KR20200043562A

KR20200043562A - 지노스테마 론기페스 vk1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 ampk 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR20200043562A
Application number: KR1020180123598A
Authority: KR
Inventors: 오원근; 팜하탄텅; 허정무; 트란반온; 둑 트롱 흐앙
Original assignee: 서울대학교산학협력단; 하노이 약학대학교
Priority date: 2018-10-17
Filing date: 2018-10-17
Publication date: 2020-04-28
Also published as: WO2020080641A1; KR102143342B1

Abstract

본 발명은 지노스테마 론기페스 VK1(Gynostemma longipes VK1) 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물들이 포도당 이동, 지방산 합성, 근육 재생 등의 다양한 생리 작용에 관여하는 AMPK를 활성화 시키고, 근아세포의 증식 촉진뿐만 아니라 지방세포 내로의 당 흡수를 촉진시키는 것을 확인함으로써, 본 발명의 조성물을 이용하여 효과가 우수한 근육 질환, 비만, 당뇨병, 대사증후군 등과 같은 AMPK 관련 질환의 치료제 또는 동물약품, 개선용 건강기능식품 또는 동물 사료용 조성물을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물{Composition comprising extract of Gynostemma longipes VK1 or compounds isolated thereof for preventing or treating AMPK-related diseases}

본 발명은 지노스테마 론기페스 VK1(Gynostemma longipes VK1) 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

AMPK(5′-AMP-activated protein kinase)는 세포의 영양 상태나 운동 등, 세포의 에너지 상태(AMP/ATP 및 ADP/ATP 비율)의 저하에 의해 활성화 된다. AMPK의 활성화는 세포의 에너지 대사에 관여하는 다른 여러 가지 효소들의 인산화를 조절함으로써 포도당 이동(glucose transport), 지방산 합성(fatty acid synthesis), 콜레스테롤 생합성(cholesterol synthesis) 등의 다양한 생리 작용에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다(Hardie, D.G., 2007). AMPK의 활성화에 대한 효과는 에너지 대사 조절과 밀접하게 연관되어 있는 간, 근육, 지방, 췌장과 같은 표적 장기와 관련되어 있다. 간에서 AMPK가 활성화가 되면 지방산과 콜레스테롤의 합성을 억제하고 지방산의 산화를 촉진하며, 골격근에서 AMPK가 활성화되면 지방산의 산화와 당 흡수를 촉진하고, 지방세포에서는 지방 분해와 지방 생성을 억제한다. 또한, 췌장 β 세포에서 AMPK의 활성화는 인슐린 분비를 촉진시키는 것으로 알려져 있어, AMPK의 역할과 관련하여 대사성 질환의 주요한 약물 목표점으로 많은 연구가 이루어져 왔다(하주헌, et al. 2010).

각 조직에서의 AMPK 활성화 관련 기전을 자세히 살펴보면, 운동에 의하여 촉진되는 근세포에서의 포도당 흡수(glucose uptake)에 AMPK가 관여함이 밝혀졌으며, AMPK는 일반적으로 세포 내에서 에너지 준위를 모니터하는 센서(sensor) 역할을 담당하고 있는 것으로 밝혀지고 있다. 운동을 하거나 허기진 상태에서 근육세포, 간세포 그리고 지방세포는 필요한 에너지를 공급하기 위하여 지방, 글리코겐 등의 합성을 억제하며, 저장물질(지방)로부터 지방 분해를 통하여 몸에서 필요한 에너지를 생성케 하는 역할을 수행한다. 또한, AMPK는 지방세포로부터 분비되는 렙틴(leptin)과 아디포넥틴(adiponectin)의 세포 내 신호전달물질로도 알려져 있다. 특히, 아디포넥틴은 비만인 사람의 혈중에서 정상 체중의 사람에 비교하여 낮은 농도로 측정되는 것으로 보아, 비만으로 기인한 인슐린 저항성과 높은 관계가 있을 것으로 추정되며, 이에 따라, AMPK 활성화 물질은 비만의 훌륭한 약물 목표점으로 가능하다(Hardie D.G., 2007(1)).

지금까지 경구용 당뇨병 치료에 사용되어 왔으나 그 기전을 모르고 있었던 메트포민(metformin)의 약물 목표점이 AMPK 활성과 관련이 있음이 밝혀진 이후에, 많은 기업들이 이들을 목표점으로 약물을 개발하여 왔으며, 2008년에 호주의 가르반 의학연구소에서는 비터멜론(bitter melon, 여주)에서 추출한 4가지 성분이 체내 대사를 조절하는데 관여하는 것으로 잘 알려진 단백질 효소인 AMPK 활성화를 통해 항당뇨 활성을 나타낸다는 결과를 발표하였다(Tan, M.J., et al., 2008). 이를 통해, AMPK 활성화 물질의 당뇨병을 포함한 대사증후군 치료제로서의 가능성을 예상할 수 있다.

근육(muscle)은 인체에서 가장 구성량이 많은 조직으로서, 인체의 기능적 능력을 유지하고 대사성 질환을 예방하기 위해서는 적정 근육량의 확보가 필수적으로 요구된다. 근육은 크게 평활근(smooth muscle), 심장근(cardiac muscle), 골격근(skeletal muscle)으로 나뉘며, 골격근은 우리 몸 전체에서 상당한 부분을 차지하면서 골격의 움직임을 촉진시키며, 호흡을 유지하는 주요 조직이고, 비만과 제2형 당뇨병 예방에 있어서 중요한 포도당과 지방산을 사용하는 1차 말초 조직이다(Fu, X., et al., 2015). 세포에서 AMPK는 촉매성 α-아단위(subunit)(α1 및 α2), 조절성 β-아단위(β1 및 β2) 및 γ-아단위(γ1, γ2 및 γ3)로 이루어져 있다. 우리 몸에서 상당한 부분을 차지하는 골격근은 운동 중 ATP의 사용을 통한 에너지 불균형을 유도하여 세포 내 AMP와 ADP 농도를 증가시킨다. γ-아단위에서 ADP와 AMP의 결합은 알로스테릭(allosteric) 기전을 통해 AMPK 효소를 10배까지 활성화시키는 구조 변화를 일으킨다. 이러한 구조 변화는 또한, 상위 유전자인 LKB1(liver kinase B1)에 의한 촉매성 α-아단위의 172번 트레오닌(α-Thr172) 인산화를 촉발시키고 단백질 포스파타아제에 의한 탈인산화를 보호하여 활성을 100배 증가시킨다. 따라서 알로스테릭 효과와 α-Thr172 인산화가 병용되면 최대 1000배 이상 AMPK가 활성화되는 것으로 알려져 있다. AMPK는 또한 CaMKKβ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase β)에 의해 촉매되는 α-Thr172 인산화를 통한 세포 내 Ca² ⁺ 농도의 상승에 의해서도 활성화된다. 운동을 통한 근육에서의 AMPK 활성화는 AMPK 활성화에 의하여 매개되는 여러 질환의 치료에 중요하다(Kjobsted, R., et al., 2018).

인체의 상당 부분을 차지하는 골격근은 분열하지 않고, 다핵체인 근섬유로 이루어져 있으며, 배 형성 과정에서 만들어진다. 배 형성 과정이 끝난 후에는, 출생 후 생장 또는 근육 분화(myogenesis) 과정에 의해 근육이 형성된다. 특히, 근육 동상이나 염좌, 타박상 등에 의해 근육이 손상되면 근육 재생을 위한 근육 분화가 일어나는 것으로 보고되고 있다. 근육 분화는 먼저 위성세포(satellite cell)가 활성화 되고, 활성화 된 위성세포가 근아세포(myoblast)로 분화(differentiation)된다(Morgan, J.E., et al., 2003). 분화된 근아세포가 증식(proliferation)되어 근아세포들 간에 융합(fusion)이 일어나 근관세포(myotube)로 발달한다. 이러한 근관세포들이 모여 근섬유(muscle fiber)를 형성하고, 근섬유는 다발을 이루어 최종적으로 근육을 형성하게 된다.

최근 연구에 따르면 AMPKα1이 위성세포에서 우성인 이성질체(dominant isoform)이며, 근육 재생 과정에서 근육세포의 비정식적인 shh(sonic hedgehog) 신호전이 과정을 통한 와버그-유사 해당과정(Warburg-like glycolysis)을 향상시켜 근육 재생을 촉진하는 것으로 나타났다. 이러한 결과는 AMPKα1이 넉-아웃(knock-out)된 위성세포는 AMPK의 활성화가 감소되어 있고, 근육 전구세포의 증식 및 분화가 억제된 것을 통해서도 확인되었다(Fu, X., et al., 2015). 따라서 AMPK의 활성화는 근육 재생을 촉진시키는 과정에서도 효과적인 약물 표적을 제공한다. 한편, 노화나 위성세포에서 근아세포로의 분화, 근아세포의 분열 등과 같은 근육 분화 과정 동안에 문제가 발생하면, 근위축증(muscle atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscle injury), 근이영양증(muscle dystrophy), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease) 및 신경 손상(nerve injury)과 같은 여러 가지 근육 장애 및 질환이 발생할 수 있다(Bonaldo, P., et al., 2013; Wagatsuma, A., et al., 2014).

또한, 상기 근육감소증은 악액질(cachexia)로 인해 나타나기도 한다. 악액질은 만성 소모성 복합증후군의 일종이며 암, 결핵, 혈우병 등의 말기에서 볼 수 있는 고도의 전신쇠약 증세를 의미한다. 특히, 악성종양, 만성폐쇄성폐질환, 만성심부전 등의 만성질환을 동반하여 발생하고, 식욕부진을 동반한 체중감소, 근육량 및 체지방 감소, 염증반응 등이 나타난다. 이러한 악액질로 인한 근육감소는 골격근량의 지속적인 감소와 기능손상에 의한 복합증후군으로 나타나는 것으로, 점진적이고 서서히 진행되는 근육량 손실이 나타나는 노화, 및 근육 분화 장애에 의한 근육 감소 질환과 달리 급성적인 근육감소 증상이 나타난다. 이러한 생리적 특성의 차이는 예방 및 치료에 있어서도 차이를 보인다. 따라서 근육감소라는 징후가 발생되더라도 그 발생 원인에 따라 악액질, 노화, 및 근육 분화 장애 각각의 특성에 맞추어진 치료가 필요하다(류승완, 2017).

근육 장애 및 질환을 극복하기 위한 방법으로, 근육세포를 재생하는 방법이 최근에 보고되고 있으며, 이러한 근육세포의 재생은 근육세포 바깥부분에 존재하는 위성세포를 자극하여 위성세포가 분열을 일으켜 근육 조직을 형성하는 것으로 알려져 있다. 근육세포의 재생은 손상된 근육의 수리뿐만 아니라 노화에 의한 자연적인 근육 손실(Conboy, I.M., et al., 2003), 비만과 당뇨를 포함한 대사증후군의 조절(Mounier, R., et al., 2015) 및 소모성 증후군인 악액질(Bossola, M., et al., 2016; Ramamoorthy, S., et al., 2009)에도 적용이 가능한 것으로 보고되었다.

지노스테마 론기페스(Gynostemma longipes)는 박과(Cucurbitaceae)에 속하는 여러해살이 덩굴 식물로 베트남 및 중국 남부지역에서 자생하며, 우리나라 울릉도 및 남쪽 지방, 베트남, 일본, 중국 등에서 자라는 여러해살이 식물인 돌외(Gynostemma pentaphyllum)와 외부 모양이 비슷하다.

돌외(Gynostemma pentaphyllum)는 덩굴 식물로 줄기가 덩굴손으로 다른 물체를 감아 기어오르며 이리저리 엉켜서 성장하며 잎을 말려 "돌외차"로 사용한다. 돌외는 근경 또는 전초를 칠엽담(七葉膽)이라 하며, 전통적으로 거담, 기관지염, 담, 종독, 중독, 해수 등 호흡기·순환계 질환에 사용되어 왔다. 돌외의 잎은 호생하며 양면에 다세포로 된 백색털이 있으나 곧 없어지고 소엽은 보통 5개이지만 3-7개인 것도 있다.

지노스테마 론기페스는 돌외에 비하여 상대적으로 잎이 7~9장으로 많은 것이 특징으로, 베트남에서 돌외와 잎의 모양으로 구별이 상대적으로 어려워 돌외와 함께 칠엽담으로 통칭되어 혼용하여 사용되어졌다. 그러나 지노스테마 론기페스는 특징적으로 돌외에 비하여 잎이 많으며, 줄기에 가는 섬모가 있고(pubescent), 돌외 보다 쓴 맛을 갖는 것이 특징이다. 지노스테마 론기페스에 대한 연구는 많이 진행되고 있지 않았으며, 최근 화학적 조성에 대한 연구가 시도되고 있으며, 베트남 연구진이 지노스테마 론기페스 C.Y.Wu(Gynostemma longipes C.Y.Wu)로부터 지론기포사이드 II-III(gylongiposide II-III) 및 지펜토사이드 A(gypentoside A)를 분리하였다(Anh P.T., et al., 2015).

지노스테마 론기페스 VK1은 본 발명인이 발견한 신규 품종으로, 지노스테마 속(Gynostemma spp.) 다른 식물과 형태학적 차이를 보이고, 기존에 알려져 있던 지노스테마 론기페스와 다른 단일염기 다형성이 있음이 확인된 신규 품종이며, 화학적 조성 성분에 있어서도 지노스테마 속뿐만 아니라 동종인 지노스테마 론기페스와도 화학적 성분이 차이가 있음이 확인되었다(한국등록특허 제1811048호).

이에, 본 발명인은 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 연구하는 과정에서 추출물로부터 화합물들을 분리하였고, 이러한 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 및 이로부터 분리된 화합물들이 포도당 이동, 지방산 합성, 콜레스테롤 생합성 등의 다양한 생리작용에 관여하는 AMPK를 활성화 시키며 더욱이, 지방세포 및 근육세포에서의 AMPK를 활성화 시킴으로써 근육 질환, 비만, 당뇨병 또는 대사증후군을 치료할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성할 수 있었다.

