KR101372833B1 - 탄게레틴을 함유하는 혈관 질환의 치료 또는 예방용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 탄게레틴(tangeretin)을 유효성분으로 함유하는 평활근 세포의 증식 또는 이동 억제 효과가 있는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증, 뇌경색, 뇌출혈, 및, 뇌졸중 등과 같은 혈관 질환을 예방 및 치료할 수 있으며, 상기 질병들을 개선할 수 있는 다양한 치료제에도 유용하게 응용될 수 있다.

Description

탄게레틴을 함유하는 혈관 질환의 치료 또는 예방용 조성물 {Composition comprising tangeretin for treating or preventing vascular disease}

본 발명은 혈관 평활근 세포의 증식 또는 이동을 억제하는 효과가 있는 탄게레틴(tangeretin)을 함유하는 혈관 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

비정상적인 혈관 평활근 세포(vascular smooth muscle cells, VSMCs)의 증식과 이동은 동맥경화증이나 혈관재협착증과 같은 혈관 질환의 원인이 된다(Ross, R., Mechanisms of atherosclerosis - a review. Adv. Nephrol. Necker Hosp., 1990, 19, 79-86; Schwartz, S.M., Smooth muscle migration in atherosclerosis and restenosis. J. Clin. Invest., 1997, 100, 87-89). 혈관 평활근 세포에서의 상처나 만성염증에 대한 반응으로서, 이에 대한 면역 반응을 복원시키기 위해 대식세포와 T 임파구가 상처나 염증반응이 일어난 곳에 모이게 되면, 이러한 면역 반응들이 혈관 평활근 세포의 증식과 이동을 자극하게 된다(Ross, R., Atherosclerosis - an inflammatory disease. 1999, N. Engl. J. Med., 340, 115-126). 혈관 중막(medial layer)에 위치한 혈관 평활근 세포는 수축성을 갖고 있다고 알려져 있지만(Ross, R., The pathogenesis of atherosclerosis : a perspective for the 1990s. 1993, Nature, 362, 801-809) 상기 혈관 평활근 세포가 혈관 내막으로 이동한 후에는, 혈관 평활근 세포는 혈관의 수축성을 조절하는 기능을 잃고, 내혈관에 쌓이게 되며, 이러한 현상은 다양한 혈관 질환을 발생시키는 것으로 알려져 있다.

혈관 질환의 발달과 진행은 다양한 사이토카인(cytokines)과 성장인자(growth factors)로부터 유도된다(Sachinidis, A. et al ., Different effects of plateletderived growth factor isoforms on rat vascular smooth muscle cells. J. Biol. Chem., 1990, 265, 10238-10243). PDGF(platelet-derived growth factor)는 PDGF-A, PDGF-B, PDGF-C, PDGF-D의 4개의 유전자로 구성될 수 있으며 혈관 평활근 세포를 위한 가장 강력한 화학주성인자(化學走性因子, chemoattractant)이다. 상기 PDGF 중에서, 단지 PDGF-BB만이 동형이량체(homodimer), 이형이량체(heterodimer) 타입의 모든 수용체(PDGFR-αα, PDGFR-αβ, PDGFR-ββ)에 결합할 수 있다. PDGF-BB가 PDGFR-α나 PDGFR-β 체인(chains)에 결합하게 되면 PDGF-R의 인산화가 유도되고 PI3K/AKT, PLCγ, MAPKs 같은 신호전달을 활성화하게 된다(Heldin, C.H., Ostman, A., Ronnstrand, L., Signal transduction via platelet-derived growth factor receptors. Biochim. Biophys. Acta, 1998, 1378, 79-113.). AKT는 PI3K의 하위 신호전달의 타겟으로서, 다양한 타입의 세포에 있어서 세포이동, 증식, 항-아폽토시스 등에 굉장히 중요한 역할을 하며, MAPK 신호전달은 동물세포의 증식, 이동, 생존의 조절에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

