ES2326415T3

ES2326415T3 - Vacuna contra la malaria.

Info

Publication number: ES2326415T3
Application number: ES03810941T
Authority: ES
Inventors: Michael Theisen; Soren Jepsen
Original assignee: Statens Serum Institut SSI
Current assignee: Statens Serum Institut SSI
Priority date: 2002-11-12
Filing date: 2003-11-06
Publication date: 2009-10-09
Anticipated expiration: 2023-11-06
Also published as: JP2006512926A; WO2004043488A1; ZA200504415B; AU2003275949B2; AU2003275949A1; CN1741815A; EP1567189B1; BR0315205A; DK200201741A; ATE432081T1; US7749507B2; JP4573773B2; EP1567189A1; CN1741815B; DE60327801D1; DK1567189T3; CA2505724C; US20110020387A1; US20060024324A1; CA2505724A1

Abstract

Una vacuna basada en antígenos contra la malaria capaces de generar una respuesta inmune tanto contra moléculas de GLURP como contra moléculas de MSP3, comprendiendo a) una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, o b) un análogo de SEQ ID Nº: 1, que se produce por procedimientos recombinantes o sintéticos por sustitución, inserción, adición o deleción de uno o más residuos aminoacídicos, siendo dicho análogo inmunogénico como se valora: i) determinando una respuesta celular in vitro por liberación de IFN-gamma a partir de linfocitos retirados de un animal o ser humano actualmente o previamente infectado con malaria, o por detección de proliferación de estas células T; ii) determinando inducción de liberación de IFN-gamma o detección de proliferación de células T por el uso de líneas celulares T derivadas de un individuo inmune o de una persona infectada por malaria donde las líneas celulares T se han bien dirigido bien con P. falciparum vivo, bien con extractos del parásito o bien con filtrado de cultivo durante 10 a 20 días con la adición de IL-2; iii) determinando una respuesta celular in vivo como una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DHT) positiva después de inyección intradérmica o parche de aplicación local de como mucho 100 µg del polipéptido o la parte inmunogénica para un individuo quien está infectado clínicamente o subclínicamente con P. falciparum; o iv) determinando una respuesta humoral in vitro por una respuesta de anticuerpo específica en un individuo inmune o infectado por una técnica de ELISA o una transferencia de Western donde el polipéptido o la parte inmunogénica se absorbió bien a una membrana de nitrocelulosa o bien a una superficie de poliestireno.

Description

Vacuna contra la malaria.

Campo de la invención

Una vacuna basada en antígenos contra malaria que comprende proteínas de fusión derivadas de proteína rica en glutamato de Plasmodium falciparum (GLURP) acoplada genéticamente a la proteína 3 del merozoito, o una vacuna que comprende el ADN que codifica esta proteína de fusión y la producción de una vacuna tal.

Antecedentes

La malaria afecta al 40% de la población mundial con aproximadamente 1,5-2,7 millones de muertes anualmente (57). Esto representa un tremendo sufrimiento humano y una carga que impide el desarrollo de las comunidades endémicamente afectadas. La malaria está ahora casi confinada a las áreas más pobres de África, Asia, y Latinoamérica, pero la transmisión se ha reintroducido a áreas donde previamente se había erradicado. La malaria es uno de los mayores problemas de salud pública mundiales.

La emergencia creciente de vectores resistentes a insecticida y de parásitos resistentes a fármaco implica la inversión en nuevas y mejores herramientas de control. Las vacunas de la malaria tienen el potencial de aliviar en gran manera la carga de malaria. Sin embargo, nuestra comprensión de los mecanismos subyacentes a la inmunidad protectora es incompleta, de este modo necesitan definirse marcadores específicos de protección.

Una vacuna contra la malaria efectiva requerirá la inducción de respuestas inmunes humorales y celulares apropiadas contra varios antígenos del parásito clave expresados durante las diversas fases del ciclo de vida del parásito. Cada fase en el ciclo de vida proporciona una oportunidad de vacuna.

Dos líneas de evidencia sugieren que una vacuna contra la malaria es alcanzable:

Primeramente, una observación bien establecida es que la exposición repetida a parásitos de malaria puede conducir al desarrollo de una inmunidad clínica sólida, un estado de preinmunización con existencia concomitante de parásitos y de anticuerpos protectores. Los individuos clínicamente inmunes tienen generalmente una densidad de parásitos menor y la inmunidad es bastante efectiva para reducir mortalidad. En segundo lugar, los experimentos en seres humanos, así como en modelos animales, han establecido que las inmunizaciones pueden inducir inmunidad contra una prueba subsiguiente con parásitos sugiriendo que la vacunación puede llegar a ser una herramienta realista para el control de malaria.

En experimentos ahora clásicos, Cohen y colegas demostraron que la trasferencia pasiva de anticuerpos purificados de individuos clínicamente inmunes podría mejorar los ataques agudos de malaria en niños africanos con infecciones de Plasmodium falciparum que ponen la vida en peligro (10). Druilhe y colaboradores confirmaron los resultados de Cohen (42). Ellos mostraron que los IgG de los africanos del oeste inmunes clínicamente a la malaria fueron capaces -en una manera independiente de cepa- de disminuir sustancialmente la carga del parásito en niños tailandeses asintomáticos con malaria de Plasmodium falciparum resistente a fármacos.

Estos experimentos de transferencia pasiva esenciales han demostrado que los anticuerpos son cruciales en reducir/eliminar la carga de parásitos en fase asexual.

Sin embargo, las investigaciones in vitro con las mismas preparaciones de IgG "protectoras" (42) demostraron que los anticuerpos no inhiben el crecimiento parasitario solos, sino que actúan sinérgicamente con células mononucleares sanguíneas para controlar la multiplicación parasitaria (5). Este mecanismo que contiene parásito se refiere como una inhibición celular dependiente de anticuerpo (ADCI) (5, 26, 31). Estudios recientes han demostrado adicionalmente que la unión de anticuerpos citofílicos tales como IgG1 e IgG3 en conjunción con células mononucleares de la sangre por medio de sus receptores Fc\gammaIIa activa la liberación de factores mortales tales como factor de necrosis tumoral-\alpha (6).

Los estudios inmunoepidemiológicos respaldan la relevancia in vivo de un mecanismo monocito-dependiente, mediado por anticuerpos que muestra una correlación entre la adquisición de inmunidad clínica y los niveles de anticuerpos IgG1 e IgG3, que unen bien al receptor Fc\gammaRIIa monocítico (1, 41). La implicación teórica de este receptor en el desarrollo de inmunidad contra la malaria clínica se respalda también por el hallazgo de que el polimorfismo alélico en Fc\gammaRIIa está asociado con susceptibilidad diferente a malaria de Plasmodium falciparum (45). Se ha revelado que los infantes keniatas homocigotos para el alelo Fc\gammaRIIa-Arg131 están menos en riesgo de infecciones de alta densidad de Plasmodium falciparum comparados con niños con el genotipo heterocigoto Arg/His131 (45). Dado que el genotipo Fc\gammaRIIa-Arg131 (pero no el genotipo Fc\gammaRIIa-His131) une fuertemente a IgG1 e IgG3, este hallazgo respalda la noción de que la matanza mediada por monocitos de Plasmodium falciparum es un mecanismo importante para la contención del parásito in vivo. Adicionalmente, Aucan y col. (2) hallaron que los niveles de anticuerpos IgG2 específicos -pero no IgG3 ni IgG1- estaban asociados con protección de malaria clínica en una población de Burkina Faso. La secuenciación subsiguiente de Fc\gammaRIIa reveló que el 70% de los sujetos del estudio tenían el alelo Fc\gammaRIIa-Arg131. Este alelo se une fuertemente a IgG2 sugiriendo que IgG2 está actuando como una subclase citofílica en esta población (2). Colectivamente estas observaciones sugieren que el genotipo Fc\gammaRIIa es un factor importante para el desarrollo de inmunidad frente a malaria clínica y presta soporte a la validez del modelo in vitro de ACDI.

El desarrollo de una vacuna para la malaria ha llegado a reconocerse de forma creciente como una prioridad alta en el esfuerzo para controlar malaria a lo largo del mundo debido a la incidencia creciente de enfermedad resistente a los fármacos. Las nuevas herramientas se requieren por lo tanto para facilitar la evaluación clínica de vacunas candidatas, en particular la validación de correlatos in vitro de la protección proporcionada por vacunación. ADCI puede proporcionar una herramienta tal (13). Los candidatos a vacuna de fase sanguínea actualmente más prominentes MSP1, MSP2, AMA1 y RESA se han seleccionado principalmente para realización de pruebas clínicas debido a su capacidad para inducir anticuerpos inhibidores del crecimiento en modelos animales preclínicos (9, 16, 16, 30, 55). Sin embargo, a pesar de las promesas iniciales, han demostrado en general ser pobremente inmunogénicos en los voluntarios humanos (18, 25, 29, 43) y los anticuerpos inducidos fueron incapaces de inhibir la crecimiento in vitro de P. falciparum. Así, el ensayo de inhibición de la invasión in vitro no está listo para servir como un marcador sustituto de inmunidad.