종래 선행기술로서 한국등록특허 제1811048호에는 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 및 이로부터 분리한 화합물이 기재되어 있으나, 인지기능 장애 예방 또는 치료 효과로 본 발명의 AMPK 활성화 및 근육 재생 효과 또는 대사증후군 관련 질환에 대한 예방 또는 치료 효과는 전혀 기재 및 암시되어 있지 않다. 또한, 한국공개특허 제2014-0108621호에는 지페노사이드 화합물을 포함하는 돌외(Gynostemma pentaphyllum) 추출물이, 한국등록특허 제0945382호에는 덩굴차(Gynostemma pentaphyllum) 추출물이 기재되어 있으나, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1(Gynostemma longipes VK1) 추출물 및 이로부터 분리한 화합물의 AMPK 활성화 관련 효과는 기재되어 있지 않아 본 발명의 구성과 차이가 있다. 중국등록특허 제103238741호에는 지노스테마 론기페스(Gynostemma longipes)가 기재되어 있으나, 본 발명의 화합물 및 이의 AMPK 활성화 효과가 전혀 기재되어 있지 않아 본 발명의 구성과 차이가 있다.

한국등록특허 제1811048호, 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 론기페노사이드 A 화합물을 유효성분으로 포함하는 인지기능장애 예방 또는 치료용 조성물, 2017. 12. 14. 등록. 한국공개특허 제2014-0108621호, 돌외의 지페노사이드 추출물을 포함하는 제2형 당뇨병, 비만 또는 고지혈증의 치료 또는 예방용 조성물, 2014. 09. 12. 공개. 한국등록특허 제0945382호, 덩굴차 추출물을 유효성분으로 함유하는 신경 퇴행성질환의 치료 및 예방용 약학조성물, 2010. 02. 24. 등록. 중국등록특허 제103238741호, Nutritious animal food for improving pork quality, 2014. 05. 14. 등록.

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본 발명의 목적은 지노스테마 론기페스 VK1(Gynostemma longipes VK1) 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 지노스테마 론기페스 VK1 추출물로부터 분리한 신규 화합물 및 이의 분리 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-20-O-β-D-glucopyranoside)(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[(4-O-acetyl)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 3), 지펜토노시드 A(Gypentonoside A)(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside)(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione)(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(20(S)-hydroxydammar-24-en-3,12,23-trione)(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S),25-trihydroxydammaran-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(3β-hydroxydammar-20,24-dien-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(4,20(S)-dihydroxy-3,4-seco-dammar-24-en-12,23-dion-3-oic acid)(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(4,20(S),25-trihydroxy-3,4-seco-dammaran-12,23-dion-3-oic acid)(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(4-hydroxy-3,4-seco-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dion-3-oic acid)(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β-hydroxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(3β-hydroxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S),25-trihydroxydammaran-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(3β-hydroxydammar-20,24-dien-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S),25-trihydroxydammar-23(E)-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S),25-trihydroxydammar-23(E)-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside)(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 지노스테마 론기페스 VK1(Gynostemma longipes VK1) 추출물을 함유하는 AMPK(5′-AMP-activated protein kinase) 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 동물 약품, 개선용 건강기능식품 조성물 및 동물 사료용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물은 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르(acetic ester), 아세톤(acetone) 및 메틸에틸케톤(methylethylketone)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 동물 약품, 개선용 건강기능식품 조성물 및 동물 사료용 조성물에 관한 것이다.

상기 화합물은 바람직하게는 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물이다.

상기 조성물은 AMPK를 활성화 시킬 수 있다.

상기 AMPK 관련 질환은 근육 질환, 비만, 당뇨병 또는 대사증후군일 수 있다.

상기 근육 질환은 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 피부근육염(dermatomyositis), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 신경 손상(nerve injury), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 악액질(cachexia) 및 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 악액질은 암, 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS), 복강질환(celiac disease), 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 만성심부전증(chronic heart failure), 선천성 심부전증(congestive heart failure), 요독증(uremia), 결핵(tuberculous), 크론병(crohn's disease), 치료되지 않거나 심각한 제1형 당뇨, 신경성식욕부진 및 호르몬 부족에 의한 소모증후군일 수 있다.

또한, 본 발명은 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 용매로 하여 추출한 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 수득하는 1단계; 상기 1단계의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 이온교환수지에 흡착시킨 후 유기용매로 용출시켜 분획물을 확보하는 2단계; 및 상기 2단계의 분획물을 직접 결정화 하거나 컬럼 크로마토그래피에 가하여 상기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 분리하는 3단계; 로 이루어진 것을 특징으로 하는 상기 화학식 1의 화합물 1~19를 분리하는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 또한, 하기 화학식 2의 화학구조를 갖는 신규 화합물 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)에 관한 것이다.

[화학식 2]

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 상기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 함유하는 AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물은 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물일 수 있다. 상기 C1~4의 저급 알코올로는 메탄올, 에탄올, 주정, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등을 이용할 수 있고, 또한, 상기 C1~4의 초산에스테르는 식품의약품안전처 "의약품잔류용매기준가이드라인"의 저독성 용매로 분류되는 것으로, 초산메틸(methyl acetate), 초산에틸(ethyl acetate), 초산프로필(propyl acetate), 초산이소프로필(isopropyl acetate), 초산부틸(butyl acetate), 초산이소부틸(isobutyl acetate) 등을 이용할 수 있다. 바람직하게는 물 및 C1~4의 저급 알코올이며, 더 바람직하게는 에탄올이며, 가장 바람직하게는 70%[v/v] 에탄올이다.

상기 용매는 지노스테마 론기페스 VK1 중량의 2~500배의 중량을 가할 수 있다.

또한, 상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물은 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물을 농축한 농축액을 희석하여 만든 희석액을 이온교환수지에 가하여 유기용매로 용출시켜 분획한 분획물일 수 있다.

상기 희석액은 지노스테마 론기페스 VK1 추출물의 농축액에 증류수를 가하여 만들 수 있으며, 상기 증류수는 농축액 중량의 5~200배의 중량을 가할 수 있다.

상기 이온교환수지는 디아이온 HP-20(Diaion HP-20), SP825, AXT204, XAD1600T, MN200, SP70, SP710 등에서 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 디아이온 HP-20, SP70 또는 SP710이며, 가장 바람직하게는 합성흡착제로 방향족계 무치환 수지 중 미국 FDA에서 식품 및 의약품에 대하여 사용될 수 있는 규격(CFR173.62, Code of Federal Regulations Title 21)을 충족한 흡착 수지인 SP70 또는 SP710이다.

상기 유기용매는 C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르 및 아세톤일 수 있다. 상기 C1~4의 저급 알코올은 메탄올, 주정, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있고, 상기 C1~4의 초산에스테르는 초산메틸, 초산에틸, 초산프로필, 초산이소프로필, 초산부틸, 초산이소부틸 등일 수 있다. 바람직하게는 에탄올 및 아세톤이며, 가장 바람직하게는 95%[v/v] 에탄올이다.

또한, 본 발명은 상기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

상기 화학식 1의 화합물은 상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물로부터 분리할 수 있다.

상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물로부터 분리된 화학식 1의 화합물은 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 크로마토그래피로 분획하여 얻을 수 있으며, 상기 크로마토그래피는 디아이온 HP-20 컬럼 크로마토그래피(Diaion HP-20 column chromatography), 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(reverse phase silica gel column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 조제용 역상-고성능 액체 크로마토그래피(preparative reversed-phase high performance chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC) 등에서 선택하여 사용할 수 있다.

한편, 본 발명의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 합성될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있다.

상기 AMPK 관련 질환은 근육 질환, 비만, 당뇨병 또는 대사증후군일 수 있으며, 이에 한정되지 않은다.

상기 근육 질환은 근육세포의 결핍, 비정상적인 감소 또는 근육 세포의 기능 장애로 인해 발생할 수 있는 질환으로, 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 피부근육염(dermatomyositis), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 신경 손상(nerve injury), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 악액질(cachexia), 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases) 등일 수 있으며, 이에 한정되지 않는다.

상기 악액질은 소모증후군(wasting syndrome)이라고도 하며, 식욕부진을 동반한 체중감소, 근육량 및 체지방 감소, 염증반응 등을 특징으로 한다. 이러한 악액질은 암, 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS), 복강질환(celiac disease), 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rhematoide arthritis), 만성심부전증(chronic heart failure), 선천성 심부전증(congestive heart heart failure), 요독증(uremia), 결핵(tuberculous), 크론병(crohn's disease), 치료되지 않거나 심각한 제1형 당뇨, 신경성식욕부진, 호르몬 부족 등에 의해 나타날 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 퇴행성 근육질환은 근육이 지속적으로 파괴되는 것으로, 뒤시엔느 근위축증(Duchenne muscular dystrophy), 베이커 근위축증(Becker's muscular dystrophy), 지대형 근위축증(Limb-girdle muscular dystrophy), 선천성 근위축증(congential muscular dystrophy), 얼굴어깨윗판 근위축증(facioscapulohumeral muscular dystrophy), 근긴장성 위축증(myotonic dystrophy), 안구인두근위축증(oculopharyngeal muscular atrophy), 말단 근위축증(distal muscular dystrophy), 애머리-드레이푸스 근위축증(emery-dreifuss muscular dystrophy) 등일 수 있다.

상기 당뇨병은 제1형 당뇨병 또는 제2형 당뇨병일 수 있다. 바람직하게는 제2형 당뇨병이다.

상기 대사증후군(metabolic syndrome)이란, 뇌심혈관질환 및 당뇨병의 위험을 높이는 체지방증가, 혈압 상승, 혈당 상승, 혈중 지질 이상 등의 이상 상태들의 집합을 말하는 것으로, 체지방 감소 및 당뇨병 치료를 통해 개선할 수 있다.

상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 AMPK를 활성화 시킬 수 있다.

본 발명의 'AMPK(5′-AMP-activated protein kinase)'는 세포의 영양 상태나 운동 등, 세포의 에너지 상태의 저하에 의해 활성화 되는 것으로, AMPK의 활성화는 세포의 에너지 대사에 관여하는 여러 가지 효소들의 인산화를 조절하여 포도당 이동, 지방산 합성, 콜레스테롤 생합성 등의 다양한 생리 작용에 영향을 미친다.

상기 AMPK의 활성화는 지방산과 콜레스테롤의 합성을 억제하고, 지방산 산화 및 당 흡수를 촉진하며, 근육 재생을 촉진한다.

상기 AMPK의 활성화는 지방산 합성에 필요한 효소인 아세틸-CoA 카르복실라아제(acetyl-CoA carboxylase, ACC)를 인산화시켜 비활성화시킴으로써 지방산 산화를 증가시킬 수 있다.

상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.

상기 약학적 조성물은 상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토즈, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여 경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.1~1000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.5~500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

상기 약학적 조성물은 쥐, 가축, 반려동물, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 점막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 근육세포에서 AMPK를 활성화함으로써 지방산 연소를 촉진시키고 포도당의 근육과 지방으로의 저장을 촉진하여 비만, 당뇨 또는 대사증후군을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 또한, 근아세포의 증식 촉진 및 근육 재생에 중요한 신호전달 물질인 AMPK의 활성화를 촉진하여 근육 재생을 유도함으로써 근육 질환을 예방 또는 치료하는 데 사용될 수 있다.

또한, 상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 포함하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 건강기능식품 조성물일 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물은 상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함할 수 있다.

상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물은 본 발명의 건강기능식품 조성물에 0.001~100중량%로 하여 포함될 수 있다.

본 발명의 건강기능식품 조성물은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강기능성식품류 등이 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 유효성분으로 포함하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 조성물은 근육 질환, 비만, 당뇨병 또는 대사증후군 개선용 동물 사료용 조성물을 제공한다.

상기 동물 사료용 조성물은 사료 첨가제를 포함할 수 있다. 본 발명의 사료첨가제는 사료 관리법상의 보조 사료에 해당한다.

상기 동물 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 화학식 1의 화합물 1~19를 분리하는 방법에 관한 것으로, 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 용매로 하여 추출한 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 수득하는 1단계; 상기 1단계의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 이온교환수지에 흡착시킨 후 유기용매로 용출시켜 분획물을 확보하는 2단계; 및 상기 2단계의 분획물을 직접 결정화 하거나 컬럼 크로마토그래피에 가하여 상기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 분리하는 3단계;로 이루어질 수 있다.

상기 1단계의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물은 농축하여 농축액을 수득하고, 수득한 농축액을 희석하여 상기 2단계의 이온교환수지에 가할 수 있다.

상기 2단계의 이온교환수지는 디아이온 HP-20(Diaion HP-20), SP825, AXT204, XAD1600T, MN200, SP70, SP710 등에서 선택하여 사용할 수 있다. 바람직하게는 디아이온 HP-20, SP70 또는 SP710이며, 가장 바람직하게는 합성흡착제로 방향족계 무치환 수지 중 미국 FDA에서 식품 및 의약품에 대하여 사용될 수 있는 규격(CFR173.62, Code of Federal Regulations Title 21)을 충족한 흡착 수지인 SP70 또는 SP710이다.

상기 2단계의 유기용매는 C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르 및 아세톤일 수 있다. 상기 C1~4의 저급 알코올은 메탄올, 주정, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 등일 수 있고, 상기 C1~4의 초산에스테르는 초산메틸, 초산에틸, 초산프로필, 초산이소프로필, 초산부틸, 초산이소부틸 등일 수 있다. 바람직하게는 에탄올 및 아세톤이며, 가장 바람직하게는 95%[v/v] 에탄올이다.