혈관 평활근 세포의 증식을 억제하는 것에 있어서, 세포주기의 조절도 중요한 관건이라고 할 수 있다. 일반적으로, 동물 세포의 증식은 복합적이면서도 순차적인 세포주기(cell cycle)의 통제를 받는다(Sherr, C.J., Cancer cell cycles. Science, 1996, 274, 1672-1677). CDK(cyclin-dependent kinases)의 활성은 사이클린 조절 서브유닛(cyclin regulatory subunits)에 의해 조절된다. 이들은 효소활성을 가진 CDK 서브유닛으로 구성된 복합체를 형성하고, 이것은 세포주기의 특정 구간에서 조절된다. 많은 세포에서 G₁구간에서 S구간으로 들어가는 것은 사이클린 D/CDK4(cyclin D/CDK4)나 사이클린 E/CDK2(cyclin E/CDK2)와 같은 사이클린/CDK 복합체(cyclin/CDK complexes)의 결합 및 활성이 요구된다. 이러한 사이클린/CDK 복합체의 카이네이즈(kinase) 활성은 CKI(cyclin-dependent kinase inhibitors)에 의해 억제된다. 상기 CKI 중에서 INK4 패밀리(INK4 family, p16INK4a 및 p15INK4b)는 단지 CDK4와 CDK6만을 저해하지만, Cip 패밀리(Cip family, p21cip1 및 p27kip1)는 모든 CDK를 억제하는 것으로 알려져 있다.

감귤류(Citrus)의 플라보노이드(flavonoids)는 만성심질환(coronary heart disease)에 넓은 생물학적 활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Benavente-Garcia, O., Castillo, J., Update on uses and properties of citrus flavonoids : new findings in anticancer, cardiovascular, and anti-inflammatory activity. J. Agric. Food Chem., 2008, 56, 6185-6205). 탄게레틴(tangeretin)은 PMF(polymethoxylated flavones)로서, 감귤류 나무 열매의 껍질에 주로 농축되어 있는 플라보노이드이며, 항암활성 및 항산화 활성이 있다고 알려져 있다. 그러나, 혈관 평활근 세포에서의 탄게레틴이 갖는 활성은 아직 알려져 있지 않은 바, 본 발명자는 탄게레틴이 PDGF-BB(platelet-derived growth factor BB)로 인해 유도되는 혈관 평활근 세포의 증식 또는 이동을 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 혈관 평활근 세포의 증식 또는 이동을 억제하는 효과가 있는 탄게레틴을 함유하는 혈관 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 하기 화학식 1의 탄게레틴을 함유하는 혈관 질환의 치료 또는 예방용 조성물에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화학식 1의 화합물 탄게레틴은 혈관 평활근 세포의 증식 또는 이동을 억제하는 효과가 있는 것을 특징으로 한다.

상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증, 뇌경색, 뇌출혈, 및, 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물로 이용될 수 있다.

상기 화학식 1로 표시되는 탄게레틴 화합물은 진피(Aurantii nobilis Pericarpium, 감귤류 열매의 껍질을 말린 생약)를, 물, 유기용매(알코올, 알코올수용액, 에틸아세테이트, 에테르, 아세톤, 클로로포름 등), 또는 물과 유기용매의 혼합용매에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 디아이온 HP-20 레진과 같은 흡착수지 사용방법, 칼럼 크로마토그래피에 의한 방법 등 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수 있다.

또한, 상기 화학식 1로 표시되는 본 발명의 화합물은 당해 기술 분야에서 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있으며, 약학적으로 허용 가능한 염으로 제조될 수 있다.

본 발명은 상기 화학식 1의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 함유하는 혈관 질환의 예방 또는 치료를 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상기 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 화합물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수 회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 화합물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 탄게레틴(tangeretin)을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 평활근 세포의 증식 또는 이동 억제 효과가 뛰어났으며, 이로 인해, 동맥경화증, 고혈압, 협심증, 심근경색, 허혈성 심장질환, 심부전, 경혈관 동맥 성형술 후 발생하는 합병증, 뇌경색, 뇌출혈, 및, 뇌졸중 등과 같은 혈관 질환을 치료하거나 개선할 수 있는 다양한 의약품에 유용하게 응용될 것으로 사료된다.

