KR101418059B1 - 후박 추출물을 포함하는 항암용 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명에 따라 천연물 유래 물질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 및 이의 제조방법이 제공된다. 상기 항암용 조성물은 기존의 화학치료제가 가지고 있던 문제점인 부작용 내지 독성의 위험에 대한 우려가 없을 뿐만 아니라, 핵막 단백질인 BAF를 인산화시켜 세포분열 기간에 핵막의 분해와 재형성에 중요한 역할을 수행하여 종양 형성 및/또는 발달에 결정적인 영향을 하는, VRK1 인산화 효소에 의한 BAF 인산화를 특이적으로 저해할 수 있어, 효과적인 표적화 항암치료 용도로 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 항암용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 VRK1(Vaccina-related kinase 1)과 BAF 단백질 간의 결합 및 BAF의 인산화에 대한 저해 활성을 가지는 천연물 유래 물질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물에 관한 것이다.
항암치료제에는 DNA 손상을 유도하거나, 혹은 tubulin 단백질의 구조를 변형시키는 전통적 형태의 화학치료제와 특정 유전자를 타겟으로 하여 암을 치료하고자 하는 분자 표적화 약물의 두 가지 종류가 있다. 일반적으로 암의 치료에 이용되는 화학적 치료기술은 외과적 수술과 방사선 치료 (Radio therapy, Radio radiation)를 기반으로 한 치료법이었다. 하지만 최근 전통적 화학치료요법은 표적화 항암치료라는 새로운 국면으로 접어들고 있다. 표적화 치료 혹은 맞춤형 의약품은 특정 유전자, 심지어 특정 유전자의 다형적 변화물 (Polymorphism)을 목표로 하여 치료한다. 이는 기존의 분열 중인 세포를 타겟으로 하는 약물과는 큰 차이가 있다. 이러한 형태의 연구는 현재 많은 종류의 항암치료에 도움이 될 것으로 크게 기대되고 있다.
표적화 항암치료의 개념을 생각할 때 소분자성 저해물질 (Small molecule inhibitor)이나 단일클론항체 (Monoclonal antibody)의 표적이 될 수 있는 유전자를 선별하는 것은 매우 중요하며 근본적인 문제이다. 오늘날, 대부분의 관련 항암치료제는 세포 표면에 존재하는 수용체 타이로신 인산화효소 (Receptor Tyrosine Kinase), 혹은 체세포 분열 촉발성 인산화효소 (Mitotic Kinase)를 타겟으로 하고 있다.
특히 최근에는 세포주기에 관련된 유전자 또한 많은 연구자들의 흥미를 끌어 주목을 받고 있다. 세포 외부의 성장인자 수용체나 분비성 단백질과는 다르게, 세포주기와 관련된 세포 내부의 유전자는 암세포 형성의 근본적인 시작점이 되는 경우가 많으며 따라서 기존의 타겟과는 다르게 좀 더 신뢰할 만한 신약타겟이 될 가능성이 크다.
하지만, 기존의 타겟이나 또는 개발되고 있는 신약의 타겟 유전자는 세포의 구조적 부분을 담당하거나, 다양한 생리현상에 관여하는 다면성 때문에 많은 부작용을 야기하고 있다. 또한 기존의 소분자성 저해제는 생체적합성 및 표적지향성 등에 문제점을 가지는 경우가 많다. 특히 표적화 약물을 개발하고 있는 세계적 추세에 비추어 볼 때, 국내에서 새로운 신약타겟을 제시하는 논문은 거의 없는 편이며, 특정 유전자를 표적화한 약물을 보고한 경우도 매우 드문 실정이다.
VRK1은 세포주기에 따라서 서로 다른 역할을 수행하며, 특히 G0기를 벗어나는데 핵심적인 기능을 수행하는 듯하다. 이는 serum을 첨가하였을 때 즉시 반응하는 양상을 참고하여 내린 결론이며, 비슷한 초기 반응 유전자인 MYC, FOS 등과 유사한 행동을 하는 데에서 기인한다. 특히 세포주기의 시작 초반에 인산화되어야 하는 c-Jun, ATF2, p53 등은 VRK1의 잘 알려진 기질이기도 하다. 이는 VRK1이 세포주기의 진행에 반드시 필요한 요소임을 간접적으로 보여주는 것이다. 또한 매우 안정된 단백질 중의 하나로써, VRK1은 DNA 손상에 반응하여 p53을 인산화하는 역할을 수행한다. 또한 VRK1은 세포주기의 후반부에서 히스톤 단백질 H3의 Thr3과 Ser10을 인산화시켜 염색사를 염색체로 응축시켜 염색체 분리가 일어나도록 하는데 결정적 역할을 하며 아울러 핵막 단백질인 BAF를 인산화시켜 세포분열 기간에 핵막의 분해와 재형성에 중요한 역할을 한다.