상기 3단계의 컬럼 크로마토그래피는 디아이온 HP-20 컬럼 크로마토그래피(Diaion HP-20 column chromatography), 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 역상 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(reverse phase silica gel column chromatography), RP-18 컬럼 크로마토그래피(RP-18 column chromatography), LH-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 조제용 역상-고성능 액체 크로마토그래피(preparative reversed-phase high performance chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC) 등에서 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명은 지노스테마 론기페스 VK1(Gynostemma longipes VK1) 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 AMPK 관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물들이 포도당 이동, 지방산 합성, 근육 재생 등의 다양한 생리작용에 관여하는 AMPK를 활성화 시키고, 근아세포의 증식 촉진뿐만 아니라 지방세포 내로의 당 흡수를 촉진시키는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 조성물을 이용하여 효과가 우수한 근육 질환, 비만, 당뇨병, 대사증후군 등과 같은 AMPK 관련 질환의 치료제, 개선용 건강기능식품, 동물 사료용 조성물 등을 개발할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물로부터 분리한 화합물들의 세포 독성을 확인한 결과로, (A) 및 (C)는 지방세포인 3T3-L1 세포에서의 독성을, (B) 및 (D)는 근아세포인 C2C12 세포에서의 독성을 보여주고 있다. (A) 및 (B)는 화합물 10~14를 40μM 농도로 처리한 경우의 세포 독성을, (C) 및 (D)는 화합물 19의 처리 농도(10, 20, 30μM)에 따른 세포 독성을 보여주고 있다.
도 2는 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물들의 AMPK 활성화(인산화) 및 ACC 비활성화(인산화) 촉진 효과를 확인한 결과로, (A)는 지노스테마 론기페스 VK1 추출물의, (B)는 지노스테마 론기페스 VK1 추출물로부터 분리한 화합물 1~19의 AMPK 활성화 및 ACC 비활성화 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 3은 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물들의 근아세포 증식 촉진 효과를 확인한 결과로, (A) 및 (B)는 지노스테마 론기페스 VK 1 추출물 처리에 따른 근아세포 증식 촉진 효과를 MTT(A) 및 WST(B) 어세이를 통해 확인한 결과를, (C)는 지노스테마 론기페스 VK1 추출물로부터 분리한 화합물 1~9의 근아세포 증식 촉진 효과를 MTT 및 WST 어세이를 통해 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 4는 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물 1의 암세포의 세포 증식 촉진 여부를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 5는 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물 1의 근아세포의 증식에 있어서 DNA 합성 촉진 효과를 확인한 결과로, (A)는 면역화학염색 방법을, (B)는 유세포 분석기를 이용하여 DNA 합성 촉진 효과를 확인한 결과를 보여주고 있다.
도 6은 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물 10~19의 지방세포에서의 당 흡수 촉진 효과를 확인한 결과로, (A)는 포도당의 형광 유도체인 2-NBDG의 지방세포 내 흡수로 인한 형광 이미지를 확인한 결과를, (B)는 세포 내 형광 세기를 측정한 결과를 보여주고 있다.
도 7은 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물 10, 11, 13 및 17의 지방세포에서의 포도당 수송체(GLUT4)의 전위를 확인한 결과로, (A)는 지방세포의 원형질막 내 GLUT4의 양을 밴드로 확인한 결과를, (B)는 밴드를 수치화한 결과(B)를 보여주고 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지고, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

<실시예 1. 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 제조>

실시예 1-1. 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 제조

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1(Gynostemma longipes VK1)은 베트남의 Ha Giang(GPS 23°08'34.9"N 105°25'42.6"E) 지역에서 2016년 3월 및 9월 재배된 것을 채집한 것으로, 베트남 하노이 대학의 Tran Van On 교수가 외부 형태학적 특징을 기반으로 하여 지노스테마 론기페스 VK1임을 확인하였다.

분말화 된 지상부(aerial parts, 식물체의 잎과 줄기)의 지노스테마 론기페스 VK1 10g에 하기 표 1에 해당되는 추출 용매를 각각 300㎖씩을 넣어 혼합한 후, 초음파 추출하는 것을 3회 반복 진행하여 추출액(3×300㎖)을 얻었다. 얻은 추출액을 여과하고 진공상태에서 용매를 증발시켜 각각의 추출물을 제조하였다.

상기에서 제조한 각각의 추출용매에 따른 추출물 내에 존재하는 본 발명의 화합물 1의 함량을 확인하기 위해 고성능 액체 크로마토그래피(high-performance liquid chromatography, HPLC)를 수행하였다. 상기 추출물 1g씩을 각각의 추출용매 1㎖로 녹이고 0.2㎛의 필터로 여과하여 HPLC 분석용 샘플을 제조하였다. 각각의 샘플을 이용하여 30℃에서 아세토나이트릴:물(1:9→1:0[v/v])의 농도구배 용출 조건에 따라 HPLC(Agilent 1200 HPLC system)(INNO C18 컬럼, 4.6×250㎜, 5㎛ 입자 크기, 유속 0.5㎖/분)를 수행하여 본 발명의 화합물 1의 성분 및 함량 변화를 분석하고, 그 결과를 하기 표 1에 나타내었다. 이때, 분리, 정제된 본 발명의 화합물 1을 표준시료로 이용하였다.

추출 용매	본 발명의 화합물 1을 포함하는 추출물의 추출량(%)	본 발명의 화합물 1 함유량 (%)
증류수	16.5	1.27
30% 에탄올	18.5	6.6
50% 에탄올	17.5	12.2
70% 에탄올	14.0	16.5
95% 에탄올	11.5	10.3
100% 메탄올	11.5	9.7
n-헥산	8	0
아세톤	4	1.3
에틸아세테이트	8.5	5.9
n-부탄올	11.0	3.1

실시예 1-2. 지노스테마 론기페스 VK1 분획물 제조

건조된 지노스테마 론기페스 VK1 30g에 500㎖의 70%[v/v] 에탄올을 넣고 초음파 추출하는 것을 3회 반복하여 추출액을 얻었다. 이후 추출액을 감압농축기로 농축하여 농축액 5.1g을 확보하고, 확보한 농축액에 500㎖의 20%[v/v] 에탄올을 첨가하여 20%[v/v] 에탄올 현탁액을 만들었다. 20%[v/v] 에탄올 현탁액을 SP70 수지에 통과시켜 흡착시키고, 추출 농축액 중량의 100배에 해당되는 500㎖의 증류수, 20%[v/v] 에탄올, 40%[v/v] 에탄올, 60%[v/v] 에탄올, 80%[v/v] 에탄올 및 95%[v/v] 에탄올을 차례대로 처리하여 흡착물질을 용출시켜 분획물을 확보하였으며, 최종적으로 아세톤을 용매로 사용하여 흡착 물질을 용출시켰다.

상기 과정을 통해 확보한 지노스테마 론기페스 VK1 70%[v/v] 에탄올 추출물 및 분획물에 존재하는 본 발명의 화합물 1의 함량을 분석하였다. 이때, 분석 방법은 상기 실시예 1-1의 본 발명의 화합물 1의 정량 방법과 동일한 방법을 이용하였고, 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

추출물 또는 분획물			본 발명의 화합물 1의 함유량 (%)
구성	농도 (㎎/㎖)	주입량 (㎕)	본 발명의 화합물 1의 함유량 (%)
70% 에탄올 추출물	1	10	14.0
증류수 분획물	1	10	0
20% 에탄올 분획물	1	10	0
40% 에탄올 분획물	1	10	1.2
60% 에탄올 분획물	1	10	17.2
80% 에탄올 분획물	1	10	47.7
95% 에탄올 분획물	1	10	8.6

< 실시예 2. 화합물 분리>

화합물의 분리는 채집 시기별 화합물의 다양성을 확인하기 위하여 상기 실시예 1-1의 지노스테마 론기페스 K1과 같이 베트남의 Ha Giang 지역에서 2016년 3월 및 9월에 재배되어 채집한 것을 이용하였다.

상기 실시예 1-2에서 제조한 지노스테마 론기페스 VK1 분획물의 본 발명의 화합물 1의 함유량을 확인한 결과를 바탕으로, 실시예 1-2의 분획물 제조 과정과 동일한 과정을 통해, 95%[v/v] 에탄올 분획물을 확보하였다. 보다 구체적으로, 3월에 재배되어 채집된 지노스테마 론기페스 VK1을 70%[v/v] 에탄올을 이용하여 추출물을 확보하고, 확보한 추출물을 농축하였다. 이후, 농축물을 20%[v/v] 에탄올에 현탁하여 SP70 수지에 가한 후, 본 발명의 화합물 1이 유출되지 않는 30%[v/v] 에탄올을 이용하여 수지를 세척한 뒤, 95%[v/v] 에탄올로 용출하여 95%[v/v] 에탄올 분획물을 확보하였다. 확보한 95%[v/v] 에탄올 분획물을 농축한 후, 농축된 분획물 일부(75g)를 에틸아세테이트:메탄올:증류수(10:1:0.1→4:1:0.1[v/v/v])의 농도구배 용출 조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)(컬럼크기: 10×35㎝, 입자크기: 63-200㎛)를 수행한 후, 박층 크로마토그래피 프로파일(thin-layer chromatography profile)을 기반으로 9개의 분획물을 얻었다(C1~C9).

상기 C7 분획물을 아세톤 용매 하에서 결정화하여 화합물 1(50.5g)을 확보하였다.

상기 C8 분획물을 C18-역상 실리카겔(C18-reverse phase silica gel, RP-C18) 컬럼 크로마토그래피에 가한 후, 메탄올:증류수(1:1→1:0[v/v])의 농도구배 조건으로 용출한 후, 아세토니트릴:증류수(2:3[v/v])의 등용매로 2㎖/분 유속 조건으로 HPLC(컬럼: Optima Pak C₁₈)를 연속적으로 수행하여 화합물 2(12.5㎎) 및 화합물 3(21.3㎎)을 분리하였다.

상기 C9 분획물을 메탄올:증류수(1:1→1:0[v/v])의 농도구배 조건으로 RP-C18 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 8개의 소분획물을 확보하였다(C9-1~C9-8).

상기 C9-3 소분획물을 아세토니트릴:증류수(3:6[v/v])의 등용매로 2㎖/분 유속 조건으로 HPLC(컬럼: Optima Pak C₁₈)를 수행하여 화합물 4(20.4㎎) 및 화합물 5(10.5㎎)를 분리하였다.

상기 C9-4 소분획물을 아세토니트릴:증류수(2:3[v/v])의 등용매로 2㎖/분 유속 조건으로 HPLC(컬럼: Optima Pak C₁₈)를 수행하여 화합물 6(22.2㎎) 및 화합물 7(17.1㎎)을 분리하였다.

상기 95%[v/v] 에탄올 분획물의 일부를 100%[v/v] 메탄올 등용매 조건으로 세파덱스 LH-20(sephadex LH-20) 컬럼 크로마토그래피와 아세토니트릴:증류수(7:3[v/v])의 등용매로 2㎖/분 유속 조건으로 HPLC(컬럼: Optima Pak C₁₈)를 연속적으로 수행하여 화합물 8(18.5㎎) 및 화합물 9(16.0㎎)를 분리하였다.

또한, 9월에 재배되어 채집된 지노스테마 론기페스 VK1을 이용하여 상기 3월에 재배되어 채집된 지노스테마 론기페스 VK1의 95%[v/v] 에탄올 분획물 제조 방법과 동일한 방법을 통해 95%[v/v] 에탄올 분획물을 확보하였다. 확보한 95%[v/v] 에탄올 분획물을 농축하여 35.6g의 농축물을 얻었다. 농축물을 95%[v/v] 에탄올에 용해하고 방치하여 침전물(28.8g)과 용해물(이하, GLS라 함, 6.8g)로 분리하였다.

상기 GLS를 메탄올:증류수(1:1→1:0[v/v])의 농도구배 조건으로 역상 실리카겔(reverse phase silica gel; RP-18) 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 6개의 분획물을 얻었다(GLS-M1~GLS-M6).

상기 GLS-M4 분획물을 RP-C18 컬럼 크로마토그래피에 가한 후, 아세토니트릴:증류수(1:1[v/v])의 등용매, 2㎖/분 유속 조건으로 HPLC(컬럼: Optima Pak C₁₈)를 수행하여 화합물 10(6.5㎎)을 분리하였다.

상기 GLS-M6 분획물을 100%[v/v] 메탄올 등용매 조건으로 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피와 아세토니트릴:증류수(6:4[v/v])의 등용매, 유속 2㎖/분 조건으로 HPLC(Optima Pak C₁₈)를 연속적으로 수행하여 화합물 11(22.5㎎) 및 화합물 19(15.5㎎)를 분리하였다.

상기 침전물을 재결정화여 상기 화합물 1을 제거한 뒤, n-헥산:에틸아세테이트(4:1→0:1[v/v])의 농도구배 조건으로 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(컬럼크기: 10×35㎝, 입자크기: 63-200㎛)를 수행하고, 계속하여 에틸아세테이트:메탄올(20:1→0:1[v/v])의 농도구배 조건으로 용출시킨 후, 박층 크로마토그래피 프로파일에 기초하여 11개의 분획물을 확보하였다(GLP-N1~GLP-N11).

상기 GLP-N6 분획물을 100%[v/v] 메탄올을 용매로 사용하여 세파덱스 LH-20 컬럼 크로마토그래피에 적용시킨 후, 아세토니트릴:증류수(7:20[v/v]) 등용매 조건으로 HPLC를 수행하여 화합물 12(6.1㎎), 화합물 13(17.0㎎) 및 화합물 14(12.0㎎)를 분리하였다.

상기 GLP-N11 분획물을 아세토니트릴:증류수(1:1→0:1[v/v]) 농도구배 조건으로 RP-C18 컬럼 크로마토그래피하여 3개의 소분획물을 수득하였다(GLP-N11-1~GLP-N11-3).

상기 GLP-N11-2 소분획물을 아세토니트릴:증류수(3:10[v/v])의 등용매, 2㎖/분 유속 조건으로 HPLC(컬럼: Optima Pak C₁₈)를 수행하여 화합물 15(5.5㎎), 화합물 17(6.0㎎) 및 화합물 18(11.2㎎)을 분리하였다.

상기 GLP-N11-3 소분획물을 아세토니트릴:증류수(2:5[v/v])의 등용매로 2㎖/분 유속 조건으로 HPLC하여 화합물 16(7.2㎎)을 분리하였다.

추가적으로, 동일한 장소에서 표준화를 위한 지노스테마 론기페스 VK1의 재배과정을 통하여 각각 3월과 9월에 재배되어 채집한 지노스테마 론기페스 VK1 두 시료의 화합물의 조성 변동을 확인하였다. 그 결과, 9월에 재배되어 채집한 지노스테마 론기페스 VK1은 3월에 재배되어 채집된 지노스테마 론기페스 VK1보다 치환된 당의 숫자가 증가되어 화합물 3 및 4의 함량이 증가하였으나, 화합물의 전체적인 조성은 변화가 없는 것을 확인하였다.

이에 따라, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1은 각 채집시기별 구성 화합물의 다양성을 확인하였으나, 본 발명에서 얻어진 화합물은 두 채집 시기에 채집된 지노스테마 론기페스 K1에 모두 존재함을 확인하였다.

<실시예 3. 화합물의 물리화학적 구조 확인>

실시예 3-1. 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1).

3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 결정;

[α]

-32.0 (c 0.1, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 244㎚ (3.8);

IR (KBr) ν_max 3404, 2973, 2938, 1697, 1616, 1073, 1055, 1010㎝^-1;

HRESIMS m/z 925.5157 [M-H]^- (calcd 925.5166);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 3 및 표 4 참조.

실시예 3-2. 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2).