도 1은 탄게레틴이 PDGF-BB로 유도된 렛드 대동맥의 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 확인하기 위해 세포 수를 측정한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 탄게레틴이 DNA 합성을 억제하여 PDGF-BB로 유도된 렛드 대동맥의 평활근 세포의 증식을 억제하는 것을 확인하기 위해 BrdU 삽입 정도를 확인한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 3은 탄게레틴이 PDGF-BB로 유도된 렛드 대동맥의 평활근 세포의 이동을 억제하는 것을 확인하기 위해 상처 치료 어세이(도 3A)와 보이덴 챔버 어세이(도 3B)를 수행한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 FACS 분석법을 이용하여 탄게레틴이 렛드 대동맥의 평활근 세포의 세포 주기를 조절하는 것을 확인한 결과이다.
도 5는 Annexin-V와 PI의 이중 염색 어세이를 이용하여 탄게레틴이 렛드 대동맥의 평활근 세포의 세포 사멸 또는 괴사를 유도하지 않음을 확인한 결과이다.

< 실시예 1. 렛드 대동맥의 평활근 세포의 분리 및 배양>

렛드 대동맥의 평활근 세포(RASMC, rat aortic smooth muscle cells)는 10~12주령의 웅성 SD(Spraque-Dawley) 렛드의 복부 동맥 위쪽 부분으로부터 [Wang, Y. et al ., Mast cell granule remnants carry LDL into smooth muscle cells of synthetic phenotype and induce their conversion into foam cells. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol., 1995, 15, 801-810]에 개시된 방법을 변형하여 추출하였다. 마취된 렛드로부터 적출된 대동맥을 2mm 두께로 잘라 콜라게네이즈(type II collagenase, 1mg/㎖, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 1시간 동안 처리하여 내피세포(endothelial cells)를 제거하였고, 이를 세포 배양 배지로 세척하였다. 내피세포가 제거된 대동맥 조직들은 0.1% 젤라틴으로 코팅된 배양접시에서 10일간 세포 배양 배지로 배양하였다. 상기 내피세포를 제거한 후 남은 세포는 알파 평활근 액틴(α-smooth muscle actin)의 면역염색법(immunocytochemical staining)을 이용하여 95% 이상이 렛드 대동맥의 평활근 세포임을 확인하였다.

이 후, 5~9번째 계대(passages) 배양된 렛드 대동맥의 평활근 세포를 본 실험에 이용하였으며, 10% FBS(fetal bovine serum), 100U/㎖ 페니실린, 100μg/㎖ 스트렙토마이신이 포함된 DMEM(Dulbeco's Modified Eagle Medium) 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂ 조건의 흡윤 배양기에서 상기 세포를 배양하였다.

< 실시예 2. 탄게레틴의 분리 및 물리화학적 성질 확인>

탄게레틴(tangeretin, 5,6,7,8,4′-pentamethoxyflavone)을 분리정제하기 위해, 건조된 진피(Aurantii nobilis Pericarpium) 3kg을 잘게 분쇄한 후, 에탄올 10ℓ에 7일 동안 실온에서 추출한 후 상기 에탄올 추출물을 왓트만 용지(Whatman paper, No. 1)로 거르고, 진공상태에서 감압 증류하여 용매를 제거하여 에탄올 잔류물 560g을 획득하였다. 상기 잔류물을 다시 증류수 3.0ℓ에 현탁한 후, 다시 n-헥산(1000㎖)으로 2회 추출하였다. 그 후 클로로포름(1000㎖, 2회)으로 추출하여, 280g의 헥산 분획물, 15g의 클로로포름 분획물을 얻었다. 클로로포름 분획물 1.2g은 헥산과 에틸 아세테이트의 농도 구배(10:0-0:10 부피비)를 이용한 용출 용매를 이용하여 실리카겔(15g, Merck silica 230-400 mesh) 크로마토그래피를 시행하여 9개의 소분획물을 얻었다. 상기 소분획물 중 다섯 번째 분획물을 HPLC(high-performance liquid chromatography; YMC Pack Pro C18 column, 250 x 20mm, 70% acetonitrile in H₂O)를 실시하여 12mg의 탄게레틴을 얻었다. 분리된 탄게레틴은 HPLC를 통해 순도 98% 이상임을 확인하였다.

