JP2018020964A

JP2018020964A - 治療剤の調製方法

Info

Publication number: JP2018020964A
Application number: JP2016151555A
Authority: JP
Inventors: 功坂井田; Isao Sakaida; 太郎高見; Taro Takami; 健二米田; Kenji Yoneda
Original assignee: Shibuya Kogyo Co Ltd; Yamaguchi University NUC
Current assignee: Shibuya Corp; Yamaguchi University NUC
Priority date: 2016-08-01
Filing date: 2016-08-01
Publication date: 2018-02-08
Also published as: CA3032516A1; TW201809268A; US20190160108A1; EP3492090A1; WO2018025596A1; EP3492090A4

Abstract

【解決手段】手術室８で患者から骨髄液１０を約４０ｍＬ採取して採取チューブ１１に収容し、それを無菌状態のアイソレータ２内に搬入する。その後、アイソレータ２内で採取チューブ１１内の骨髄液１０を検査用のチューブ１３と培養用のチューブ１４等に分注する。
チューブ１４内の骨髄液１０に赤血球沈降剤を加えて、赤血球を沈殿させた後に上清を回収する。その後、回収された上清から肝再生用骨髄細胞含有画分を濃縮した濃縮液を作成し、該濃縮液をフラスコ５（培養用容器）に分注する。次に、フラスコ５をインキュベータ４内に搬入して、細胞の培養を開始する。
また、アイソレータ１から検査用のチューブ１３、１６を外に取り出して、該チューブ１３、１６内の骨髄液１０、濃縮液に対して安全性等の検査を行う。
【効果】患者から採取した骨髄液１０の安全性を培養開始直後に検査することができる。
【選択図】図１

Description

本発明は治療剤の調製方法に関し、より詳しくは、例えば肝不全や腎不全あるいは脳梗塞などの疾病の治療に用いる治療剤の調製方法に関する。

従来、患者の骨髄液を採取し骨髄液中の間葉系幹細胞を患者の体内に戻すことにより、臓器や組織の治療を行うことが試みられている。例えば、肝不全の患者を治療するために、患者の骨髄液を採取してそれを洗浄・濃縮した後に患者の静脈に戻す治療方法が提案されており、さらに、その治療方法に用いる治療剤の調製方法も提案されている（例えば特許文献１）。
特許文献１の調製方法においては、患者から４００ｍＬの骨髄液を採取して、それを洗浄・濃縮することで輸注用液（治療剤）を調製するようになっており、該輸注用液（治療剤）を患者の静脈に戻すことで治療効果を得るようになっている。

特許第４７５２０５８号公報

学校法人山口大学発表資料ＡＢＭｉ療法

ところで、特許文献１の治療剤の調製方法においては、所要量（４００ｍＬ）の骨髄液を採取するために患者に全身麻酔を施す必要があり、かつ、採取時間が長時間となるため、患者の身体的負担が大きいという問題があった。
そこで、従来、患者から採取した少量（約３０ｍＬ）の骨髄液を培養して、該培養した細胞を患者に戻すことにより、特許文献１と同等の治療効果を得るようにした治療方法が提案されている（非特許文献１）。この治療方法においては、患者から採取した骨髄液がウイルスに汚染されていないことが前提となるが、患者から採取した骨髄液の安全性に関して特に考慮されていなかった。そのため、仮に患者から採取した骨髄液がウイルスに汚染されていた場合には、その後の骨髄液の培養作業自体が無駄になるという問題があった。

上述した事情に鑑み、本発明は、人体から採取した細胞に、無菌状態に維持されたアイソレータ内で所要の処理を行ってから細胞を培養するようにした治療剤の調製方法であって、
人体から採取した細胞を収容した採取容器をアイソレータ内に搬入する工程と、無菌状態のアイソレータ内で上記採取容器内の細胞を検査用容器と培養用容器に分注する工程と、細胞を収容した培養用容器をインキュベータ内へ搬入して細胞の培養を開始する工程と、上記検査用容器内の細胞に所要の検査を行う工程とを備えることを特徴とするものである。

