의 가공인삼추출물을 처리한 경우에 근관세포 수가 증가하는 것을 확인하였다. 또한, 비교예 1 및 비교예 4의 인삼분말 또는 홍삼분말에 진세노사이드 Rh2, Rg3를 각각 추가하거나 모두 추가한 비교예 7 내지 비교예 11의 가공인삼추출물을 처리한 경우에는 비교예 1 및 비교예 4의 가공인삼추출물에 비해 근관세포의 수가 증가하였고, 특히나, 진세노사이드 Rh2 또는 Rg3를 각각 추가한 비교예 9 및 비교예 10의 가공인삼추출물을 처리한 경우에 비해 두 개의 진세노사이드를 같이 추가한 비교예 7, 비교예 8, 비교예 10 및 비교예 11의 가공인삼추출물을 처리한 경우에 근관세포 수가 많은 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가공인삼추출물과 같이 진세노사이드 Rh2 및 Rg3를 함께 투여한 경우에 근육 분화 촉진 효과가 증가한다는 것을 알 수 있었다.
<실험예 4. 가공인삼추출물의 근관세포 너비 증가 효과 확인>
근육 분화 과정 중에서 생성된 근관세포는 그 길이 및 너비가 증가하면서 주변 근관세포들과 융합되어 근섬유를 형성한다. 따라서, 본 발명의 가공인삼추출물의 근육 분화에의 영향을 확인하기 위해 근관세포의 너비 증가 효과를 확인하였다.
상기 실험예 1의 방법으로 C2C12 세포를 근관세포로 분화시킨 후, 상기 실시예 2의 가공인삼추출물을 0, 1, 10, 30㎍/㎖이 되도록 처리하고, 24시간 동안 배양하였다. 배양한 세포를 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 15분간 고정시키고 0.2% 트리톤 X-100(triton X-100)을 15분간 처리한 후, 5% BSA(bovine serum albumin)로 6시간 동안 블로킹(blocking)시켰다. 블로킹 후 세포 형태를 관찰하기 위해 세포에 근관 형성 유지 단백질인 MHC(myosin heavy chain)에 대한 항체를 넣고 4℃에서 12시간 반응시킨 다음에 Alexa Fluor 488 형광물질이 결합된 2차 항체를 실온에서 4시간 동안 반응시켜 면역형광염색 한 후, 형광현미경을 통해 MHC에 붙어 있는 형광물질을 이용해 근관세포 이미지를 관찰하고, Image J 프로그램을 이용하여 근관세포의 너비를 측정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이때, 근관세포의 너비는 무작위로 5개의 지역에서 총 100개 이상의 근관세포의 너비를 측정하여 정량화 하였다.
도 4(A)의 근관세포의 이미지 및 4(B)의 근관세포 너비를 측정한 결과를 통해 알 수 있듯이, C2C12로부터 분화된 근관세포의 너비가 실시예 2의 가공인삼추출물 처리농도에 따라 증가하는 것을 확인하였다.
또한, 본 명세서에서는 보여주지 않았으나, 본 발명의 실시예 1 내지 실시예 5의 가공인삼추출물을 처리한 경우에도, 상기 실시예 2의 가공인삼추출물을 처리한 경우와 마찬가지로 근관세포의 너비가 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가공인삼추출물이 근관세포의 너비 증가를 통해 근육 분화를 촉진하는 효과가 있음을 알 수 있었다.
<실험예 5. 가공인삼추출물의 근위축 억제 효과 확인>
실험예 5-1. 근위축 동물세포 모델 제조
본 발명의 가공인삼추출물의 근위축 억제 효과를 확인하기 위해, 근위축 동물 세포 모델을 제조하였다. 이때, 근위축이 일어나면 근관세포의 너비 및 길이가 감소되는 것을 바탕으로 동물세포 모델을 제조하였다.
상기 실험예 1의 근관세포 분화 유도와 동일한 방법으로 근관세포를 분화시킨 후, FBS가 포함하되 않은 DMEM 배지를 넣고 3시간 동안 배양하였다. 배양 후, 각 세포에 근육분화 억제 물질인 미오스타틴(myostatin, MSTN)을 농도별로 24시간 동안 처리하고, 근위축이 유도되었는지 확인하기 위해 근관세포의 너비 변화를 측정하였다. 근관세포의 너비 변화 측정은 상기 실험예 4와 동일한 방법을 수행하여 측정하였고, 면역형광염색 한 후, 형광현미경을 통해 MHC에 붙어 있는 형광물질을 이용해 근관세포 이미지를 관찰하고, Image J 프로그램을 이용하여 근관세포의 너비를 측정하여, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5에서 보여주듯이, 미오스타틴을 처리하지 않은 근관세포에 비해 미오스타틴을 처리한 경우, 처리 농도가 증가함에 따라 근관세포의 너비가 감소하는 것을 확인하였고, 0.4㎍/㎖의 미오스타틴을 처리한 경우에 근관세포의 너비가 가장 크게 감소하였다.