La falta de correlatos adecuados de protección de humanos que reflejen inhibición de invasión de merozoitos ha fomentado el desarrollo de otros modelos in vitro que reflejan mecanismos de matar posibles en individuos clínicamente inmunes. Druilhe y colaboradores han hipotetizado que los anticuerpos actúan sinérgicamente con monocitos sanguíneos humanos para controlar crecimiento de parásitos in vivo y para tener desarrollado de acuerdo el correlato in vitro de este mecanismo de matar -el ensayo ADCI. Los autores de la invención tienen hasta el momento identificados dos antígenos -GLURP y MSP3- que son objetivos de anticuerpos humanos ADCI-efectivos.

La proteína rica en glutamato de Plasmodium falciparum (GLURP) y la proteína 3 de superficie del merozoito (MSP3) son ambas objetivo para los anticuerpos IgG humanos, que pueden inhibir crecimiento parasitario in vitro en una manera dependiente de monocitos (36, 52) e in vivo en el modelo de ratón SCID humanizado (3). Los efectos similares de los anticuerpos humanos contra estos antígenos se sugieren también por un número de estudios inmunoepidemiológicos, que demuestran que los niveles de anticuerpos citofílicos específicos de GLURP y MSP3 (IgG1 y IgG3) están asociados significativamente con un riesgo reducido de ataques de malaria (11, 38,50).

El descubrimiento de GLURP y MSP3 está basado en los análisis in vitro de transferencia pasiva de inmunidad por Inmunoglobulina G Africana purificada (5, 6, 14, 42). Estas investigaciones han conducido a la elucidación de un mecanismo efector teórico en la defensa frente a malaria de P. falciparum (12), y en la identificación subsiguiente de las moléculas parásitas implicadas. Los epítopes de células B principales reconocidos por estos anticuerpos IgG humanos se han localizado en secuencias conservadas en las regiones GLURP_{27-489} y MSP3_{212-257}, respectivamente (36, 50, 51). Estos estudios conducen a la identificación de la región N-terminal de GLURP (GLURP_{27-489}) (52) y de la región C-terminal de MSP3, (MSP3_{210-380}) (36) como dianas de anticuerpos biológicamente activos.

Diferentes regiones de estos antígenos se han producido previamente en Escherichia coli condensadas con diversas marcas de afinidad (35, 53, 54). Mientras que tales secuencias adicionales son ventajosas para purificación también plantean un problema potencial debido a que tales respuestas inmunes frente a tales secuencias pueden volverse inútiles para aplicaciones repetidas. Investigaciones epidemiológicas inmunitarias confirmaron la relevancia de anticuerpos IgG anti-GLURP y anti-MSP3 para protección adquirida:

Para GLURP, tres estudios independientes llevados a cabo en Dielmo, Senegal (38), Dodowa, Ghana (11, 50) y OoDo, Myanmar (Soe Soe, impublicado) han demostrado una correlación estadísticamente significativa entre niveles de anticuerpos IgG3 y/o IgG1 específicos de GLURP y protección frente a ataques de malaria. Esta asociación fue altamente significativa incluso después de controlar el efecto causante de confusión de la exposición de P. falciparum asociada con la edad. Estos resultados confirman los estudios previos, que encontraron que anticuerpos IgG que se dan en la naturaleza dirigidos a GLURP están asociados con protección contra enfermedad en niños gambienses (15) y contra niveles altos de parasitemia en niños de Liberia (21) y de Burkina Faso (4).

Para MSP3, una relación elevada (> 2) de anticuerpos citofílicos o no citofílicos (IgG1 + IgG3/IgG2+IgG4+IgM) permitió distinguir individuos sin ataques de malaria de individuos con ataques de malaria. Esto se encontró en cada grupo de edad entre aproximadamente 200 aldeanos de Dielmo que han estado bajo supervisión clínica diaria durante más de 8 años (37). A nivel individual, la aparición de anticuerpos IgG3 anti-MSP3 estuvo fuertemente asociada con la protección, en contraste con anticuerpos de otros isotipos dirigidos contra la misma molécula o anticuerpos de cualquier isótipo contra 5 antígenos diferentes (37).

Una consistencia similar en datos seroepidemiológicos no es común para cualquier otro candidatos de vacuna de la malaria como se ejemplifica por MSP1, el hasta ahora candidato líder como una vacuna contra malaria de P. falciparum.

Los análisis de secuencia de las regiones de GLURP_{27-189} y MSP3_{210-380} de 44 aislados de campo y líneas de laboratorio de P. falciparum muestran que los epítopes definidos en GLURP (P1, P3, y P4) (48) y MSP3 (péptido b) (34), que se han marcado como objetivo por anticuerpos humanos efectivos para ADCI están casi completamente conservados sugiriendo que están funcionalmente obligados y no sujetos a selección por variación al nivel de aminoácido. De los diferentes epítopes en la región de GLURP_{27-189}, P3 debe ser el más importante, dado que anticuerpos humanos purificados por afinidad contra el péptido P3 mediaron el efecto de ADCI más fuerte in vitro (51). La conservación de epítopes de células B principales en GLURP y MSP3 está respaldada adicionalmente por la observación de que son casi idénticos entre P. falciparum y el parásito estrechamente relacionado Plasmodium reichenowi; un parásito natural de los chimpancés (39, 53), y que el plasma de anticuerpos IgG de 71 liberianos adultos clínicamente inmunes a malaria presenta patrones de unión idénticos para con proteínas recombinantes que representan las regiones de GLURP_{27-500} de ambas especies (53).

Colectivamente, estos hallazgos demuestran que epítopes de GLURP y de células B de MSP3 reconocidos por anticuerpos humanos efectivos se conservan biológicamente entre aislados de P. falciparum geográficamente distantes y funcionalmente obligados, sugiriendo que una vacuna basada en GLURP y MSP3 puede proteger contra un amplio intervalo de cepas de parásitos a lo largo del mundo.

Experimentos in vitro mostraron que los anticuerpos humanos purificados por afinidad que se dan en la naturaleza para GLURP (52) y MSP3 (36) podrían inhibir crecimiento de parásitos en una manera dependiente de monocitos, mientras que los anticuerpos de control purificados por afinidad en 7 candidatos de vacuna de malaria distintos fueron incapaces de ejercer un efecto similar (47).

El mismo efecto inhibidor se obtuvo usando anticuerpos IgG purificados por afinidad tanto contra proteínas recombinantes (GLURP_{27-489}, y GLURP_{705-1178}) (52) como contra péptidos sintéticos derivados de la región GLURP R0, P3 (GLURP_{93-207}), S3 (GLURP_{407-434}), y LR67 (GLURP_{85-312}) (50, 51), respectivamente.

Los experimentos in vivo donde los anticuerpos humanos específicos de MSP3b purificados por afinidad se transfirieron pasivamente dentro de ratones Hu-RBC BXN infectados por P. falciparum, mostraron una eliminación de parásito tan rápida como aquella inducida por cloroquina, y más rápida que aquella inducida por la IgG africana total IgG (3). La última observación indica que la inmunización con antígenos seleccionados puede conducir a inmunidad más fuerte que aquella inducida por el parásito completo (3).

Experimentos in vivo donde los monos Aotus inmunizados con MSP3 recombinante en coadyuvante completo de Freund estuvieron totalmente protegidos contra una prueba experimental de P. falciparum (20). Las inmunizaciones de monos Saimiri sciureus ha demostrado que GLURP_{27-500} adsorbido a Al(OH)_{3} es no tóxico, inmunogénico y facilita altas valoraciones de anticuerpos anti-GLURP que reconocen P. falciparum por IFA (8). En una prueba subsiguiente con eritrocitos infectados con P. falciparum, dos de cada tres monos estuvieron parcialmente protegidos, estando este efecto directamente relacionado con la valoración y la especificidad de epítope de los anticuerpos desarrollados por los primates en respuesta al inmunógeno (8).

Estos hallazgos respaldan fuertemente la noción de que las respuestas inmunes contra epítopes de células B GLURP y MSP3 que facilitan anticuerpos ADCI-efectivos controlan la multiplicación de parásitos in vivo.

Diferentes regiones de estos antígenos se han producido previamente en Escherichia coli condensados con diversas marcas de afinidad (35, 53, 54). Mientras que tales secuencias adicionales son ventajosas para purificación también plantean un problema potencial debido a que las respuestas inmunes de huéspedes frente a tales secuencias pueden volverse inútiles por aplicaciones repetidas. Es deseable por lo tanto explorar sistemas de expresión que ayuden a producir la proteína recombinante sin una marca de afinidad codificada por vector.

Se ha seleccionado un número restringido de formulaciones basadas en MSP3 y GLURP para desarrollo adicional de vacunas y se ha estudiado en el nivel preclínico primero en ratones (49, 54) y después en primates no humanos sometidos a pruebas con P. falciparum (8). La región N-terminal de GLURP y la región C-terminal de MSP3 demostraron ser fuertemente inmunogénicas en modelos preclínicos. Estos se han producido ahora individualmente usando un sistema de expresión nuevo, altamente eficiente, basado en el pH y el promotor regulado por la fase de crecimiento, P170, a partir de Lactococcus lactis (23, 33).