このような構成によれば、人体から採取した細胞の安全性を検査することができるとともに、インキュベータ内で培養される細胞のコンタミネーションを確実に防止できる。

本発明の一実施例を示す概略の構成図。図１に示したアイソレータシステムを用いた処理工程を示す図。

以下、図示実施例について本発明を説明すると、図１において、１はアイソレータシステムであり、このアイソレータシステム１を用いて細胞を培養して肝不全の患者の治療剤の調製を行うとともに、患者から採取した骨髄液（細胞）の安全性を検査するようになっている。
アイソレータシステム１は、内部が無菌状態に維持されて所要の作業が行われるアイソレータ２と、このアイソレータ２の側壁２Ａに接続されたパスボックス３と、アイソレータ２に接離可能に設けられて、無菌状態の内部で細胞の培養を行うインキュベータ４とを備えている。

アイソレータ２の１つの側壁２Ａには、開口部２Ｂが形成されるとともに、該開口部２Ｂを開閉する開閉扉２Ｃが設けられている。そして、上記開口部２Ｂおよび開閉扉２Ｃを外方から覆ってパスボックス３が側壁２Ａに接続されている。上記開口部２Ｂと対向するパスボックス３の側壁に開口部３Ａが形成されるとともに、該開口部３Ａを開閉する開閉扉３Ｂが設けられている。
パスボックス３の開閉扉３Ｂを開放させることで、開口部３Ａを介して蓋付きチューブ等の容器やその他の器材をパスボックス３内に出し入れできるようになっており、容器等を搬入後に開閉扉３Ｂによって開口部３Ａを閉鎖し、パスボックス３内で容器等の外面除染を行った後、アイソレータ２の開閉扉２Ｃを開放させることで、開口部２Ｂを介してパスボックス３からアイソレータ２に容器等を出し入れできるようになっている。
パスボックス３と反対側となるアイソレータ２の側壁２Ｄにも開口部２Ｅが形成されるとともに、この開口部２Ｅを開閉する開閉扉２Ｆが設けられている。さらに、アイソレータ２の側壁２Ｄの外側には開口部２Ｅを覆ってインキュベータ４を気密を保持して接続するための接続口２Ｇが設けられている。インキュベータ４を接続口２Ｇの位置に接続した状態において、開口部２Ｅを介して容器等をアイソレータ２内からインキュベータ４内へまたはインキュベータ４内からアイソレータ２内へ搬入できるようになっている。

インキュベータ４の正面の壁部４Ａには開口部４Ｂが形成されるとともに、外方側から上記開口部４Ｂを開閉する開閉扉４Ｃが設けられている。所要時にインキュベータ４全体をアイソレータ２の隣接位置まで移動させ、上記アイソレータ２の接続口２Ｇと連結することにより気密を保持して接続できるようになっている。
そして、図１に示すようにインキュベータ４をアイソレータ２の接続口２Ｇの位置に接続した状態で開閉扉２Ｆ、４Ｃを開放させることで、アイソレータ２内とインキュベータ４内が接続口２Ｇを介して連通し、その状態において、培養容器としてのフラスコ５をアイソレータ２内からインキュベータ４内へ搬入するようになっている。

