KR100500543B1

KR100500543B1 - 다이하이드로 벤조퓨란구조를 골격으로 하는 카이네이즈저해 화합물

Info

Publication number: KR100500543B1
Application number: KR10-2002-0007039A
Authority: KR
Inventors: 양범석; 박호군; 서선희; 이승표; 심선미
Original assignee: 한국과학기술연구원
Priority date: 2002-02-07
Filing date: 2002-02-07
Publication date: 2005-07-12
Also published as: KR20030067161A

Abstract

본 발명은 다이하이드로 벤조퓨란 구조를 골격으로 하는 카이네이즈 저해 화합물에 관한 것이다. 다이하이드로퓨란 구조 및 이와 결합된 수소결합을 제공하는 작용기를 가지는 페놀 구조를 가진 화합물은 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 활성을 저해하며, DDR2 카이네이즈 효소의 산화적 스트레스에 의한 타이로신 인산화를 저해하여 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 비이상적 과다 활성 증가가 원인으로 알려진 간 경화, 류마티즘, 암, 동맥경화, 건선증등 질병의 치료제로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

다이하이드로 벤조퓨란구조를 골격으로 하는 카이네이즈 저해 화합물{KINASE INHIBITORY COMPOUNDS WITH DIHYDROBENZOFURAN SCAFFOLD}

본 발명은 다이하이드로 벤조퓨란 구조를 골격으로하는 카이네이즈 저해 화합물에 관한 것이다. 다이하이드로 벤조퓨란 구조 및 이와 결합된 하이드록시 페놀 구조를 가진 화합물은 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 활성을 저해하며, DDR2 카이네이즈 효소의 산화적 스트레스에 의한 타이로신 인산화를 저해하여 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 비이상적 과다 활성 증가가 원인으로 알려진 간 경화, 류마티즘, 암, 동맥경화, 건선증등 질병의 치료제로 사용할 수 있다.

세포는 외부의 자극에 대해 끊임없이 반응하면서 그 활성을 나타내고 있다. 그 중 단백질 카이네이즈(protein kinase)의 인산화 효소 활성은 중심적인 역할을 수행하는 것으로 외부의 자극정보를 세포내로 전달하는 신호 전달체계에서 700 여종 이상으로 알려져 있다. 현재 알려진 대부분의 단백질 카이네이즈는 많은 인간 질병에서 비이상적으로 활성화를 나타내고 있으며, 이는 질병 발현의 직·간접적인 원인이 되고 있다. 따라서 카이네이즈 활성을 저해하는 화합물은 질병의 치료제로서의 가치를 가지게 된다.

단백질 카이네이즈는 구조적으로 유사한 토폴로지(Topology)를 가지며, 특징적으로 N-말단의 ATP 부착 도메인과 N-말단과 C-말단 부위사이에서 이루어지는 기질 펩타이드 부착 부위를 형성하는 구조로 이루어져 있다. 단백질 카이네이즈의 효소 작용은 ATP 분자의 감마 위치의 인산 그룹을 떼어내어 이를 단백질의 타이로신(tyrosine) 또는 세린/트레오닌(serine/threonine) 아미노산기의 하이드록실 그룹에 공유 결합을 이루는 화학반응에 촉매반응을 일으킨다. 단백질 카이네이즈의 N-말단의 ATP 부착부위는 대부분의 카이네이즈에서 구조적 유사성을 가지며, 이로인해 ATP와 경쟁적 부착을 통해 카이네이즈 효소 활성을 저해하는 화합물은 1∼10 uM의 IC₅₀를 가지는 선도 화합물 수준에서 여러 카이네이즈에 대한 선택성이 특이적이지 못한 경우가 많으나, 선도 화합물의 화학골격구조를 기반으로 다양한 변형을 통해 특정 단백질 카이네이즈에 대한 선택성이 매우 우수한 화합물을 만들 수 있으며, 이런 점에서 ATP 부착 부위에 부착성을 가지며 단백질 카이네이즈를 저해하는 선도 화합물 골격은 여러 가지의 많은 다른 카이네이즈에 대한 저해제를 만들 수 있는 기본 골격 구조를 제공하기 때문에 매우 유용성이 높다.