이를 통해, 본 발명의 가공인삼추출물의 근위축 억제 효과를 확인하기 위한 근위축 동물세포 모델 제조시 미오스타틴 0.4㎍/㎖을 처리하기로 결정하였다.
실험예 5-2. 가공인삼추출물의 근위축 억제 효과 확인
본 발명의 가공인삼추출물의 근위축 억제 효과를 확인하기 위해 상기 실험예 5-1의 근위축 동물세포 모델 제조 방법과 동일한 방법으로 근위축을 유도한 후, 근관세포의 너비 변화를 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 이때, 미오스타틴(MSTN) 0.4㎍/㎖과 상기 실시예 2의 가공인삼추출물 30㎍/㎖을 24시간 동안 단독 처리하거나 병용 처리하였고, 미오스타틴 및 실시예 2의 가공인삼추출물을 처리하지 않은 근관세포를 대조군으로 이용하였다.
도 6(A)의 근관세포의 이미지 및 6(B)의 근관세포 너비를 측정한 결과를 통해 알 수 있듯이, 대조군에 실시예 2의 가공인삼추출물을 처리한 경우에는 근관세포의 너비가 증가하는 반면에, 미오스타틴(MSTN)을 처리하면 근관세포의 너비가 감소되는 것을 확인하였다. 또한, 미오스타틴과 실시예 2의 가공인삼추출물을 함께 처리한 경우에는 미오스타틴에 의해 감소된 근관세포의 너비가 증가하는 것을 확인하였다.
이를 통해, 본 발명의 가공인삼추출물이 근육 분화 과정 중에 근관세포의 너비를 증가시킬 뿐만 아니라 미오스타틴에 의한 근위축을 억제한다는 것을 알 수 있었다.
<실험예 6. 가공인삼추출물의 미오스타틴 관련 신호전달 억제 효과 확인>
실험예 6-1. Smad 2 인산화 억제 효과 확인
미오스타틴(MSTN)은 액티빈 타입 II 수용체(activin type II receptor, ActRIIB)-Smad2 신호전달 경로의 활성화를 통해 유비퀴틴 프로테아좀 경로(ubiquitin proteasome pathway, UPP) 매개 단백질 분해를 증가시켜 근위축을 유도하는 것으로 알려져 있다. 이에, 본 발명의 가공인삼추출물의 미오스타틴에 의한 근위축 억제 효과를 확인하기 위해 ActRIIB-Smad2 신호전달 경로 중 Smad2의 인산화 억제 여부를 확인하였다.
상기 실험예 5-2와 동일한 방법으로 분화시킨 근관세포에 미오스타틴 및 상기 실시예 2의 가공인삼추출물을 처리하여 세포를 확보하였고, 이를 이용해 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다. 이때, 실시예 2의 가공인삼추출물의 경우 처리 농도가 0, 10, 30, 100㎍/㎖이 되도록 처리하였다. 확보한 세포에 용해 완충용액(lysis buffer)을 넣고 세포를 용해시킨 후 원심 분리하여 상등액의 단백질을 확보하였다. 확보한 상등액의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 분리하고 PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인을 블로킹 용액으로 블로킹 시킨 다음, Smad2 및 인산화 된 Smad2(pSmad2)의 양을 확인하기 위해 각각의 1차 항체를 처리한 후, 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하고, ECL(enhanced chemiluminescence)(Amersham 사)를 이용하여 단백질 발현을 확인하였다. 이때, 단백질 밴드 밀도를 측정하여 수치화하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7(A)의 단백질 발현 밴드 결과 및 7(B)의 발현량을 수치화한 결과에서 보여주듯이, 근관세포에 미오스타틴(MSTN)을 처리한 경우에는 Smad2의 인산화(pSmad2)가 증가한 반면에, 실시예 2의 가공인삼추출물을 처리한 경우에는, 처리 농도가 증가함에 따라 Smad2의 인산화(pSmad2)가 감소되는 것을 확인하였다.
실험예 6-2. MyoD 분해 경로 억제 효과 확인
근육 분화에 중요한 근원섬유 단백질 발현에 핵심적인 전사인자인 미오디(MyoD)의 분해 과정은 미오스타틴(MSTN)-ActRIIB-Smad2 경로에 의해 활성화되는 UPP 과정에 의해 주도되는 것으로 알려져 있다. UPP 과정은 대상 단백질에 특화된 유비퀴틴화 E3 리가아제(ligase)들에 의해 조절되는데, 이 과정에 핵심적인 미오디의 E3 리가아제는 MAFbx로 알려져 있다. 이에, 본 발명의 가공인삼추출물에 의한 미오스타틴에 의한 근위축 억제 효과를 확인하기 위해 미오디와 MAFbx 함량 변화를 확인하였다.