탄게레틴(tangeretin) : light yellow needles;

C₂₀H₂₀O₇ ; mp 153-154℃ ; IR γ _max (KBrcm¹) : 2947.0, 2842.2, 1650.7, 1608.1, 1586.7, 1513.5, 1462.6, 1362.1, 1264.8, 1110.7, 1074.4, 1016.3, 830.5; ¹H NMR (500 Hz, CDCl₃) δ : 7.88 (2H, d, J=8.8, H-2, 6), 7.02 (2H, d, J = 8.5, H-3, 5), 6.62 (1H, s, H-3), 4.11, 4.03, 3.89 (3H, s, OMe), 3.96 (6H, s, 2×OCH3) ; ¹³C NMR (500 MHz, CDCl₃) δ : 177.4 (C-4), 162.4 (C-4), 161.3 (C-2), 151.4 (C-7), 148.4 (C-5), 147.8 (C-9), 144.1 (C-6), 138.1 (C-8), 127.8 (C-2, 6), 123.8 (C-1), 114.9 (C-10), 114.6 (C-3,5), 106.7 (C-3), 62.3, 62.1, 61.9, 61.7, 55.6 (5×OMe).

< 실시예 3. 탄게레틴의 평활근 세포의 증식 억제 효과 확인 - 세포 수 측정>

렛드 대동맥 평활근 세포의 증식은 세포 수 측정으로 확인하였다. 상기 렛드 대동맥 평활근 세포는 12웰 배양 플레이트의 각 웰에 4×10⁴세포/㎖로 분주되었고, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양 플레이트에 세포가 70% 정도 채워지면 상기 세포를 24시간 동안 FBS가 없는 배지에서 배양한 후, 새로운 FBS가 없는 배지에서 다양한 농도(1~30μM)의 탄게레틴을 30분간 처리하였으며, PDGF-BB(40ng/㎖)를 처리하여 24시간 동안 세포 증식을 자극하였다. 이 후, 상기 세포에 트립신(trypsin)을 처리하고 헤모사이토미터(hemocytometer)와 현미경을 이용해 세포 수를 측정하였으며, 이에 대한 결과를 도 1에 나타내었다. 탄게레틴은 DMSO(dimethyl sulfoxide)로 녹여서 사용하였으며, 상기 DMSO의 최종 농도는 세포배지에서 0.05%가 넘지 않도록 하였다. 대조군(PDGF-BB와 탄게레틴의 무처리군)에는 PDGF-BB 대신 0.2% BSA가 처리되었고, 탄게레틴 대신 DMSO가 처리되었다. 또한, 탄게레틴이 없는 처리군에는 PDGF-BB와 DMSO를 처리하였다. 상기 PDGF-BB, 탄게레틴, 0.2% BSA, DMSO는 FBS가 없는 배양배지에 처리되었다. 이 후의 실시예에서 대조군은 상기 조건으로 처리하였다. PDGF-BB는 PBS(phosphate buffered saline)에 녹여서 사용하였다.

도 1을 참고하면, PDGF-BB만을 단독으로 처리했을 때는 렛드 대동맥의 평활근 세포의 수가 PDGF-BB 무처리군보다 급격히 증가되어 있었지만, 탄게레틴의 처리로 인해 탄게레틴의 농도별로 세포 수 증식이 현저하게 억제되는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 4. 탄게레틴의 평활근 세포의 증식 억제 효과 확인 - BrdU 삽입 확인>

렛드 대동맥의 평활근 세포에서의 DNA 합성에 대한 탄게레틴의 효과를 확인하기 위해 BrdU(bromodeoxyuridine, thymidine analogue) 증식 어세이 키트(BrdU proliferation assay kit, Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하였다.

실시예 3과 동일하게 렛드 대동맥 평활근 세포에 다양한 농도(1~30μM)의 탄게레틴을 30분간 처리한 후 PDGF-BB(40ng/㎖)를 처리하여 24시간 동안 세포 증식을 자극하였다. 이 후, BrdU를 4시간 동안 반응시킨 뒤, 항체(anti-BrdU-peroxidase)를 처리하였고, 상기 BrdU와 항체의 면역 복합체에 트리메틸 벤지딘 기질(trimethyl benzidine substrate)을 처리한 후, ELISA(enzyme-linked immunospecific assay) 측정기를 이용해 450nm에서 상기 복합체에 대한 흡광도를 측정하였으며, 이를 도 2에 나타내었다. 세포의 DNA 합성 및 세포 증식 정도는 BrdU의 삽입 정도에 따라 비교 분석되었다.