세포가 외부 자극을 인지하는 분자 기전 중의 하나는 세포외에 존재하는 특정 리간드에 대해 세포막에 리간드에 특이적으로 결합하는 수용체 단백질이 있고 수용체에 특이적으로 결합한 리간드는 수용체 단백질을 활성화시켜 신호를 세포 내로 전달하는 기전이다. 따라서 일반적으로 이러한 역할을 하는 수용체는 세포 밖에 노출된 세포외 부분과 세포내 사이토졸에 노출된 세포내 부분으로 구분되며, 그 중간은 원형질막을 통과하는 막 통과 부분으로 구성되어 있다. 세포외의 수용체 부분은 특정 리간드가 결합하는 부분이며 세포내 부분은 리간드에 의해 활성화된 수용체의 활성 신호를 세포내로 전달하는 기능을 수행한다. 수용체가 세포외 부분에 리간드가 결합할 때 그 신호를 세포내로 전달하는 분자 기전에는 여러 형태가 알려져 있는데 이중에는 세포 내에 도출된 C-말단 부위에 타이로신 카이네이즈 활성을 가지는 도메인이 존재하여 특정 리간드가 부착되면 수용체 단백질이 단일체에서 이중체로 만들어지면서 그 타이로신 효소 활성이 활성화되면서 이중체 상에서 서로의 C-말단에 있는 타이로신을 인산화한다. 이러한 과정은 세포내로 신호를 전달하는 가장 중요한 과정이 되며, C-말단의 타이로신이 인산화된 수용체는 세포내로 신호를 만들어 내게 된다. 이렇게 원형질막에 존재하며 세포 외부 특정 리간드에 결합하면서 그 C-말단의 타이로신 카이네이즈 활성이 활성화되는 단백질류를 수용체 타이로신 카이네이즈류라고 한다. 지난 20여 년 간 이러한 기작을 가지고 세포외 자극을 세포내로 전달하는 타이로신 카이네이즈 활성을 가지는 수용체가 많이 알려져 왔다. 대표적인 것으로는 EGFR, PDGFR, IR, IGFR, c-fms, VEGFR등이 여기에 속하며, 이중에 VEGFR이나 EGFR의 타이로신 카이네이즈의 ATP 부착 부위에 강하게 결합하여 이들 타이로신 카이네이즈 활성을 저해하는 화합물들은 현재 항암제등 신약으로 매우 유망하게 개발되고 있다.

DDR 타이로신 카이네이즈 수용체류 단백질도 이러한 수용체 타이로신 카이네이즈류중의 하나이다. DDR(Discoidin Domain Receptor)은 미생물에서 발견된 렉틴에 부착되는 단백질인 디스코이딘(Discoidin)과 그 세포외 부위가 유사성이 있는 관계로 이루어졌다. 인간등 동물의 경우 DDR 1 형과 DDR 2 형의 아미노산 서열상 서로 유사성을 가진 단백질이 각각 다른 유전자에 의해 코딩되면서 존재하는 것으로 알려져 있다. 인간에 있어서 DDR 수용체 카이네이즈 유전자의 존재는 90년대 초에 알려져 있었지만 그 기능 연구는 1997년 그 리간드가 파이버 콜라젠이라는 사실이 처음 밝혀져 주목을 끌기 시작하면서 본격화되고 있다.