3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-20-O-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-37.5 (c 0.1, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 244㎚ (3.8);

IR (KBr) ν_max 3400, 2970, 2938, 1698, 1617, 1069, 1053, 1008㎝^-1;

HRESIMS m/z 1087.5682 [M-H]^- (calcd 1087.5694);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 3 및 표 4 참조.

실시예 3-3. 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3).

3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[(4-O-acetyl)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-35.2 (c 0.1, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 244㎚ (3.8);

IR (KBr) ν_max 3402, 2971, 2938, 1702, 1616, 1060, 1054, 1010㎝^-1;

HRESIMS m/z 967.5276 [M-H]^- (calcd 967.5272);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 3 및 표 4 참조.

실시예 3-4. 지펜토노시드 A(화합물 4).

Gypentonoside A;

흰색 무정형 분말;

[α]

-37.5 (c 0.1, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 244㎚ (3.8), 190㎚ (3.5);

IR (KBr) ν_max 3400, 2970, 2938, 1698, 1617, 1069, 1053, 1008㎝^-1;

HRESIMS m/z 1087.5682 [M-H]^- (calcd 1087.5694).

실시예 3-5. 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5).

3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-33.0 (c 0.1, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 244㎚ (3.7);

IR (KBr) ν_max 3403, 2972, 2940, 1702, 1616, 1060, 1054, 1010㎝^-1;

HRESIMS m/z 780.4712[M-H]^-, C₄₂H₆₈O₁₃(calcd 780.4710);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 3 및 표 4 참조.

실시예 3-6. 3β,20(S) - 디히드록시다마르 -24-엔-12,23- 디오네 (화합물 6).

3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione;

흰색 무정형 분말;

[α]

-33.0 (c 0.1, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 244㎚ (3.9);

IR (KBr) ν_max 3403, 2972, 2940, 1702, 1616, 1060, 1010㎝^-1;

HRESIMS m/z 472.5276 [M-H]^-, C₃₀H₄₈O₄(calcd 472.5270);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 5 및 표 6 참조.

실시예 3-7. 20(S)- 히드록시다마르 -24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7).

20(S)-hydroxydammar-24-en-3,12,23-trione;

흰색 무정형 분말;

[α]

-38.0 (c 0.1, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 244㎚ (3.8);

IR (KBr) ν_max 3403, 2972, 2940, 1702, 1616, 1060, 1054, 1010㎝^-1;

HRESIMS m/z 470.5272 [M-H]^-, C₃₀H₄₆O₄(calcd 472.5270);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 5 및 표 6 참조.

실시예 3-8. 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8).

3β,20(S),25-trihydroxydammaran-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-32.5 (c 0.1, 메탄올);

IR (KBr) ν_max 3403, 2972, 2940, 1702, 1616, 1060, 1054, 1010㎝^-1;

HRESIMS m/z 949.5129 [M+Na]⁺ (calcd 949.5131), m/z 943.5374 [M+H]⁺ion peak (calcd 943.5380);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 5 및 표 6 참조.

실시예 3-9. 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9).

3β-hydroxydammar-20,24-dien-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-33.0 (c 0.1, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 275㎚ (3.6);

IR (KBr) ν_max 3403, 2972, 2940, 1702, 1616, 1060, 1054, 1010㎝^-1;

HRESIMS m/z 907.5066 [M-H]^-, C₄₈H₇₆O₁₆(calcd 907.5061);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 5 및 표 6 참조.

실시예 3-10. 4,20(S)-디히드록시-3,4- 세코 - 다마르 -24-엔-12,23- 디온 -3- 오익산 (화합물 10).

4,20(S)-dihydroxy-3,4-seco-dammar-24-en-12,23-dion-3-oic acid;

흰색 무정형 분말;

[α]

+13.5 (c 0.2, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 254㎚ (3.8);

IR (KBr) ν_max 3402, 2972, 2923, 1711, 1053, 1008㎝^-1;

HRESIMS m/z 503.3382 [M-H]^-, C₃₀H₄₇O₆ (calcd 503.3378);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 7 및 표 8 참조.

실시예 3-11. 4,20(S),25- 트리히드록시 -3,4- 세코 - 다마란 -12,23- 디온 -3- 오익산 (화합물 11).

4,20(S),25-trihydroxy-3,4-seco-dammaran-12,23-dion-3-oic acid;

흰색 무정형 분말;

[α]

+4.9 (c 0.2, 메탄올);

IR (KBr) ν_max 3398, 2972, 2361, 1701, 1051, 1013㎝^-1;

HRESIMS m/z 521.3496 [M-H]^-, C₃₀H₄₉O₇(calcd 521.3484);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 7 및 표 8 참조.

실시예 3-12. 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12).

4-hydroxy-3,4-seco-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dion-3-oic acid;

흰색 무정형 분말;

[α]

+5.5 (c 0.2, 메탄올);

IR (KBr) ν_max 3400, 2970, 2938, 1698, 1617, 1069, 1053, 1008㎝^-1;

HRESIMS m/z 405.2647 [M-H]^-, C₂₄H₃₇O₅(calcd 405.2646);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 7 및 표 8 참조.

실시예 3-13. 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13).

3β-hydroxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→3)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

+2.7 (c 0.2, 메탄올);

IR (KBr) ν_max 3709, 2971, 2870, 1698, 1617, 1069, 1053, 1013㎝^-1;

HRESIMS m/z 873.4525 [M-HCOO]^-, C₄₃H₆₉O₁₈ (calcd for 827.4489);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 7 및 표 8 참조.

실시예 3-14. 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14).

3β-hydroxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

+5.9 (c 0.2, 메탄올);

IR (KBr) ν_max 3403, 2935, 1704, 1388, 1134, 1048, 1005㎝^-1;

HRESIMS m/z 1019.5104 [M+HCOO]^-, C₄₉H₇₉O₂₂(calcd 1019.5068);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 7 및 표 8 참조.

실시예 3-15. 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15).

3β,20(S),25-trihydroxydammaran-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-1.5 (c 0.2, 메탄올);

IR (KBr) ν_max 3401, 2971, 2923, 2371, 2320, 1053, 1008㎝^-1;

HRESIMS m/z 1135.5946 [M+HCOO]^-, C₅₅H₉₁O₂₄(calcd 1135.5906);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 9 및 표 10 참조.

실시예 3-16. 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16).

3β-hydroxydammar-20,24-dien-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-1.6 (c 0.2, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 280 nm (3.7), 250 nm (3.8);

IR (KBr) ν_max 3400, 2972, 2942, 2371, 2320, 1053, 1013㎝^-1;

HRESIMS m/z 1099.5730 [M+HCOO]^-, C₅₅H₈₇O₂₂ (calcd 1099.5694);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 9 및 표 10 참조.

실시예 3-17. 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17).

3β,20(S),25-trihydroxydammar-23(E)-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-2.5 (c 0.2, 메탄올);

IR (KBr) ν_max 3400, 2971, 2921, 2346, 2313, 1053, 1008㎝^-1;

HRESIMS m/z 973.5414 [M+HCOO]^-, C₄₉H₈₁O₁₉ (calcd 973.5378);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 9 및 표 10 참조.

실시예 3-18. 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18).

3β,20(S),25-trihydroxydammar-23(E)-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-0.5 (c 0.2, 메탄올);

IR (KBr) ν_max 3400, 2982, 2372, 2320, 1052, 1037㎝^-1;

HRESIMS m/z 1119.6008 [M+HCOO]^-, C₅₅H₉₁O₂₃(calcd 1119.5957);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 9 및 표 10 참조.

실시예 3-19. 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19).

3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl(1→2)-β-D-glucopyranoside;

흰색 무정형 분말;

[α]

-0.8 (c 0.2, 메탄올);

UV (메탄올) λ_max (log ε) 225nm (2.8);

IR (KBr) ν_max 3390, 2971, 1057, 1013㎝^-1;

HRESIMS m/z 811.4872 [M+HCOO]^-, C₄₃H₇₁O₁₄ (calcd 811.4849);

¹H NMR 및 ¹³C NMR 데이터는 하기 표 9 및 표 10 참조.

¹H NMR spectrocopic data [in Pyridine-d ₅)
No	화합물 1 δ _H (J in Hz) 500Mhz	화합물 2^a δ _H (J in Hz) 600Mhz	화합물 3^b δ _H (J in Hz) 600Mhz	화합물 5 δ _H (J in Hz) 500Mhz
1	1.20, overlap 0.69, overlap	1.18, overlap 0.69, overlap	1.20, overlap 0.69, overlap	1.22, overlap 0.73, overlap
2	2.11, overlap 1.70, overlap	2.12, overlap 1.71, overlap	2.11, overlap 1.70, overlap	2.23, overlap 1.80, overlap
3	3.25, overlap	3.26, dd (11.2, 4.4)	3.32, dd (11.2, 4.4)	3.32, dd (11.6, 4.0)
5	0.66, overlap	0.65, overlap	0.66, m	0.67, d (9.6)
6	1.50, overlap 1.39, overlap	1.49, overlap 1.40, overlap	1.50, m 1.39, m	1.49, m, overlap 1.41, m, overlap
7	1.39, overlap 1.25, overlap	1.38, overlap 1.25, overlap	1.39, m 1.25, m	1.42, m, overlap 1.26, m, overlap
9	1.62, overlap	1.79, overlap	1.62, m	1.65 (dd, 13.0, 4.0)
11	2.24, overlap 2.22, dd (10.5, 3.1)	2.24, overlap 2.22, overlap	2.24, overlap 2.22, dd (10.5, 3.1)	2.23, overlap (2H)
13	3.26, d (9.6)	3.66, d (9.4)	3.28, d (9.6)	3.27, d (10.0)
15	1.15, overlap 2.07, overlap	1.12, overlap 1.97, overlap	1.15, overlap 2.07, overlap	1.16, m, overlap 1.84, m, overlap
16	2.07, overlap 1.91, overlap	2.30, overlap 2.00, overlap	2.07, overlap 1.91, overlap	2.10, m, overlap 1.93, m, overlap
17	2.77, td (10.0, 5.1)	3.12, td (10.0, 5.1)	2.80, td (10.0, 5.0)	2.80, td (10.0, 5.1)
18	1.12, s	1.28, s	1.11, s	1.13, s
19	0.76, s	0.76, s	0.82, s	0.79, s
21	1.50, s	1.80, s	1.53, s	1.53, s
22	2.90, d (14.2) 2.72, d (14.2)	3.38, d (14.2) 3.21, d (14.2)	2.90, d (14.2) 2.72, d (14.2)	2.93, d (14.2) 2.74, d (14.2)
24	6.28, s	6.22, s	6.30, s	6.31, brs
26	2.15, s	2.14, s	2.17, s	2.17, s
27	1.70, s	1.67, s	1.71, s	1.71, s
28	1.17, s	1.17, s	1.19, s	1.24, s
29	1.11, s	1.11, s	1.11, s	1.19, s
30	0.84, s	0.83, s	0.86, s	0.86, s
1'	4.80, d (7.7)	4.82, d (7.5)	4.84, d (7.7)	4.96, d (7.7)
2'	4.01, overlap	4.01, overlap	4.06, overlap	4.30, overlap
3'	4.11, overlap	4.11, overlap	4.11, overlap	4.29, overlap
4'	4.01, overlap	4.01, overlap	4.01, overlap	4.16, t (9.1)
5'	3.85, overlap	3.87, overlap	3.89, overlap	3.98, overlap
6'	4.48, overlap 4.33, overlap	4.53, overlap 4.43, overlap	4.61, overlap 4.47, overlap	4.61, dd (12.0, 2.4) 4.41, dd (12.0, 6.6)
1''	5.92, br s	5.95, br s	5.99, br s	6.59, brs
2''	4.66, overlap	4.66, overlap	4.72, overlap	4.88, m
3''	4.45, overlap	4.45, overlap	4.48, overlap	4.70, dd (9.4, 3.4)
4''	4.26, overlap	4.28, overlap	5.79, t (10.0)	4.35, overlap
5''	4.61, overlap	4.62, overlap	4.74, overlap	4.81, dq (9.5, 6.0)
6''	1.64, d (6.0)	1.65, d (6.0)	1.41, d (6.0)	1.73, d (6.0)
1'''	5.70, br s	5.72, br s	5.72, br s
2'''	4.87, br s	4.87, br s	4.84, br s
3'''	4.53, overlap	4.52, overlap	4.53, overlap
4'''	4.28, overlap	4.30, overlap	4.30, overlap
5'''	4.70, overlap	4.69, overlap	4.72, overlap
6'''	1.60, d (6.0)	1.62, d (6.0)	1.63, d (6.0)
a: Chemical shift of 20-0-glu: H-1''''[5.16, d(7.76)], H-2''''[4.53, overlap], C-3''''[4.62, overlap], C-4''''[4.35, overlap], C-5''''[3.93, overlap], C-6''''[4.52, overlap] b: Chemical shift of 3''-Acetyl: CH₃(2.10, s)