이상의 사실에서 기존의 기술적 한계를 뛰어넘는 새로운 형태의 표적화 항암치료제의 선정이 시급하며, VRK1을 표적화하는 약물이 하나의 대안이 될 수 있음을 알 수 있다.
이에 본 발명은 상기 종래기술의 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 기존의 화학치료제가 가지고 있던 문제점인 부작용 내지 독성의 위험이 없고 표적화 항암치료에 적합한, 천연물 유래 물질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 후박 추출물, 상기 후박 추출물로부터 분리한 화합물, 및 상기 화합물의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명자들은 표적화 항암 치료에 적합한 천연물질을 찾기 위해 한약재 및 약용농산물로 취급되는 여러 가지 식물체로 만든 대규모 식물체 라이브러리를 이용한 활성조사단계를 수행하였으며, 그 결과 한약재 또는 약용 농산물 등으로 이용되고 있는 후박으로부터 추출된 물질이 종양형성에 결정적인 영향을 하는 VRK1 인산화 효소에 의한 BAF 인산화를 특이적으로 저해하는 작용을 한다는 점을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.
상기 VRK1은 세포주기의 진행에 반드시 필요한 요소이며, 핵막 단백질인 BAF를 인산화시켜 세포분열 기간에 핵막의 분해와 재형성에 중요한 역할을 한다. 따라서 이러한 VRK1에 의한 BAF 인산화 관련 신호계를 특이적으로 억제하는 작용을 하는 상기 후박 추출물은 새로운 형태의 표적화 항암치료 용도로 효과적으로 사용될 수 있다.
본 발명의 항암용 조성물이 적용될 수 있는 구체적인 질환으로는 예를 들어, 두경부편평상피암, 폐암, 대장암, 또는 혈액암 등과 같은 각종 암을 들 수 있으며, 바람직하게는 편평상피암 또는 혈액암이다.
따라서 본 발명의 일 구현예는 후박 추출물, 상기 후박 추출물로부터 분리한 화합물, 및 상기 화합물의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 명세서에서, ‘치료’는 증상의 경감 또는 개선, 질환의 범위의 감소, 질환 진행의 지연 또는 완화, 질환 상태의 개선, 경감 또는 안정화, 부분적 또는 완전한 회복, 생존의 연장 기타 다른 이로운 치료 결과 등을 모두 포함하는 의미로 사용된다.
또한 본 명세서에서, ‘후박 추출물’은 다양한 기관, 예컨대 잎, 꽃, 줄기 및 뿌리 등 전초로부터 추출하여 얻은 것을 의미하며, 바람직하게는 후박의 수피로부터 추출하여 얻은 것일 수 있다.
또한 본 명세서에서, 후박 추출물 또는 이의 분획물의 중량은 후박 추출물 또는 이의 분획물 내의 용매가 제거된 상태의 건조 중량을 기준으로 한다.
상기 후박은 현화식물문 쌍떡잎식물강 목련목 녹나무과에 속하는 것으로서, 후박나무(Machilus thunbergii), 당후박나무(Magnolia officinalis) 또는 일본목련나무(Magnolia obovata) 등을 사용할 수 있다.
바람직하게는 상기 후박 추출물, 상기 후박 추출물로부터 분리한 화합물, 또는 상기 화합물의 유도체는, VRK1의 기질인 BAF의 인산화 억제를 통해 암의 형성 또는 발달을 저해하는 것일 수 있다.
상기 후박 추출물은 바람직하게는 n-헥산, EtOAC(에틸아세테이트), n-BuOH(n-부탄올), 및 MeOH(메탄올) 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매로 추출한 유기용매 추출물일 수 있다.
상기 유기용매의 사용량은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 상기 후박 중량의 3 내지 5 배의 양으로 사용할 수 있다.