DDR1과 DDR2의 생체내 역할은 그동안의 연구 발표 내용으로 볼 때 파이브로브라스트 세포의 성장을 조절하는 것이 확인되었다. 특히 DDR2 수용체 카이네이즈의 이상성이 난치성 인간 질병인 간경화증과 연관이 있음을 알 수 있다. 구체적으로 간 경화증은 파이버 콜라젠이 과잉 생산되어 간에 축적되면서 질병이 야기되는 병변으로, 최근 현재 간경화 증상 유발의 주원인으로 지목되는 간 조직내의 간 성상 세포가 활성화되는 과정에서 이 수용체중의 하나인 DDR2의 발현이 증가하며 동시에 크게 활성화되며 또한 이는 간성상 세포의 과잉성장과 콜라젠 분비에 중요한 역할을 한다는 실험결과가 발표되었다. 콜라젠과 연관된 또 다른 질병으로 류마티즘을 들 수 있다. 류마티즘은 지속적으로 연골 부위에 면역 세포가 활성화되어 TNF-alpha와 같은 사이토카인의 분비양이 증가하면서 콜라젠 분해 효소인 MMP-1의 활성이 크게 증가하여 연골 조직이 크게 파괴되는 질병으로, MMP-1 단백질을 주로 발현하는 연골 조직내의 세포는 연골을 감싸고 있는 활막에 존재하는 시노비알 피브로브라스트(synovial fibroblast) 세포이다. 일반적으로 시노비알 피브로브라스트는 정상적인 상황에서는 그 증식과 활성이 잘 통제되어져 있다. 최근 DDR2의 활성 증가에 의해 MMP-1 유전자 발현이 증가함이 발표되어 졌다. 류마티스 환자의 연골 조직에서 추출한 시노비알 피브로브라스트 세포에서 DDR2의 단백질 발현이 관찰되었으며 아울러 시노비알 피브로브라스트에 여러 형태의 콜라젠을 처리하면 MMP-1 promoter 활성이 증가함이 관찰되었다. 이러한 사실은 DDR2의 활성 증가가 류마티즘 병변을 일으키는 주 원인임을 반증한다고 볼 수 있다. DDR류의 타이로신 카이네이즈는 암 세포의 성장과 전이에도 관여함이 보고되어졌다. 일부 암세포에서 이들의 과잉발현이 관찰되었으며 이들의 활성화는 암 세포 성장에 필요하다고 알려진 MMP-1 또는 MMP-2의 발현을 증가시킨다는 연구보고는 이를 설득력 있게 설명한다. 따라서 이들의 활성 저해는 암에 대한 치료 효과를 예상할 수 있다. 또한 DDR류의 타이로신 카이네이즈는 동맥경화증에서 나타나는 혈관세포 주위의 세포성장에 직접적으로 관여함이 밝혀졌는바 이들의 특징적인 저해제는 동맥경화증에서 혈관벽이 좁아지는 현상을 막는 치료제로 사용될 가능성을 보여 준다. 상기에서 기술된 사실을 근거로 하여 특이적으로 DDR2 타이로신 카이네이즈 활성을 저해하는 물질은 간 경화나 류마티즘, 암등의 난치성 질병 치료제로 유용하게 이용될 수 있다고 유추된다.

CDK4/cyclin D1은 세포가 세포 분열시 G1 주기에서 S 주기로 이동하기 위해 필요한 카이네이즈 활성이다. 일반적으로 분열이 정지된 휴지기 상태의 세포내에는 CDK4/cyclin D1 활성이 매우 낮으나, 성장하는 세포에서는 CDK4/cyclin D1 활성이 필수적이며, 따라서 이의 저해는 세포의 성장을 G1 주기에 멈추게 하여 세포 성장을 저해한다. 현재 여러 CDK4/cyclin D1의 ATP 부착 부위에 ATP와 경쟁적으로 부착되며 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 활성을 저해하는 화합물들이 발굴되어 신약으로 개발되고 있다. 그 적용증은 우선 주로 암 세포 성장을 억제하여 항암제로의 사용을 목적으로 하지만 인간 질병 중 세포의 이상증식으로 인한 질병들, 예를 들어 류마티즘, 레스테노시스 등에도 적용될 가능성이 있다.

상기에서 언급된 사실로부터 DDR2나 CDK4/cyclin D1의 ATP 부착 부위에 특이적으로 부착하여 이들 카이네이즈 활성을 저해하는 화합물들은 암, 간경화, 류마티즘, 레스테노시스등 여러 인간 질병의 치료 신약으로 개발될 가치를 충분히 가짐을 알 수 있다. DDR2는 매우 최근에 그 비이상성이 간 경화등 인간 질병에서 관찰됨이 알려졌다. 그러나, 이에 대한 어떤 저해제도 아직 알려진 물질이 없다. 본 발명은 DDR2 카이네이즈 활성에 대한 저해능이 있는 선도 화합물을 천연 화합물군에서 스크리닝하여 발명하여 보여 주었다.

지난 8년간 여러종의 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 활성을 저해하는 화합물로서 아데닌 유도체 계열, 인돌론 유도체 계열, 프레보노이드 유도체 계열등 여러 화합물들이 발명되었다. 그러나 이들 화합물들중 오직 프레보피리돌만이 항암제로서 임상 2상 단계의 임상 실험이 되어지며 나머지 화합물들은 독성등의 문제로 전임상 단계에 머물러 있다. 프레보피리돌을 제외한 다른 CDK4/cyclin D1 저해 화합물들이 심각한 독성을 보이는 이유는 분명하지 않다. 이러한 이유로 새로운 화학구조 골격을 가지는 CDK4/cyclin D1 저해 화합물을 발명하여 전임상, 임상실험을 하는 것이 필요하다.