Los autores de la presente invención han identificado hasta el momento dos antígenos -GLURP y MSP3- que son objetivos de anticuerpos humanos ADC1-efectivos y recientemente llevaron a cabo dos ensayos en fase clínica I con los antígenos individuales. Ambas vacunas indujeron respuestas celulares fuertes en los voluntarios, mientras que las respuestas de anticuerpos IgG fueron moderadas. Todos los voluntarios del ensayo de GLURP generaron anticuerpos contra los epítopes de células B P3, que es el objetivo más importante de los anticuerpos ADC1-efectivos en individuos clínicamente inmunes. Los niveles relativamente bajos de anticuerpos inducidos por vacunas pueden estar relacionados con el número limitado epítopes de células B en los péptidos sintéticos de GLURP.

Carvalho, L. J. M. y col. (1999) Memorias do Instituto Oswaldo Cruz 94, supl. II, página 216 informa de estudios preclínicos que evalúan antígenos construidos de MSP3 y GLURP en combinación con diversos coadyuvantes en monos Saimiri sciureus. Los antígenos MSP3 y GLURP se usan por separado, y mientras que todas las combinaciones antígeno-coadyuvante son capaces de facilitar anticuerpos dirigidos contra el inmunógeno, los mismos sueros son incapaces de inhibir el crecimiento de P. falciparum en ensayos de inhibición celular dependientes de anticuerpos.

Carvalho, L. J. M. y col. (2002) Scand. J. Immunol. 56: 327-343 describen antígenos candidatos, objetivos de mecanismos y ensayos llevados a cabo con vacunas de la malaria potenciales. MSP3 y GLURP se mencionan brevemente, sin embargo, no hay sugerencia de como los niveles de anticuerpos inducidos por vacunas se pueden incrementar para estos dos antígenos.

Es por lo tanto, deseable desarrollar una vacuna basada en una proteína recombinante, que incluya GLURP y MSP3 preferiblemente con secuencias vecinas que contengan epítopes de células B y células T u otros antígenos de P. falciparum tales como el antígeno CS. Es deseable usar también sistemas de expresión, que produzcan la proteína recombinante sin una marca de afinidad codificada por vector, tal como L. lactis.

Sumario de la invención

Se revela una vacuna contra la malaria, que tiene una expresión de anticuerpo inducida por vacuna mejorada. La vacuna comprende una proteína de fusión derivada de proteína rica en glutamato de Plasmodium falciparum (GLURP) genéticamente acoplada a al menos otra proteína derivada de Plasmodium falciparum, por ejemplo la proteína 3 de la superficie del merozoito (MSP3), o la secuencia de nucleótidos correspondiente que codifica dicha proteína de fusión.

Descripción detallada de la invención

La presente invención describe una vacuna basada en antígenos contra la malaria que comprende

a) una proteína de fusión que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº: 1, o

b) un análogo de SEQ ID Nº: 1, que se produce por procedimientos recombinantes o sintéticos por sustitución, inserción, adición o deleción de uno o más residuos aminoacídicos, siendo dicho análogo inmunogénico como se valora:

i) determinando una respuesta celular in vitro por liberación de IFN-\gamma a partir de linfocitos retirados de un animal o ser humano actualmente o previamente infectado con malaria, o por detección de proliferación de estas células T;

ii) determinando inducción de liberación de IFN-\gamma o detección de proliferación de células T por el uso de líneas celulares T derivadas de un individuo inmune o de una persona infectada por malaria donde las líneas celulares T se han bien dirigido bien con P. falciparum vivo, bien con extractos del parásito o bien con filtrado de cultivo durante 10 a 20 días con la adición de IL-2;

iii) determinando una respuesta celular in vivo como una respuesta DHT positiva después de inyección intradérmica o parche de aplicación local de como mucho 100 \mug del polipéptido o de la parte inmunogénica para un individuo quien está infectado clínicamente o subclínicamente con P. falciparum; o

iv) determinando una respuesta humoral in vitro por una respuesta de anticuerpo específica en un individuo inmune o infectado por una técnica de ELISA o una transferencia Western donde el polipéptido o la parte inmunogénica se absorbió bien a una membrana de nitrocelulosa o bien a una superficie de poliestireno.

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En otra realización la vacuna comprende SEQ ID Nº 1 y epítopes inmunogénicos adicionales de una proteína derivada de Plasmodium falciparum.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una proteína de fusión que comprende

a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 1; o

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También se revela una proteína de fusión que comprende adicionalmente uno o más epítopes inmunogénicos de una o más proteína derivadas de Plasmodium falciparum, tales como CS, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, MSP6, AMA1, Pf155/RESA, RAP1, EBA-175, pfEMP1, EXP1, LSA1, LSA3, Pf25, Pf45/48, Pf230, Pf27, Pf16, o Pf28.

La presente invención se refiere también a un procedimiento para la preparación de la proteína de fusión de una bacteria recombinante, por ejemplo Lactococcus.

En un aspecto adicional, la invención proporciona un ácido nucleico que comprende

a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 o

b) un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos de acuerdo con la invención.

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En aún otra realización la vacuna comprende una BCG recombinante que contiene una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína de fusión anteriormente mencionada.

Dado que las vacunas basadas en GLURP y MSP3 inducen el mismo tipo de respuestas inmunes es decir altos niveles de anticuerpos específicos y posiblemente se complementan unas a otras como dianas para el sistema inmune, las regiones respectivas GLURP25-500 y MSP3212-382 se introdujeron juntas como un híbrido recombinante en Lactococcus lactis en un sistema de expresión génica novedoso, que está basado en el pH y en el promotor regulado de fase de crecimiento, P170, de L. lactis (7, 23, 33, 56).

Este sistema de expresión génica ofrece un procedimiento de fermentación simple , que se ha desarrollado específicamente para el promotor P170. L. lactis se elige como huésped de expresión debido a que i) es un microorganismo generalmente reconocido como seguro (GRAS) industrial bien caracterizado, el mejor conocido para su uso en la producción de productos lácteos fermentados, ii) se puede cultivar en un medio sintético definido, iii) las proteínas recombinantes se pueden segregar en el sobrenadante de cultivo, de donde pueden purificarse fácilmente, iv) no produce sustancias tóxicas.

La región N-terminal de GLURP y la región C-terminal de MSP3 se han producido ahora en una proteína quimérica de fusión, usando L. lactis.

La inmunogenicidad de la proteína híbrida se ha estudiado en ratones con Montanide (Seppic) usado como el coadyuvante. Montanide se usó en ensayos clínicos recientes con péptidos sintéticos largos derivados de GLURP y MSP3, respectivamente. Las inmunizaciones con la proteína híbrida generaron consistentemente una respuesta de anticuerpos más fuerte contra los dominios GLURP y MSP3 individuales que contra una mezcla de las dos
moléculas.

La diferencia fue más pronunciada para la respuesta de anticuerpos específica de MSP3 que sugiere que los epítopes de células T localizados en la región R0 de GLURP proporcionan ayuda para los epítopes de células B en la región de MSP3. Esta es una capacidad sorprendente del antígeno GLURP que se puede usar con otros antígenos de la malaria también.

En contraste, cuando los animales se inyectaron con una mezcla de GLURP y MSP3, los ratones individuales tendieron a montar una respuesta de anticuerpos predominante contra cada molécula. En algunos animales GLURP fue inmunodominante mientras que en otros animales MSP3 fue el inmunógeno dominante.

El híbrido se reconoció también de forma más efectiva por anticuerpos de IgG que se dan en la naturaleza en adultos africanos clínicamente inmunes que los antígenos individuales.

La proteína híbrida GLURP-MSP3 tiene por lo tanto cuatro ventajas principales comparada con las moléculas GLURP y MSP3 individuales:

i) es más inmunogénica que cualquier combinación de las moléculas individuales,

ii) genera una respuesta inmune fuerte tanto contra GLURP como contra MSP3,

iii) permite la realización de pruebas tanto de GLURP como de MSP3 en un ensayo clínico individual,

iv) se predice que es tan segura como las moléculas individuales, dado que la realización de pruebas preclínicas en ratones y en primates no humanos ha mostrado que no contiene neoepítopes en la articulación de condensación entre GLURP y MSP3.

Definiciones Proteínas de fusión

Una proteína de fusión recombinante está codificada por una secuencia de nucleótidos, que se obtuvo uniendo genéticamente secuencias de nucleótidos derivadas de regiones diferentes de un gen y/o uniendo secuencias de nucleótidos derivadas de dos o más genes separados. Estas secuencias de nucleótidos pueden derivarse de P. falciparum, pero pueden derivarse también de otros organismos, de los plásmidos usados para los procedimientos de clonación o de otras secuencias de nucleótidos.

Fragmento o epítope inmunogénico

Un fragmento o epítope inmunogénico se define como una parte de la proteína que induce una respuesta inmune en una muestra biológica o un individuo actualmente o anteriormente infectado con un microorganismo tal como malaria.