상기 후박 추출물은 바람직하게는 상기 유기용매 추출물을 극성에 따라 n-헥산(n-hexane), 에틸 아세테이트(EtOAc), 및 n-부탄올(n-BuOH)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분획용매로 순차적으로 분획하여 얻어진 n-헥산 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 및 n-부탄올 분획물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분획물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 n-헥산 분획물 또는 n-부탄올 분획물일 수 있다.
상기 후박 추출물로부터 분리한 화합물 또는 상기 화합물의 유도체는 바람직하게는 하기 화학식 4로 표시되는 것일 수 있다.
상기 화학식 4에서,
R1은 수소이고, R2는 포화된, 또는 1개 또는 5개의 이중결합에 의해 불포화된 C13 내지 C17의 직쇄상 탄화수소기이다.
바람직하게는 상기 R2는 1개 또는 2개의 이중결합에 의해 불포화된 C13 내지 C17의 직쇄상 탄화수소기일 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 후박 추출물로부터 분리한 화합물은 하기 화학식 1 또는 3의 화합물일 수 있으며, 보다 바람직하게는 하기 화학식 1의 화합물일 수 있다.
상기 항암용 조성물은 바람직하게는 상기 후박 추출물, 상기 후박 추출물로부터 분리한 화합물, 및 상기 화합물의 유도체로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.0001~99.9 중량%, 더욱 바람직하게는 0.1~99중량%로 포함할 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 항암용 조성물은 그 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제 등을 더욱 포함할 수 있다.
상기 담체, 부형제 및 희석제는 예컨대 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 등이 될 수 있다.
상기 항암용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있으며, 예컨대 경구 투여시에는 산제, 과립제, 정제, 현탁제, 에멀젼, 시럽 등의 제형으로 사용될 수 있다.
바람직한 투여량은 투여대상 및/또는 질환의 치료 또는 예방에 적합한 함량이 될 수 있으며, 이는 투여대상의 연령, 성별, 일반 건강 상태 및 체중, 질병의 종류 및 중증도, 제형의 종류, 조성물에 함유된 다른 성분의 종류 및 함량, 조성물의 분비율, 투여경로 및 기간 등을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있으며, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다.
상기 투여대상은 인간을 포함하는 포유류가 될 수 있으며, 항암 용도로서 바람직한 유효 투여량은 예컨대, 유효성분을 기준으로 하였을 때 1 회 성인 체중 1 ㎏을 기준으로 하여 20mg 내지 40mg의 용량으로 1회 이상 투여 가능하다. 그러나 상기한 투여량은 예시하기 위한 일예에 불과하며 상기 범위에 한정되지는 않는다.
본 발명의 다른 일 구현예는 1) 후박에 n-헥산, 에틸아세테이트, n-부탄올, 및 메탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매를 첨가하는 단계; 및 2) 상기 유기용매가 첨가된 후박을 상온에서 추출 및 여과하여 후박 추출물을 얻는 단계를 포함하는 항암용 조성물 제조방법을 제공한다.
바람직하게는 상기 유기용매로 추출하는 단계는 상온에서 20 내지 28 시간 동안 이루어질 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한 바람직하게는 상기 2) 단계 이후, 3) 상기 여과단계를 거쳐 얻어진 여액과 잔사를 분리하고, 상기 분리된 잔사에 대해 상기 1) 및 2) 단계를 2회 내지 3회 반복하여 실시하는 단계를 더 포함할 수 있다.
또한 상기 후박 추출물은 상기 2) 단계 및/또는 3) 단계를 거쳐 얻어진 여액을 모아 감압 농축, 동결 건조 또는 분무 건조 등을 수행하는 추가 공정을 더 포함함으로써 분말 상태로 제조할 수 있다.
상기 유기용매의 사용량은 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 상기 후박 중량의 3 내지 5 배의 양으로 사용할 수 있다.
바람직하게는 상기 유기용매 추출단계 이후에, 상기 유기용매 추출물을 극성에 따라 n-헥산, 에틸 아세테이트, 및 n-부탄올로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분획용매로 순차적으로 분획하여 n-헥산 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 및 n-부탄올 분획물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 분획물을 얻는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 분획 공정에 적합한 온도 내지 시간 등의 조건은 당업자가 적절히 조절하여 수행할 수 있으나, 바람직하게는 20 내지 35℃에서 수행할 수 있다.