현재 약 5∼10여종의 단백질 카이네이즈의 ATP 부착 부위를 표적으로 하는 선도 화합물 골격이 주로 카이네이즈 저해 화합물 개발에 사용되고 있다. 그러나 몸안에 약 700여종의 카이네이즈가 있는 점과 전임상과 임상실험에서 저해제의 좋은 개발 결과를 위해서는 더욱 다양한 단백질 카이네이즈 저해 선도 화합물 골격구조의 할용을 통한 저해 화합물 개발이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 다이하드로퓨란 구조 및 이와 결합된 수소결합을 제공하는 작용기를 가지는 페놀 구조를 포함하는 화합물이 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 ATP 부착 부위에 결합함으로서 활성 저해를 나타내며, 특히 DDR2 카이네이즈 효소의 산화적 스트레스에 의한 타이로신 인산화를 저해하여 DDR2 카이네이즈 효소의 활성 저해를 나타냄을 알아내어 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 다이하이드로 벤조퓨란 구조 및 이와 결합된 하이드록시 페놀 구조를 가진 화합물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 또다른 목적은 상기 화합물을 유효성분으로 하는 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 비이상적 활성화로부터 야기되는 질병의 치료제를 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 다이하이드로 벤조퓨란 구조 및 이와 결합된 하이드록시 페놀 구조를 포함하는 하기 화학식 1의 화합물을 제공한다. 상기 식에서, A는 -C(O)-CH=, -C(O)-CH ₂ -, C1 ~ C4 알킬렌 또는 C1 ~ C4 알케닐렌이며; D는 산소, 또는 C1 ~ C4 알킬렌이며, E는 C1 ~ C4 알콕시카보닐기 또는 카복실기이며; Y는 C1 ~ C4 알킬기, 또는 이다.

또한, 본 발명은 상기 화합물을 유효성분으로 하는 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 비이상적 활성화로부터 야기되는 질병의 치료제를 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 다이하이드로 벤조퓨란 구조 및 이와 결합된 하이드록시 페놀 구조를 가지는 것을 특징으로 하는 화합물을 포함한다.

바람직하게는 하기 화학식 2∼4의 화합물을 포함한다.

[화학식 2]

[화학식 3]

[화학식 4]

상기 화합물은 통상적인 화학적 합성법으로 합성할 수 있으며, 식물로부터 추출하여 얻을 수 있다. 바람직하게는 전통적으로 중국 등의 동양 의학에서 널리 사용되어져온 전통 약제로부터 추출할 수 있다.

상기 화합물은 디하이드로퓨란 구조 및 하이드록시 페놀 구조를 가지고 있으며, 이러한 구조를 포함한 화합물이 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 활성을 저해한다.

구체적으로, 상기 화합물이 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 ATP 부착 부위에 결합함으로써 활성 저해를 나타내며, 또한 DDR2 효소의 산화적 스트레스에 의한 타이로신 인산화를 저해하여 DDR2 카이네이즈 효소의 활성 저해를 나타낸다.

하기 실시예에서 보는 바와 같이, 상기 화합물에 대한 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소 활성 저해능을 측정한 결과, 저해능 IC₅₀이 1∼10 uM 의 유의성이 있는 저해능을 나타내고 있다(표 1 및 표 3 참조). 또한, ATP 농도를 증가하였을 경우, 상기 화합물에 의한 카이네이즈 활성 저해 IC₅₀이 증가하는 경향을 나타내는데(표 2 및 표 4 참조), 이는 상기 화합물이 DDR2 또는 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소에 대한 저해에 있어서 ATP가 효소에 부착하는 것을 방해하는 것이 그 저해 작용의 한 기전임을 나타내는 것이며, 디하이드로퓨란 구조가 일반적인 티로신 카이네이즈(tyrosine kinase)의 ATP 경쟁적 저해제와 화학구조적으로 유사한 점은 상기 화합물이 DDR2 티로신 카이네이즈의 한 기질인 ATP의 부착을 방해함으로써 그 저해 작용을 나타냄을 알 수 있다.