도 2의 결과를 참고하면, 실시예 3에서의 세포 수 측정 결과에서와 마찬가지로, PDGF-BB만을 처리한 렛드 대동맥의 평활근 세포는 PDGF-BB 무처리군보다 BrdU의 삽입 정도가 활발하여, 세포 증식으로 인한 DNA 합성이 활발한 것으로 확인되었으며, 탄게레틴의 처리 농도가 증가할수록 렛드 대동맥의 평활근 세포의 증식이 현저하게 억제됨을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5. 탄게레틴의 세포 이동 억제 효과 확인>

세포이동의 측정은 상처 치료 어세이(wound healing assay)와 보이덴 챔버 어세이(Boyden chamber assay)를 통해 확인하였다.

상처 치료 어세이(wound healing assay)는 [Choi, K.H. et al., Phosphoinositide 3-kinase is a novel target of piceatannol for inhibiting PDGF-BB-induced proliferation and migration in human aortic smooth muscle cells. Cardiovasc. Res., 2010, 85, 836-844]에 개시된 방법을 이용하였다. 렛드 대동맥의 평활근 세포가 배양접시에서 가득 차도록 자라게 되면, 2mm 팁(tip)을 이용하여 세포를 일부 긁어냈다. 이 후, PDGF-BB(40ng/㎖)를 단독으로 또는 탄게레틴과 함께 처리하였다. 24시간 후에 세포의 이동을 현미경(×100 magnifications)을 통해 확인하였다.

보이덴 챔버 어세이는 [Hwangbo, C. et al., Activation of the integrin effector kinase focal adhesion kinase in cancer cells is regulated by crosstalk between protein kinase Cα and the PDZ adapter protein mda-9/syntenin. Cancer Res., 2010, 70, 1645-1655]에 개시된 방법을 이용하였으며, 이를 위해 보이덴 챔버의 각 웰당 3×10⁴개의 농도로 세포를 분주하여 챔버의 위쪽에 두었다. PDGF-BB(40ng/㎖)와 각각의 화합물들은 농도별로 챔버의 아래쪽 부분에 두었다. 챔버는 37℃의 5% CO₂ 흡윤 배양기에 4시간 동안 두었으며, 4시간 후에, 필터의 아래쪽 부분으로 이동된 세포를 메탄올로 고정하였고, 이를 염색한 후 현미경(×100 magnification)을 이용하여, 각 필터에서의 세포 수를 확인하였다.

상기 결과는 도 3에 나타내었는데, 도 3A는 상처 치료 어세이 결과를 나타낸 것이며, 도 3B는 보이덴 챔버 어세이 결과를 나타낸 것으로, 두가지 어세이에서 모두, PDGF-BB만을 처리한 렛드 대동맥의 평활근 세포는 PDGF-BB 무처리군보다 세포 이동 정도가 현저하게 증가하였음을 확인할 수 있으며, 탄게레틴의 처리 농도별로 세포 이동 정도가 급격하게 억제됨을 알 수 있었다.