또한 바람직하게는 상기 순차 분획 단계 이후에, 각 순차 분획단계에서 얻어진 분획물을 감압 농축 및 동결 건조 하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따라 천연물 유래 물질을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물 및 이의 제조방법이 제공된다. 상기 항암용 조성물은 기존의 화학치료제가 가지고 있던 문제점인 부작용 내지 독성의 위험에 대한 우려가 없을 뿐만 아니라, 핵막 단백질인 BAF를 인산화시켜 세포분열 기간에 핵막의 분해와 재형성에 중요한 역할을 수행하여 종양 형성 및/또는 발달에 결정적인 영향을 하는, VRK1 인산화 효소에 의한 BAF 인산화를 특이적으로 저해할 수 있어, 효과적인 표적화 항암치료 용도로 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1f는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 후박 추출물, 및 이의 분획물의 VRK1 효소활성 저해 능력을 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리, 동정된 각 단일 활성성분의 VRK1 효소활성 저해 능력 및 BAF에 대한 특이적 저해 여부를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 종양동물 모델에서 항암능력을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 2a 내지 도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따라 분리, 동정된 각 단일 활성성분의 VRK1 효소활성 저해 능력 및 BAF에 대한 특이적 저해 여부를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 3a 및 3b는 종양동물 모델에서 항암능력을 평가한 결과를 나타낸 것이다.
이하 본 발명의 이해를 돕기 위해 바람직한 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예
1. 후박 추출물 및
분획물의
제조 및 효소활성 저해 능력 측정
1.1 실험방법
국내산 후박 (Machilus thunbergii) 20 kg을 분쇄한 후, 80%(v/v) 메탄올(MeOH) 80L를 가하여 실온에서 24시간 동안 2회 추출한 후 여과지로 여과하였다. 이후 얻어진 여액을 45℃에서 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었다.
얻어진 MeOH 후박 추출물을 다시 극성에 따라 n-헥산(n-hexane), 에틸 아세테이트(EtOAc), 및 n-부탄올(n-BuOH)로 순차적으로 분획하여 n-헥산 분획물, 에틸 아세테이트 분획물, 및 n-부탄올 분획물을 얻었다.
구체적으로 n-헥산 분획물에 대하여 n-헥산-EtOAc 혼합용매의 극성을 높여가며 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) (c.c) 실시하여 13개의 분획물을 얻었다. 에틸 아세테이트 분획물에 대하여 CHCl3-아세톤(acetone) 혼합용매의 극성을 높여가며 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 13개의 분획물을 얻었다. 또한 n-부탄올 분획물에 대하여 CHCl3-아세톤 혼합용매의 극성을 높여가며 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 실시하여 12개의 분획물을 얻었다.
상기 얻어진 분획물에 대해 VRK1(NM_003384) 및 그 기질인 BAF(NM_003860)를 이용하여 in vitro kinase assay(Lopez-Borges S & Lazo PA (2000) The human vaccinia-related kinase 1 (VRK1) phosphorylates threonine-18 within the mdm-2 binding site of the p53 tumour suppressor protein. Oncogene 19(32):3656-3664)를 수행하여 효소활성 저해 능력을 측정하여 도 1a 내지 도 1f에 나타냈다.
구체적으로 각각 500ng의 VRK1 단백질과 500ng의 BAF 단백질을 사용하였으며, 각 분획물은 표시된 농도대로 사용(특별히 표시되지 않은 경우 분획의 1ul)하였다. 30℃에서 반응물 총 20ul의 양(분획물은 1ul)으로 반응을 진행하였으며, (20mM Tris-Cl[pH7.5], 5mM MgCl2, 0.5mM DTT, 150mM KCl, 32P-gamma-ATP)의 조성의 버퍼를 사용하였다. 반응 후 모든 용액은 SDS-PAGE를 통해 분리하고, SYPRO RUBY (Biorad, USA)로 염색하였다.(Kang TH, et al. (2007) Mitotic histone H3 phosphorylation by vaccinia-related kinase 1 in mammalian cells. Mol Cell Biol 27(24):8533-8546)
1.2. 결과
도 1a는 유기용매 n-헥산(n-hexane), 에틸 아세테이트(EtOAc), 및 n-부탄올(n-BuOH) 각각에 의해 추출된 물질이 효소반응을 얼마나 저해하는지 조사한 것으로서, VRK1에 의한 BAF의 인산화 효소활성 저해 효과는 헥산 분획과 BuOH 분획에서 가장 높게 나타남을 확인할 수 있었다.