¹³C NMR spectroscopic data (in Pyridine-d ₅)
No	화합물 1 δ _C, type 125Mhz	화합물 2^a δ _C, type 150Mhz	화합물 3^b δ _C, type 150Mhz	화합물 5 δ _C, type 125Mhz
1	39.3, CH₂	39.4, CH₂	39.4, CH₂	39.4, CH₂
2	26.9, CH₂	26.9, CH₂	27.0, CH₂	27.1, CH₂
3	88.5, CH	88.6, CH	88.6, CH	88.8, CH
4	39.9, C	39.9, C	39.9, C	40.0, C
5	56.6, CH	56.6, CH	56.7, CH	56.7, CH
6	18.8, CH₂	18.8, CH₂	18.8, CH₂	18.9, CH₂
7	34.8, CH₂	35.0, CH₂	34.8, CH₂	34.9, CH₂
8	40.9, C	41.1, C	41.0, C	41.0, C
9	54.6, CH	54.9, CH	54.8, CH	54.7, CH
10	37.7, C	37.7, C	37.7, C	37.7, C
11	40.1, CH₂	40.3, CH	40.1, CH₂	40.2, CH
12	211.7, C	211.4, C	211.8, C	211.8, C
13	56.2, CH	56.5, CH	56.3, CH	56.3, CH
14	56.5, C	56.5, C	56.5, C	56.7, C
15	32.2, CH₂	32.6, CH₂	32.2, CH₂	32.3, CH₂
16	25.2, CH₂	25.3, CH₂	25.2, CH₂	25.2, CH₂
17	45.2, CH	43.5, CH	45.2, CH	45.3, CH
18	16.0, CH₃	16.2, CH₃	16.0, CH₃	16.1, CH₃
19	16.5, CH₃	16.6, CH₃	16.5, CH₃	16.5, CH₃
20	74.0, C	80.7, C	74.1, C	74.1, C
21	27.2, CH₃	23.7, CH₃	27.2, CH₃	27.3, CH₃
22	54.8, CH₂	55.1, CH₂	55.0, CH₂	55.0, CH₂
23	201.7, C	199.8, C	201.7, C	201.7, C
24	126.4, CH	126.6, CH	126.5, CH	126.6, CH
25	154.9, C	154.5, C	154.9, C	154.9, C
26	20.9, CH₃	20.8, CH₃	21.0, CH₃	21.0, CH₃
27	27.7, CH₃	27.6, CH₃	27.7, CH₃	27.7, CH₃
28	28.1, CH₃	28.1, CH₃	28.2, CH₃	28.3, CH₃
29	16.9, CH₃	16.9, CH₃	16.8, CH₃	17.2, CH₃
30	17.4, CH₃	17.3, CH₃	17.5, CH₃	17.5, CH₃
1'	105.3, CH	105.3, CH	105.1, CH	105.8, CH
2'	78.3, CH	78.5, CH	78.6, CH	78.1, CH
3'	87.5, CH	87.6, CH	87.8, CH	80.3, CH
4'	70.6, CH	70.4, CH	70.6, CH	72.5, CH
5'	78.3, CH	78.3, CH	78.6, CH	78.7, CH
6'	62.8, CH₂	62.8, CH	62.8, CH₂	63.3, CH₂
1''	102.5, CH	102.4, CH	101.9, CH	102.1, CH
2''	72.2, CH	71.0, CH	70.3, CH	72.8, CH
3''	72.7, CH	72.7, CH	72.3, CH	72.9, CH
4''	73.9, CH	73.9, CH	76.0, CH	74.5, CH
5''	70.5, CH	70.6, CH	67.6, CH	69.9, CH
6''	18.9, CH₃	18.9, CH₃	18.2, CH₃	19.1, CH₃
1'''	103.9, CH	104.0, CH	104.1, CH
2'''	72.7, CH	72.6, CH	72.7, CH
3'''	72.9, CH	73.0, CH	72.9, CH
4'''	73.8, CH	73.8, CH	73.8, CH
5'''	71.0, CH	71.0, CH	71.1, CH
6'''	18.7, CH₃	18.7, CH₃	18.7, CH₃
a : Chemical shift of 20-0-glu: C-1''''(98.8, CH), C-2''''(73.0, CH), C-3''''(72.9, CH), C-4''''(74.0, CH), C-5''''(78.2, CH), C-6''''(63.3, CH₂) b : Chemical shift of 3''-Acetyl: 171.9 (C=0); 21.4(CH₃)

¹H NMR spectrocopic data [in Pyridine-d ₅)
No	화합물 6 δ _H (J in Hz) 600Mhz	화합물 7 δ _H (J in Hz) 500Mhz	화합물 8 δ _H (J in Hz) 500Mhz	화합물 9 δ _H (J in Hz) 600Mhz
1	1.20, overlap 0.69, overlap	1.58, m 1.23, m	1.24, m 0.75, m	1.22, overlap 0.73, overlap
2	2.10, overlap 1.70, overlap	2.48, m 2.42, m	2.15, m 1.75, m	2.04, m 1.56, overlap
3	3.40, dd (10.8, 5.4)		3.28, dd (11.7, 4.1)	3.30, dd (11.7, 4.2)
5	0.80, overlap	1.35, m	0.69, m	0.69, overlap
6	1.50, overlap 1.39, overlap	1.50, m 1.41, m	1.54, m 1.41, m	1.52, m 1.42, m
7	1.39, overlap 1.25, overlap	1.43, m 1.28, m	1.41, m 1.27, m	1.45, m 1.27, m
9	1.62, overlap	1.78, m	1.66, overlap	1.62, m
11	2.34, overlap 2.32, overlap	2.37, overlap 2.28, dd (10.5, 3.8)	2.24, overlap 2.22, overlap	2.27, overlap 2.21, overlap
13	3.31, d (9.6)	3.31, d (9.6)	3.20, d (9.7)	3.04, d (10.5)
15	1.17, overlap 1.88, overlap	1.17, m 1.87, m	1.80, m 1.14, m	1.45, m 1.27, m
16	2.10, overlap 1.92, overlap	2.12, m 1.93, m	2.02, m 1,88, m	2.07, m 1.91, m
17	2.80, td (10.0, 5.1)	2.8, td (5.2, 9.6)	2.78, td (10.1, 5.3)	3.20, ddd (17.0, 10.6, 6.7)
18	1.19, s	1.19, s	1.12, s	1.15, s
19	0.85, s	0.83, s	0.78, s	0.81, s
21	1.54, s	1.54, s	1.53, s	2.34, s
22	2.94, d (14.2) 2.74, d (14.2)	2.94, d (14.2) 2.75, d (14.2)	3.11, d (15.6) 2.83, d (15.6)	6.47, s
24	6.32, s	6.31, s	2.96, d (14.8) 2.95, d (14.8)	6.18, s
26	2.17, s	2.17, s	1.46, s	2.23, s
27	1.72, s	1.72, s	1.46, s	1.70, s
28	1.23, s	1.14, s	1.19, s	1.22, s
29	1.04, s	1.05, s	1.12, s	1.16, s
30	0.88, s	0.89, s	0.83, s	0.89, s
1'			4.82, d (7.4)	4.86, d (7.7)
2'			4.03, overlap	4.07, overlap
3'			4.12, t (8.0)	4.11, t (8.0)
4'			4.02, overlap	4.07, overlap
5'			3.85, m	3.89, m
6'			4.46, dd (11.8, 3.4) 4.32, dd (11.8, 5.4)	4.60, overlap 4.52, overlap
1''			5.94, br s	6.00, br s
2''			4.66, overlap	4.72, overlap
3''			4.45, overlap	4.50, overlap
4''			4.25, t (9.4)	4.31, overlap
5''			4.66, overlap	4.68, overlap
6''			1.66, d (6.0)	1.70, d (6.0)
1'''			5.70, br s	5.77, br s
2'''			4.87, br s	4.93, br s
3'''			4.53, dd (9.5, 3.1)	4.59, overlap
4'''			4.26, t (9.4)	4.32, overlap
5'''			4.66, overlap	4.75, overlap
6'''			1.61, d (6.0)	1.66, d (6.0)

¹³C NMR spectroscopic data (in Pyridine-d ₅)
No	화합물 6 δ _C, type 150Mhz	화합물 7 δ _C, type 125Mhz	화합물 8 δ _C, type 125Mhz	화합물 9 δ _C, type 150Mhz
1	39.3, CH₂	39.5, CH₂	39.4, CH₂	39.4, CH₂
2	29.0, CH₂	34.4, CH₂	26.9, CH₂	28.7, CH₂
3	78.1, CH	216.2, C	88.7, CH	88.7, CH
4	39.9, C	47.7, C	40.0, C	39.8, C
5	56.7, CH	55.3, CH	56.7, CH	56.6, CH
6	19.2, CH₂	20.3, CH₂	18.9, CH₂	19.0, CH₂
7	34.9, CH₂	34.1, CH₂	34.9, CH₂	34.8, CH₂
8	41.0, C	40.9, C	41.1, C	41.0, C
9	54.9, CH	54.0, CH	54.7, CH	54.1, CH
10	38.2, C	37.7, C	37.8, C	37.7, C
11	40.3, CH₂	40.3, CH₂	40.2, CH	39.8, CH₂
12	211.9, C	211.2, C	211.9, C	209.9, C
13	56.3, CH	56.8, CH	56.9, CH	59.0, CH
14	56.7, C	56.3, C	56.3, C	55.3, C
15	32.3, CH₂	32.3, CH₂	32.2, CH₂	32.2, CH₂
16	25.2, CH₂	25.2, CH₂	25.2, CH₂	28.7, CH₂
17	45.3, CH	45.2, CH	45.4, CH	45.7, CH
18	16.1, CH₃	15.7, CH₃	16.0, CH₃	16.1, CH₃
19	16.5, CH₃	16.0, CH₃	16.5, CH₃	16.4, CH₃
20	74.1, C	74.1, C	73.9, C	159.7, C
21	27.2, CH₃	27.3, CH₃	27.0, CH₃	17.7, CH₃
22	55.0, CH₂	55.0, CH₂	55.1, CH₂	126.3, CH
23	201.8, C	201.7, C	212.9, CH₂	191.7, C
24	126.6, CH	126.5, CH	54.8, CH	127.5, CH
25	154.9, C	155.0, C	70.0, C	154.1, C
26	21.0, CH₃	21.0, CH₃	30.8, CH₃	20.8, CH₃
27	27.7, CH₃	27.7, CH₃	30.4, CH₃	27.7, CH₃
28	28.4, CH₃	27.0, CH₃	28.2, CH₃	28.2, CH₃
29	16.6, CH₃	21.5, CH₃	17.0, CH₃	17.1, CH₃
30	17.5, CH₃	17.3, CH₃	17.5.CH₃	17.7, CH₃
1'			105.3, CH	105.4, CH
2'			78.4, CH	78.5, CH
3'			87.8, CH	87.7, CH
4'			70.8, CH	70.8, CH
5'			78.4, CH	78.4, CH
6'			63.0, CH₂	63.0, CH₂
1''			102.5, CH	102.6, CH
2''			72.4, CH	72.5, CH
3''			72.8, CH	72.9, CH
4''			74.1, CH	74.1, CH
5''			70.5, CH	70.6, CH
6''			18.9, CH₃	18.9, CH₃
1'''			104.0, CH	104.1, CH
2'''			72.9, CH	72.7, CH
3'''			73.0, CH	73.0, CH
4'''			73.9, CH	74.0, CH
5'''			71.1, CH	71.2, CH
6'''			18.7, CH₃	18.8, CH₃

¹H NMR spectrocopic data [in Pyridine-d ₅)
No	화합물 10 δ _H (J in Hz) 500Mhz	화합물 11 δ _H (J in Hz) 500Mhz	화합물 12 δ _H (J in Hz) 500Mhz	화합물 13 δ _H (J in Hz) 600Mhz	화합물 14 δ _H (J in Hz) 600Mhz
1	3.21, ddd (4.7, 11.5, 15.5) 1.95, ddd (4.6, 11.8, 15.5)	3.21, ddd (4.7, 11.5, 15.5) 1.94, ddd (4.6, 11.8, 15.5)	3.17, ddd (4.7, 11.5, 15.5) 1.92, ddd (4.6, 11.8, 15.5)	1.45, overlap 1.11, overlap	1.46, overlap 1.09, overlap
2	2.56, overlap 3.00, overlap	2.54, overlap 2.98, overlap	2.51, ddd (4.7, 11.8, 15.6) 2.98, ddd (4.6, 11.5, 15.6)	1.23, overlap 2.77, overlap	2.25, overlap 1.79, overlap
3				3.24, overlap	3.29, overlap
5	1.69, overlap	1.67, overlap	1.67, overlap	0.69, m	0.72, m
6	1.67, overlap 1.65, overlap	1.69, overlap 1.65, overlap	1.65, overlap 1.63, overlap	1.50, m 1.40, m	1.50, overlap 1.40, overlap
7	1.29, m 1.28, m	1.29, m 1.26, m	1.29, m 1.28, m	1.40, m 1.20, m	1.40, overlap 1.20, overlap
9	2.20 dd (13.4, 3.3)	2.19, dd (13.4, 3.3)	2.16, dd (14.2, 3.3)	1.70, m	1.71, overlap
11	2.60, dd (13.4, 3.3) 2.39, t (13.4)	2.59, dd (13.4, 3.3) 2.35, t (13.4)	2.58, dd (14.2, 3.3) 2.30, t (14.2)	2.23, overlap 2.15, overlap	2.27, overlap 2.14, t (13.0)
13	3.33, d (9.7)	3.27, d (9.7)	3.31, d (9.7)	3.21, d (9.7)	3.19, d (9.7)
15	1.85, m 1.17, overlap	1.83, m 1.16, overlap	1.74, m 1.53, overlap	1.69, overlap 1.10, overlap	1.70, overlap 1.09, overlap
16	2.10, overlap 1.92, overlap	2.06, overlap 1.89, overlap	2.00, m 1.76, overlap	2.00, overlap 1.70, overlap	1.96, overlap 1.72, overlap
17	2.79, td (10.2, 5.2)	2.80, td (10.2, 5.2)	3.38, m	3.35, m	3.30, m
18	1.26, s	1.24, s	1.15, s	1.00, s	1.01, s
19	1.19, s	1.18, s	1.16, s	0.77, s	0.75, s
21	1.52, s	1.52, s	2.22, s	2.23, s	2.21, s
22	2.92, d (14.2) 2.70, d (14.2)	3.12, d (14.2) 2.83, d (14.2)
24	6.31, br s	3.00, br s
26	1.72, s	1.50, s
27	2.18, s	1.50, s
28	1.46, s	1.46, s	1.45, s	1.07, s	1.09, s
29	1.50, s	1.50, s	1.49, s	1.15, s	1.19, s
30	0.86, s	0.85, s	0.81, s	0.71, s	0.78, s
1'				4.76, d (7.7)	4.73, d (8.0)
2'				3.97, overlap	3.94, t (8.0)
3'				4.07, overlap	4.06, t (8.0)
4'				3.84, overlap	3.80, overlap
5'				3.84, overlap	3.90, overlap
6'				4.59, overlap 4.47, overlap	4.48, overlap 4.08, overlap
1''				5.88, br s	5.89, br s
2''				4.68, overlap	4.68, overlap
3''				4.50, overlap	4.50, overlap
4''				4.25, overlap	4.29, overlap
5''				4.64, overlap	4.62, overlap
6''				1.63, d (4.6)	1.63, d (6.3)
1'''				5.67, br s	5.69, br s
2'''				4.84, overlap	4.87, overlap
3'''				4.51, overlap	4.53, overlap
4'''				4.31, overlap	4.28, overlap
5'''				4.68, overlap	4.70, overlap
6'''				1.60, d (4.6)	1.62, overlap
1''''					5.39, br s
2''''					4.53, overlap
3''''					4.62, overlap
4''''					4.35, overlap
5''''					4.34, overlap
6''''					1.64, overlap