또한, 하기 실시예에서 보는 바와 같이, DDR2 C-말단을 과잉 발현하는 sf9 세포에 과산화수소를 처리하면 세포내에서의 DDR2 티로신기의 인산화가 현저히 증가하며, 과산화수소에 의해 DDR2 단백질의 타이로신 인산화의 증가는 곧 DDR2 가 세포의 가해진 산화적 스트레스에 의한 세포내 유리산소에 의해 타이로신기가 인산화되며 변형된다. 이렇게 타이로신 인산화가 증가한 DDR2 타이로신 카이네이즈 단백질 절편을 순수 분리하여 인산화가 되지 않은 DDR2 타이로신 카이네이즈 단백질 절편과 카이네이즈 효소 활성을 비교한 결과, 그 활성이 더욱 우수함을 알 수 있었다(도 2 참조). 이러한 사실을 이용하여 상기 화합물이 가지는 항산화 기능이 과산화수소에 의한 세포내 DDR2의 인산화를 저지할 수 있는가를 측정한 결과, 도 3에서 보는 바와 같이 과산화수소에 의한 DDR2 타이로신 인산화를 저해함을 알 수 있었다. 이는 상기 화합물이 DDR2의 인산화 효소 기능을 저해하는데 있어서, ATP 부착 부위에 대한 ATP의 부착을 저해하여 그 효소 기능을 저해함과 동시에 산화적 스트레스에 의한 타이로신 인산화에 의한 활성 증가도 저해함을 알 수 있다.

상기 화합물은 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 비이상적 활성화로부터 야기되는 질병을 치료하는 치료제로서, 구체적으로 간경화, 류마티즘, 암, 동맥경화 및 건성증을 치료하는 치료제로 사용할 수 있다.

본 발명의 다이하이드로 벤조퓨란 및 이와 결합된 하이드록시 페놀 구조를 포함하는 화합물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명의 화합물은 실제 임상투여시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 본 발명의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이크 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 유효성분의 제제 내 함유량은 체내에서의 활성 성분의 흡수도, 불활성화율, 배설속도, 사용자의 연령, 성별 및 상태 등에 따라 적절히 선택할 수 있다. 본 발명에서는 0.1∼100 ㎎/㎏이고, 바람직하게는 0.1∼10 ㎎/㎏이며, 하루 1∼3 회 투여할 수 있다.

본 발명의 화합물은 실험용 생쥐에 각각 100 ㎎/㎏을 경구투여시 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구 투여 최소치사량(LD₅₀)은 100 ㎎/㎏ 이상으로 생체 안정성이 매우 높다는 것을 알 수 있으며, 따라서 본 발명의 화합물에 대해 안정하게 투여될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실험예 1> DDR2 카이네이즈 효소 활성 저해능 검색

DDR2 카이네이즈 효소 활성을 가진 단백질은 DDR2의 전체 단백질 중 타이로신 카이네이즈 활성이 있는 C-말단 부위만을 곤충세포 발현 벡터를 이용하여 sf9 곤충세포에서 유전공학적 방법으로 대량발현 후 이를 순수 정제하여 사용하였다.

카이네이즈 효소 활성은 20∼100 ㎕ 용액상에서 실시하였다. 효소는 100∼500 ng 정도를 사용하였고, 기질로 polyD4Y(Promega, U.S.A.)를 사용하였고, 펩타이드 양은 2∼4 ㎍을 사용하였다. 효소 반응은 Tris-HCl(pH 7.5)에서 행해졌고 또 다른 기질인 ATP는 10 uM이 사용되었으며 0.2∼0.4 uCi의 p32-gamma-ATP를 첨가하였다. 효소 반응에 필요한 2가 이온은 MgCl₂를 5mM을 사용하였다. 효소 반응은 30 분 동안 수행하였고 반응후 1/2 부피의 30% 인산 용액을 가하여 반응을 종결하였다. 상기 반응액을 아비딘(avidin)으로 코팅된 막(membrane, Promega, U.S.A.)에 스포팅한 후 10 mM Tris-HCl(pH 8.0) 및 100 mM NaCl용액으로 5번 세척한 후 막에 부착된 인산화된 펩타이드에서 발생하는 방사능을 BAS 방사능 영상 측정기(Kodak)로 측정하여 효소 반응 정도를 정량하였다.

각 화합물의 효소 반응 저해능을 측정하기 위해서 상기 기술한 효소 반응 측정법을 수행시 화합물을 농도를 다르게 첨가하여 효소 반응을 수행한 후 50% 효소 반응을 억제하는 화합물의 농도를 구하여 IC₅₀ 값으로 결정하였다. 본 발명의 화학식 2∼4의 화합물을 DMSO 용액에 10 mM의 농도로 녹이고, 이를 물에서 적당히 묽힌 후 저해능 IC₅₀ 값 측정에 사용하였다. ATP 농도 변화에 의한 화합물의 저해정도 변화 측정은 IC₅₀ 측정 효소 반응 용액내의 ATP 농도를 10 uM과 100 uM의 두 가지 다른 농도에서 IC₅₀ 값을 구함으로써 측정하였다. 결과는 하기 표 1∼2에 나타내었다.