La respuesta inmune puede controlarse por uno de los procedimientos siguientes:

\bullet Una respuesta celular in vitro se determina por liberación de una citoquina relevante tal como IFN-\gamma, a partir de linfocitos retirada de una animal o ser humano que está infectado actualmente o previamente con malaria, o por detección o proliferación de estas células T. La inducción se lleva a cabo por la adición del polipéptido o la parte inmunogénica a una suspensión que comprende de 1x10^{5} células a 3x10^{5} células por pocillo. Las células se aíslan bien de la sangre, el bazo, el hígado o el pulmón y la adición del polipéptido o la parte inmunogénica da como resultado una concentración de no más de 20 \mug por ml de suspensión y la estimulación se lleva a cabo de dos a cinco días. Para llevar a cabo la monitorización se da a las células un pulso con timidina marcada radiactivamente y después de 16-22 horas de incubación se detecta la proliferación por cuenta de centelleo líquido. Una respuesta positiva es una respuesta más que los antecedentes más dos desviaciones estándar. La liberación de IFN-\gamma puede determinarse por el procedimiento de ELISA, que se conoce bien por una persona experta en la técnica. Una respuesta positiva es una respuesta más que los antecedentes más dos desviaciones estándar. Las citoquinas distintas de IFN-\gamma podrían ser relevantes cuando se monitoriza la respuesta inmune al polipéptido, tal como IL-12, TNF-\alpha, IL-4, IL-5, IL-10, IL-6, TGF-\beta. Un procedimiento distinto y más sensible para determinar la presencia de una citoquina (por ejemplo IFN-\gamma) es el procedimiento de ELISPOT donde las células aisladas bien de la sangre, bien del bazo, bien del hígado o bien del pulmón se diluyen a una concentración de preferiblemente de 1 a 4 x 10^{6} células/ml y se incuban durante 18-22 horas en presencia del polipéptido o de la parte inmunogénica que da como resultado una concentración de no más de 20 \mug por ml. Las suspensiones celulares están diluidas de aquí en adelante a 1 x 10^{6}/ml hasta 2 x 10^{6}/ml y se trasfieren a placas Maxisorp recubiertas con placas anti-IFN-\gamma y se incuban durante preferiblemente 4 a 16 horas. Las células productoras de IFN-\gamma se determinan por el uso de anticuerpo anti-IFN-\gamma secundario marcado y un sustrato relevante que ocasiona manchas, que pueden enumerase usando un microscopio de disección. Es también una posibilidad determinar la presencia de ARNm que codifica para la citoquina relevante por el uso de la técnica de PCR. Usualmente se medirán una o más citoquinas utilizando por ejemplo la PCR, el ELISPOT o el ELISA. Se apreciará por una persona experta en la técnica que un incremento o decremento significativo en la cantidad de cualquiera de estas citoquinas inducida por un polipéptido específico se puede usar en evaluación de la actividad de inmunización del polipéptido.

\bullet Una respuesta celular in vitro puede determinarse por el uso de las células T derivadas de un individuo inmune o de una persona infectada de malaria donde las líneas de células T se han dirigido con cada P. falciparum vivo, extractos del parásito o del filtrado de cultivo durante 10 a 20 días con la adición de IL-2. La inducción se lleva a cabo por adición de no más de 20 \mug de polipéptido por ml de suspensión a las líneas de células T que contienen de 1 x 10^{5} células a 3 x 10^{5} células por pocillo y la incubación se lleva a cabo de dos a seis días. La inducción de IFN-\gamma o la liberación de otra citoquina relevante se detecta por ELISA. La estimulación de las células T se puede controlar también detectando proliferación celular usando timidina marcada radiactivamente como se describe anteriormente. Para ambos ensayos una respuesta positiva es una respuesta más que los antecedentes más dos desviaciones estándar.

\bullet Una respuesta celular in vivo que se puede determinar también como una respuesta DHT positiva después de inyección intradérmica o parche de aplicación local de como mucho 100 \mug del polipéptido o de la parte inmunogénica para un individuo quien está infectado clínicamente o subclínicamente con P. falciparum, teniendo una respuesta positiva un diámetro de al menos 5 mm 72-96 horas después de la inyección o aplicación.

\bullet Una respuesta humoral in vitro se determina por una respuesta de anticuerpos específica en un individuo inmune o infectado. La presencia de anticuerpos se puede determinar por una técnica de ELISA o por una prueba de bandas de Western donde el polipéptido o la parte inmunogénica se absorbe bien a una membrana de nitrocelulosa o bien una superficie de poliestireno. El suero se diluye preferiblemente en PBS de 1:10 a 1:100 y se añade al polipéptido absorbido y la incubación está llevándose a cabo de 1 a 12 horas. Mediante el uso de anticuerpos secundarios marcados la presencia de anticuerpos específicos se puede determinar midiendo la D.O. por ejemplo por ELISA donde una respuesta positiva es una respuesta de más que los antecedentes más dos desviaciones estándar o alternativamente una respuesta visual en una prueba de bandas de Western.

\bullet Otro parámetro relevante es la medida de la protección en modelos animales inducida después de vacunación con el polipéptido en un coadyuvante o después de vacunación con ADN. Modelos animales adecuados incluyen primates, conejillos de indias o ratones, que se ponen a prueba con una infección. La lectura de salida para protección inducida podría estar disminuida de la densidad parasitaria comparada con animales no vacunados, los tiempos de supervivencia podrían estar prolongados comparados con animales no vacunados y la pérdida de peso podría estar disminuida comparada con animales no vacunados.

Proteína homóloga

La homología se define como un análogo o variante de la proteína de fusión de la presente invención. La proteína de fusión está caracterizada por aminoácidos específicos y está codificada por secuencias de ácidos nucleicos específicas. Se entenderá que tales secuencias incluyen análogos y variantes producidos por procedimientos recombinantes o sintéticos en los que tales secuencias polipeptídicas se han modificado por sustitución, inserción, adición o deleción de uno o más residuos aminoacídicos en el polipéptido recombinante y serán aún inmunogénicas en cualquiera de los ensayos biológicos descritos en ellos. Las sustituciones son preferiblemente "conservadoras". Las sustituciones son preferiblemente sustituciones silenciosas en el uso del codón que no conducen a ningún cambio en la secuencia de aminoácidos, pero pueden introducirse para potenciar la expresión de la proteína. Éstas se definen de acuerdo con la siguiente tabla. Los aminoácidos en el mismo bloque en la segunda columna y preferiblemente en la misma línea en la tercera columna pueden sustituirse unos por otros. Los aminoácidos en la tercera columna están indicados en código de una letra.

1

Vacuna, proteína

La invención se refiere a una composición de vacuna que comprende una proteína de fusión de acuerdo con la invención. Con el fin de asegurar la realización óptima de una composición de vacuna tal se prefiere que ella comprenda un transportador, vehículo o coadyuvante inmunológicamente o farmacéuticamente aceptable.

Una vacuna efectiva, en la que una proteína de la invención está reconocida por el animal, será capaz en un modelo animal de disminuir la carga en sangre y en órganos objetivo, de prolongar los tiempos de supervivencia y de disminuir pérdida de peso después de la prueba con un parásito de malaria, en comparación con animales no vacunados.

Además, la proteína de fusión de la invención puede estar acoplada a un carbohidrato o a un resto lipídico, por ejemplo un vehículo, o uno modificado de modos distintos, por ejemplo acetilándose.

Cuando se produce en un microorganismo la proteína de fusión de la invención no se acetilará normalmente si no se toman medidas especiales. La acetilación puede ser ventajosa ya que los polipéptidos acetilados pueden ser más estables en célula, sangre o fluidos corporales y tisulares. Además, la acetilación puede conferir el polipéptido con una estructura y conformación que imita la estructura y la conformación del antígeno nativo de P. falciparum.

Los vehículos adecuados están seleccionados del grupo constituido por un polímero al que el/los polipéptido(s) está(n) unido(s) por interacción no covalente, tal como plástico, por ejemplo poliestireno, o un polímero al que el/los polipéptido(s) está(n) unido(s) covalentemente, por ejemplo seroalbúmina bovina, ovoalbúmina, o hemocianina de lapa de California. Los vehículos adecuados se seleccionan del grupo constituido por un diluyente y un agente de suspensión. El coadyuvante está seleccionado preferiblemente del grupo constituido por bromuro de dimetildioctadecilamonio (DDA), Quil A, poli I:C, hidróxido de aluminio, coadyuvante incompleto de Freund, IFN-\gamma, IL-2, IL-12, lípido A monofosforilo (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM), dibehenato de trehalosa y dipéptido de muramilo (MDP).

La preparación de vacunas que contienen secuencias peptídicas como ingredientes activos se entiende generalmente bien en la técnica, como se ejemplifica por las patentes de los Estados Unidos 4.608.251; 4.601.903; 4.599.231 y 4.599.230.

Otros procedimientos de conseguir efecto coadyuvante para la vacuna incluyen uso de agentes tales como hidróxido de aluminio o fosfato de aluminio (alumbre), polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol), agregación de la proteína en la vacuna por tratamiento de calor, agregación reactivando con anticuerpos tratados con pepsina (Fab) a albúmina, mezcla con células bacterianas tales como C. parvum o con componentes de endotoxinas o de lipopolisacáridos de bacterias gram-negativas, se puede emplear también emulsión en vehículos aceitosos fisiológicamente aceptables tales como monooleato de manida (Aracel A) o emulsión con solución al 20 por ciento de un perclorofluorocarbono (Fluosol-DA) usada como un sustituto de bloque. Otras posibilidades implican el uso de sustancias inmunomoduladoras tales como citoquinas o inductores de IFN-\gamma sintéticos tales como poli I:C en combinación con los coadyuvantes mencionados anteriormente.