¹³C NMR spectroscopic data (in Pyridine-d ₅)
No	화합물 10 δ _C, type 125Mhz	화합물 11 δ _C, type 125Mhz	화합물 12 δ _C, type 125Mhz	화합물 13 δ _C, type 150Mhz	화합물 14 δ _C, type 150Mhz
1	35.8, CH₂	35.9, CH₂	35.7, CH₂	39.2, CH₂	39.1, CH₂
2	30.0, CH₂	30.0, CH₂	30.0, CH₂	28.1, CH₂	28.0, CH₂
3	177.4, C	177.3, C	177.3, C	88.6, CH	88.8, CH
4	75.1, C	75.1, C	75.1, C	39.3, C	39.2, C
5	52.6, CH	52.6, CH	52.5, CH	56.5, CH	56.5, CH
6	23.2, CH₂	23.3, CH₂	23.1, CH₂	18.7, CH₂	18.8, CH₂
7	34.1, CH₂	34.1, CH₂	34.0, CH₂	34.6, CH₂	34.6, CH₂
8	40.8, C	40.8, C	40.5, C	40.7, C	40.6, C
9	47.1, CH	47.1, CH	46.1, CH	53.8, CH	53.6, CH
10	42.2, C	42.2, C	42.1, C	37.5, C	37.6, C
11	40.0, CH₂	40.0, CH₂	39.2, CH₂	39.8, CH₂	39.8, CH
12	211.8, C	211.8, C	209.8, C	210.3, C	209.9, C
13	56.8, CH	57.0, CH	58.5, CH	58.5, CH	58.4, CH
14	56.6, C	56.6, C	55.1, C	54.8, C	54.6, C
15	32.3, CH₂	32.3, CH₂	31.9, CH₂	31.8, CH₂	31.7, CH₂
16	25.3, CH₂	25.3, CH₂	26.3, CH₂	26.1, CH₂	26.0, CH₂
17	45.3, CH	45.4, CH	48.0, CH	47.9, CH	47.9, CH
18	15.8, CH₃	15.8, CH₃	15.7, CH₃	15.9, CH₃	15.9, CH₃
19	21.2, CH₃	21.2, CH₃	20.9, CH₃	16,2, CH₃	16,2, CH₃
20	74.1, C	73.9, C	210.2, C	210.0, C	210.2, C
21	27.1, CH₃	26.8, CH₃	30.2, CH₃	30.2, CH₃	30.2, CH₃
22	54.8, CH₂	55.1, CH₂
23	201.9, C	213.1, C
24	126.6, CH	57.8, CH₂
25	154.9, C	70.0, C
26	27.7, CH₃	30.8, CH₃
27	21.0, CH₃	30.5, CH₃
28	28.6, CH₃	28.6, CH₃	28.6, CH₃	28.1, CH₃	28.0, CH₃
29	34.5, CH₃	34.5, CH₃	34.5, CH₃	16.9, CH₃	16.8, CH₃
30	17.3, CH₃	17.3, CH₃	17.2, CH₃	17.4, CH₃	17.4, CH₃
1'				105.3, CH	105.2, CH
2'				78.3, CH	78.4, CH
3'				87.5, CH	87.0, CH
4'				70.6, CH	70.5, CH
5'				78.3, CH	76.2, CH
6'				62.8, CH₂	68.1, CH₂
1''				102.5, CH	102.4, CH
2''				72.3, CH	72.1, CH
3''				72.7, CH	72.1, CH
4''				74.0, CH	73.7, CH
5''				70.1, CH	70.0, CH
6''				18.9, CH₃	18.9, CH₃
1'''				104.0, CH	103.8, CH
2'''				72.7, CH	72.4, CH
3'''				72.9, CH	72.6, CH
4'''				73.8, CH	73.8, CH
5'''				71.0, CH	70.9, CH
6'''				18.7, CH₃	18.8, CH₃
1''''					102.6, CH
2''''					72.9, CH
3''''					72.6, CH
4''''					74.0, CH
5''''					70.6, CH
6''''					18.6, CH₃

¹H NMR spectrocopic data [in Pyridine-d ₅)
No	화합물 15 δ _H (J in Hz) 600Mhz	화합물 16 δ _H (J in Hz) 600Mhz	화합물 17 δ _H (J in Hz) 500Mhz	화합물 18 δ _H (J in Hz) 500Mhz	화합물 19 δ _H (J in Hz) 600Mhz
1	1.24, m 0.75, m	1.22, overlap 0.73, overlap	1.21, overlap 0.72, overlap	1.21, overlap 0.78, overlap	1.20, overlap 0.78, overlap
2	2.15, m 1.75, m	2.22, overlap 1.75, overlap	2.22, overlap 1.75, overlap	2.21, overlap 1.78, overlap	2.21, overlap 1.77, overlap
3	3.26, dd (11.7, 4.1)	3.32, overlap	3.27, dd (11.9, 4.3)	3.27, dd (11.9, 4.3)	3.29, overlap
5	0.72, m	0.68, overlap	0.67, overlap	0.70, overlap	0.67, overlap
6	1.54, m 1.41, m	1.52, m 1.42, m	1.53, overlap 1.42, overlap	1.51, overlap 1.42, overlap	1.49, overlap 1.40, overlap
7	1.41, m 1.27, m	1.45, m 1.27, m	1.45, overlap 1.26, overlap	1.40, overlap 1.27, overlap	1.40, overlap 1.26, overlap
9	1.66, overlap	1.67, m	1.67, overlap	1.66, overlap	1.66, overlap
11	2.24, overlap 2.22, overlap	2.27, overlap 2.22, overlap	2.27, t (13.0) 2.22, dd (13.0, 4.0)	2.23, overlap (2H)	2.22, overlap (2H)
13	3.17, d (9.7)	3.02, d (10.5)	3.36, d (9.6)	3.33, d (9.6)	3.30, overlap
15	1.80, m 1.14, m	1.85, m 1.23, m	1.87, m 1.17, m	1.86, m 1.14, m	1.86, overlap 1.17, overlap
16	2.02, m 1.88, m	2.07, m 1.91, m	2.14, m 1.90, m	2.10, m 1.89, m	2.08, m 1.90, m
17	2.74, td (10.1, 10.0, 5.3)	3.17, ddd (17.0, 10.6, 6.7)	2.76, m	2.72, m	2.73, td (10.0, 5.3)
18	1.09, s	1.14, s	1.13, s	1.11, s	1.11, s
19	0.75, s	0.82, s	0.78, s	0.77, s	0.78, s
21	1.46, s	2.33, s	1.45, s	1.42, s	1.42, s
22	3.10, d (15.6) 2.81, d (15.6)	6.44, s	2.59, dd (13.8, 6.5) 2.53, dd (13.8, 8.6)	2.57, dd (13.8, 6.5) 2.51, dd (13.8, 8.3)	1.76, overlap (2H)
23			6.25, ddd (15.1, 8.3, 6.5)	6.21, ddd (15.1, 8.3, 6.5)	2.41, m2.28, m
24	2.94, br s	6.16, s	5.99, d (15.1)	5.97, d (15.1)	5.27, m
26	1.44, s	1.70, s	1.52, s	1.51, s	1.66, s
27	1.45, s	2.22, s	1.52, s	1.51, s	1.62, s
28	1.18, s	1.24, s	1.19, s	1.21, s	1.23, s
29	1.12, s	1.10, s	1.14, s	1.11, s	1.17, s
30	0.78, s	0.88, s	0.86, s	0.83, s	0.89, s
1'	4.72, d (7.5)	4.80, d (7.5)	4.83, d (7.5)	4.79, d (7.5)	4.92, d (7.2)
2'	4.01, overlap	4.02, overlap	4.09, overlap	4.00, overlap	4.28, overlap
3'	4.11, overlap	4.13, overlap	4.18, overlap	4.12, overlap	4.26, overlap
4'	3.86, overlap	3.87, overlap	3.89, overlap	3.84, overlap	4.13, t (9.3)
5'	3.94, overlap	3.95, overlap	4.07, overlap	3.95, overlap	3.95, ddd (9.3, 5.4, 2.6)
6'	4.53, overlap 4.13, overlap	4.53, overlap 4.13, overlap	4.53, overlap 4.38, overlap	4.49, overlap 4.14, overlap	4.57, dd (11.8, 2.6) 4.37, dd (11.8, 5.4)
1''	5.86, br s	5.96, br s	5.99, br s	6.00, br s	6.56, br s
2''	4.66, overlap	4.68, overlap	4.71, overlap	4.68, overlap	4.84, dd (3.0, 1.3)
3''	4.45, overlap	4.50, overlap	4.50, overlap	4.49, overlap	4.66, dd (9.4, 3.0)
4''	4.27, overlap	4.33, overlap	4.30, overlap	4.33, overlap	4.33, t (9.4)
5''	4.60, overlap	4.62, overlap	4.66, overlap	4.62, overlap	4.79, dq (9.4, 6.2)
6''	1.61, d (6.3)	1.68, d (6.3)	1.68, d (6.3)	1.67, d (6.3)	1.70, d (6.2)
1'''	5.65, br s	5.75, br s	5.76, br s	5.74, br s
2'''	4.86, overlap	4.92, overlap	4.93, overlap	4.92, overlap
3'''	4.50, d (9.3)	4.52, d (9.3)	4.58, overlap	4.52, d (9.3)
4'''	4.25, overlap	4.28, overlap	4.32, overlap	4.28, overlap
5'''	4.67, overlap	4.70, overlap	4.74, overlap	4.70, overlap
6'''	1.57, d (6.3)	1.64, d (6.3)	1.64, d (6.3)	1.62, d (6.3)
1''''	5.37, br s	5.44, br s		5.43, br s
2''''	4.50, overlap	4.53, overlap		4.52, overlap
3''''	4.59, overlap	4.62, overlap		4.63, overlap
4''''	4.32, overlap	4.35, overlap		4.35, overlap
5''''	4.31, overlap	4.34, overlap		4.34, overlap
6''''	1.59, d (6.3)	1.65, d (6.3)		1.64, d (6.3)

¹³C NMR spectroscopic data (in Pyridine-d ₅)
No	화합물 15 δ _C, type 150Mhz	화합물 16 δ _C, type 125Mhz	화합물 17 δ _C, type 125Mhz	화합물 18 δ _C, type 150Mhz	화합물 19 δ _C, type 150Mhz
1	39.3, CH₂	39.3, CH₂	39.4, CH₂	39.3, CH₂	39.3, CH₂
2	26.8, CH₂	27.0, CH₂	27.0, CH₂	27.0, CH₂	27.1, CH₂
3	89.2, CH	89.0, CH	88.6, CH	89.1, CH	88.7, CH
4	39.9, C	39.8, C	41.0, C	39.9, C	40.0, C
5	56.7, CH	56.6, CH	56.6, CH	56.7, CH	56.7, CH
6	18.7, CH₂	19.0, CH₂	18.9, CH₂	18.4, CH₂	18.8, CH₂
7	34.8, CH₂	34.7, CH₂	34.9, CH₂	34.8, CH₂	34.9, CH₂
8	41.0, C	41.0, C	41.4, C	41.0, C	41.0, C
9	54.7, CH	54.0, CH	54.7, CH	54.7, CH	54.8, CH
10	37.8, C	37.8, C	37.7, C	37.8, C	37.7, C
11	40.2, CH	40.0, CH₂	40.2, CH₂	40.2, CH₂	40.2, CH₂
12	212.5, C	210.0, C	212.2, C	212.3, C	212.1, C
13	56.8, CH	59.0, CH	56.9, CH	56.8, CH	56.9, CH
14	56.7, C	55.2, C	56.2, C	56.2, C	56.7, C
15	32.3, CH₂	32.1, CH₂	32.3, CH₂	32.2, CH₂	32.3, CH₂
16	25.2, CH₂	28.8, CH₂	24.8, CH₂	24.7, CH₂	24.8, CH₂
17	45.1, CH	45.7, CH	44.4, CH	44.3, CH	44.4, CH
18	16.1, CH₃	16.1, CH₃	16.1, CH₃	16.1, CH₃	16.1, CH₃
19	16.6, CH₃	16.4, CH₃	16.5, CH₃	16.6, CH₃	17.2, CH₃
20	73.9, C	159.8, C	74.0, C	73.8, C	73.6, C
21	26.8, CH₃	17.7, CH₃	27.5, CH₃	27.5, CH₃	26.9, CH₃
22	55.2, CH₂	126.2, CH	45.8, CH₂	45.8, CH₂	42.3, CH₂
23	212.9, C	191.7, C	123.2, CH	123.1, CH	23.9, CH₂
24	57.7, CH₂	127.4, CH	143.1, CH	143.0, CH	126.2, CH
25	70.1, C	154.0, C	70.1, C	70.1, C	131.2, C
26	30.7, CH₃	27.7, CH₃	31.1, CH₃	31.0, CH₃	26.1, CH₃
27	30.3, CH₃	20.8, CH₃	31.0, CH₃	31.0, CH₃	18.0, CH₃
28	28.1, CH₃	28.2, CH₃	28.1, CH₃	28.1, CH₃	28.1, CH₃
29	16.8, CH₃	16.9, CH₃	17.0, CH₃	16.6, CH₃	16.5, CH₃
30	17.5, CH₃	17.7, CH₃	17.6, CH₃	17.6, CH₃	17.6, CH₃
1'	105.3, CH	105.3, CH	105.4, CH	105.3, CH	105.8, CH
2'	78.5, CH	78.5, CH	78.3, CH	78.4, CH	77.6, CH
3'	87.1, CH	87.3, CH	87.6, CH	87.2, CH	80.2, CH
4'	71.0, CH	70.7, CH	70.7, CH	70.8, CH	72.5, CH
5'	76.4, CH	76.4, CH	78.5, CH	76.4, CH	78.6, CH
6'	68.4, CH₂	68.4, CH₂	62.9, CH₂	68.3, CH₂	63.2, CH₂
1''	102.5, CH	102.6, CH	102.6, CH	102.6, CH	102.1, CH
2''	72.2, CH	72.1, CH	72.4, CH	72.1, CH	72.5 CH
3''	72.5, CH	72.3, CH	72.8, CH	72.3, CH	72.9, CH
4''	73.7, CH	73.9, CH	74.1, CH	73.9, CH	74.5, CH
5''	70.2, CH	70.2, CH	70.2, CH	70.2, CH	69.9, CH
6''	19.0, CH₃	19.0, CH₃	18.9, CH₃	18.9, CH₃	19.0, CH₃
1'''	103.9, CH	104.0, CH	104.1, CH	104.0, CH
2'''	72.7, CH	72.8, CH	72.8, CH	72.8, CH
3'''	72.8, CH	73.1, CH	73.0, CH	73.0, CH
4'''	73.9, CH	74.1, CH	74.0, CH	74.0, CH
5'''	70.8, CH	70.7, CH	71.1, CH	70.6, CH
6'''	18.9, CH₃	19.0, CH₃	18.8, CH₃	19.0, CH₃
1''''	102.8, CH	102.8, CH		102.8, CH
2''''	73.0, CH	72.9, CH		73.0, CH
3''''	72.8, CH	72.8, CH		72.9, CH
4''''	74.1, CH	74.2, CH		74.2, CH
5''''	70.8, CH	70.8, CH		70.8, CH
6''''	18.7, CH₃	18.7, CH₃		18.7, CH₃

<실시예 4. 동물세포 배양>

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물의 근육 또는 지방 조직에서의 AMPK 활성화를 확인하기 위해 근아세포(myoblast)인 C2C12(마우스 골격근 세포) 세포 또는 지방세포(adipocyte)인 3T3-L1 세포를 이용하였다.