화학식 2∼4의 화합물의 DDR2 타이로신 카이네이즈 저해(IC₅₀)

화합물	화학식 2	화학식 3	화학식 4
IC₅₀(uM)	10 uM 이하	10 uM 이하	10 uM 이하

효소 반응 용액의 ATP 농도에 따른 화학식 4의 화합물의 DDR2 카이네이즈에 대한 IC₅₀ 변화

ATP 농도	10 uM	100 uM
IC₅₀(uM)	4.1	10.7

상기 표 1∼2에서 보는 바와 같이, DDR2 카이네이즈 효소에 대해 IC₅₀ 값이 10 uM 이하로 유의성있는 저해능을 나타내고 있으며, ATP 농도가 증가하였을 경우, 카이네이즈 활성 저해 IC₅₀ 값이 증가함을 나타내고 있다. 상기 결과를 통하여 본 발명의 화합물이 DDR2 카이네이즈 효소의 활성 저해를 나타내며, 본 발명의 화합물이 DDR2 카이네이즈 효소에 대한 저해에 있어서, ATP가 효소에 부착하는 것을 방해나는 것이 그 저해 작용의 한 기전임을 나타내고 있다.

<실험예 2> CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소 활성 저해능 검색

CDK4/cyclin D1 복합체 단백질은 순수 정제된 것을 구입하여 사용하였다. 카이네이즈 효소 활성은 20∼100 ㎕ 용액 상에서 실시하였다. 효소는 100 ng을 사용하였고, 기질로 정제된 RB 단백질 C-말단 펩타이드를 사용하였고, 펩타이드 양은 2∼4 ㎍을 사용하였다. 효소 반응은 Tris-HCl(pH 7.5)에서 행해졌고 또 다른 기질인 ATP는 10 uM이 사용되었으며 0.2∼0.4 uCi의 p32-gamma-ATP를 첨가하였다. 효소 반응에 필요한 2가 이온은 MgCl₂를 5mM을 사용하였다. 효소 반응은 20 분 동안 수행하였으며, 반응 후 1/2 부피의 30% 인산 용액을 가하여 반응을 종결하였다. 상기 반응액을 P81 필터페이퍼에 스포팅 한 후 10 mM Tris-HCl(pH 8.0), 100 mM NaCl용액으로 5번 씻어낸 후 p81 페이퍼에 부착된 인산화된 RB에서 발생하는 방사능을 BAS 방사능 영상 측정기(Kodak)로 측정하여 효소 반응 정도를 정량하였다. ATP 농도 변화에 의한 화합물의 저해정도 변화측정은 ATP 농도를 10 uM과 100 uM 두가지 다른 농도에서 IC₅₀ 값을 구함으로써 측정하였다. 결과는 하기 표 3∼4에 나타내었다.

화학식 2∼4의 화합물의 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 저해 측정(IC₅₀)

효소 반응 용액의 ATP 농도에 따른 화학식 4의 화합물의 CDK4/cyclin D1에 대한 IC₅₀ 변화

ATP 농도	10 uM	100 uM
IC₅₀(uM)	5.4	11.9

상기 표 3∼4에서 보는 바와 같이, CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소에 대해 IC₅₀ 값이 10 uM 이하로 유의성있는 저해능을 나타내고 있으며, ATP 농도가 증가하였을 경우, 카이네이즈 활성 저해 IC₅₀ 값이 증가함을 나타내고 있다. 상기 결과를 통하여 본 발명의 화합물이 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 활성 저해를 나타내며, 본 발명의 화합물이 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소에 대한 저해에 있어서, ATP가 효소에 부착하는 것을 방해나는 것이 그 저해 작용의 한 기전임을 나타내고 있다.