상기 실험예 5-2와 동일한 방법으로 분화시킨 근관세포에 미오스타틴 및 상기 실시예 2의 가공인삼추출물을 처리하여 세포를 확보하였다. 이때, 실시예 2의 가공인삼추출물의 경우, 처리 농도가 30㎍/㎖이 되도록 처리하였다. 확보한 세포를 이용해 상기 실시예 6-1과 동일한 방법으로 미오디와 MAFbx에 해당되는 항체를 이용하여 웨스턴 블롯을 수행하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8(A)의 MAFbx 및 미오디 단백질 발현 밴드 결과와 8(B)의 MAFbx 및 8(C)의 미오디 발현량을 수치화한 결과에서 보여주듯이, 근관세포에 미오스타틴(MSTN)을 처리한 경우에는 MAFbx의 발현이 증가하고, 미오디의 발현은 감소하는 반면에, 실시예 2의 가공인삼추출물을 처리한 경우에는, MSTN에 의해 증가된 MAFbx가 감소되고, MSTN에 의해 감소된 미오디의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
상기 실험예 6-1 및 실험예 6-2의 결과를 통해, 본 발명의 가공인삼추출물이 근육 분화 억제제인 미오스타틴의 신호전달 과정을 억제함으로써 근육 분화를 촉진한다는 것을 알 수 있었다.
Claims (6)
- (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 인삼 분말 및 밀기울로 구성된 배지에 접종하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 균을 배양하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)배양물을 한외여과막(ultrafilteration)으로 정제하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)정제물로부터 효소를 분리하는 단계;
(e) 인삼 분말, 홍삼 분말, 인삼추출물 또는 홍삼추출물에 상기 단계 (d)효소를 첨가하는 단계;
(f) 상기 단계 (e)첨가물을 발효하는 단계;
(g) 상기 단계 (f)발효물을 분리하는 단계;
(h) 상기 단계 (g)상등액을 농축하는 단계;
(i) 상기 단계 (h)농축물을 아세트산, 젖산, 구연산, 사과산 및 주석산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기산으로 반응하는 단계; 및
(j) 상기 단계 (i)반응물을 중화 및 여과, 정제, 농축, 건조하는 단계;
로 제조된 가공인삼추출물을 유효성분으로 포함하는 근위축을 억제하는 것을 특징으로 하는 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 및 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases)으로 이루어진 군에서 선택되는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 진세노사이드 Rh2 및 Rg3를 각각 0.5~30중량%를 함유하는 것을 특징으로 하는 근위축증, 근이영양증, 근신경 전도성 질병, 당뇨병성 근위축증, 근위축성 측삭 경화증 및 퇴행성 근육질환으로 이루어진 군에서 선택되는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 근관세포(myotube) 분화를 촉진하는 것을 특징으로 하는 근위축증, 근이영양증, 근신경 전도성 질병, 당뇨병성 근위축증, 근위축성 측삭 경화증 및 퇴행성 근육질환으로 이루어진 군에서 선택되는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 조성물은 미오스타틴(myostatin)에 의한 근위축 현상을 억제하는 것을 특징으로 하는 근위축증, 근이영양증, 근신경 전도성 질병, 당뇨병성 근위축증, 근위축성 측삭 경화증 및 퇴행성 근육질환으로 이루어진 군에서 선택되는 근육 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물. - 삭제
- (a) 아스퍼질러스 나이거(Aspergillus niger)를 인삼 분말 및 밀기울로 구성된 배지에 접종하는 단계;
(b) 상기 단계 (a)의 균을 배양하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)배양물을 한외여과막(ultrafilteration)으로 정제하는 단계;
(d) 상기 단계 (c)정제물로부터 효소를 분리하는 단계;
(e) 인삼 분말, 홍삼 분말, 인삼추출물 또는 홍삼추출물에 상기 단계 (d)효소를 첨가하는 단계;
(f) 상기 단계 (e)첨가물을 발효하는 단계;
(g) 상기 단계 (f)발효물을 분리하는 단계;
(h) 상기 단계 (g)상등액을 농축하는 단계;
(i) 상기 단계 (h)농축물을 아세트산, 젖산, 구연산, 사과산 및 주석산으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기산으로 반응하는 단계; 및
(j) 상기 단계 (i)반응물을 중화 및 여과, 정제, 농축, 건조하는 단계;
로 제조된 가공인삼추출물을 유효성분으로 포함하는 근위축을 억제하는 것을 특징으로 하는 근위축증(muscular atrophy), 근이영양증(muscular dystrophy), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS) 및 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases)으로 이루어진 군에서 선택되는 근육 질환의 개선용 건강기능식품.
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