도 1b 내지 도 1d는 각 용매의 분획을 더욱 자세히 나누어 효소활성저해능력을 검증한 것으로, 이 중 가장 강한 저해능력을 보이는 헥산 용매를 이용한 9번 10번 분획을 선택하여 좀 더 넓은 범위로 분획을 하였다(도 1e 및 도 1f). 헥산 분획은 가장 강한 효소활성 저해능력을 보일 뿐만 아니라, 일반적으로 헥산에 녹아있는 물질은 세포 투과성이 높은 특성이 있으므로, 후술할 실시예에서는 EtOAC분획과 BuOH분획은 기각하고 헥산 분획을 계속하여 분석하였다.
실시예
2. n-
헥산
분획물로부터
단일 활성성분 분리 및 효소활성 저해 능력 측정
2.1. 단일 활성성분 분리 및 동정
상기 실시예 1에 따라 측정된 분획 중 저해 활성이 특히 좋게 나타난 n-헥산 분획물을 다시 추출하고, 컬럼 크로마토그래피(column chromatography)로 정제하여 범위를 좁혀가며, 단일 성분 분획을 획득하였다.
구체적으로 메탄올 대신 100%(v/v)의 n-헥산을 추출용매로 사용한 것 외에는 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 후박을 추출하여 n-헥산 추출물 151 g을 얻었다. n-hexane 분획 (MTH) 중 50 g에 대하여 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography) (c.c.) (Φ 7.5×12 cm, n-헥산-EtOAc=6:1→acetone)를 실시하여 11개의 분획물 (MTH1~MTH11)을 얻었다. 분획 MTH7+8[1.7 g, Ve/Vt 0.42-0.57]에 대하여 실리카 겔 c.c. (Φ 4.5×15 cm, CHCl3-acetone=100:1)를 실시하여 11개의 분획물 (MTH7+8-1~MTH7+8-11)을 얻었다. 소분획 MTH7+8-4 (1.3 g, Ve/Vt 0.10-0.35)를 ODS c.c. (Φ 4×6 cm, MeOH-H2O=9:1→10:1→12:1)로 정제하여 13개의 분획물(MTH7+8-4-1~MTH7+8-4-13)을 얻었고, 이 중 효소 저해 능력이 뛰어난 분획을 정제하여 하기 화학식 1, 2, 3으로 표시되는 3가지의 단일 분자를 분리 및 동정하였다.
상기 분리된 단일 분자의 양은 각각 화학식 1의 화합물 136 mg, 화학식 2의 화합물 20 mg, 화학식 3의 화합물 105 mg(추출물 중량 대비 각각 0.09 중량%, 0.013 중량 %, 및 0.07 중량 %)이었다.
각 화합물의 화학구조는 NMR, MS 및 IR 등의 스펙트럼 데이터를 해석하였으며, 이들은 부타놀리드(Butanolide)의 화학구조로 (3Z,4S)-3-(7Z)-7-헥사데센-1-일리덴디히드로-4-히드록시-5-메틸렌-2(3H)-퓨라논((3Z,4S)-3-(7Z)-7-hexadecen-1-ylidenedihydro-4-hydroxy-5-methylene-2(3H)-Furanone)(화학식 1), (2E)-메틸 에스테르-2-[(1S)-1-히드록시-2-옥소프로필]-2-옥타데센산((2E)-methyl ester-2-[(1S)-1-hydroxy-2-oxopropyl]-2-Octadecenoic acid)(화학식 2), (3Z,4S)-3-헥사데실리덴디히드로-4-히드록시-5-메틸렌-2(3H)-퓨라논((3Z,4S)-3-hexadecylidenedihydro-4-hydroxy-5-methylene-2(3H)-Furanone)(화학식 3)로 동정 하였다.