상기 C2C12 세포 및 3T3-L1 세포는 10% FBS(fetal bovine serum), 100U/㎖의 페니실린(penicillin) 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신(streptomycin)이 포함되어 있는 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium, Gibco사) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다.

<실시예 5. 세포 독성 확인>

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1에서 분리한 화합물의 세포 독성 여부를 확인하기 위해 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 어세이를 수행하였다.

상기 실시예 4에서 배양한 C2C12 세포 또는 3T3-L1 세포를 96웰 플레이트에 분주하고 24시간 동안 배양하고, 상기 실시예 2에서 분리한 화합물 1~19를 40μM이 되도록 처리하고 24시간 동안 추가 배양 하였다. 배양이 끝나고, 2㎎/㎖의 MTT 용액 20㎕를 각 웰에 넣고 4시간 동안 반응시킨 후, 배양액을 제거하고 형성된 포마잔(formazan) 침전물을 100㎕의 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹이고 550㎚에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 1(A) 및 1(B)에 나타내었다.

도 1(A) 및 1(B)에서 보여주듯이, 상기 실시예 2에서 분리한 화합물 중, 화합물 10~18은 40μM의 농도에서 3T3-L1 세포(A) 또는 C2C12 세포(B)에 대한 독성이 없는 것을 확인하였다. 또한, 본 명세서에서 직접적으로 결과를 보여주지 않았으나, 화합물 1~9의 경우에도 세포 독성이 전혀 나타나지 않았다. 반면에, 화합물 19의 경우에는 40μM 농도에서 두 종류의 세포 모두에서 독성이 나타났다.

이에, 화합물 19의 세포 독성이 나타나지 않는 농도를 확인하기 위해 화합물 19를 농도가 10, 20, 30μM이 되도록 처리하여 세포 독성 여부를 확인하였고, 그 결과를 도 1(C) 및 1(C)에 나타내었다.

도 1(C) 및 1(D)에서 보여주듯이, 화합물 19의 경우, 10μM의 농도에서 3T3-L1 세포(C) 또는 C2C12 세포(D) 모두에서 독성이 나타나지 않는 것을 확인하였다.

이에 따라, 화합물 1~18은 20μM로, 화합물 19는 10μM로 처리하여 각 화합물의 활성을 확인하였다.

<실시예 6. AMPK 활성화 확인>

근육 재생 과정에 있어서 AMPK 활성화가 근육 재생을 촉진하다는 것이 보고되었다. 또한, 골격근에서 AMPK가 인산화되어 활성화되면 지방산의 산화와 당 흡수를 촉진하고, 활성화된 AMPK는 지방산 합성에 필요한 효소인 아세틸-CoA 카르복실라아제(acetyl-CoA carboxylase, ACC)를 인산화시켜 비활성화시킴으로써 지방산 산화를 증가시킨다.

이에, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물들의 근육 관련 세포에서의 AMPK의 활성화 및 ACC의 비활성화에의 효과를 확인하였다.

상기 실시예 4에서 배양한 C2C12 세포를 6웰 플레이트에 분주하고 세포가 70~80% 정도 찰 때까지 배양하였다. 배양액을 제거하고 2% 말 혈청(horse serum, Gibco)이 포함된 DMEM 배지(분화용 배지)를 넣고 배양하여 근관세포로의 분화를 유도하였다. 이때, 근관세포가 생성될 때까지 2일 간격으로 새로운 분화용 배지로 교체해주었다.

상기 분화된 근관세포에 상기 실시예 2의 화합물을 분리하는 과정 중에, 70%[v/v] 에탄올 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 SP70 수지에 가한 후, 30%[v/v] 에탄올을 이용하여 수지를 세척한 뒤 95%[v/v] 에탄올로 용출하여 확보한 95%[v/v] 에탄올 분획물은 10, 20, 40㎍/㎖을, 상기 실시예 2의 화합물 1~18은 20μM을, 화합물 19는 10μM을 처리하고, 30~60분 동안 배양하였다. 이때, 양성 대조군으로 AMPK 활성화 물질로 알려진 Aicar(5-aminoimidazole-4-carboxamide ribonucleotide) 0.2mM을 처리하여 세포를 확보하였다. 확보한 세포를 이용하여 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였다.

상기 각각의 시료를 처리한 세포를 모아 PBS(phosphat buffered saline)로 세척하고, 세포 용해 완충용액(cell lysis buffer)(50 mM Tris-HCl (pH 7.6), 120 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% NP-40, 50 mM NaF)을 넣어 세포를 용해시킨 후 원심 분리하여 상등액의 단백질을 확보하였다. 확보한 상등액의 단백질을 SDS-PAGE(sodium dodecyl polyacrylamide gel electrophoresis)를 통해 분리하고 PVDF(polyvinylidenefluoride) 멤브레인으로 이동(transfer)시켰다. 멤브레인을 블로킹 용액으로 블로킹 시킨 다음, AMPKα, 인산화 된 AMPKα(p-AMPKα), ACC, 인산화 된 ACC(p-ACC)의 양을 확인하기 위해 각각에 해당하는 1차 항체를 처리한 후, 1차 항체에 대한 2차 항체를 처리하고, ECL(enhanced chemiluminescence)(Amersham사)를 이용하여 단백질 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보여주듯이, (A)의 상기 실시예 2의 95%[v/v] 에탄올 분획물을 농도별로 처리한 경우에 분획물 처리 농도에 따라 AMPK의 인산화가 증가하는 것을 확인하였다. 또한 (B)의 상기 실시예 2의 화합물 1~19를 처리한 경우에, 단백질 발현 밴드((B)의 위쪽 그림) 및 단백질 발현 밴드를 발현량을 수치화한 결과((B)의 아래쪽 그래프)에서 보듯이, 아무것도 처리하지 않은 세포와 대비하여 각각의 화합물을 처리한 세포에서의 AMPK 및 ACC의 인산화가 대부분 증가되는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 지노스테마 론기페스 추출물 및 이로부터 분리한 화합물들이 근아세포에서 근관세포로의 분화가 유도된 근육 관련 세포에서의 AMPK 인산화를 유도하여 활성화시키고, ACC를 비활성화시켜 근육 재생을 촉진한다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 7. 근아세포의 증식 확인>

실시예 7-1. 근아세포의 증식 촉진 효과 확인

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물들의 근육 재생 효과를 확인하기 위해 MTT 어세이 및 WST-1(water-soluble tetrazolium salt-1) 어세이를 이용하여 근아세포 증식 촉진 효과를 확인하였다.

96웰 플레이트에 웰 당 4,000개의 세포를 분주하고 8시간 동안 배양 후, 5% FBS가 포함된 배지로 교체하고, 상기 실시예 2의 95%[v/v] 에탄올 분획물은 10㎍/㎖이 되도록 처리하고 24시간 또는 48시간 동안 배양하였고, 상기 실시예 2의 화합물 1~18은 20μM이, 화합물 19는 10μM이 되도록 처리하고 48시간 동안 배양한 다음 MTT 어세이 또는 WST-1 어세이를 수행하였다.

배양이 끝나고 2㎎/㎖의 MTT 용액 20㎕를 각 웰에 넣고 4시간 동안 반응시킨 후, 배양액을 제거하고 형성된 포마잔 침전물을 100㎕의 DMSO로 녹이고 550㎚에서 흡광도를 측정하여 MTT 어세이를 수행하였다. 또한, 배양이 끝나고 10㎕의 WST-1 용액을 각 웰에 넣고 2시간 동안 반응시킨 후 440㎚에서 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보여주듯이, 상기 실시예 2의 95%[v/v] 에탄올 분획물을 처리한 경우, MTT 어세이(A) 및 WST-1 어세이(B) 결과 모두에서 분획물을 처리하지 않은 경우와 비교하여 세포 생존율이 증가하였고, 처리 시간에 따른 세포 생존율의 경우에도 분획물을 처리하지 않은 경우에 비해, 상기 실시예 2의 95%[v/v] 에탄올 분획물을 처리한 경우에 시간에 따른 세포 생존율이 20~30% 더 높음을 확인하였다.

또한, 상기 실시예 2의 화합물 1~19를 처리한 경우에도, (C)의 결과에서 보여주는 화합물 1~9 뿐만 아니라, 화합물 10~19 모두에서 C2C12 세포 생존율이 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해 모두 증가하는 것을 MTT 어세이 및 WST-1 어세이를 통해 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물들이 근아세포의 증식을 촉진한다는 것을 알 수 있었고, 이러한 근아세포의 증식 촉진을 통해 근육 재생을 유도할 수 있다는 것을 충분히 예측할 수 있었다.

실시예 7-2. 근아세포 특이적 증식 촉진 효과 확인

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물의 근아세포 증식 촉진 효과가 근아세포에 특이적으로 일어나는 것인지를 확인하기 위해 암세포주인 MCF-7 및 MDA-MB 세포를 이용하여 상기 실시예 7-1의 MTT 어세이 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 이때, 상기 실시예 2의 95%[v/v] 에탄올 분획물은 10㎍/㎖을, 상기 실시예 2의 화합물 1은 10μM이 되도록 처리한 후, 48시간 동안 배양한 것을 이용하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에서 보여주듯이, 상기 실시예 2의 95%[v/v] 에탄올 분획물 및 상기 실시예 2의 화합물 1을 처리하더라도 MCF-7 및 MDA-MB 세포 모두 세포 생존율이 증가하지 않는 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물의 세포 증식 촉진 효과는 암세포를 비롯한 모든 세포에 작용하는 것이 아니라 근아세포에 특이적이라는 것을 알 수 있었다.

<실시예 8. 근아세포 증식 과정에서의 DNA 합성 촉진 효과 확인>

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물의 근아세포 증식 과정에서 DNA 합성을 촉진시키는 것을 확인하기 위해 BrdU(5-bromo-2′-deoxyuridine)를 이용한 면역화학염색(immunechemical stain) 방법과 유세포 분석기(flow cytometry)를 사용하였다. BrdU는 세포주기(cell cycle) 중 DNA 합성기인 S기(S-phase)에 있는 세포를 염색할 수 있다.

면역화학염색 방법은, 상기 실시예 4에서 배양한 C2C12 세포를 커버슬라이드가 들어있는 세포 배양 접시에 분주하고, 상기 실시예 2의 95%[v/v] 에탄올 분획물 20㎍/㎖ 또는 상기 실시예 2의 화합물 1 20μM을 처리하고 8시간 동안 배양하였다. 이때, DMSO를 처리한 세포를 대조군으로 이용하였다. 배양 후, 50μM의 BrdU 라벨링 용액(labeling solution)(Sigma-Aldrich, USA)을 37℃에서 2시간 동안 처리하고 2시간 후에 PBS로 세포를 세척하였다. 세척한 세포에 4% 포름알데히드(formaldehyde)를 상온에서 15분간 처리하여 세포를 고정시킨 후 PBS로 세척하고 트리톤 X-100 완충용액을 넣고 상온에서 20분간 처리하여 세포 투과도를 증가시킨 다음, 2N HCl 용액을 얼음 상에서 20분간 처리하였다. 2N HCl 용액을 제거하고 상온에서 포스페이트/시트르산 완충용액(pH 7.4)을 10분간 처리하고 트리톤 X-100 완충용액으로 세포를 세척한 다음 항-BrdU 항체를 하룻밤 동안 처리하였다. 다음날 항-BrdU 항체를 제거하고, 항-BrdU 항체를 인식할 수 있는 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 2차 항체를 1시간 동안 처리한 다음, DAPI(4',6-diamidino-2-phenylindole)를 처리하여 세포의 핵을 염색시켰다. 세포가 붙어 있는 커버슬라이드를 마운팅 용액(mounting solution)으로 고정 시킨 후, 형광현미경(Olympus ix70 Fluorescence Microscope, Olympus Corporation, JPN)으로 세포 이미지를 관찰하였고, 그 결과를 도 5(A)에 나타내었다.

도 5(A)에서 보여주듯이, 상기 실시예 2의 95%[v/v] 에탄올 분획물 또는 상기 실시예 2의 화합물 1을 처리한 경우 BrdU로 염색된 세포(붉은 색)의 수가 증가한 것을 확인하였다.

또한, 유세포 분석기의 경우에는, 상기 실시예 4에서 배양한 C2C12 세포를 36㎜ 세포 배양 접시에 분주하고, 상기 실시예 2의 화합물 1을 5, 10, 20μM이 되도록 처리하고 8시간 동안 배양하였다. 이때, 아무것도 처리하지 않은 세포를 정상군으로, DMSO를 처리한 세포를 대조군으로 이용하였다. 배양 후, 50μM의 BrdU 라벨링 용액을 37℃에서 2시간 동안 처리하고 2시간 후에 PBS로 세포를 세척하고 트립신(trypsin)을 이용하여 세포를 모았다. 모은 세포에 70% 에탄올을 넣고 4℃에서 1시간 동안 처리하여 세포 투과도를 증가시킨 다음, 1000rpm으로 2분간 원심 분리하여 세포를 분리하고, 0.5% 트리톤 X-100이 포함되어 있는 2N HCl 용액을 넣고 상온에서 30분간 처리하였다. 세포를 1% BSA(bovine serum albumin)이 포함되어 있는 PBS로 세척하고 0.5% 트리톤 X-100과 1% BSA가 포함되어 있는 PBS로 세포를 현탁한 후, 항-BrdU 항체를 넣고 상온에서 4시간 동안 반응시킨 다음, 20㎍/㎖의 PI(propidium iodide)가 포함된 PBS를 넣고 암소에서 30분간 반응시켜 세포를 확보하였다. 확보한 세포를 유세포 분석기(FACSCalibur, BD 사, USA)를 이용하여 BrdU 및 PI로 이중 염색된 세포를 분석하였고, 그 결과를 도 5(B)에 나타내었다.