<실험예 3> DDR2 C-말단 카이네이즈 활성의 과산화수소수에 의한 증가와 화학식 4의 화합물에 의한 활성 저해 정도 측정

(단계 1) 과산화 수소수처리를 통해 DDR2를 발현하는 sf9 세포에 산화적 스트레스를 가했을 때 DDR2 c-말단 카이네이즈 단편의 타이로신 인산화 증가 측정

DDR2 카이네이즈 단편 단백질을 상기 실험예 1에서 상술한 방법으로 sf9 세포에서 발현하였다. 상기 세포에 최고 200 uM 농도까지의 과산화수소수를 여러 농도 변화에서 2시간 처리 후 이 세포를 램리 버퍼에서 녹이며 파쇄하였다. 이를 10% PAGE 전기영동법을 한 후 p-티로신(p-tyrosine) 특이적 항체를 이용하여 통상적인 웨스턴 브로팅 방법으로 DDR2 단백질상의 타이로신 인산화 정도를 측정하였다. 이때 p-티로신 특이적 항체는 퍼록시데이즈가 부착되어져 있어 통상적인 케미루미네슨스 반응 키트(AP biotech)를 이용하여 X-ray 필름을 사용하였으며, DDR2의 타이로신 인산화 정도를 정량하였다. 결과는 도 1에 나타내었다.

도 1에서 보는 바와 같이, DDR2 C-말단을 과잉발현하는 sf9 세포에 과산화수소를 처리하면 세포내에서의 DDR2 티로신기의 인산화가 현저히 증가한다. 과산화수소에 의해 DDR2 단백질의 타이로신 인산화의 증가는 곧 DDR2가 세포에 가해진 산화적 스트레스에 의한 세포내 유리산소에 의해 타이로신기가 인산화되며 변형됨을 알 수 있다.

(단계 2) 과산화 수소수 처리 후 타이로신 인산화된 DDR2 C-말단 카이네이즈 절편의 과산화 수소수를 처리하지 않은 DDR2와의 효소 활성 비교

상기 실험예 1의 방법에 따라 DDR2 C-말단 카이네이즈가 발현된 sf9 세포에 과산화 수소 1 mM을 1시간 처리 후 DDR2 c-말단 카이네이즈를 순수 분리하였다. 이를 과산화 수소수 처리를 하지 않고 분리한 DDR2 C-말단 카이네이즈와 실시예 1의 방법에 따라 효소 활성을 시간 별로 측정하여 비교하였다. 결과는 도 2에 나타내었다.

도 2에서 보는 바와 같이, 타이로신 인산화가 증가한 DDR2 타이로신 카이네이즈 단백질 절편을 순수분리하여 인산화가 되지 않은 DDR2 타이로신 카이네이즈 단백질 절편이 그 활성이 더욱 우수함을 알 수 있다.

(단계 3) DDR2 C-말단 카이네이즈 활성의 과산화수소수에 의한 증가와 화학식 4의 화합물에 의한 저해 정도 측정

상기 실험예 1의 방법에 따라 DDR2 C-말단 카이네이즈 단백질을 발현하는 sf9 세포에 1 mM 농도의 과산화 수소를 1시간 처리하거나 화학식 4의 화합물을 과산화 수소수 처리 3시간 전에 20 uM의 농도로 선처리 후 1 mM 농도의 과산화 수소를 1시간 처리한 두 시료간의 DDR2 C-말단 카이네이즈의 타이로신 인산화 차이를 실시예 3의 단계 1의 방법에 준하여 p-타이로신 특이적 항체로 웨스턴브로팅을 하여 비교하였다. 대조 시료로 DDR2를 발현하지 않는 sf9 세포 시료를 사용하였다. 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에서 보는 바와 같이, 화학식 4의 화합물은 과산화수소에 의한 DDR2 타이로신 인산화를 저해함을 알 수 있다. 이는 본 발명의 화합물이 DDR2의 인산화 효소 기능을 저해하는데 있어서, ATP 부착 부위에 대한 ATP 부착을 저해하여 그 효소기능을 저해함과 동시에 산화적 스트레스에 의한 타이로신 인산화에 의한 활성증가도 저해함을 나타내는 것이다.

<실험예 4> 급성 독성 실험

6 주령의 특정병원체부재(specific pathogen-free, SPF) SD계 랫트를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 본 발명의 화학식 2∼4의 화합물을 각각 0.5 % 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 각각 100 ㎎/㎏/㎖의 용량으로 1회 경구투여하였다. 실험 물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 핼액생화학적 검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다.

그 결과, 실험 물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검 소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과, 본 발명의 화학식 2∼4의 화합물은 모두 랫트에서 각각 100 ㎎/㎏까지도 독성변화를 나타내지 않았으며, 경구투여 최소치사량(LD₅₀)은 100 ㎎/㎏이상인 안전한 물질로 판단되었다.