Otra posibilidad interesante para lograr efecto coadyuvante es emplear la técnica descrita en Gosselin y col., 1992 (19). En breve, un antígeno relevante tal como un antígeno de la presente invención se puede conjugar a un anticuerpo (o fragmento de anticuerpo de unión a antígeno) contra los receptores Fc\gamma en monocitos/macrófagos.

Las vacunas se administran en una manera compatible con la formulación de dosificación, y en cantidad tal como para que sean terapéuticamente efectivas e inmunogénicas. La cantidad a administrarse depende del sujeto a tratarse, incluyendo, por ejemplo, la capacidad del sistema inmune de los individuos para montar una respuesta inmune, y el grado de protección deseado. Los intervalos de dosificación adecuados son del orden de varios miles de microgramos de ingrediente activo por vacunación con un intervalo preferido de aproximadamente 0,1 \mug a 1000 \mug, tal como en el intervalo de aproximadamente 1 \mug a 300 \mug, y especialmente en el intervalo de aproximadamente 10 \mug a 50 \mug. Los regímenes adecuados para administración inicial y refuerzos de vacunas son también variables pero están tipificados por una administración inicial seguida por inoculaciones subsiguientes u otras administraciones.

La forma de aplicación puede variarse ampliamente. Son aplicables cualquiera de los procedimientos convencionales para administración de una vacuna. Se cree que estos incluyen aplicación oral en una base fisiológicamente aceptable sólida o en una dispersión fisiológicamente aceptable, parenteralmente, por inyección o similar. La dosificación de la vacuna dependerá de la vía de administración y variará de acuerdo con la edad de la persona a vacunarse y, en un menor grado, de acuerdo con el tamaño de la persona a vacunarse.

Las vacunas se administran convencionalmente parenteralmente, por inyección, por ejemplo, bien subcutáneamente o bien intramuscularmente. Formulaciones adicionales que son adecuadas para modos distintos de administración incluyen supositorios y, en algunos casos, formulaciones orales. Para supositorios, los aglutinantes y vehículos apropiados pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos; tales supositorios pueden estar formados a partir de mezclas que contienen el ingrediente activo en el intervalo del 0,5% al 10%, preferiblemente 1-2%. Formulaciones orales incluyen excipientes tales empleados normalmente como, por ejemplo, calidades farmacéuticas de manitol, lactosa, almidón, estearato de magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y similares. Estas composiciones toman la forma de soluciones, suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de liberación mantenida o polvos y contienen ventajosamente 10-95% de ingrediente activo, preferiblemente
25-70%.

En muchos casos, será necesario tener administraciones múltiples de la vacuna. Especialmente, las vacunas se pueden administrar para impedir una infección con malaria y/o para tratar infección con malaria establecida. Cuando se administra para impedir una infección, la vacuna se da profilácticamente, antes de que estén presentes signos o síntomas clínicos definitivos de una infección.

Debido a variación genética, diferentes individuos pueden reaccionar con respuestas inmunes de fuerza variante para la misma proteína. Por lo tanto, la vacuna de acuerdo con la invención puede comprender diversas proteínas diferentes con el fin de incrementar la respuesta inmune. La vacuna puede comprender dos o más polipéptidos o partes inmunogénicas, donde todas la proteínas son según se definen anteriormente, o algunos pero no todos los péptidos pueden derivase de P. falciparum u otros microorganismos. En el último ejemplo, los polipéptidos que no satisfacen necesariamente los criterios establecidos anteriormente para polipéptidos pueden bien actuar debido a su propia inmunogenicidad o bien actuar meramente como coadyuvantes.

La vacuna puede comprender 1-20, tal como 2-20 o incluso 3-20 proteínas diferentes o proteínas de fusión, tales como 3-10 proteínas diferentes o proteínas de fusión.

ADN de vacuna

Los fragmentos de ácidos nucleicos de la invención se pueden usar para llevar a cabo expresión de antígenos in vivo, es decir los fragmentos de ácidos nucleicos se pueden usar en las así llamadas vacunas de ADN como se revisa en Ulmer y col. 1993.

Así, la invención se refiere también al uso de un ácido nucleico de acuerdo con la invención para la preparación de una vacuna.

La eficacia de una vacuna de ADN tal puede posiblemente potenciarse administrando el gen que codifica el producto de expresión conjuntamente con un fragmento de ADN con un fragmento de ADN que codifica un polipéptido que tiene la capacidad de modular una respuesta inmune.

Vacunas recombinantes vivas

Una posibilidad para activar de forma efectiva una respuesta inmune celular para una vacuna puede lograrse expresando el antígeno relevante en una vacuna en un microorganismo no patógeno, Mycobacterium bovis BCG.

Por lo tanto, otro aspecto importante de la presente invención es una calidad adicional de la vacuna de BCG viva actualmente disponible, en la que una o más copias de una secuencia de ADN que codifican una o más proteínas de fusión según se definen anteriormente se han incorporado dentro del genoma del microorganismo en una manera que permite al microorganismo expresar y segregar la proteína. Se contempla la incorporación de más de una copia de una secuencia de nucleótidos de la invención para potenciar la respuesta inmune.

Legendas de figuras

Figura 1. Representación esquemática de pPSM1013 y pAMJ328 y de las construcciones de expresión usadas en L. lactis. Se indica la posición de los sitios de restricción codificados del vector mencionados en el en el texto, promotor P170, secuencia de Shine-Dalgarno (SD), y péptido señal 310mut2. Se pronostica que la señal peptidasa escinde entre el aminoácido nº 32 y el 33, dejando así residuos Ala-Glu en el extremo N-terminal de las proteínas recombinantes maduras. La numeración de nucleótidos de glurp y MSP3 fue relativa a A en el codón ATG de M59706 y L07944, respectivamente.

Figura 2. (A) Gel de poliacrilamida al 12,5% teñido de azul de Coomassie de proteína de condensación GLURP-MSP3 purificada (carril 1), de GLURP_{23-514} (carril 2), y de MSP3_{212-380} (carril 3) producida en L. lactis MG 1363. (B) Análisis de HPLC en una columna C4 de la proteína híbrida GLURP-MSP3 y de GLURP_{25-514}, respectivamente. Se indican los tamaños (en kilodaltons) de los marcadores de masa molecular. (C) Secuencias de aminoácidos deducidas y mapeo peptídico de GLURP_{25-514}. Los primeros cuatro aminoácidos (Ala-Glu-Arg-Ser) del híbrido de GLURP-MSP3 están derivados del vector de clonación pSM 1013. Las muestras para mapeo de masa peptídica se cortaron de un gel SDS-PGE teñido con Cooomassie. La mitad de una banda (aprox. 1 \mug de proteína) se lavó, se secó, se redujo y se alquiló con yodoacetilamida antes de digerirse durante toda una noche por tripsina modificada (Promega, EE.UU.), esencialmente como se describe (44). El sobrenadante de lo digerido se aplicó a puntas GELoader (Eppendorff, Alemania) envasadas con material de fase reversa Poros 20 R2 (PerSeptive, EE.UU.) y se eluyó con 0,8 \mul de ácido alfa-cianohidroxicinámico (20 \mug/\mul en acetonitrilo al 70%/agua al 30%) directamente sobre el objetivo de MALDI (28). Se llevó a cabo análisis en un PerSeptive Voyager STR (PerSeptive, EE.UU.) operado en el modo reflector y los resultados se analizaron en GPMAW versión 5.02 (Lighthouse Data, Dimamarca). Las secuencias cubiertas por péptidos en los espectros de MALDI-TOF están subrayadas y se indica el porcentaje de cobertura total de secuenciación.

Figura 3. Patrones de respuestas de anticuerpos IgG a pares de antígenos derivados GLURP y MSP3 en 71 muestras de plasma de liberianos adultos clínicamente inmunes a la malaria. El coeficiente de correlación y el valor de P se proporcionan en cada panel.

Figura 4. Respuestas a anticuerpos en ratones. Se inmunizaron grupos de 10 ratones con el híbrido (gr7), una mezcla de GLURP y MSP3 en una jeringuilla (gr8), o con GLURP y MSP3 en jeringuillas separadas en sitios diferentes (gr9). (A) Las muestras de plasma del día 35 se probaron para reactividad de anticuerpo en placas de ELISA recubiertas con GLURP_{25-514} o MSP3_{212-3}. Los gráficos de caja muestran medianas, percentiles 25, y 75 y los bigotes muestran el intervalo de los datos. (B) Respuestas acumulativas de sueros de ratones con 8 péptidos que representan epítopes de células B de GLURP (51) y (C) respuesta de isotipo de ratones para los que los resultados se presentan en el panel A. Cada barra vertical representa la absorbancia media (\pm error estándar de medida) en ELISA específicos de GLURP y de MSP3.