도 5(B)에서 보여주듯이, 상기 실시예 2의 화합물 1의 처리 농도에 따라 S기에 있는 세포의 수가 증가하는 것을 확인하였다.

따라서 상기 도 5(A) 및 도 5(B)의 결과를 통해, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물이 근아세포가 증식하는 과정에서 세포의 DNA 합성을 촉진시킨다는 것을 알 수 있었다.

<실시예 9. 비만, 당뇨병 또는 대사증후군 치료 효과 확인>

실시예 9-1. 당 흡수 촉진 효과 확인

AMPK 활성화가 비만, 당뇨병 또는 대사증후군 치료제 개발에 있어서 중요한 타겟이 된다는 것을 기반으로 본 발명의 AMPK 활성화 효과를 가진 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물의 지방세포의 포도당 흡수(glucose uptake) 촉진 여부를 확인하였다.

상기 실시예 4에서 배양한 지방세포인 3T3-L1 세포를 96웰 플레이트에 분주하고, 10% FBS가 포함된, 포도당이 없는 DMEM 배지로 24시간 동안 배양하였다. 포도당의 형광 유도체(fluorescent analogue of glucose)인 2-NBDG(2-(N-(7-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)amino)-2-deoxyglucose)(Invtrogen, USA) 50μM을 모든 웰에 처리하고, 100nM 인슐린(양성 대조군) 또는 상기 실시예 2의 화합물 1~18 20μM 및 화합물 19 10μM을 각각의 웰에 처리하고 1시간 동안 배양하였다. 이때, DMSO를 처리한 것을 대조군으로 이용하였다. 1시간 후에 차가운 PBS로 세포를 세척한 다음, 형광 마이크로 플레이트 리더기(fluorescence microplate reader)(Spectra Max GEMINI XPS, Molecular Devices, USA)를 이용해 여기(excitation)/방출(emission) 파장이 450/535㎚인 조건으로 형광세기를 측정하였다. 또한 형광 현미경(Olympus ix70 Fluorescence Microscope, Olympus Corporation, Japan)을 이용하여 형광 이미지를 촬영하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서 보여주듯이, 2-NBDG의 3T3-L1 세포 내 흡수에 의한 형광 이미지를 확인한 결과(A) 및 세포 내 형광 세기를 측정한 결과(B)에서, 화합물 10~19를 처리한 경우, 세포 내 형광이 DMSO만을 처리한 대조군에 비해 증가한 것을 확인하였다.

또한, 본 명세서에는 직접적으로 보여주지 않았으나, 화합물 1~9를 처리한 경우에도 지방세포인 3T3-L1 세포 내 2-NBDG에 의한 형광이 증가한 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물이 지방세포의 당 흡수를 촉진시킴으로써 비만, 당뇨병 또는 대사증후군 치료 효과를 나타낸다는 것을 알 수 있었다.

실시예 9-2. 당 수송체 전위(translocation) 확인

대사증후군은 말초 조직으로의 포도당 흡수가 저항을 받는 인슐린 내성(insulin resistance)을 나타낸다. 비만 및 대사증후군에서 체중의 감소는 인슐린 내성을 감소시켜 저장 조직으로의 포도당 흡수를 촉진하는 것으로 알려지고 있다. 또한, 말초 조직으로의 포도당 흡수 촉진은 2형 당뇨병 관리를 위한 전제 조건인 혈액 내 포도당을 제거하는데 필수적인 작용 기작이다. 포도당 수송체 4(glucose transporter 4, GLUT4)는 인슐린에 반응하여 활성화 되는 주요 포도당 수송체로, 지방세포의 원형질막으로의 전위가 필수적이다. 이에, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물의 지방세포에서의 GLUT4의 전위에 영향을 주는지 확인하기 위해 지방세포의 원질막 단백질을 분리하여 웨스턴 블롯을 수행하였다.

상기 실시예 4에서 배양한 지방세포인 3T3-L1 세포를 6웰 플레이트에 분주하고, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 넣고 배양하였다. 이후, FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 상기 실시예 2의 화합물 중, 화합물 10, 11, 13 및 17을 20μM이 되도록 혼합하여 세포에 처리하고 24시간 동안 배양하였다. 이때, 양성대조군으로 인슐린 100nM을 넣고 2시간 동안 배양한 것을 이용하였다. 각각의 세포를 모은 후, Yamamoto, N., et al., (2001)의 세포 원형질막 분획 방법을 이용하여 3T3-L1 세포의 원형질막 분획물을 확보하였다. 확보한 원형질막 분획물의 단백질 농도를 BCA 단백질 분석 키트(Bio-Rad Laboratories, Inc., USA)를 이용하여 정량하였다. 단백질 정량 결과를 이용해 원형질막 분획물 내 단백질의 양이 동일하도록 한 후, 12% SDS-PAGE를 통해 크기별로 분리시킨 후, PVDF 멤브레인으로 이동시켰다. 멤브레인을 5% 탈지유가 포함된 블로킹 용액으로 블로킹시킨 다음, GLUT4에 대한 항체를 2시간 동안 처리하였다. 이때, 로딩 대조군으로 Na+/K+ ATPase α1를 확인하기 위해 이에 대한 항체를 처리하였다. 2시간 후에, 각각의 항체에 대한 2차 항체를 처리하고, ECL(Amersham사)을 이용하여 단백질 발현을 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.

도 7에서 보여주듯이, 3T3-L1 세포의 원형질막 내에 전위한 GLUT4 단백질 양을 확인한 밴드 결과(A) 및 단백질 밴드를 수치화한 결과(B)에서, 아무것도 처리하지 않은 세포에 비해, 인슐린, 상기 실시예 2의 화합물 10, 11, 13 및 14를 처리한 경우에, 3T3-L1 세포의 원형질막에 존재하는 GLUT4의 양이 증가한 것을 확인하였다.

이를 통해, 본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물이 GLUT4의 전위를 통해 포도당의 흡수를 촉진시킴으로써 비만, 당뇨병 또는 대사증후군에서 나타나는 인슐린 내성을 감소시켜 혈액 내 당의 함량을 감소시킴으로써 비만, 당뇨병 또는 대사증후군을 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

<제제예 1. 약학적 제제>

제제예 1-1. 정제의 제조

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 20g 또는 화합물 1 200㎎을 각각 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

제제예 1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 화합물 1 100㎎, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

<제제예 2. 건강기능식품의 제조>

제제예 2-1. 건강기능식품의 제조

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 20g, 비타민 혼합물 적량, 비타민 A 아세테이트 70㎍, 비타민 E 1.0㎎, 비타민 B1 0.13㎎, 비타민 B2 0.15㎎, 비타민 B6 0.5㎎, 비타민 B12 0.2㎍, 비타민 C 10㎎, 비오틴 10㎍, 니코틴산아미드 1.7㎎, 엽산 50㎍, 판토텐산 칼슘 0.5㎎, 무기질 혼합물 적량, 황산제1철 1.75㎎, 산화아연 0.82㎎, 탄산 마그네슘 25.3㎎, 제1인산칼륨 15㎎, 제2인산칼슘 55㎎, 구연산칼륨 90㎎, 탄산칼슘 100㎎, 염화마그네슘 24.8㎎을 섞어 과립으로 제조하였으나, 용도에 따라 다양한 제형으로 변형시켜 제조할 수 있다. 또한, 상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강기능식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조할 수 있다.

제제예 2-2. 건강기능성 음료의 제조

본 발명의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물 1을 1g, 구연산 0.1g, 프락토올리고당 100g, 정제수 900g을 섞어 통상의 음료 제조방법에 따라 교반, 가열, 여과, 살균, 냉장하여 음료를 제조하였다.

Claims

하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranosyl-20-O-β-D-glucopyranoside)(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[(4-O-acetyl)-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 3), 지펜토노시드 A(Gypentonoside A)(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside)(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12,23-dione)(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(20(S)-hydroxydammar-24-en-3,12,23-trione)(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S),25-trihydroxydammaran-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(3β-hydroxydammar-20,24-dien-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(4,20(S)-dihydroxy-3,4-seco-dammar-24-en-12,23-dion-3-oic acid)(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(4,20(S),25-trihydroxy-3,4-seco-dammaran-12,23-dion-3-oic acid)(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(4-hydroxy-3,4-seco-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dion-3-oic acid)(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β-hydroxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(3β-hydroxy-22,23,24,25,26,27-hexanordammaran-12,20-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S),25-trihydroxydammaran-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(3β-hydroxydammar-20,24-dien-12,23-dione-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S),25-trihydroxydammar-23(E)-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S),25-trihydroxydammar-23(E)-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→3)]-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→6)]-β-D-glucopyranoside)(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(3β,20(S)-dihydroxydammar-24-en-12-one-3-O-α-L-rhamnopyranosyl-(1→2)-β-D-glucopyranoside)(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 지노스테마 론기페스 VK1(Gynostemma longipes VK1) 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 AMPK(5′-AMP-activated protein kinase) 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제1항에 있어서,
상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물은 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
제3항에 있어서,
상기 화합물은 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학 조성물은 AMPK를 활성화 시키는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AMPK 관련 질환은 근육 질환, 비만, 당뇨병 또는 대사증후군인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제6항에 있어서,
상기 근육 질환은 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 피부근육염(dermatomyositis), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 신경 손상(nerve injury), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 악액질(cachexia) 및 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서,
상기 악액질은 암, 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS), 복강질환(celiac disease), 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 만성심부전증(chronic heart failure), 선천성 심부전증(congestive heart failure), 요독증(uremia), 결핵(tuberculous), 크론병(crohn's disease), 치료되지 않거나 심각한 제1형 당뇨, 신경성식욕부진 및 호르몬 부족에 의한 소모증후군인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]
제9항에 있어서,
상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물은 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]
제11항에 있어서,
상기 화합물은 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 건강기능식품 조성물은 AMPK를 활성화 시키는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AMPK 관련 질환은 근육 질환, 비만, 당뇨병 또는 대사증후군인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
제14항에 있어서,
상기 근육 질환은 근위축증(muscular atrophy), 근질환(myopathy), 근육 손상(muscular injury), 근이영양증(muscular dystrophy), 근무력증(myasthenia), 근육감소증(sarcopenia), 근신경 전도성 질병(myoneural conductive disease), 피부근육염(dermatomyositis), 당뇨병성 근위축증(diabetic amyotrophy), 신경 손상(nerve injury), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 악액질(cachexia) 및 퇴행성 근육질환(degenerative muscle diseases)으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
제15항에 있어서,
상기 악액질은 암, 에이즈(acquired immune deficiency syndrome, AIDS), 복강질환(celiac disease), 만성폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease, COPD), 다발성경화증(multiple sclerosis), 류마티스성 관절염(rheumatoid arthritis), 만성심부전증(chronic heart failure), 선천성 심부전증(congestive heart failure), 요독증(uremia), 결핵(tuberculous), 크론병(crohn's disease), 치료되지 않거나 심각한 제1형 당뇨, 신경성식욕부진 및 호르몬 부족에 의한 소모증후군인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 건강기능식품 조성물.
하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 동물 약품.
[화학식 1]
제17항에 있어서,
상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물은 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 동물 약품.
하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 동물 약품.
[화학식 1]
제19항에 있어서,
상기 화합물은 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 동물 약품.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 동물 약품은 AMPK를 활성화 시키는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 동물 약품.
제17항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AMPK 관련 질환은 근육 질환, 비만, 당뇨병 또는 대사증후군인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 예방 또는 치료용 동물 약품.
하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 포함하는 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 함유하는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 동물 사료용 조성물.
[화학식 1]
제23항에 있어서,
상기 지노스테마 론기페스 VK1 추출물은 지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 용매로 추출한 추출물인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 동물 사료용 조성물.
하기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 동물 사료용 조성물.
[화학식 1]
제25항에 있어서,
상기 화합물은 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 동물 사료용 조성물.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 동물 사료용 조성물은 AMPK를 활성화 시키는 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 동물 사료용 조성물.
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 AMPK 관련 질환은 근육 질환, 비만, 당뇨병 또는 대사증후군인 것을 특징으로 하는 AMPK 관련 질환 개선용 동물 사료용 조성물.
지노스테마 론기페스 VK1을 물, C1~4의 저급 알코올, C1~4의 초산에스테르, 아세톤 및 메틸에틸케톤으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상을 용매로 하여 추출한 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 수득하는 1단계;
상기 1단계의 지노스테마 론기페스 VK1 추출물을 이온교환수지에 흡착시킨 후 유기용매로 용출시켜 분획물을 확보하는 2단계; 및
상기 2단계의 분획물을 직접 결정화 하거나 컬럼 크로마토그래피에 가하여 상기 화학식 1의 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 1), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 지펜토노시드 A(화합물 4), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18) 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19)로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 화합물을 분리하는 3단계;
로 이루어진 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1의 화합물 1~19를 분리하는 방법.
[화학식 1]
하기 화학식 2의 화학구조를 갖는 신규 화합물 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노실-20-O-β-D-글루코피라노시드(화합물 2), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[(4-O-아세틸)-α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 3), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 5), 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12,23-디오네(화합물 6), 20(S)-히드록시다마르-24-엔-3,12,23-트리오네(화합물 7), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 8), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→3)-[α-L-람노피라노실-(1→2)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 9), 4,20(S)-디히드록시-3,4-세코-다마르-24-엔-12,23-디온-3-오익산(화합물 10), 4,20(S),25-트리히드록시-3,4-세코-다마란-12,23-디온-3-오익산(화합물 11), 4-히드록시-3,4-세코-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디온-3-오익산(화합물 12), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 13), 3β-히드록시-22,23,24,25,26,27-헥사노르다마란-12,20-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 14), 3β,20(S),25-트리히드록시다마란-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 15), 3β-히드록시다마르-20,24-디엔-12,23-디오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 16), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 17), 3β,20(S),25-트리히드록시다마르-23(E)-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-[α-L-람노피라노실-(1→3)]-[α-L-람노피라노실-(1→6)]-β-D-글루코피라노시드(화합물 18), 및 3β,20(S)-디히드록시다마르-24-엔-12-오네-3-O-α-L-람노피라노실-(1→2)-β-D-글루코피라노시드(화합물 19).
[화학식 2]