< 실시예 6. 탄게레틴의 세포 주기 억제 효과 확인>

탄게레틴이 세포 주기를 억제하는 것을 확인하기 위해, FACS(fluorescence-activated cell sorting) 분석법을 이용하였다. 이에 대한 세포 처리 조건은 실시예 3의 세포 증식 어세이와 동일하게 수행하였다. 이를 위해, 탄게레틴과 PDGF-BB가 처리된 세포에 트립신 처리를 하고, 차가운 PBS로 두 번 세척한 후, 원심분리하였다. 상기 원심분리를 통해 모여진 세포는 70%(v/v) 에탄올에 1시간 동안 두었고(4℃), PBS로 세척하였다. 이 후, 차가운 RNase A(0.1mg/㎖, in PBS, pH 7.4)가 포함된 PI(propidium iodide) 용액(50μg/㎖)을 암실에서 30분간 반응시켰으며, 상기 세포의 PI 염색 상태를 FACS 칼리버(Fluorescence Activated Cell Sorting Calibur, Becton & Dickinson Co., USA)를 이용하여 분석하였고, 이를 위한 분석은 Cell Quest software(Becton-Dickinson)를 이용하였으며 상기 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4를 참고하면, PDGF-BB만을 처리한 렛드 대동맥의 평활근 세포는 PDGF-BB 무처리군보다 DNA 합성 단계인 S주기 상태의 세포가 현저하게 증가하였고, 성장 정체 상태인 G₀/G₁ 주기 상태의 세포수가 줄어들어 있음을 확인할 수 있으며, 탄게레틴의 처리 농도별로 다시 S주기의 세포가 줄어들고 G₀/G₁ 주기 상태의 세포수가 늘어남을 알 수 있었다. 즉, 상기 결과를 통해서도, 탄게레틴이 PDGF-BB로 유도되는 세포 증식을 억제한다는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 7. 죽은 세포의 확인 - 아넥신 -V와 PI 의 이중 염색 어세이 >

탄게레틴이 아폽토시스(apoptosis) 상태나 세포괴사를 유도하는지를 확인하기 위해 죽은 상태의 세포를 확인할 수 있는 PI(propidium iodide)와 아넥신-V(annexin-V)에 대한 이중 염색 어세이(double staining assay)를 수행하였다. 이를 위한 실험은 아넥신-V-FLUOS 염색 키트(Annexin-V-FLUOS staining kit, BD Biosicences, San Jose, CA, USA)를 이용하여 수행하였다. 먼저, 렛드 대동맥 평활근 세포에 다양한 농도의 탄게레틴을 처리하여 30분간 전배양 한 후, PDGF-BB(40ng/㎖)를 24시간 동안 처리하여 배양하였다. 이 후, 트립신 처리하여 PBS로 세포를 세척하고 100㎕의 결합 버퍼(binding buffer)에 세포를 현탁한 후, 5㎕의 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 표지된 annexin-V(FITC-labeled annexin-V)와 5㎕의 PI(50μg/㎖의 원액 사용)를 실온의 암실에서 15~25분간 반응시켰다. 이 후 상기 렛드 대동맥 평활근 세포를 FACS 칼리버로 분석하였다. 세포의 상태는 아넥신-V^-/PI^-(살아있는 세포, living cells), 아넥신-V⁺/PI^-(아폽토시스 상태의 세포, apoptotic cells), 아넥신-V⁺/PI⁺(괴사된 상태의 세포, necrotic cells)로 분류하였고 이를 도 5에 나타내었다.

도 5의 결과를 참고하면, 대부분의 세포가 아넥신-V^-/PI^-(살아있는 세포, living cells, 도 5A) 상태임을 확인할 수 있었으며, 아넥신-V⁺ 상태의 세포가 5% 미만으로 거의 나타나지 않음을 알 수 있었다(도 5B). 상기 도 5의 결과와 도 4의 결과를 통해서, 탄게레틴이 혈관 평활근 세포를 사멸시키는 것이 아닌, 세포 주기를 G₀/G₁ 상태로 유지시켜 세포의 증식을 억제하는 것이라고 유추할 수 있었다.

< 실시예 8. 독성실험>

8-1. 급성독성

본 발명의 화합물 탄게레틴을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 20마리를 대조군은 10마리, 실험군은 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 아무것도 투여하지 않았으며, 실험군은 탄게레틴을 2.0g/㎏(일반적인 동물실험에서 사용되는 양의 50배 정도)의 농도로 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 2.0g/㎏ 농도의 탄게레틴을 투여한 실험군은 모두 생존하였다.

8-2. 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 탄게레틴을 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

< 사용예 1. 약학적 제제예 >

1-1. 정제의 제조

본 발명의 화합물 탄게레틴 20g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

1-2. 주사액제의 제조

본 발명의 화합물 탄게레틴 0.5g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

Claims (3)

1. 하기 화학식 1의 구조를 갖는 탄게레틴(tangeretin)을 함유하는 것을 특징으로 하는 혈관재협착증, 고혈압, 및, 뇌졸중으로 이루어진 군에서 선택되는 혈관 질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
   [화학식 1]
   

   
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