Figura 5. El híbrido contiene solo epítopes de células B derivados de GLURP y de MSP3. Una reserva de plasma de ratones inmunizados con el híbrido se preincubó con GLURP, MSP3, una mezcla de GLURP y MSP3 o el híbrido en las concentraciones indicadas antes de añadirse a ELISA recubierto con el híbrido. La incubación previa con una mezcla de GLURP y MSP3 o el híbrido inhibió completamente la unión de anticuerpos Ig al híbrido.

Figura 6. Análisis de inmunotransferencia de P. falciparum NF54. Se separó un extracto célular completo en un gel de poliacrilamida al 7,5% y se sometió a inmunotransferencia con plasma de ratones inmunizados con GLURP_{25-514} (carril 1), MSP3_{212-380} (carril 2) e híbrido GLURP-MSP3 (carril 3). Se indican los tamaños (en kilodaltons) de los marcadores de masa molecular.

Ejemplos Ejemplo 1 Materiales y procedimientos

Cepas bacterianas, plásmidos y condiciones de crecimiento. E. coli DH10B (K-12, F^{-} mcrA \Delta (mrr-hsdRMS-mcrBC) \varphi80dlacZ \Deltam15 \DeltalacX74 deoRrecA1 endA1 araD139 \Delta(ara, leu)7697 galU galK \lambda^{-} rpsL nupG) (Life Technologies) conteniendo los plásmidos indicados se cultivó en caldo de cultivo Luria (LB) suplementado con eritromicina (200 \mug/ml). L. lactis MG1363 (17) conteniendo los plásmidos indicados se cultivó bien en caldo de cultivo M17 (Difco Ltd.) con glucosa al 0,5% (peso/volumen) o bien en medio de un aminoácido sintético (SA) potenciado llamado medio 3 x SA IV (24) suplementado con 1 \mug/ml de eritromicina. Los medios LB o M17 solidificados se suplementaron con 200 ó 1 \mug/ml de eritromicina, respectivamente. El vector, pPSM1013 (fig. 1), es un plásmido de expresión de alto número de copias basado en el replicón pAM\beta1 (46) que contiene sitios de restricción únicos que permiten la construcción de fusiones en fase con una secuencia de péptido señal de secreción optimizada, SP310mut2 (Ravn, P., Arnau, J., Madsen, S.M., Vrang, A., y Israelsen, H. impublicado). El ARNm para el péptido se traslada a partir de un sitio de iniciación traduccional codificado por plásmido y se transcribe a partir del promotor de L. lactis inducible por pH y por fase de crecimiento, P170 (7, 23, 33). No hay esencialmente ninguna transcripción del promotor P170 a valores de pH de 7 ó más. Sin embargo, la transcripción se induce en la transición a fase estacionaria a valores de pH por debajo de 6,5. El plásmido pAMJ328 se deriva de pPSM1013 eliminando todas las secuencias reguladoras lacZ evitando transcripción del promotor lac y creando una región de clonación nueva desprovista del péptido señal (32).

Construcción de plásmidos que expresan GLURP y MSP3 en L. lactis . Todos los plásmidos se construyeron en E. coli DH10B y se transformaron en L. lactis MG1363 por electroporación como se describe (22). Todas las construcciones de plásmidos se verificaron por secuenciación de ADN.

pMST73. La región no repetida de FVO glurp se amplificó con los cebadores 5'-CCC AGA TCT ACA AGT GAG AAT AGA AAT AAA C [nucleótidos 79 a 100] (contando desde A en el codón de partida de ATG de M59706) y 5'-CCC AGA TCT TGC TTC ATG CTC GCT TTT TT CCG AT [nucleótidos 1475 a 1500]; digeridos con BglII, y el fragmento resultante de ADN se clonó en pPSM1013 digerido con BglII.

pKBR5. El plásmido pMST73 se digirió con BamHI y SalI, y el fragmento de ADN resultante que contenía el inserto glurp se clonó dentro de pAMJ328 digerido con BamHI-SalI.

pKBR7. La región no repetida de F32 glurp se amplificó con los cebadores 5'-AAG TAG ATC TAC TAA TAC AAG TGA GAA TAG AAA TAA AC [nucleótidos 73 a 100], y 5'-GTT CAG ATC TTT ATT CAT GAT GGC CTT CTA GC [nucleótidos 1519 a 1542]; el fragmento de ADN resultante se digirió con BglII y se clonó dentro de pPSM1013 digerido con BglII.

pKBR8. Se digirió el plásmido pKBR7 con BamHI y SalI, y el inserto de glurp se clonó en pAMJ328 digerido con BamHI-SalI.

pKBR9. La región C-terminal de F32 MSP3 se amplificó con los cebadores 5'-CCC AGA TCT AAA GCA AAA GAA GCT TCT AGT TAT [nucleótidos 628 a 651] y 5'-ATT AGA TCT CAT TTA ATG ATT TTT AAA ATA TTT GGA TA, [nucleótidos 1118 a 1140] (contando desde A en el codón de partida de ATG de L07944); el fragmento de ADN resultante se digirió con BglII y se clonó dentro de pPSM1013 digerido con BglII. Esta región de MSP3 es idéntica a aquella del alelo FC27 (número de acceso L07944) excepto para los siguientes residuos en posiciones variables en MSP3: 735 (T\rightarrowC) y 948 (AG).

pKBR10. El plásmido pKBR9 se digirió con BamHI y SalI, y el inserto MSP3 se clonó en pAMJ328 digerido BamHI-SalI.

pKBR11. El fragmento BglII de pKBR9 se clonó dentro de pKBR5 digerido parcialmente con BglII proporcionando una fusión en fase entre glurp_{79-1500} y MSP3_{628-1140}. Esta molécula híbrida corresponde al alelo F32 excepto para los siguientes residuos en posiciones variables en GLURP: Leu-50, Asn-53, Glu-65, Asp-129, Glu-224, Pro-500.

Fermentación. La fermentación de L. lactis MG1363, que contiene plásmido pKBR8 (GLURP), pKBR10 (MSP3) o pKBR11 (híbrido GLURP-MSP3), se llevó a cabo en 1 l de medios 3xSA IV suplementados con eritromicina (1 \mug/ml), extracto de levaduras (0,5%) y glucosa (1,5%) en fermentadores 2 l a 30ºC. El pH de partida del medio de cultivo se ajustó a 7,4. Dado que L. lactis MG1363 produce ácido láctico durante el crecimiento, pH está declinando según se incrementa la densidad celular. Después de aproximadamente 3 horas de crecimiento, el pH se redujo a 6 y este nivel se mantuvo por una captación controlada por pH de KOH 2 M durante otras 8 horas hasta que la densidad celular fue aproximadamente D.O._{600} = 8. Se añadió una solución de glucosa al 50% en paralelo con la base dado que esta tiende a incrementar el rendimiento bacteriano. Las células bacterianas se eliminaron del sobrenadante de cultivo (conteniendo proteína exportada) por ultrafiltración con filtro Pellicon 2 Durapore (PVDF, 0,22 pm, 0,1 m^{2}) (Millipore). Los sobrenadantes de cultivo bien se usaron inmediatamente o bien se almacenaron a 20ºC.

Purificación de proteínas recombinantes. Se desarrolló una estrategia de purificación para el GLURP recombinante, el MSP3 recombinante y las moléculas híbridas. Los sobrenadantes de cultivo libres de células se concentraron en un sistema Millipore Labscale^{TM} TFF instalado con un filtro Pellicon XL Biomax 8 (membrana de polipropileno, 50000 Da, 50 cm^{2}) y los concentrados se sometieron a intercambio de tampón a Bis-Tris 20 mM (pH 6,4) en una columna de Sephadex G-25 (C26/40, 170 ml). Las proteínas recombinantes se purificaron primero en una columna de Alta Resolución de Sefarosa HiTrap Q de 5 ml (Phamacia Biotech) aplicando un gradiente de NaCl de 0 a 1 M en tampón de columna a un caudal de 1 ml/min. Se almacenaron y dializaron fracciones (2 ml) que contenían la proteína recombinante deseada y se dializaron contra Bis-Tris 20 mM (pH 6,4) y se aplicaron a una columna de Alta Resolución de Sefarosa HiTrap Q de 5 ml (Phamacia Biotech). La proteína recombinante se eluyó por un gradiente de tampón de columna de NaCl de 0 a 1 M. Se eluyeron GLURP y MSP3 en picos individuales mientras que el híbrido se eluyó en dos picos. Las fracciones (2 ml) que contienen los picos deseados se almacenaron y se ajustaron a (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 M y se purificaron adicionalmente en una columna de Alta Resolución de Fenilsefarosa de 5 ml (Phamacia Biotech) aplicando un gradiente de (NH_{4})_{2}SO_{4} 1 a 0 M en Bis-Tris 20 mM (pH 6,4) a una velocidad de flujo de 1 ml/min. Se llevó a cabo el análisis de todas las fracciones por SDS-PAGE. Las concentraciones de proteína se midieron por el ensayo de proteínas BCA^{TM} (Pierce, Rockford, Illinois, EE.UU.).