[화학식 1]
(3Z,4S)-3-(7Z)-7-헥사데센-1-일리덴디히드로-4-히드록시-5-메틸렌-2(3H)-퓨라논
분자식: C21H34O3
분자량 : 334.49
50.0 mg, TLC (ODS F254) Rf 0.26, MeOH-H2O=13:1
oil. IR (KBr, cm-1): 3425, 3000, 1780, 1680, 850; EI/MS m/z : 335 [M+H]＋, 334[M]＋, 317[M+H-H2O]＋, 291[M-43]＋, 179, 177, 140, 135, 126, 123, 109, 97, 95, 83, 81, 79, 70, 69, 67, 57, 55, 43, 41; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3,, δ): 6.69 (1H, td, J=8.0, 2.0 Hz, H-7), 5.35(2H, m, H-12), 5.35(2H, m, H-13), 5.12 (1H, br s, H-3), 4.89 (1H, dd, J=3.5, 2.0 Hz, H-5b), 4.68 (1H, dd, J=3.0, 1.0 Hz, H-5a), 2.78 (2H, m, H-7), 2.03 (2H, m, H-11), 2.03 (2H, m, H-14), 1.50 (2H, q, J=7.0 Hz, H-8), 0.90 (3H, br t, J=7.0 Hz, H-21); 13C-NMR (500 MHz, CDCl3,, δ): 165.3 (C-1), 157.6 (C-4), 151.2 (C-6), 130.2 (C-13), 129.4 (C-12), 126.9 (C-2), 90.2 (C-5), 68.8 (C-3), 31.9 (C-19), 28.3 (C-8), 27.2 (C-14), 27.0 (C-11), 22.7 (C-20), 14.1 (C-21)
(2E)-메틸 에스테르-2-[(1S)-1-히드록시-2-옥소프로필]-2-옥타데센산
분자식 : C22H40O4
분자량 : 368.55
Colorless crystals, mp 45.5-46.5℃; IR (KBr, cm-1): 3500, 3450, 1720, 1700, 1640; EI/MS m/z : 369[M+H]＋, 326[M+H-Ac]＋, 325[M-Ac]＋, 321[M-74]＋, 293[M-75]＋, 140, 125, 115, 111, 109, 97, 95, 83, 70, 69, 57, 55, 43; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3,, δ): 7.09 (1H, td, J=7.6 Hz, H-6), 4.92 (1H, br d, H-3), 3.75 (3H, s, OMe), 2.37 (2H, td, J=7.5, 7.5 Hz, H-7), 2.17 (3H, s, H-5), 1.54 (2H, q, J=7.5 Hz, H-8), 0.89 (3H, br t, J=7.0 Hz, H-23); 13C-NMR (500 MHz, CDCl3,, δ): 206.3 (C-4), 166.5 (C-1), 149.1 (C-6), 129.8 (C-2), 73.4 (C-3), 52.0 (C-OMe), 31.9 (C-19), 28.7 (C-8), 24.8 (C-5), 22.7 (C-20), 14.1 (C-21)
[화학식 3]
(3Z,4S)-3-헥사데실리덴디히드로-4-히드록시-5-메틸렌-2(3H)-퓨라논
분자식 : C21H36O3
분자량 : 336.51
35.0 mg, TLC (ODS F254) Rf 0.19, MeOH-H2O=15:1
crystals. IR (KBr, cm-1): 3425, 1770, 1750, 1660, 850; EI/MS m/z : 337 [M+H]＋, 336[M]＋, 319[M+H-H2O]＋, 293[M-43]＋, 140, 135, 126, 123, 109, 97, 95, 83, 81, 79, 70, 69, 67, 57, 55, 43, 41; 1H-NMR (500 MHz, CDCl3,, δ): 6.69 (1H, td, J=8.0, 2.0 Hz, H-6), 5.12 (1H, br d, H-3), 4.89 (1H, dd, J=3.0, 2.0 Hz, H-5b), 4.68 (1H, dd, J=3.0, 1.0 Hz, H-5a), 2.78 (2H, m, H-7), 1.49 (2H, q, J=7.0 Hz, H-8), 0.89 (3H, br t, J=7.0 Hz, H-21); 13C-NMR (500 MHz, CDCl3,, δ): 165.3 (C-1), 157.6 (C-4), 151.3 (C-6), 126.8 (C-2), 90.3 (C-5), 68.9 (C-3), 31.9 (C-19), 28.3 (C-8), 14.1 (C-21)
2.2. 효소활성 저해 능력 측정
상기 얻어진 각 단일 분자에 대해 상기 실시예 1과 동일한 방법(in vitro kinase assay)으로 효소활성 저해 능력을 측정하여 도 2a에 나타냈다.