アイソレータ２の正面の側壁には、図示しない複数のグローブが設けられるとともに、内部を確認できる透明な窓が設けられている。そして、作業者が上記グローブに両手を差し込んで、アイソレータ２内で所要の作業を行うとともに、上記開閉扉２Ｃ、２Ｆの開閉作業及びパスボックス３からアイソレータ２内への容器や器材等の搬入出作業とアイソレータ２内からインキュベータ４内への容器の搬入作業等を行うようになっている。
無菌作業室としてのアイソレータ２及びそれに接続されたパスボックス３内は、開閉扉２Ｃ、２Ｆ、３Ｂが閉鎖された状態または開閉扉２Ｆ、３Ｂが閉鎖され開閉扉２Ｃが開放された状態において所要時に図示しない除染装置によって除染ガスが供給されるようになっている。それによって、アイソレータ２とパスボックス３内が除染されて無菌状態に維持されるようになっている。
また、インキュベータ４内も図示しない除染装置によって所要時に除染ガスが供給されるようになっており、開閉扉４Ｃが閉鎖された状態において除染ガスが供給されることによって、インキュベータ４内が除染されて無菌状態に維持されるようになっている。また、アイソレータ２とインキュベータ４を連結する際は、アイソレータ２の接続口２Ｇにインキュベータを連結し、開閉扉２Ｆ、４Ｃを閉鎖した状態で接続口２Ｇに除染ガスを導入して滅菌することにより、アイソレータ２とインキュベータ４を無菌的に接続することができる。

しかして、本実施例は、患者から培養すべき細胞として骨髄液１０を採取し、それをアイソレータシステム１により培養して治療剤を調製するとともに、細胞の培養開始直後に骨髄液の安全性を検査するようにしたことが特徴である。
すなわち、次のような作業工程により細胞の培養（治療剤の調製）と検査が行われる。
先ず、病院内の手術室８において肝不全の患者の腸骨から３０〜５０ｍＬの骨髄液１０を局所麻酔下で採取し、それを蓋付きの採取チューブ１１（採取容器）に入れて上記アイソレータシステム１の設置場所まで搬送する（図１及び図２のＳ１、Ｓ２参照）。なお、上記特許文献１においては全身麻酔をした患者から４００ｍＬの骨髄液１０を採取していたのに対して、本実施例では、採取量が少量（３０〜５０ｍＬ程度）であるため、患者に局所麻酔を施した状態で骨髄液１０を採取するようにしている。
この後、アイソレータシステム１において、作業者は次のような手順で作業を行う。なお、骨髄液１０を収容した採取チューブ１１がアイソレータシステム１に搬送される前の段階において、図１に示すようにインキュベータ４は、アイソレータ２の接続部２Ｇの位置に無菌的に接続されている。また、各開閉扉２Ｃ、２Ｆ、４Ｂ、３Ｂは閉鎖されており、アイソレータ２、インキュベータ４及びパスボックス３内は除染ガスによって予め除染されて無菌状態となっている。また、アイソレータ２内には、予め所要の大きさの落下菌シャーレ１２、蓋付きのチューブ１３〜１５等の調製作業に必要な器材が搬入されており、それらの器材も除染ガス等によって予め除染されている。

この状態において、作業者は、先ず、パスボックス３の開閉扉３Ｂを開放し、開口部３Ａを介してパスボックス３内に骨髄液１０が入った採取チューブ１１を搬入し、その後に開閉扉３Ｂを閉鎖する。この後、パスボックス３内に除染装置から除染ガスが供給されるので、採取チューブ１１の外面が除染され、除染ガスのエアレーションが行われる（図１、図２のＳ３）。なお、除染ガスでの除染に限らず、採取チューブ１１の外面をアルコールで清拭してもよい。
この後、作業者は上記アイソレータ２のグローブに両手を差し込んで、アイソレータ２内で以下のような作業を行う。

先ず、開閉扉２Ｃを開放して、骨髄液１０が入った採取チューブ１１をパスボックス３からアイソレータ２内に搬入し、開閉扉２Ｃを閉鎖する（図１、図２のＳ４）。
その後、アイソレータ２内にある１つの落下菌シャーレ１２を右奥に置き、２つ目の落下菌シャーレ１２を左奥に置き、それらの蓋をあける（図１）。
次に、採取チューブ１１内の骨髄液１０を、容量１０ｍＬの蓋つきの複数本の検査用のチューブ１３に１ｍＬずつ分注する（図１、図２のＳ５）。これら骨髄液１０をいれたチューブ１３は、後述する骨髄液１０の安全性等の検査の際に使用される。
次に、容量７５ｍＬのチューブ１４に上記採取チューブ１１内の骨髄液１０を分注し、ＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）、ＨＥＳ（赤血球沈降剤）等を使用して赤血球を沈降させる（図２のＳ６）。