Inmunización y purificación de IgG de ratón. Se asignaron al azar treinta ratones hembra BALBc/CF1 BALBc/CF1 (27) (7 a 10 semanas de edad) a tres grupos. Se inmunizaron dos grupos con 20 \mug de híbrido GLURP_{27-500}-MSP3_{212-380} (gr7), o con una mezcla de 15 \mug de GLURP_{25-512} y 5 \mug de MSP3_{212-380} (gr8) por inyecciones subcutáneas en la base del rabo, respectivamente; y el tercer grupo (gr9) recibió 15 \mug de GLURP_{25-512} inyectados en la base del rabo y 5 \mug de MSP3_{212-380} inyectados en el hombro. Todos los inmunógenos se emulsionaron en Montanide (®- ?) y cada ratón recibió tres inyecciones a intervalos de 2 semanas y se sangró en los días 0, 14, 28 y 35. La IgG total se purificó por precipitación con (NH_{4})_{2}SO_{4} y purificación subsiguiente en columnas de DEAE a partir de muestras de suero almacenadas tomadas en el día 35 de animales en los grupos gr7, 8, y 9 y a partir de muestras almacenadas el día 0.

ELISA y muestras de suero. Se llevaron a cabo ensayos inmunoabsorbentes unidos a enzima (ELISA) como se describe previamente en detalle (54). Las concentraciones de recubrimiento de GLURP_{25-512}, MSP3_{212-380}, y GLURP_{27-500}-MSP3_{212-380} fueron 0,5, 1,0 y 0,5 \mug/ml respectivamente. Se ensayaron diluciones en serie de plasma de adultos liberianos inmunes clínicamente a malaria, donantes daneses nunca expuestos a malaria (51), y ratones en placas de ELISA recubiertas con cada antígeno y se trazaron los valores de absorbancia frente a las diluciones de plasma. Con el fin de comparar respuestas de anticuerpos antihíbridos con las respuestas de anticuerpos anti-GLURP y anti-MSP3 respectivas en diferentes muestras de plasma la valoración de anticuerpos se definió como la dilución de plasma, que dio un valor de absorbancia de A492 = 1000 en la parte paralela de las curvas.

Ensayos de ELISA de competición. Se añadieron GLURP_{25-518} recombinante y MSP3_{212-380} recombinante y una mezcla de estos dos antígenos a diversas concentraciones (3,2 x 10^{-5} \mug/ml a 100 \mug/ml) a una reserva de plasma de ratones inmunizados con el híbrido GLURP-MSP3 diluido en polvo de leche 1,25% (p/v) en PBS. La dilución de plasma usada se ajustó dando una absorbancia (A492) de aproximadamente 2500. Las mezclas de antígeno-anticuerpo se incubaron durante toda una noche a 4ºC y se determinó subsiguientemente la reactividad para placas de ELISA recubiertas de híbridos GLURP-MSP3.

Prueba de Anticuerpos de Inmunofluorescencia Indirecta (IFA). IFA se llevó a cabo como se comunicó anteriormente (5). Brevemente, se incubó una película fina de RBC que contenía predominantemente fases esquizontes de P. falciparum NF54 con diluciones en serie de IgG de ratón purificada en solución salina tamponada con fosfato (PBS pH 7,4) durante 30 min a 37ºC en una cámara húmeda. Después de lavar con PBS, los anticuerpos de ratón se revelaron con IgG antirratón de cabra conjugada con Alexa Fluor (Molecular Probes, EE.UU.) diluido 1:300 en PBS. Después de lavar el portaobjetos se examinó bajo luz ultravioleta. La valoración de punto final fue la dilución más alta de los anticuerpos, que produce inmunofluorescencia específica visible.

Análisis de RP-HPLC de GLURP y de GLURP-MSP3. Las muestras se analizaron en un sistema de HPLC (Phamacia, Suecia), usando una columna de proteína C4 (VYDAC®, 214TP54, EE.UU.). Se hizo análisis en un sistema de tampón Acetonitrilo:H_{2}O:TFA. Las muestras purificadas se diluyeron 1:2 en tampón A (H_{2}O + TFA al 0,1% (p/v)) y se aplicaron sobre la columna, la elución se hizo usando un gradiente lineal de tampón B al 0-80% (Acetonitrilo al 80% + TFA al 0,1% (p/v)) sobre 20 volúmenes de columna. Se llevó a cabo elución por UV-Abs. 214 nm. Los picos se recogieron y se secaron a vacío en un HetoVac (Heto, Dinamarca) y se mantuvieron a 4ºC bajo experimentos adicionales.

EM de Maldi-Tof y ES-EM. Muestras para mapeo de masa peptídica para eliminarse de un gel de SDS-PAGE teñido por Coomassie. Se lavó, se secó, se redujo y se alquiló con yodoacetamida media banda (aproximadamente 1 \mug de proteína) antes de digerirse durante toda una noche por tripsina modificada (Promega, EE.UU.), esencialmente como se describió (44). El sobrenadante de la digestión se aplicó a puntas GELoader (Eppendorff, Alemania) envasadas con material en fase reversa de Poros 20 R2 (PerSeptive, EE.UU.) y se eluyó con 0,8 \mul de ácido alfa-cianohidroxicinámico (20 \mug/\mul en acetonitrilo al 70%/agua al 30%) directamente sobre el objetivo MALDI (28). Se llevó a cabo análisis en un PerSeptive Voyager STR (PerSeptive, EE.UU.) operado en el modo reflector y los resultados se analizaron en GPMAW versión 5.02 (Lighthouse Data, Dinamarca).

La espectrometría de masas por electropulverización de la proteína intacta se llevó a cabo en una fracción de RP-HPLC (aproximadamente 20 \mug de proteína). La muestra se secó y se redisolvió en ácido fórmico al 5% a una concentración de 20 \mumol/\mul antes de analizarse en un Micromass QTOF (Micromass, Reino Unido) usando una fuente de nanopulverización.

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Ejemplo 2 Expresión de glurp y MSP3 en L. lactis

Los fragmentos de PCR que codifican las regiones glurp_{79-1500} y MSP3_{628-1140} se clonaron uno junto al otro creando de este modo una fusión en fase entre un péptido señal codificado por vector y una proteína de fusión GLURP_{27-500}-MSP3_{212-380} (pKBR11, fig. 1). Este híbrido contiene dos residuos aminoacídicos adicionales creados uniendo estos fragmentos glurp y MSP3. Para comparación, los fragmentos individuales glurp_{73-1542} y MSP3_{628-1140} se clonaron también (pKBR8 y pKBR10, fig. 1). Los plásmidos se transformaron en L. lactis MG1363 y las cepas resultantes se cultivaron en fermentadores como se describe en Materiales y Procedimientos. El pH del medio de cultivo se mantuvo a 6 logrando transformación óptima a partir del promotor P170 (33). Todas las tres proteínas recombinantes se segregaron en los sobrenadantes de cultivo de donde se purificaron por intercambio iónico secuencial en HiTrap Q y columnas de SP Sefarosa seguido por cromatografía de interacción hidrófoba de fenilsefarosa. La SDS-PAGE subsiguiente mostró que los plásmidos pKBR11 (carril 1), pKBR8 (carril 2), y pKBR10 (carril 3) produjeron productos principales de 136, 100, y 36 kDa respectivamente (fig. 2A). Se observaron bandas de masa molecular menor adicionales en las preparaciones de GLURP y MSP3 purificadas. Cuando se analizaron por inmunotransferencia los productos menores en carriles 2 y 3 se reconocieron específicamente, como lo fueron los productos de longitud total, por anticuerpos para GLURP y MSP3 respectivamente, sugiriendo que ellos pueden resultar de traducción incompleta del ARNm y/o de escisión por proteasa de los productos de proteína primordiales. Un mapa peptídico de tríptico MALDI EM de las bandas purificadas de SDS-PAGE en el carril 2 confirmó que esta proteína de masa molecular menor se deriva de GLURP_{25-514} (datos no mostrados). La pureza de las preparaciones de GLURP_{27-500}-MSP3_{212-380} y GLURP_{25-514} se valoró por HPLC como se describe en Materiales y Procedimientos. GLURP_{27-500}-MSP3_{212-380} y GLURP_{25-514} dieron picos principales individuales (Fig. 2B). Las masas moleculares de GLURP_{27-500}-MSP3_{212-380} y GLURP_{25-514} fueron 74950 y 56518 Da (\pm 20 Da), respectivamente, como se determinó por ES EM. Asumiendo que las dos proteínas recombinantes contienen cada una los residuos de aminoácidos codificados por vectorer, A-E-R-S, unidos a los extremos N-terminales (fig. 1), estos pesos moleculares corresponden bien a los valores predichos de 74939 y de 56518, respectivamente. Así, tanto las proteínas recombinantes de GLURP_{27-500}-MSP3_{212-380} como las proteínas recombinantes de GLURP_{25-514} estuvieron intactas y contenían los residuos de aminoácidos predichos.

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Ejemplo 3 Antigenicidad de GLURP y MSP3 producidos en L. lactis

La antigenicidad de las proteínas recombinantes se evaluó frente a plasma de 71 liberianos adultos clínicamente inmunes a malaria (fig. 3). Las diluciones en serie de todas las muestras de plasma se probaron en placas separadas recubiertas con cada proteína recombinante y la valoración antígeno-específica se determinó como la dilución que da una absorbancia de 1000. Como se esperaba, diferente plasma contenía diferentes cantidades de anticuerpos IgG específicos de GLURP y de MSP3 (fig. 3A). En general, las valoraciones de anticuerpos específicos de híbridos excedieron aquellas registradas con los antígenos GLURP_{25-514} y MSP3 individuales (fig. 3B y C) sugiriendo que la molécula híbrida proporciona una presentación adecuada de determinantes antigénicos de GLURP y MSP3, respectivamente.