도 2a에 나타난 결과에서 알 수 있듯이, 화학식 1의 화합물이 가장 우수한 효소활성 저해 능력을 나타냈다. 이처럼 화학식 1 내지 3의 화합물 중 가장 강한 효능을 보이는 화학식 1의 화합물을 선택하여 농도에 따른 효소활성 저해 효과를 확인하기 위하여 최종 농도를 달리 하면서 상술한 것과 동일한 방법으로 효소활성 저해 능력을 측정한 결과, IC50이 약 0.8μM로 나타나 VRK1의 BAF에 대한 효소활성 저해 능력이 매우 뛰어남을 확인할 수 있었다(도 2b).
또한 화학식 1의 화합물과 다른 화합물(화학식 2 및 3)의 농도별 효소활성 저해 능력을 비교한 결과, 화학식 2의 화합물은 효소활성 저해 활성이 매우 낮게 나타난 반면, 화학식 1의 화합물의 IC50은 상술한 바와 같이 약 0.8μM로 나타났고, 화학식 3의 화합물 또한 화학식 1의 화합물보다는 효과가 낮았지만 역시 효소활성 저해 활성이 있음을 확인할 수 있었다 (도 2c)
2.3.
VRK1
의
BAF
에 대한 인산화를 특이적으로 저해하는지 여부 실험
이러한 VRK1의 저해능력이 효소에 작용하는지 혹은 기질에 특이적인지를 알아보기 위해, VRK1의 또 다른 기질인 히스톤 H3(hH3)(Accession no. BC095447), 및 카세인(casein)(Sigma C5890)에 대한 효소활성 저해 능력을 상기 실시예 1과 동일한 방법으로 측정하였다.
도 2d 및 2e에 나타난 바와 같이, 화학식 1의 화합물은 BAF를 사용한 실험에서 나타난 결과(도 2b)와는 달리, 히스톤 H3 및 카세인에 대한 효소활성은 거의 저해하지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 상기 화학식 1의 화합물은 VRK1의 효소활성 자체에 대한 저해가 아닌 VRK1에 의한 BAF 인산화 반응만을 특이적으로 저해한다는 점을 알 수 있었다.
실시예
3. 종양동물 모델에서 항암 능력 평가
3.1. 실험방법
상기 화학식 1의 화합물이 종양모델에서 실제로 항암능력을 발휘하는지를 검증하기 위해 6 주령의 c57BL/6 암컷 마우스 (각 실험별 3마리씩)에 동종 유래의 B16F10 세포 (1.0 x 105)(한국세포주은행-cat no. 80008)를 피하주사하여 흑색종을 발달시켰다. 이후 흑색종이 발달된 마우스에 화학식 1의 화합물을 각각 농도를 달리하여(10mg/kg, 20mg/kg, 40mg/kg) 100ul씩 일주일 간격으로 총 3회 직접 주사한 후, 결과를 관찰하여 도 3a(농도에 따른 종양 감소 정도를 측정한 사진) 및 도 3b(농도별 처리군의 종양을 적출하여 측정된 종양의 중량(g))에 나타내었다.(Choi BH et al., Cancer Lett. 2008 Mar 8;261(1):37-45. Epub 2007 Dec 26. 참조)
3.2. 결과
도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, 아무런 처리를 하지 않고 용매(PBS에 10%(w/v) DMSO가 함유된 것)만을 사용한 대조군과 비교하여 화학식 1의 화합물을 처리한 실험군은 모두 종양의 크기가 유의적으로 감소하였음을 확인할 수 있었다. 또한 이러한 종양 감소 효과는 화합물의 처리 농도에 의존적으로 나타났으며, 특히 40mg/kg으로 처리한 실험군의 경우 대조군의 종양의 중량이 약 0.55g로 나타난 것에 반해 약 0.05g에 불과한 것으로 나타나, 대조군에 비해 무려 약 1/11배로 종양의 중량이 감소되는 현저한 효과를 나타냈다.
이처럼 화학식 1의 화합물은 항암 능력이 매우 뛰어남을 확인할 수 있어 항암용 조성물로 효과적으로 사용될 수 있다.
Claims (7)
- 하기 화학식 1의 화합물을 유효성분으로 포함하는 항암용 조성물.
[화학식 1]
- 제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은, VRK1의 기질인 BAF의 인산화 억제를 통해 암의 형성 또는 발달을 저해하는 것인 항암용 조성물.
- 제1항에 있어서,
상기 화학식 1의 화합물은 후박 추출물로부터 분리한 것인 항암용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 항암용 조성물은 화학식 1의 화합물을 전체 조성물의 중량을 기준으로 0.0001~99.9 중량%로 포함하는 것인 항암용 조성물.
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