次に、アイソレータ２内に設置された図示しない遠心分離機により遠心して細胞含有成分を取り出し、５０ｍＬチューブ１５にいれることにより間葉系幹細胞を分離する（図２のＳ７）。
これにより、チューブ１５内に、間葉系幹細胞（肝再生用骨髄細胞含有画分）が濃縮された濃縮液が作成されたことになる。
この後、容量１０ｍＬのチューブ１６に濃縮液を１ｍＬいれる。これは、後述する検査の際にセルカウントを行うためである（図２のＳ８）。
さらに、培地を入れた複数個のフラスコ５に残りの濃縮液を分注する（図２のＳ９）。これにより、複数個のフラスコ５内の培地に細胞が播種されたことになる。

この後、開閉扉２Ｆ，４Ｃを開放させた後、上記フラスコ５をアイソレータ２からインキュベータ４内に搬入した後に開閉扉２Ｆ、４Ｃを閉鎖する。これにより、インキュベータ４内でフラスコ５により骨髄液１０の細胞の培養が開始される（図１、図２のＳ１０）。
他方、この直後に、アイソレータ２内において、最初に骨髄液１０が１ｍＬずつ分注された複数本のチューブ１３の蓋と２つの落下菌シャーレ１２、１２の蓋を閉じる（図２のＳ１１）。
この後、アイソレータ２の開閉扉２Ｃを開放して、２つの落下菌シャーレ１２、１２、チューブ１３及びセルカウント用のチューブ１６をパスボックス３内に搬入する（図２のＳ１２）。これらチューブ１３内の骨髄液１０と、チューブ１６内の濃縮液は、後述する検査のウイルスチェック用、セルカウント用に使用するものである。
次に、開閉扉２Ｃを閉鎖してからパスボックス３の開閉扉３Ｂを開放し、パスボックス３内の２つの落下菌シャーレ１２、１２およびウイルスチェック用とセルカウント用のチューブ１３とチューブ１６をパスボックス３の外部に取り出す（図１、図２のＳ１３）。

そして、この後、パスボックス３の外部に取り出されたチューブ１３内の骨髄液１０及びチューブ１６内の濃縮液に対して以下のような各種の検査が行われる（図２のＳ１４）。
先ず、チューブ１３内の骨髄液１０の外観検査が行われる。この外観検査は、作業者が目視によって外観に異常がないことを確認する。
次に、骨髄液１０の細胞数について検査を行う。この検査は、自動血球計数装置にて測定するものであり、検査対象となるのは、チューブ１３内の骨髄液１０及びチューブ１６の濃縮液である。なお、必要に応じて、改良ノウバウエル計算盤と顕微鏡で細胞数を計算する。
さらに、Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ（生存率）について検査を行う。この検査は、改良ノウバウエル計算盤と顕微鏡を用いて、トリパンブルー染色法にて算出する。ここでの検査対象となるのは、チューブ１３内の骨髄液１０である。以上の検査は、インキュベータ４にフラスコ５を搬入して培養を開始した直後に行われる。
また、チューブ１３内の骨髄液１０について、無菌検査を行う。この検査は、増菌培養法であり、専用の培養装置（ＢＡＣＴＥＣ）により培養後、菌の検査を行うようになっている。
次に、チューブ１３の骨髄液１０に対して比色法によりエンドトキシンの検査を行う。