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Ejemplo 4 Inmunogenicidad de productos de GLURP y de MSP3 recombinantes

Para determinar si la molécula híbrida GLURP-MSP3 es un inmunógeno superior comparado con una mezcla de las moléculas de GLURP_{25-514} y MSP3_{212-380} individuales, los grupos de ratones BALBc/CF1 se inmunizaron cada uno subcutáneamente con la molécula híbrida en Montanide o con GLURP_{25-514} y MSP3_{212-380} combinados bien en una jeringuilla o bien inyectados por separado en dos sitios diferentes. Tras la tercera inyección, los sueros del día 35 se pusieron a prueba para reactividad de anticuerpo IgG frente a GLURP y MSP3, respectivamente. Mientras que la valoración GLURP-ELISA promedio es sólo ligeramente más alta en el grupo híbrido que en los otros dos grupos, la valoración de MSP3-ELISA promedio es 4,3 veces más alta (prueba de Kruskal Wallis, P<0,004) en el grupo que recibe el híbrido comparado con el grupo que recibe MSP3_{212-380} y GLURP_{25-514} en dos sitios diferentes (comparar gr7 y gr9 en fig. 4A). Al nivel individual, ratones inmunizados con el híbrido reaccionaron fuertemente tanto con dominios GLURP como con dominios MSP3 mientras que los ratones inmunizados con una combinación de dos moléculas tendieron a montar una respuesta de anticuerpos predominante bien contra GLURP o bien contra MSP3. Los anticuerpos IgG anti-híbridos están principalmente dirigidos contra los péptidos P3, P4, P11, y S3 que contienen epítopes conocidos para anticuerpos humanos (51); sin embargo los péptidos P5 y P9 que no contienen tales epítopes se reconocieron también (Fig. 4B). Mientras que los perfiles de la subclase de IgG específica de GLURP y específica de MSP3 son similares para todas las formulaciones de vacuna (Fig. 4C), los anticuerpos IgG específicos de GLURP tienden a usar la cadena ligera Kappa y los anticuerpos IgG específicos de MSP3 tienden a usar la cadena ligera Lambda. Esta diferencia en la cadena ligera se encontró para todos los anticuerpos específicos de GLURP o específicos de MSP3 si se produjeron contra el híbrido o si se produjeron contra las mezclas de las moléculas individuales.

La especificidad de anticuerpos de ratón para el híbrido se analizó también por ELISA de competición (Fig. 5). Parece que los anticuerpos para el híbrido son puramente específicos de GLURP y específicos de MSP3, dado que una mezcla de GLURP_{25-514} y MSP3_{212-380} solubles pudo inhibir completamente la unión de anticuerpos anti-híbrido a GLURP_{27-500}-MSP3_{212-380} inmovilizado. Así, la construcción de una molécula híbrida de GLURP-MSP3 no ha creado epítopes de células B nuevos en el área solapante.

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Ejemplo 5 Reactividad de sueros anti-GLURP y anti-MSP3 de ratón con GLURP y MSP3 nativos

La inmunogenicidad del GLURP recombinante y del MSP3 recombinante se investigó también por inmunotransferencia de proteínas derivadas de parásitos con suero de ratón inmunizado con cada una de las tres proteínas recombinantes, híbrido, GLURP_{25-514} y MSP_{3212-380}, respectivamente. Como se demuestra en fig. 6, el plasma de ratones inmunizados con GLURP_{25-514}, MSP3_{212-380}, y el híbrido reconoció proteínas de aproximadamente 220.000 Da (carril 1), 48.000 Da (carril 2), y ambos (carril 3), respectivamente.

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Ejemplo 6 Competición de antígenos entre GLURP y MSP3 producidos en forma de péptidos sintéticos largos Inmunógenos

Las regiones de MSP3 y de GLURP usadas se produjeron como péptidos sintéticos largos:

100

Inmunizaciones

Se asignaron al azar veinte ratones hembra BALBc (7 a 10 semanas de edad) a cuatro grupos y se inmunizaron por inyecciones subcutáneas con diferentes combinaciones de MSP3 y de GLURP:

1. el grupo 110 se inmunizó con 5 \mug de LR55,

2. el grupo 111 se inmunizó con 5 \mug of LR67,

3. el grupo 112 se inmunizó con una mezcla de 5 \mug de LR55 + 5 \mug de LR67 por inyecciones subcutáneas en la base del rabo,

4. el grupo 113 recibió 5 \mug de LR55 inyectados en la base del rabo y 5 \mug de LR67 inyectados en el hombro.

Todos los inmunógenos se emulsionaron en Montanide ISA720 y cada uno de los ratones recibió tres inyecciones a intervalos de 2 semanas y se sangró en los días 0, 14, 28 y 35.

ELISA

Las diluciones seriadas de las muestras de plasma del día 35 se probaron en placas de ELISA recubiertas bien con LR55 o bien con LR67 a 0,5 y a 5 \mug/ml respectivamente, y los valores de absorbancia se trazaron frente a las diluciones de plasma. La valoración de anticuerpos se definió como la dilución de plasma, que dio un valor de absorbancia de A492 = 1,00 en la parte paralela de las curvas.

Resultados

Para determinar si es factible obtener una respuesta inmune equilibrada contra una mezcla de MSP3 y GLURP producidos en forma de péptidos sintéticos largos, se inmunizaron cuatro grupos de ratones BALBc inmunizados cada uno subcutáneamente con 1) LR55 (gr110), 2) LR67 (gr111), 3) LR55 y LR67 combinados en una jeringuilla (gr 112) o 4) LR55 y LR67 inyectados por separado en dos sitios diferentes (gr113). Se recogieron sueros 35 días después de la primera inyección, se probaron para reactividad de anticuerpo IgG contra GLURP y MSP3, respectivamente. Los ratones inmunizados con LR55 o LR67 solos reaccionaron fuertemente bien con LR55 o bien con LR67, respectivamente (Figura 7(a) y 7(b)). Asimismo, los ratones inmunizados con las dos moléculas inyectadas en sitios diferentes reaccionaron fuertemente tanto con dominios GLURP como con dominios MSP3 (figura 7(d)) mientras que los ratones inmunizados con una combinación de las dos moléculas administradas en una jeringuilla reaccionaron exclusivamente contra LR55 (figura 7(c)).

Este resultado respalda fuertemente la noción de que una mezcla de productos de GLURP y de MSP3 individuales no se puede administrar en una formulación de vacuna única sin competición antigénica entre GLURP y MSP3.

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4

5

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<210> 2

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<211> 1953

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<212> ADN

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<213> Plasmodium falciparum

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<400> 2

6

7

Claims

1. Una vacuna basada en antígenos contra la malaria capaces de generar una respuesta inmune tanto contra moléculas de GLURP como contra moléculas de MSP3, comprendiendo

iii) determinando una respuesta celular in vivo como una respuesta de hipersensibilidad de tipo retardado (DHT) positiva después de inyección intradérmica o parche de aplicación local de como mucho 100 \mug del polipéptido o la parte inmunogénica para un individuo quien está infectado clínicamente o subclínicamente con P. falciparum; o

iv) determinando una respuesta humoral in vitro por una respuesta de anticuerpo específica en un individuo inmune o infectado por una técnica de ELISA o una transferencia de Western donde el polipéptido o la parte inmunogénica se absorbió bien a una membrana de nitrocelulosa o bien a una superficie de poliestireno.

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2. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación 1 que comprende adicionalmente un fragmento inmunogénico de una proteína derivada de Plasmodium falciparum.

3. Una proteína de fusión capaz de generar una respuesta inmune tanto contra moléculas de GLURP como MSP3, comprendiendo

a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 1; o

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4. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 3 que comprende adicionalmente fragmentos inmunogénicos de una o más proteínas derivadas de Plasmodium falciparum.

5. Una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 4 en la que el fragmento inmunógeno se elige de CS, MSP1, MSP2, MSP4, MSP5, MSP6, AMA1, Pf155/RESA, RAP1, EBA-175, pfEMP1, EXP1, LSA1, LSA3, Pf25, Pf45/48, Pf230, Pf27, Pf16, o Pf28.

6. Un procedimiento de preparación de una proteína de fusión de acuerdo con las reivindicaciones 3-5 a partir de un Lactococcus sp. recombinante.

7. Un ácido nucleico que comprende

a) la secuencia de aminoácidos de SEQ ID Nº 2 o

b) un ácido nucleico que codifica una secuencia de aminoácidos según se define en la reivindicación 3 b).

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8. Un ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 que codifica para una proteína de fusión de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5.

9. Uso de una ácido nucleico de acuerdo con la reivindicación 7 u 8 para la preparación de una vacuna.

10. Una vacuna que comprende una BCG recombinante que expresa la secuencia de ácidos nucleicos de acuerdo con la reivindicación 7 u 8.