<제제예 1> 캡슐제의 제조방법

화학식 4의 화합물 1 ㎎을 락토오스 14.8 ㎎, 폴리비닐 피롤리돈 10.0 ㎎, 마그네슘 스테아레이트 0.2 ㎎과 함께 섞었다. 혼합물을 적당한 장치를 사용하여 단단한 No. 5 젤라틴 캡슐에 채웠다.

상기 분말 및 캡슐제의 구성성분은 다음과 같다.

화학식 4의 화합물·················· 1.0 ㎎

락토오스 ······················14.8 ㎎

폴리비닐 피롤리돈··················10.0 ㎎

마그네슘 스테아레이트 ··············· 0.2 ㎎

<제제예 2> 주사액제의 제조방법

화학식 4의 화합물 1 ㎎, 만니톨 180 ㎎, Na₂HPO₄·12H₂O 26 ㎎ 및 증류수 2974 ㎎을 함유시켜 주사제를 제조하였다. 상기 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

상기 주사액제의 구성성분은 다음과 같다.

화학식 4의 화합물 ················· 1 ㎎

만니톨 ······················· 180 ㎎

Na₂HPO₄·12H₂O ····················26 ㎎

증류수 ······················ 0.2 ㎎

상술한 바와 같이, 본 발명의 다이하이드로 벤조퓨란 구조 및 이와 결합된 하이드록시 페놀 구조를 포함하는 화합물은 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소 활성을 저해하여 DDR2 및 CDK4 카이네이즈 효소의 비이상적 과다 활성 증가가 원인으로 알려진 간 경화, 류마티즘, 암, 동맥경화, 건선증등 질병의 치료제로 활용할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 항산화 활성이 산화적 스트레스에 의한 DDR2 카이네이즈 효소 활성 증가 저해에 직접적인 영향을 나타냄을 보임을 통해 이들 화합물들의 항산화 활성과 ATP 경쟁적 카이네이즈 저해 기능을 동시에 갖는 것이 치료제로서 더욱 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 본 발명에서 DDR2 C-말단 카이네이즈를 발현하는 sf9 세포에 과산화수소 처리시 DDR2 C-말단 카이네이즈 타이로신 인산화를 나타낸 사진이며,

도 2는 본 발명에서 과산화수소처리로 타이로신 인산화된 DDR2 C-말단 카이네이즈의 효소 활성을 나타낸 그래프이며,

도 3은 본 발명의 화학식 4의 화합물에 의해 산화적 스트레스에 의한 DDR2 C-말단 카이네이즈 타이로신 인산화의 저해를 나타낸 사진이다.

1 : sf9 대조시료,

2 : DDR2를 감염한 sf9 세포에 과산화수소 1 mM로 1 시간 처리한 경우,

3 : DDR2를 감염한 sf9 세포에 화학식 4의 화합물을 3 시간 처리후 과산화수소 1 mM로 1 시간 처리한 경우.

Claims

다이하이드로 벤조퓨란 구조 및 이와 결합된 하이드록시 페놀 구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 하기 화학식 1의 화합물:

화학식 1

상기 식에서,

A는 -C(O)-CH=, -C(O)-CH₂-, C1 ~ C4 알킬렌 또는 C1 ~ C4 알케닐렌이며;

D는 산소, 또는 C1 ~ C4 알킬렌이며,

E는 C1 ~ C4 알콕시카보닐기 또는 카복실기이며;

Y는 C1 ~ C4 알킬기, 또는 이다.
제 1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.

화학식 2
제 1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.

화학식 3
제 1항에 있어서, 상기 화합물이 하기 화학식 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 화합물.

화학식 4
제 1항의 화합물을 유효성분으로 하는, 간경화, 류마티즘, 암, 및 동맥경화로 이루어진 군으로부터 선택되는 질병의 치료제.
제 5항에 있어서, 상기 제 1항의 화합물이 DDR2 및 CDK4/cyclin D1 카이네이즈 효소의 ATP 부착 부위에 결합함으로써 활성 저해를 나타내는 것을 특징으로 하는 치료제.
제 5항에 있어서, 상기 제 1항의 화합물이 DDR2 효소의 산화적 스트레스에 의한 타이로신 인산화를 저해하여 DDR2 효소의 활성 저해를 나타내는 것을 특징으로 하는 치료제.
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