本実施例においては、以上のような検査を行うようになっている。この検査の結果、患者から採取した骨髄液１０、濃縮液の安全性について問題があると判定された場合には、インキュベータ４でのフラスコ５内の細胞の培養を中止し、フラスコ５をインキュベータ４から取り出して廃棄する（図２のＳ１５）。
他方、上記検査を行った結果、患者から採取した骨髄液１０、濃縮液の安全性に問題がないと判定された場合には、上記インキュベータ４内でのフラスコ５による細胞の培養をそのまま継続する。
そして、その後、インキュベータ４内での細胞の継代培養作業が完了することで、完成品としての治療剤（被培養物）が調製される。すると、該治療剤を収容した容器をインキュベータ４から取り出してから病院の手術室に持ち込んだ後に、治療剤を患者の静脈から体内に戻すようにしている。これにより、肝不全の患者の治療効果を得るようになっている（図２のＳ１６）。

このような本実施例によれば、インキュベータ４内で培養される細胞と同等の検査用のサンプルを無菌状態のアイソレータ２内で作成することができる。そのため、インキュベータ４で培養されるフラスコ５内の細胞にコンタミネーションが生じるのを確実に防止することができる。また、インキュベータ４での細胞の培養開始直後に、上記検査用サンプルを使用して患者から採取した骨髄液１０の安全性を確実に検査することができる。
さらに、上記特許文献１の調製方法においては、患者に全身麻酔を掛けた状態において４００ｍＬの骨髄液を採取するため、患者の身体的負担が大きいという問題があった。これに対して、本実施例においては、患者に部分麻酔を施した状態で少量（３０〜５０ｍＬ程度）の骨髄液１０を採取すればよい。そのため、本実施例においては、従来と比較して骨髄液を採取する際の患者の身体的負担を軽減することができるとともに、骨髄液１０の採取に要する時間も大幅に短縮することができる。

なお、上記実施例においては、検査用容器としてのチューブ１３、１６をパスボックス３を介して外部に取り出した後にチューブ１３、１６の骨髄液１０、濃縮液に対して所要の検査を行っているが、アイソレータ２内でチューブ１３、１６内の骨髄液１０等の安全性等の検査を行うことも可能である。
また、上記実施例は、患者から採取した骨髄液１０の細胞を培養する場合について説明しているが、骨髄液以外の人体から採取される細胞を培養する場合にも本発明を適用することも可能である。
また、上記実施例では、検査項目としてセルカウント、生存率、無菌性等を例示したが、細胞の安全性を確認するその他の検査項目を設定することもできる。

１‥アイソレータシステム２‥アイソレータ
４‥インキュベータ５‥フラスコ（培養用容器）
１０‥骨髄液（人体から採取された細胞）
１１‥採取チューブ（採取容器）１３、１６‥チューブ（検査用容器）
１４、１５‥チューブ（培養用容器）

Claims

人体から採取した細胞に、無菌状態に維持されたアイソレータ内で所要の処理を行ってから細胞を培養するようにした治療剤の調製方法であって、
人体から採取した細胞を収容した採取容器をアイソレータ内に搬入する工程と、無菌状態のアイソレータ内で上記採取容器内の細胞を検査用容器と培養用容器に分注する工程と、細胞を収容した培養用容器をインキュベータ内へ搬入して細胞の培養を開始する工程と、上記検査用容器内の細胞に所要の検査を行う工程とを備えることを特徴とする治療剤の調製方法。
上記細胞を収容した採取容器は、上記アイソレータに接続されたパスボックスに搬入され、該パスボックス内で外面を除染された後にアイソレータ内に搬入されるようになっており、
また、上記検査用容器をパスボックスを介してアイソレータの外部に取り出してから該検査用容器内の細胞に上記所要の検査を行うことを特徴とする請求項１に記載の治療剤の調製方法。
上記細胞は、非代償性肝硬変症患者から採取される骨髄液であって、
上記採取容器から上記培養用容器に分注された細胞に赤血球沈降剤を加えて、赤血球を沈殿させた後に上清を回収する工程と、該回収された上清から肝再生用骨髄細胞含有画分を濃縮する工程と、濃縮された肝再生用骨髄細胞含有画分を別の培養用容器に分注する工程とを備え、該別の培養容器をインキュベータ内に搬入して細胞の培養を開始することを特徴とする請求項２に記載の治療剤の調製方法。